JP5046077B2

JP5046077B2 - Method for stabilizing S-adenosylmethionine

Info

Publication number: JP5046077B2
Application number: JP2006016595A
Authority: JP
Inventors: 治幸家藤; えい子浮穴; 力藤井; 和夫正木
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2026-01-25
Also published as: JP2007197346A

Description

本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンを安定化させるための安定化方法に関する。 The present invention relates to a stabilization method for stabilizing S-adenosylmethionine.

S-アデノシルメチオニン(ＳＡＭ)は、近年、アルコール性肝炎その他肝臓疾患に顕著な治癒、予防効果のあることで注目されている。さらに、うつ病に対する治癒効果、骨関節症での機能回復効果、老人性痴呆症の改善効果なども報告されている（特許文献１）。 In recent years, S-adenosylmethionine (SAM) has attracted attention because of its remarkable curative and preventive effects on alcoholic hepatitis and other liver diseases. Furthermore, a healing effect for depression, a function recovery effect in osteoarthritis, an improvement effect on senile dementia, and the like have been reported (Patent Document 1).

このＳＡＭは酵母、その中でも清酒酵母など醸造酵母が高生産する能力のあることが知られている。しかしながら、ＳＡＭは化学的に不安定な物質であり、常温においても急速に分解が進むため、ＳＡＭの効用が注目されながらも、医薬品やサプリメントとして利用する際の大きな障害となっている。米国などでは、ＳＡＭのトシル酸塩やパラトルエンスルフォン酸塩、スルフォサルチル酸塩とすることで安定化させ、一部使用されているが、これらは食品添加物として認められているものではなく、ＳＡＭをより安全なサプリメントや食品の一部として利用することができるための安定化方法がなにより望まれている。このようなＳＡＭの安定化方法として、トレハロースに、ＳＡＭを安定化させる効果のあることが報告されている(Biochemica et Biophysica Acta, 1573 (2002) pp.105-108)。また、塩酸塩の形とすることにより安定化させて販売されているＳＡＭも多い。しかし、これらの安定化効果は十分なものではなく、より安定度の高い方法の開発が必要である。 This SAM is known to have the ability to produce high yields of yeasts, especially brewing yeasts such as sake yeast. However, since SAM is a chemically unstable substance and rapidly decomposes even at room temperature, it has been a major obstacle when used as a pharmaceutical or a supplement, although the utility of SAM is attracting attention. In the US, etc., SAM tosylate, paratoluene sulfonate, and sulfosartylate are stabilized and partially used, but these are not recognized as food additives. A stabilization method for enabling SAM to be used as a safer supplement or part of food is more desirable. As such a SAM stabilization method, it has been reported that trehalose has an effect of stabilizing SAM (Biochemica et Biophysica Acta, 1573 (2002) pp.105-108). There are also many SAMs that are stabilized and sold in the form of hydrochloride. However, these stabilizing effects are not sufficient, and development of a method with higher stability is necessary.

特開２００５−２６１３６１JP 2005-261361 Biochemica et Biophysica Acta, 1573 (2002) pp.105-108Biochemica et Biophysica Acta, 1573 (2002) pp.105-108

従って、本発明の目的は、ＳＡＭを安定化させる効果を有する物質を含有する安定化剤を用いた安定化方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a stabilization method using a stabilizer containing a substance having an effect of stabilizing SAM.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、リン酸化合物にＳＡＭを長期にわたって安定化させる効果があることを見出し、本願発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that a phosphate compound has an effect of stabilizing SAM over a long period of time, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、S-アデノシルメチオニンにピロリン酸又はその塩であるリン酸化合物を添加することを含む、S-アデノシルメチオニンの水溶液又はその凍結乾燥物若しくは乾燥物の安定化方法を提供する。 That is, the present invention provides a method for stabilizing an aqueous solution of S-adenosylmethionine, or a freeze-dried product or dried product thereof , which comprises adding pyrophosphate or a phosphate compound that is a salt thereof to S-adenosylmethionine. To do.

本発明により、従来の方法よりも長期間にわたって効果的にＳＡＭの水溶液又はその凍結乾燥物若しくは乾燥物を安定化させることができる安定化方法が提供された。本発明の安定化方法に用いられるリン酸化合物は、食品添加物としても認められているので、本発明によればＳＡＭをサプリメントや食品の一部としてより安全に利用することができる。本発明は、肝臓疾患、うつ病、骨関節症、老人性痴呆症など様々な効用が明らかでありながら、その実利用が困難であったＳＡＭについての利用の道を拓くものである。 According to the present invention, a stabilization method capable of stabilizing an aqueous solution of SAM or a lyophilized product or a dried product thereof for a longer period of time than the conventional method is provided. Since the phosphate compound used in the stabilization method of the present invention is also recognized as a food additive, according to the present invention, SAM can be used more safely as a supplement or a part of food. The present invention pioneers the use of SAM which has been difficult to use in practice, although various effects such as liver disease, depression, osteoarthritis, and senile dementia are obvious.

本発明の安定化方法で用いられるリン酸化合物は、ピロリン酸（Ｈ_２ＰＯ_４−Ｈ_２ＰＯ_３）又はその塩である。塩としてはアルカリ金属塩が好ましいが、これらに限定されない。なお、２分子以上のリン酸が脱水縮合した構造の化合物を総称してポリリン酸と言い得るが、本明細書においては、２分子のリン酸が脱水縮合した構造のものをピロリン酸、３分子以上のリン酸が脱水縮合した構造のものをポリリン酸と表現する。なお、上記リン酸化合物は、単独で用いることも２種以上を併用することも可能である。 Phosphoric acid compounds used in the stabilization method of the present invention, pyrophosphate _{_{_{_{(H 2 PO 4 -H 2 PO}}}} 3) or Ru salts der of it. The salt is preferably an alkali metal salt, but is not limited thereto. A compound having a structure in which two or more molecules of phosphoric acid are dehydrated and condensed can be collectively referred to as polyphosphoric acid. In this specification, a compound having a structure in which two molecules of phosphoric acid are dehydrated and condensed is referred to as pyrophosphoric acid, three molecules. A structure in which the above phosphoric acid is dehydrated and condensed is expressed as polyphosphoric acid. In addition, the said phosphoric acid compound can be used individually or can use 2 or more types together.

本発明で用いられる安定剤は、上記のリン酸化合物を有効成分として含有するものである。該安定剤は、粉末若しくは顆粒などの固体又は水溶液等の溶液の形態で調製し得る。固体の場合は、後述する通り、例えばＳＡＭを含む溶液に添加し溶解して用いることができる。安定剤を使用する際には、安定剤中に含まれるリン酸化合物重量がＳＡＭ重量に対して好ましくは１〜１００倍量、より好ましくは５〜２０倍量となるように用いる。例えば、本発明の安定剤を１０倍量で用いる場合、安定化させるＳＡＭを含む溶液中のＳＡＭ濃度が0.2mg／mlであれば、該ＳＡＭ溶液１mlに対しリン酸化合物が２mgとなる量の安定剤を用いる。 The stabilizer used in the present invention contains the above phosphoric acid compound as an active ingredient. The stabilizer can be prepared in the form of a solid such as a powder or granules or a solution such as an aqueous solution. In the case of a solid, as described later, for example, it can be added to a solution containing SAM and dissolved. When the stabilizer is used, it is used so that the weight of the phosphate compound contained in the stabilizer is preferably 1 to 100 times, more preferably 5 to 20 times the SAM weight. For example, when the stabilizer of the present invention is used in a 10-fold amount, if the SAM concentration in the solution containing SAM to be stabilized is 0.2 mg / ml, the amount of phosphate compound is 2 mg per 1 ml of the SAM solution. Use stabilizers.

本発明によって安定化されるＳＡＭは、特に限定されないが、酵母等のＳＡＭ産生能を有する微生物から抽出されたものであり得る。抽出物は、水溶液等の溶液形態であってもよく、また、該抽出物を凍結乾燥又は乾燥させた固体形態であってもよい。該抽出物が溶液形態の場合には、溶液形態の本発明の安定剤を該抽出物に添加して混合することにより、該抽出物中のＳＡＭを安定化させることができる。また、固体形態の本発明の安定剤を溶液形態の該抽出物に添加して溶解させることによっても、該抽出物中のＳＡＭを安定化させることができる。該抽出物が固体形態の場合には、溶液形態の本発明の安定剤中に該抽出物を添加して溶解させるか、又は固体形態の本発明の安定剤と該抽出物とをあらかじめ混合して若しくは順次水などの溶媒に溶解させることにより、該抽出物中のＳＡＭを安定化させることができる。なお、本発明の安定剤を溶液形態にする場合、溶媒としては、リン酸化合物を溶解することができ、人体に無害な溶媒であれば特に限定されないが、安全性及びコストの点から水が好ましい。 The SAM stabilized by the present invention is not particularly limited, but may be extracted from a microorganism having SAM production ability such as yeast. The extract may be in the form of a solution such as an aqueous solution, or in the form of a solid obtained by freeze-drying or drying the extract. When the extract is in a solution form, the SAM in the extract can be stabilized by adding the stabilizer of the present invention in a solution form to the extract and mixing. The SAM in the extract can also be stabilized by adding the solid form of the stabilizer of the present invention to the extract in the form of a solution and dissolving it. When the extract is in solid form, the extract is added and dissolved in the stabilizer of the present invention in solution form, or the solid stabilizer of the present invention and the extract are mixed in advance. Alternatively, the SAM in the extract can be stabilized by dissolving in a solvent such as water. When the stabilizer of the present invention is in the form of a solution, the solvent is not particularly limited as long as it is a solvent that can dissolve a phosphate compound and is harmless to the human body, but water is used from the viewpoint of safety and cost. preferable.

本発明により安定化されたＳＡＭは、液体状態のままでも長期にわたり良好に保存することができる。また、液体状態の該安定化されたＳＡＭを凍結乾燥又は乾燥させることにより固体状態とした場合でも、良好に保存することができる。 The SAM stabilized according to the present invention can be well stored for a long time even in a liquid state. Moreover, even when the stabilized SAM in a liquid state is freeze-dried or dried to obtain a solid state, it can be stored well.

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

参考例１
１．ＳＡＭの生産及び抽出
まず、酵母Saccharomyces cerevisiae K-9 (協会９号清酒酵母)を、YPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、グルコース2%) を培養液として用いて、5 ml L字管にて30℃、24時間、振とうして前培養を行った。その後、ショ糖5%、酵母エキス0.3%、KH₂PO₄ 0.4%、K₂HPO₄ 0.2%、MgSO₄・7H₂0 0.05%、L-メチオニン0.15%よりなる培地(以下D培地と称する) 78mlに、OD₆₆₀=0.1となるように、前培養した酵母菌体を植菌し、200ml容量バッフル付三角フラスコにて、30℃、2日間、振とう培養した。このようにしてＳＡＭを多く生産蓄積させた酵母菌体を培養後、遠心分離により回収し、菌体を滅菌水にて２回洗浄した。 Reference example 1
1. Production and extraction of SAM First, 5 ml L-shaped tube using yeast Saccharomyces cerevisiae K-9 (Association No. 9 sake yeast) and YPD medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) as the culture medium. And pre-cultured by shaking at 30 ° C. for 24 hours. Thereafter, a medium comprising sucrose 5%, yeast extract 0.3%, KH ₂ PO ₄ 0.4%, K ₂ HPO ₄ 0.2%, MgSO ₄ 7H ₂ 0.05%, L-methionine 0.15% (hereinafter referred to as D medium) In 78 ml, the pre-cultured yeast cells were inoculated so that OD ₆₆₀ = 0.1, and cultured in a 200 ml baffled Erlenmeyer flask with shaking at 30 ° C. for 2 days. The yeast cells that produced and accumulated a large amount of SAM in this way were cultured and then collected by centrifugation, and the cells were washed twice with sterile water.

この洗浄菌体を10 mlの滅菌水に懸濁し、-30℃にて一晩凍結後、翌日それを溶解する操作により、ＳＡＭを菌体より水抽出することを行った。続いて、遠心にて上清を回収し、それを0.2μmのメンブランフィルターでろ過し、酵母菌体により生産されたＳＡＭの抽出物を得た。 The washed cells were suspended in 10 ml of sterilized water, frozen overnight at −30 ° C., and then dissolved the next day to extract SAM from the cells. Subsequently, the supernatant was collected by centrifugation and filtered through a 0.2 μm membrane filter to obtain an extract of SAM produced by yeast cells.

２．ＳＡＭ分析
ＳＡＭの分析は以下の要領でキャピラリー電気泳動法により測定した。分析条件は以下のとおり。
分析装置
キャピラリーイオンアナライザー（Waters）
分析条件
キャピラリー：AccuSep、 75μm×60 cm
バッファー：40mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 2.5)
電圧：positive、20 kV
サンプリング：３０秒ハイドロスタティック法
温度：25℃
検出：UV 254nm 2. SAM analysis SAM analysis was measured by capillary electrophoresis in the following manner. The analysis conditions are as follows.
Analyzer Capillary ion analyzer (Waters)
Analysis conditions Capillary: AccuSep, 75μm × 60 cm
Buffer: 40 mM sodium phosphate buffer (pH 2.5)
Voltage: positive, 20 kV
Sampling: 30 seconds hydrostatic method Temperature: 25 ℃
Detection: UV 254nm

比較例１
ＳＡＭ安定性試験(その１)(凍結乾燥保存)
前記のＳＡＭ抽出物（0.2mg/ml）に、安定化試験に供する物質をＳＡＭ重量の10倍量添加し、それぞれを一定量ずつ小分けし、その後凍結乾燥を行った。そのＳＡＭと添加物質とからなる凍結乾燥物を25℃、および37℃に暗所保存し、経時的にＳＡＭの残存量を測定した。これにより、各種添加物質の乾燥状態におけるＳＡＭの安定保存状態を調べた。なお、独立した試験をそれぞれ３回行った。 Comparative Example 1
SAM stability test (part 1) (freeze-dried storage)
To the SAM extract (0.2 mg / ml), a substance to be subjected to the stabilization test was added in an amount 10 times the SAM weight, and each was subdivided into a predetermined amount, and then lyophilized. The lyophilized product composed of the SAM and the additive substance was stored in the dark at 25 ° C. and 37 ° C., and the remaining amount of SAM was measured over time. Thereby, the stable preservation | save state of SAM in the dry state of various additives was investigated. Each independent test was performed three times.

(i) 酵母から抽出したＳＡＭをそのまま凍結乾燥したもの（図１中「原液」と表示）、(ii) 希塩酸を0.1N HClとなるよう添加したあと凍結乾燥したもの（「0.1N HCl」と表示）、及び(iii)リン酸をＳＡＭ重量の10倍量、つまり市販のリン酸は85%純度であることより、ＳＡＭ抽出物(0.2mg/ml)に1 mlあたり2.42mg添加し凍結乾燥したもの（「リン酸」と表示）、の３つにつき、保存開始直後を0日、その後37℃にて暗所保存３日目、１週間目、1ヶ月目でのＳＡＭ残存量を調べた結果を図１に示した。 (i) The SAM extracted from yeast was lyophilized as it was (designated “stock solution” in FIG. 1), (ii) The SAM was lyophilized after adding dilute hydrochloric acid to 0.1N HCl (“0.1N HCl”) Display), and (iii) 10 times the SAM weight of phosphoric acid, that is, commercially available phosphoric acid is 85% pure, so 2.42 mg per ml was added to the SAM extract (0.2 mg / ml) and lyophilized. The remaining amount of SAM was examined for the three samples (labeled “phosphoric acid”) immediately after the start of storage on day 0 and then in the dark at 37 ° C. on day 3, week 1 and month 1. The results are shown in FIG.

ＳＡＭは試薬として塩酸塩の形で販売されているものが多い。塩酸塩の形では、確かに抽出物そのままで凍結保存したものより安定であることが示されたが、リン酸を添加しリン酸塩とした状態では、塩酸塩よりさらに安定に保存されていることが示された。 Many SAMs are sold in the form of hydrochloride as a reagent. In the form of hydrochloride, it was certainly shown that the extract was more stable than the one that was cryopreserved as it was, but in the state where phosphoric acid was added to form phosphate, it was stored more stably than the hydrochloride. It was shown that.

実施例１
ＳＡＭ安定性試験(その２)(凍結乾燥保存)
(i) 酵母から抽出したＳＡＭをそのまま凍結乾燥したもの（図２中「原液」と表示）、(ii) 添加によりＳＡＭの保存性が向上するとの報告のあるトレハロースをＳＡＭ重量の10倍量（ＳＡＭ抽出物(0.2mg/ml) 1 ml当たり2.0mg）添加し凍結乾燥したもの、および(iii) ポリリン酸混合物（ピロリン酸85.8%含有）をＳＡＭ重量の10倍量（ＳＡＭ抽出物(0.2mg/ml) 1 ml当たり2.0mg）添加し凍結乾燥したものの３つにつき、37℃にて1週間、１ヶ月、３ヶ月間のＳＡＭ保存試験を行った結果を図２に示す。 Example 1
SAM stability test (2) (freeze-dried storage)
(i) The SAM extracted from yeast was freeze-dried as it is (labeled “stock solution” in FIG. 2), and (ii) 10 times the SAM weight of trehalose reported to improve the storage stability of SAM by addition ( SAM extract (0.2 mg / ml) added and freeze-dried (2.0 mg), and (iii) polyphosphoric acid mixture (containing 85.8% pyrophosphate) 10 times the SAM weight (SAM extract (0.2 mg / ml)) FIG. 2 shows the results of a SAM storage test conducted at 37 ° C. for one week, one month, and three months for three of those added and lyophilized at 2.0 mg / ml).

上記試験の結果、トレハロースには保存性を増大させる効果は認められなかった。一方、ポリリン酸混合物の場合は、3ヶ月後もほぼ100%近くＳＡＭが残存しており、極めて良好なＳＡＭ保存効果が認められた。 As a result of the above test, trehalose did not have an effect of increasing the storage stability. On the other hand, in the case of the polyphosphoric acid mixture, almost 100% of SAM remained even after 3 months, and a very good SAM storage effect was observed.

以上、図１及び２に示したように、リン酸化合物、特にピロリン酸を主に含有するポリリン酸混合物にＳＡＭ乾燥状態で高い保存性が確認された。 As described above, as shown in FIGS. 1 and 2, high storage stability was confirmed in a SAM dry state in a polyphosphoric acid mixture mainly containing a phosphoric acid compound, particularly pyrophosphoric acid.

実施例２
ＳＡＭ安定性試験(その３)(水溶液保存)
前記のＳＡＭ抽出物に、安定化試験に供する物質をＳＡＭ重量の10倍量添加し、それぞれを一定量ずつ小分けし、その後水溶液の状態で、37℃に暗所保存し、経時的にＳＡＭの残存量を測定した。これにより、各種添加物質の水溶液状態におけるＳＡＭの安定保存状態を調べた。なお、独立した試験をそれぞれ３回行った。 Example 2
SAM stability test (Part 3) (Aqueous solution storage)
To the SAM extract, a substance to be used for the stabilization test was added in an amount 10 times the SAM weight, and each aliquot was aliquoted and then stored in an aqueous solution at 37 ° C. in the dark. The remaining amount was measured. Thereby, the stable preservation | save state of SAM in the aqueous solution state of various additive substances was investigated. Each independent test was performed three times.

(i) 酵母から抽出したＳＡＭ含有水溶液（ＳＡＭ量2mg/ml）（図３中「原液」と表示）、(ii) ポリリン酸ナトリウムをＳＡＭの10倍量（すなわち20mg/ml量となるように）添加したもの、及び(iii) ピロリン酸ナトリウムをＳＡＭの10倍量（20mg/ml量）添加したものを、そのまま37℃にて暗所保存した時の、1週間、１ヶ月、３ヶ月目のＳＡＭ残存率を図３に示す。 (i) SAM-containing aqueous solution extracted from yeast (SAM amount 2 mg / ml) (indicated as “stock solution” in FIG. 3), (ii) sodium polyphosphate 10 times the amount of SAM (ie 20 mg / ml) 1 week, 1 month, and 3 months when stored in a dark place at 37 ° C, with the addition of (III) sodium pyrophosphate 10 times the amount of SAM (20 mg / ml) FIG. 3 shows the SAM residual ratio.

酵母から抽出したＳＡＭそのものでは、１ヶ月あまりでＳＡＭがほぼ完全に分解消失していた。これに対し、ポリリン酸ナトリウム添加では３ヶ月後も80%以上、さらにピロリン酸ナトリウムにおいてはほぼ100％のＳＡＭが残存しており、水溶液状態でも安定したＳＡＭ保存性を示すことが認められた。 In the SAM itself extracted from yeast, the SAM was almost completely decomposed and disappeared in about one month. On the other hand, when sodium polyphosphate was added, 80% or more of SAM remained after 3 months, and almost 100% of SAM remained in sodium pyrophosphate. It was confirmed that stable SAM storage stability was exhibited even in an aqueous solution state.

安定剤として0.1N塩酸又はリン酸を添加したＳＡＭ溶液及び何も添加しないＳＡＭ溶液を種々の期間凍結乾燥状態で保存した後のＳＡＭの残存率(％)を示す図である。It is a figure which shows the residual rate (%) of SAM after preserve | saving the SAM solution which added 0.1N hydrochloric acid or phosphoric acid as a stabilizer, and the SAM solution which does not add anything in a lyophilized state for various periods. 安定剤としてトレハロース又はポリリン酸を添加したＳＡＭ溶液及び何も添加しないＳＡＭ溶液を種々の期間凍結乾燥状態で保存した後のＳＡＭの残存率(％)を示す図である。It is a figure which shows the residual ratio (%) of SAM after preserve | saving the SAM solution which added trehalose or polyphosphoric acid as a stabilizer, and the SAM solution which does not add anything in a lyophilized | freeze-dried state for various periods. 安定剤としてポリリン酸ナトリウム又はピロリン酸ナトリウムを添加したＳＡＭ溶液及び何も添加しないＳＡＭ溶液を種々の期間溶液状態で保存した後のＳＡＭの残存率(％)を示す図である。It is a figure which shows the residual rate (%) of SAM after preserve | saving the SAM solution which added sodium polyphosphate or sodium pyrophosphate as a stabilizer, and the SAM solution which does not add anything in a solution state for various periods.

Claims

A method for stabilizing an aqueous solution of S-adenosylmethionine, or a freeze-dried product or dried product thereof , comprising adding a phosphate compound that is pyrophosphate or a salt thereof to S-adenosylmethionine.

The phosphoric acid compound, at least one method according to claim 1, wherein selected from the group consisting of pyrophosphoric acid and alkali metal salts thereof.

The method according to claim 1 or 2 , wherein the phosphate compound is used in a weight of 5 to 20 times the weight of the S-adenosylmethionine.

The method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the S-adenosylmethionine is extracted from a microorganism having an ability to produce S-adenosylmethionine.

The extract from the microorganism is in the form of a solution, a lyophilized product or a dried product, and the phosphate compound is added to the extract and maintained in a solution state or the phosphate compound is added to the extract. The method according to claim 4 , wherein the added solution is lyophilized or dried and maintained in a solid state.