JP5016241B2 - Immortalized human mesangial cells - Google Patents
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Description
本発明は、不死化ヒトメサンギウム細胞及び該細胞から分化誘導して得られる分化型ヒトメサンギウム細胞、ならびにこれらの細胞を用いた腎疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to an immortalized human mesangial cell, a differentiated human mesangial cell obtained by inducing differentiation from the cell, and a screening method for a therapeutic agent for renal disease using these cells.
メサンギウム細胞は、上皮細胞、内皮細胞と共に腎臓の糸球体を構成している細胞である。メサンギウム細胞の役割は、収縮運動により糸球体のろ過機能を調節しているだけでなく、各種生理活性物質を産生し、また糸球体腎炎発症時にみられる細胞外基質（マトリックス）産生亢進の原因となる。糸球体腎炎には、例えば、免疫学的機序により発症するIgA腎症、代謝性疾患である糖尿病性腎症、遺伝性疾患であるアルポート症候群などがある。これらの種々の発症原因の腎炎のいずれにおいても、糸球体メサンギウム細胞による細胞外基質（マトリックス）成分の異常マトリックスリモデリング現象が観察され、最終的には糸球体硬化と呼ばれる腎炎終末像に至る事が知られている。従って、メサンギウム細胞のマトリックス産生を低減すれば腎疾患の進展を抑制できると考えられる。 Mesangial cells are cells that constitute the glomeruli of the kidney together with epithelial cells and endothelial cells. The role of mesangial cells is not only regulating the glomerular filtration function by contraction, but also producing various physiologically active substances, and the cause of the increased production of extracellular matrix (matrix) seen at the onset of glomerulonephritis Become. Glomerulonephritis includes, for example, IgA nephropathy that develops by immunological mechanism, diabetic nephropathy that is a metabolic disease, and Alport syndrome that is a genetic disease. In any of these various causes of nephritis, abnormal matrix remodeling of the extracellular matrix (matrix) component by glomerular mesangial cells is observed, which eventually leads to an end image of nephritis called glomerular sclerosis. It has been known. Therefore, it is considered that the progression of kidney disease can be suppressed by reducing the matrix production of mesangial cells.
各種薬剤や天然物などから上記の各種の原因に起因する糸球体腎炎の治療剤をスクリーニングするために、メサンギウム細胞の形質変化、応答タンパク質もしくはマーカータンパク質の活性変化や発現量の変化、又は各種生理活性物質の産生量、分泌量、及び／又は分解量の変化を指標として用いることが期待されている。係るスクリーニング方法により見いだされた各種薬剤や天然物は、腎疾患の治療薬の候補物質である。このような腎疾患としては、糸球体腎炎、IgA腎症、糖尿病性腎症、アルポート症候群、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎などが挙げられる。 In order to screen for therapeutic agents for glomerulonephritis caused by the above-mentioned various causes from various drugs and natural products, phenotypic changes in mesangial cells, changes in the activity or expression level of response protein or marker protein, or various physiology It is expected to use changes in the production amount, secretion amount, and / or degradation amount of an active substance as an index. Various drugs and natural products found by such screening methods are candidate substances for therapeutic drugs for renal diseases. Such renal diseases include glomerulonephritis, IgA nephropathy, diabetic nephropathy, Alport syndrome, lupus nephritis, focal glomerulosclerosis, chronic glomerulonephritis, acute progressive nephritis, nephrotic syndrome, membranous kidney Disease, crescent nephritis, mesangial proliferative nephritis, membranoproliferative glomerulonephritis and the like.
しかしながら、一般的なヒトの各形質細胞と同様に、ヒトメサンギウム細胞は初代細胞から4〜8世代の継代により増殖能を失い、刺激応答性も低下することから、同じ由来の細胞を用いて同種の条件下で機能解析や各種薬剤のスクリーニングを実施することは不可能であった。したがって、ヒトメサンギウム細胞に固有の形質を維持しているか又は誘導することができる不死化ヒトメサンギウム細胞株の樹立が望まれていた。 However, as with general human plasma cells, human mesangial cells lose their ability to proliferate after 4 to 8 generations of passage from primary cells, and the stimulus responsiveness also decreases. It was impossible to conduct functional analysis and screening of various drugs under the same conditions. Accordingly, it has been desired to establish an immortalized human mesangial cell line that can maintain or induce a trait inherent to human mesangial cells.
こうした目的のために、一般的には初代細胞にras遺伝子やc-myc遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウィルスのE1A遺伝子、シミアン・ウイルス40（SV40）T抗原遺伝子、ヒトパピローマウィルスのHPV16遺伝子等を導入して細胞を形質転換することにより、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、しかも細胞固有の特性を継代により喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。 For this purpose, in general, oncogenic genes such as ras and c-myc genes, adenovirus E1A gene, simian virus 40 (SV40) T antigen gene, and human papillomavirus HPV16 gene are introduced into primary cells. By trying to transform cells, attempts have been made to establish immortalized cells that continuously retain the active proliferative ability of primary cells and that do not lose cell-specific properties by passage.
マウスやラット由来の細胞ではSV40T抗原遺伝子の導入により本来の形質細胞の機能を維持する不死化細胞を樹立する技術が複数種の細胞株を用いて確立されてきた。例えばSV40 T抗原遺伝子を導入したマウスメサンギウム細胞株が樹立され（Brennan DC et al., kidney international, 38:1039-1046, 1990）、該細胞の機能解析がなされている。 In cells derived from mice and rats, a technique for establishing immortalized cells that maintain the functions of the original plasma cells by introducing the SV40T antigen gene has been established using a plurality of cell lines. For example, a mouse mesangial cell line into which the SV40 T antigen gene has been introduced has been established (Brennan DC et al., Kidney international, 38: 1039-1046, 1990), and the function of the cell has been analyzed.
また、SV40T抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが作出されその臓器、組織から不死化細胞を樹立する技術が確立されている。しかし、このトランスジェニックマウスより得られる不死化細胞株は、通常の初代細胞に比べてより増殖活性が高く、低分化型形質を示す。こうした欠点を補うべくSV40T抗原遺伝子に温度感受性変異（H-2K-tsA58）を導入したトランスジェニックマウスが作出されている。このようなトランスジェニックマウスから、33℃の許容温度ではSV40tsT抗原が発現することにより細胞増殖が維持される一方、非許容温度である37℃ではSV40tsT抗原の発現が抑制されることにより、条件的に分化型形質を誘導することができる不死化細胞株が樹立可能となった（Jat PS et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:5096-5100, 1991）。該マウスを用いて条件誘導型の不死化メサンギウム細胞が樹立されている（Barber RD et al., Biochim.Biophys.Acta 1355:191-203,1997）。 Moreover, transgenic mice into which the SV40T antigen gene has been introduced have been created, and techniques for establishing immortalized cells from the organs and tissues have been established. However, the immortalized cell line obtained from this transgenic mouse has a higher proliferative activity than normal primary cells and exhibits a poorly differentiated trait. To compensate for these drawbacks, transgenic mice have been created in which a temperature-sensitive mutation (H-2K-tsA58) has been introduced into the SV40T antigen gene. From such a transgenic mouse, cell growth is maintained by expressing SV40tsT antigen at an allowable temperature of 33 ° C, while expression of SV40tsT antigen is suppressed at 37 ° C, which is a non-permissive temperature. An immortalized cell line capable of inducing a differentiated trait can be established (Jat PS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5096-5100, 1991). Condition-induced immortalized mesangial cells have been established using the mice (Barber RD et al., Biochim. Biophys. Acta 1355: 191-203, 1997).
これに対して、ヒト由来のメサンギウム細胞の不死化は、SV40T抗原の導入のみでは困難であり、例えばヒトメサンギウム細胞の場合では約20継代により生育が停止し、それ以後同じ細胞株を使用しての試験は実施不可能であった。SV40T抗原遺伝子と癌遺伝子であるH-rasを同時に導入することによりこうした欠点を克服したヒトメサンギウム細胞が樹立され、90継代以上、36ヶ月以上の長期にわたる増殖が報告されている（Sraer JD et al., Kidney Int. 49:267-270, 1996）。しかし、該不死化ヒトメサンギウム細胞株は二倍増殖時間が62時間であり同一の手法により樹立された糸球体臓側上皮細胞のそれより遅く、またu-PAなどの細胞マーカーの発現が初代培養細胞とは異なるパターンを示しており、分化型形質細胞の形質を完全には保持していないことが示唆された。 In contrast, immortalization of human-derived mesangial cells is difficult only by the introduction of SV40T antigen.For example, in the case of human mesangial cells, growth stops after about 20 passages, and the same cell line is used thereafter. All tests were not possible. Human mesangial cells that have overcome these drawbacks have been established by simultaneously introducing SV40T antigen gene and oncogene H-ras, and have been reported to proliferate over 90 passages and over 36 months (Sraer JD et al. al., Kidney Int. 49: 267-270, 1996). However, the immortalized human mesangial cell line has a double growth time of 62 hours and is slower than that of glomerular epithelial cells established by the same technique, and the expression of cell markers such as u-PA is the primary culture. The pattern was different from that of the cells, suggesting that the traits of differentiated plasma cells were not completely maintained.
また、温度感受性変異（H-2K-tsA58）を有するSV40tsT抗原遺伝子を導入したヒトメサンギウム細胞は、SV40tsT抗原の非許容温度条件下で分化型形質が誘導発現される一方で、許容温度条件下で約15〜18 継代により生育が停止することから、安定して長期継代させることができなかった。また、SV40tsT抗原とhTERT遺伝子を導入することにより上皮組織細胞の不死化を実現した報告（WO2001021790）がなされているが、本方法により結合組織細胞であるメサンギウム細胞の不死化が可能であるか否かは明らかでなかった。 In addition, human mesangial cells into which the SV40tsT antigen gene having a temperature-sensitive mutation (H-2K-tsA58) has been introduced are induced to express differentiated traits under the non-permissive temperature conditions of the SV40tsT antigen. Since growth stopped after about 15 to 18 passages, stable passage over a long period could not be achieved. In addition, it has been reported that the immortalization of epithelial tissue cells by introducing SV40tsT antigen and hTERT gene (WO2001021790). Whether this method can immortalize mesangial cells that are connective tissue cells. It was not clear.
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は長期間にわたって継代培養が可能で、かつ分化型形質細胞の形質を保持しているか又は誘導することができるヒト由来の不死化メサンギウム細胞株樹立のための技術を確立することである。 The present invention has been made in view of such a situation, and the object thereof is derived from a human that can be subcultured over a long period of time and can retain or induce the traits of differentiated plasma cells. To establish a technique for establishing an immortalized mesangial cell line.
本発明者らは、SV40T抗原遺伝子と構成的に発現するヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）遺伝子とを導入することにより安定的に増殖を維持するヒト由来のメサンギウム細胞株の樹立に成功した。 The present inventors have succeeded in establishing a human-derived mesangial cell line that stably maintains growth by introducing an SV40T antigen gene and a constitutively expressed human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene.
すなわち、本発明は、構成的もしくは制御可能なように発現するSV40T抗原遺伝子及び構成的に発現するhTERT遺伝子を含有することを特徴とする不死化ヒトメサンギウム細胞を提供する。好ましくは、SV40T抗原遺伝子の発現は制御可能であり、より好ましくは、SV40T抗原遺伝子の発現は温度シフトにより制御可能である。さらに好ましい態様においては、SV40T抗原遺伝子は温度感受性変異型遺伝子SV40T tsA58である。本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞の特に好ましいものは、寄託番号FERM BP-10478として寄託されている不死化ヒトメサンギウム細胞である。 That is, the present invention provides an immortalized human mesangial cell comprising an SV40T antigen gene that is constitutively or controllably expressed and a constitutively expressed hTERT gene. Preferably, the expression of the SV40T antigen gene can be controlled, and more preferably, the expression of the SV40T antigen gene can be controlled by a temperature shift. In a further preferred embodiment, the SV40T antigen gene is the temperature sensitive mutant gene SV40T tsA58. Particularly preferred among the immortalized human mesangial cells of the present invention is the immortalized human mesangial cell deposited under the deposit number FERM BP-10478.
本発明はまた、ヒト初代メサンギウム細胞にSV40T抗原遺伝子とhTERT遺伝子とを導入することからなる、不死化ヒトメサンギウム細胞の製造方法を提供する。 The present invention also provides a method for producing immortalized human mesangial cells, which comprises introducing SV40T antigen gene and hTERT gene into human primary mesangial cells.
別の観点においては、本発明は、上述の本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞をSV40抗原発現の非許容条件下で培養することにより得られる分化型ヒトメサンギウム細胞を提供する。好ましくは、分化型ヒトメサンギウム細胞は、αSMA又はCOL4を発現する。 In another aspect, the present invention provides differentiated human mesangial cells obtained by culturing the above-described immortalized human mesangial cells of the present invention under non-permissive conditions for SV40 antigen expression. Preferably, the differentiated human mesangial cells express αSMA or COL4.
本発明はまた、上述の本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞をSV40抗原発現の非許容条件下で培養することからなる、分化型ヒトメサンギウム細胞の製造方法を提供する。 The present invention also provides a method for producing differentiated human mesangial cells, comprising culturing the above-described immortalized human mesangial cells of the present invention under non-permissive conditions for SV40 antigen expression.
さらに別の観点においては、本発明は、被検物質がヒトメサンギウム細胞の機能を調節する能力を検定する方法を提供する。この方法は、被検物質の存在下で上述の本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞株又は分化型ヒトメサンギウム細胞を培養し、そして該細胞におけるマーカータンパク質の活性及び／又は発現及び／又は分泌の程度を測定する工程を含む。本発明の方法においては、好ましくは、不死化ヒトメサンギウム細胞株又は分化型ヒトメサンギウム細胞をヒトメサンギウム細胞の刺激物質の存在下及び／又は非存在下で培養する。好ましくは、ヒトメサンギウム細胞の刺激物質は、TGF-β、BMPファミリータンパク質、AGEs、LDL及び酸化型LDL（oxidized-LDL）からなる群より選択される物質である。また好ましくは、マーカータンパク質は、COL4、FN、PAI-1、αSMA、Id1及びCbfa1からなる群より選択される物質である。 In yet another aspect, the present invention provides a method for assaying the ability of a test substance to modulate the function of human mesangial cells. This method comprises culturing the above-described immortalized human mesangial cell line or differentiated human mesangial cell of the present invention in the presence of a test substance, and the degree of activity and / or expression and / or secretion of the marker protein in the cell. The step of measuring. In the method of the present invention, preferably, an immortalized human mesangial cell line or a differentiated human mesangial cell is cultured in the presence and / or absence of a human mesangial cell stimulating substance. Preferably, the stimulating substance for human mesangial cells is a substance selected from the group consisting of TGF-β, BMP family proteins, AGEs, LDL, and oxidized LDL (oxidized-LDL). Also preferably, the marker protein is a substance selected from the group consisting of COL4, FN, PAI-1, αSMA, Id1 and Cbfa1.
さらに別の観点においては、本発明は、上述の方法により得られる、ヒトメサンギウム細胞の機能調節物質を提供する。本発明はまた、この機能調節物質を有効成分として含有する、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、アルポート症候群、糸球体腎炎、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎の治療剤を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a substance that regulates the function of human mesangial cells obtained by the above-described method. The present invention also includes glomerulonephritis, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, Alport syndrome, glomerulonephritis, lupus nephritis, focal glomerulosclerosis, chronic glomerulonephritis containing this function-regulating substance as an active ingredient. The present invention provides a therapeutic agent for acute progressive nephritis, nephrotic syndrome, membranous nephropathy, crescent nephritis, mesangial proliferative nephritis, and membranous proliferative glomerulonephritis.
本発明は、ヒト初代メサンギウム細胞にSV40T抗原遺伝子と構成的に発現するhTERTを共に導入することにより得られる、安定的に増殖を維持するヒト由来の不死化メサンギウム細胞株に関する。本発明において、安定的に増殖を維持するヒト由来の不死化メサンギウム細胞株とは、初代メサンギウム細胞が試験管内で増殖できる期間以上に長期間にわたり継代培養が可能であり、かつ安定的に形質を保持する不死化ヒトメサンギウム細胞のことを意味する。即ち、長期間とは通常では試験管内で4〜8継代の継続培養しか実施できない市販のヒト初代メサンギウム細胞の増殖可能期間を超えるものを意味するが、20継代、好ましくは30継代、より好ましくは40継代、更に好ましくは50継代、特に好ましくは60 継代以上にわたり増殖を維持することのできる細胞株のことを意味する。更にはその細胞固有の形態・機能を継代培養によっても喪失することのない細胞を意味する。 The present invention relates to a human-derived immortalized mesangial cell line stably maintaining growth obtained by introducing SV40T antigen gene and hTERT constitutively expressed into primary human mesangial cells. In the present invention, a human-derived immortalized mesangial cell line that stably maintains proliferation is capable of being subcultured for a longer period of time than the period in which primary mesangial cells can be grown in vitro, and stably transformed. Means an immortalized human mesangial cell. That is, the term "long period" usually means a cell that exceeds the proliferative period of commercially available human primary mesangial cells that can only be continuously cultured for 4 to 8 passages in a test tube, but 20 passages, preferably 30 passages, More preferably, it means a cell line that can maintain growth over 40 passages, more preferably 50 passages, and particularly preferably 60 passages or more. Furthermore, it means a cell that does not lose its inherent morphology and function even by subculture.
SV40T抗原遺伝子としては、野生型のSV40T抗原遺伝子（SV40 TAg; Genbank NC＿001669）を用いることができる。SV40T抗原遺伝子は構成的に発現させてもよく、制御可能なように発現させてもよい。SV40T抗原遺伝子の発現が制御可能である場合、SV40T抗原遺伝子を発現させると不死化メサンギウム細胞は増殖し、発現を抑制すると増殖が抑制されて分化型形質を示す分化型細胞に形質転換を起こす。発現の制御は、温度などの培養条件の変化、発現誘導物質の添加、発現阻害物質の除去などにより行うことができる。当該技術分野においては、各種の誘導可能なプロモータや発現系が知られており、そのいずれも本発明において用いることができる。好ましくは発現の制御は培養温度を変化させることにより行う。本発明の１つの好ましい態様においては、SV40T抗原遺伝子として、温度変化によりその発現が変化する温度感受性の変異を有するSV40tsT抗原遺伝子を用いる。このような変異型SV40tsT抗原遺伝子を用いることにより、形質導入の結果得られた形質導入細胞株中で、該細胞株の培養温度を発現非許容温度である温度に変化させることにより、SV40T抗原遺伝子の発現を抑制することができる。SV40tsT抗原の発現の抑制により、形質導入細胞は増殖能力を失い、分化型形質を示す分化型細胞に形質転換を起こすことが可能となる。温度感受性の変異を有するSV40tsT抗原遺伝子としては、SV40T TsA58抗原遺伝子が特に好ましい。 As the SV40T antigen gene, a wild type SV40T antigen gene (SV40 TAg; Genbank NC — 001669) can be used. The SV40T antigen gene may be expressed constitutively or may be expressed in a controllable manner. When the expression of the SV40T antigen gene is controllable, the immortalized mesangial cells proliferate when the SV40T antigen gene is expressed, and when the expression is suppressed, the proliferation is suppressed and the differentiated cells exhibiting the differentiated trait are transformed. Expression can be controlled by changing culture conditions such as temperature, adding an expression inducer, removing an expression inhibitor, and the like. Various inducible promoters and expression systems are known in the art, and any of them can be used in the present invention. Preferably, the expression is controlled by changing the culture temperature. In one preferred embodiment of the present invention, an SV40tsT antigen gene having a temperature-sensitive mutation whose expression changes with temperature changes is used as the SV40T antigen gene. By using such a mutant SV40tsT antigen gene, in the transduced cell line obtained as a result of transduction, by changing the culture temperature of the cell line to a temperature that is an expression non-permissive temperature, the SV40T antigen gene Can be suppressed. By suppressing the expression of the SV40tsT antigen, the transduced cells lose their ability to proliferate and can transform into differentiated cells exhibiting differentiated traits. As the SV40tsT antigen gene having a temperature-sensitive mutation, the SV40T TsA58 antigen gene is particularly preferable.
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）としては、全長ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム１（hTERT; Genbank NM＿003219）を用いることができる。ほ乳類の体細
胞では染色体末端に存在するテロメアが細胞分裂ごとに短縮し、一定の分裂回数の後、増殖が停止する。テロメラーゼ逆転写酵素は、このテロメア長を維持する酵素であり、この遺伝子を導入することにより細胞分裂回数を延長して細胞を不死化できることが見いだされている（Counter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14723-14728: 1998）。SV40tsT抗原遺伝子に加えて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードする遺伝子（hTERT）を構成的に発現するように導入することにより、より長期にわたり増殖を維持することのできる不死化メサンギウム細胞を樹立することができる。本発明に基づき樹立した細胞の増殖速度は、形質導入の宿主に用いた元の細胞とほぼ同等で、45〜55時間の二倍増殖時間を有しており、継代によりその増殖速度が減少することがない。また、本発明の不死化メサンギウム細胞は、後に示すメサンギウム細胞マーカー若しくは分化型メサンギウム細胞マーカーである細胞マーカーの発現能を保持していることを特徴とする。係る細胞の一例としては寄託番号がFERM BP-10478で示される不死化メサンギウム細胞を挙げることができるが、本発明は該寄託細胞に限定されるものではなく、上記記載の特徴を有する細胞であればいかなるものでもよい。
As human telomerase reverse transcriptase (hTERT), full-length human telomerase reverse transcriptase isoform 1 (hTERT; Genbank NM — 003219) can be used. In mammalian somatic cells, telomeres present at the ends of chromosomes are shortened at each cell division, and proliferation stops after a certain number of divisions. Telomerase reverse transcriptase is an enzyme that maintains this telomere length, and it has been found that introduction of this gene can increase the number of cell divisions and immortalize cells (Counter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14723-14728: 1998). To establish immortalized mesangial cells that can maintain growth for a longer period of time by introducing a constitutive expression of a gene encoding human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in addition to the SV40tsT antigen gene Can do. The growth rate of the cells established according to the present invention is almost the same as the original cell used for the transduction host, and has a double growth time of 45 to 55 hours, and the growth rate decreases with passage. There is nothing to do. Moreover, the immortalized mesangial cell of the present invention is characterized in that it retains the ability to express a cell marker that is a mesangial cell marker or a differentiated mesangial cell marker described later. An example of such a cell is an immortalized mesangial cell having a deposit number of FERM BP-10478, but the present invention is not limited to the deposited cell, and any cell having the characteristics described above may be used. Anything is acceptable.
本発明の不死化メサンギウム細胞は、市販のヒト初代メサンギウム細胞にSV40T抗原遺伝子及びhTERT遺伝子を導入することにより製造することができる。これらの遺伝子の導入は、例えば、レンチウイルス（Invitrogen社ViraPowerレンチウイルス発現システム）、レトロウイルス（IMGENEX社RetroMaxレトロウイルス発現システム、タカラバイオ社Retrovirus Constructive System、Ambionm社pSilencer Retro System）、アデノウイルス（MicroBix社AdMaxシステム、Invitrogen社ViraPower アデノウイルス発現システム）などのウイルスシステムやHVJリポソームなどを用いて行うことができる。 The immortalized mesangial cell of the present invention can be produced by introducing the SV40T antigen gene and the hTERT gene into commercially available human primary mesangial cells. These genes can be introduced, for example, by lentivirus (Invitrogen ViraPower lentivirus expression system), retrovirus (IMGENEX RetroMax retrovirus expression system, Takara Bio Retrovirus Constructive System, Ambionm pSilencer Retro System), adenovirus (MicroBix AdMax system, Invitrogen ViraPower adenovirus expression system) and other HVJ liposomes.
本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞を所望の期間培養し、増殖せしめた後に、SV40抗原発現の非許容条件下で培養を継続することにより、分化型形質を示す細胞（本明細書において「分化型メサンギウム細胞」と称する）への形質転換を誘導することができる。例えば、下記の実施例においては、37℃で発現能を失うSV40tsT抗原を導入した不死化ヒトメサンギウム細胞を用いて、発現許容温度である32℃にて不死化ヒトメサンギウム細胞を増殖せしめた後に、培養温度を37℃に変更することにより、不死化細胞から分化型メサンギウム細胞に形質転換することを示している。 After the immortalized human mesangial cells of the present invention have been cultured for a desired period and expanded, culturing is continued under non-permissive conditions for SV40 antigen expression, whereby cells exhibiting a differentiated trait (referred to herein as “differentiated forms”). Transformation into mesangial cells)). For example, in the following examples, using immortalized human mesangial cells into which SV40tsT antigen that loses expression ability at 37 ° C. was introduced, the immortalized human mesangial cells were grown at an expression permissive temperature of 32 ° C. This shows that the immortalized cells are transformed into differentiated mesangial cells by changing the culture temperature to 37 ° C.
係る方法により得られる分化型メサンギウム細胞の形質は初代細胞の有する形質と本質的に同一であり、より具体的にいえばメサンギウム細胞マーカーとしてフィブロネクチン (FN)、IV型コラーゲン（COL4）等の発現を保持し、分化型細胞マーカーであるα平滑筋アクチン (αSMA)を発現する分化型形質を示す。更に、分化型メサンギウム細胞では、TGF-β等の刺激物質の作用により、PAI-1の分泌若しくは上記マーカータンパク質の発現が亢進される。 The traits of differentiated mesangial cells obtained by this method are essentially the same as those of primary cells. More specifically, fibronectin (FN), type IV collagen (COL4), etc. are expressed as mesangial cell markers. Fig. 2 shows a differentiated trait that retains and expresses α-smooth muscle actin (αSMA), a differentiated cell marker. Furthermore, in differentiated mesangial cells, secretion of PAI-1 or expression of the marker protein is enhanced by the action of stimulating substances such as TGF-β.
本発明の不死化メサンギウム細胞ならびに分化型メサンギウム細胞は、メサンギウム細胞の機能を調節する物質の能力の検定ならびにスクリーニングに有用である。すなわち本発明の別の観点においては、被検物質の存在下で上述の本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞株又は分化型ヒトメサンギウム細胞を培養し、そして該細胞におけるマーカータンパク質の活性及び／又は発現及び／又は分泌の程度を測定することにより、被検物質がヒトメサンギウム細胞の機能を調節する能力を検定する方法が提供される。得られた測定値を対照の測定値と比較することにより、被検物質がメサンギウム細胞の機能を調節する能力を評価することができる。本発明の方法は、多種多様な被検物質からメサンギウム細胞の機能調節物質をスクリーニングするのに有用である。 The immortalized mesangial cells and differentiated mesangial cells of the present invention are useful for assaying and screening for the ability of substances that modulate the function of mesangial cells. That is, in another aspect of the present invention, the above-described immortalized human mesangial cell line or differentiated human mesangial cell of the present invention is cultured in the presence of a test substance, and the activity and / or expression of the marker protein in the cell. And / or by measuring the degree of secretion, a method for assaying the ability of a test substance to modulate the function of human mesangial cells is provided. By comparing the obtained measured value with the measured value of the control, the ability of the test substance to regulate the function of mesangial cells can be evaluated. The method of the present invention is useful for screening mesangial cell function-regulating substances from a wide variety of test substances.
本発明の検定及びスクリーニング方法の１つの態様においては、不死化ヒトメサンギウム細胞株又は分化型ヒトメサンギウム細胞をヒトメサンギウム細胞の刺激物質の存在下で培養し、応答タンパク質又はマーカータンパク質の活性及び／又は発現及び／又は分泌の程度を測定する。刺激物質としてはTGF-β、BMP-2又はBMP-4等のBMPファミリータンパク質（Ghosh et al., J Biol Chem. 274(16): 10897-902, 1999）、AGEs (Advanced glycation end products)（Fukami et al., Kidney Int. 66(6): 2137-47, 2004）、LDL（Rovin et al., Kidney Int.43(1):218-25, 1993）、酸化型LDL（oxidized LDL）（Song et al., Kidney Int. 67(5): 1743-52, 2005）、結合組織成長因子 CTGF（Wahab et al., Exp Cell Res. 15;307(2): 305-14, 2005）、及びアンジオテンシンII（Wolf et al., Am J Pathol. 140(1): 95-107, 1992）等が挙げられる。刺激物質に応答してその発現やその性質が変化するか又はその細胞内動態が変化する応答タンパク質の活性や発現の程度の測定の一例としては、TGF-β I型受容体であるALK1又はALK5のリン酸化による活性化を介したSmad2、Smad3又はSmad1、Smad5を含むSmadファミリー転写因子のリン酸化（William et al., Am J Physiol Renal Physiol. 284: F243-F252, 2003、Wang and Hirschberg, Am J Physiol Renal Physiol. 284(5): F1006-13, 2003、Abe et al., J Biol Chem. 279(14):14201-6, 2004）や該Smadファミリータンパク質の核内移行等が挙げられる。刺激物質に応答してその発現やその性質が変化するマーカータンパク質の一例としてはCOL4（Poncelet et al., Kidney Int. 56(3):1354-1365, 1999、Abe et al., J Biol Chem. 279(14): 14201-6, 2004）、Id1（Simonson et al., Nucleic Acids Res. 21(24):5767-74, 1993）、FN（Laping et al., Mol Pharmacol. 62(1):58-64,2002）、PAI-1（Lacave et al., Kidney Int. 35(3):806-11, 1989、Datta et al., J Biol Chem.275(51): 40014-40019, 2000）、Cbfa1／OSF2／RUNX2（Lee et al., Mol Cell Biol. 20(23):8783-92, 2000）等が挙げられ、実際にCOL4、Id1、FN、PAI-1はメサンギウム細胞においてTGF-βあるいはBMPファミリータンパク質やAGE刺激により誘導されることが報告されている。TGF-βのメサンギウム細胞に対する作用はマウス由来のメサンギウム細胞を用いて調べられ、メサンギウム細胞における細胞外マトリックス遺伝子発現の調節物質として作用することが示唆されている。また、TGF-βによりFNの発現が時間依存的に2倍亢進すると共にFNのグリコシル化を促進することを通してFNの分解を阻害していることが示唆された。更にTGF-βは初期においてはメサンギウム細胞の代謝活性と生存を促進するものの、最終的には細胞死に至らせることが示された（Jiang Y et al., Mol Cell Biochem. 278(1-2), 165-75, 2005）。こうしたことから、TGF-βがメサンギウム細胞における細胞外マトリックスの発現、タンパク質のグリコシル化及び細胞死に対して重要な役割を果たしていることが示唆されている。上記記載から示唆されるメサンギウム細胞における調節分子の役割から類推して、TGF-β、BMPファミリータンパク質、AGEs、LDL又は酸化型LDLなどの調節因子の存在下、被検物質をメサンギウム細胞に作用させた上で、その受容体であるALK1のリン酸化などの分子動態を観察することによって、メサンギウム細胞の機能を調節する物質を検定し探索することが可能となると考えられる。更に別の態様として、TGF-β、BMPファミリータンパク質、AGEs、LDL又は酸化型LDLなどの調節因子の存在下、被検物質をメサンギウム細胞に作用させた上で、該調節因子によりその発現が影響を受けるCOL4、FN、PAI-1、αSMA、Id1又はCbfa1などのマーカータンパク質を監視することによってメサンギウム細胞の機能を調節する物質を検定し探索することが可能となると考えられる。 In one embodiment of the assay and screening method of the present invention, an immortalized human mesangial cell line or differentiated human mesangial cell is cultured in the presence of a stimulator of human mesangial cells, and the activity of the response protein or marker protein and / or The degree of expression and / or secretion is measured. BMP family proteins such as TGF-β, BMP-2 or BMP-4 (Ghosh et al., J Biol Chem. 274 (16): 10897-902, 1999), AGEs (Advanced glycation end products) ( Fukami et al., Kidney Int. 66 (6): 2137-47, 2004), LDL (Rovin et al., Kidney Int. 43 (1): 218-25, 1993), oxidized LDL (oxidized LDL) ( Song et al., Kidney Int. 67 (5): 1743-52, 2005), connective tissue growth factor CTGF (Wahab et al., Exp Cell Res. 15; 307 (2): 305-14, 2005), and Angiotensin II (Wolf et al., Am J Pathol. 140 (1): 95-107, 1992). One example of measuring the activity or degree of expression of a response protein that changes its expression or its properties or changes its intracellular dynamics in response to a stimulant is the TGF-β type I receptor ALK1 or ALK5 Phosphorylation of Smad family transcription factors including Smad2, Smad3 or Smad1, Smad5 through activation by phosphorylation (William et al., Am J Physiol Renal Physiol. 284: F243-F252, 2003, Wang and Hirschberg, Am J Physiol Renal Physiol. 284 (5): F1006-13, 2003, Abe et al., J Biol Chem. 279 (14): 14201-6, 2004) and nuclear translocation of the Smad family protein. An example of a marker protein whose expression and properties change in response to a stimulating substance is COL4 (Poncelet et al., Kidney Int. 56 (3): 1354-1365, 1999, Abe et al., J Biol Chem. 279 (14): 14201-6, 2004), Id1 (Simonson et al., Nucleic Acids Res. 21 (24): 5767-74, 1993), FN (Laping et al., Mol Pharmacol. 62 (1): 58-64, 2002), PAI-1 (Lacave et al., Kidney Int. 35 (3): 806-11, 1989, Datta et al., J Biol Chem. 275 (51): 40014-40019, 2000) Cbfa1 / OSF2 / RUNX2 (Lee et al., Mol Cell Biol. 20 (23): 8783-92, 2000) and the like, and COL4, Id1, FN, and PAI-1 are actually TGF-β in mesangial cells. Alternatively, it has been reported that it is induced by BMP family proteins or AGE stimulation. The effect of TGF-β on mesangial cells has been investigated using mouse-derived mesangial cells, and has been suggested to act as a regulator of extracellular matrix gene expression in mesangial cells. It was also suggested that TGF-β increased FN expression in a time-dependent manner by a factor of 2 and inhibited FN degradation by promoting glycosylation of FN. Furthermore, TGF-β was initially shown to promote metabolic activity and survival of mesangial cells, but eventually lead to cell death (Jiang Y et al., Mol Cell Biochem. 278 (1-2) , 165-75, 2005). These results suggest that TGF-β plays an important role in extracellular matrix expression, protein glycosylation and cell death in mesangial cells. By analogy with the role of regulatory molecules in mesangial cells suggested from the above description, test substances are allowed to act on mesangial cells in the presence of regulatory factors such as TGF-β, BMP family proteins, AGEs, LDL, or oxidized LDL. In addition, by observing molecular dynamics such as phosphorylation of the receptor ALK1, it will be possible to test and search for substances that regulate the function of mesangial cells. In yet another embodiment, the expression of a test substance is affected by the test substance acting on mesangial cells in the presence of a regulator such as TGF-β, BMP family protein, AGEs, LDL, or oxidized LDL. By monitoring marker proteins such as COL4, FN, PAI-1, αSMA, Id1 or Cbfa1 that are received, it will be possible to test and search for substances that modulate the function of mesangial cells.
こうした応答タンパク質、又はマーカータンパク質の活性及び／もしくは発現、又は各種生理活性物質生産性、分泌量、及び／もしくは分解量の程度は、RT-PCR法、ウエスタンブロット法、EIS (Enzyme Immune Assay)法、ELISA (Enzyme-linked immunesorbent assay)法、RIA (Radioimunoassay)法、時間分解蛍光法（TR-FRET法（LANCE法、PerkinElmer Japan)）等、各種の測定技術を単独で、又は組み合わせて用いることにより測定することが可能である。 RT-PCR method, Western blot method, EIS (Enzyme Immune Assay) method is used to determine the activity and / or expression of such response protein or marker protein, or productivity of various physiologically active substances, secretion amount, and / or degradation amount. , ELISA (Enzyme-linked immune sorbent assay), RIA (Radioimunoassay) method, time-resolved fluorescence method (TR-FRET method (LANCE method, PerkinElmer Japan)), etc. It is possible to measure.
下記の実施例では、ウエスタンブロット法、ELISA法、時間分解蛍光法を用いて上記記載のスクリーニングを実施し、本発明に係る不死化ヒトメサンギウム細胞を用いた、メサンギウム細胞機能調節物質のスクリーニング方法が具体的に開示されるが、本発明はこうした具体的態様にとどまるものでなく、上記記載の所望の測定技術を単独で又は組み合わせて用いることができる。 In the following examples, there is a screening method for a mesangial cell function-regulating substance using the immortalized human mesangial cells according to the present invention, wherein the screening described above is performed using Western blotting, ELISA, and time-resolved fluorescence. Although specifically disclosed, the present invention is not limited to such specific embodiments, and the desired measurement techniques described above can be used alone or in combination.
メサンギウム細胞の機能調節物質には、メサンギウム細胞の表現型を変化せしめる能力を有する任意分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、核酸、又は低分子化合物を含む多様なクラスの化学物質が含まれる。イン・ビボで薬剤として機能する機能調節物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基、典型的な例ではアミン、カルボニル、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を少なくとも1個含み、好ましくは少なくとも2個の官能化学基を含むことができる。候補薬剤は前記官能基のうちの1個又は複数で置換された環式炭素構造もしくは複素環式構造及び／ 又は芳香族構造もしくは多環芳香族構造を、しばしば含む。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログ、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。 Mesangial cell function modulators include various classes of chemicals including any molecule that has the ability to alter the mesangial cell phenotype, such as proteins, polypeptides, nucleic acids, or small molecule compounds. A functional modulator that functions as a drug in vivo contains at least one functional group, typically an amine, carbonyl, hydroxyl, or carboxyl group, required for structural interactions with proteins, particularly hydrogen bonds, Preferably it can contain at least two functional chemical groups. Candidate agents often comprise cyclical carbon or heterocyclic structures and / or aromatic or polycyclic aromatic structures substituted with one or more of the above functional groups. Candidate agents are also found among biomolecules including peptides, sugars, fatty acids, steroids, purines, pyrimidines, derivatives thereof, structural analogs, or combinations.
候補薬剤は、極めて多様な合成又は天然の化合物ライブラリーから得ることができる。例えば、ランダムオリゴヌクレオチド及びランダムオリゴペプチドの発現を含む、多様な有機化合物及び生体分子のランダムな合成／又は特異的合成を目的として様々な手法を用いることができる。更には、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物を含む天然化合物のライブラリーが容易に作成されると共に、商業的にも供給されうる。更には、合成的に作成された、又は天然のライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理学的、及び生化学的な手法により修飾され、コンビナトリアル・ライブラリーの作成に使用することができる。構造アナログを作製するため、既知の薬理学的薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の特異的又はランダムな化学修飾を施すことが可能である。 Candidate agents can be obtained from a wide variety of synthetic or natural compound libraries. For example, various techniques can be used for the purpose of random synthesis / specific synthesis of various organic compounds and biomolecules, including expression of random oligonucleotides and random oligopeptides. In addition, libraries of natural compounds including bacterial, fungal, plant, and animal extracts can be easily created and supplied commercially. Furthermore, synthetically generated or natural libraries and compounds can be modified by conventional chemical, physical, and biochemical techniques and used to create combinatorial libraries. . Specific or random chemical modifications such as acylation, alkylation, esterification, amidation, etc. can be applied to known pharmacological agents to make structural analogs.
本発明はまた、上述の本発明のスクリーニングにより見いだされたヒトメサンギウム細胞の機能調節物質を提供する。メサンギウム細胞の機能としては、腎糸球体のろ過機能の調節、各種生理活性物質の産生、さらには糸球体腎炎発症時にみられる細胞外基質（マトリックス）産生亢進が挙げられる。IgA腎症、糖尿病性腎症、アルポート症候群などの腎疾患では糸球体メサンギウム細胞による異常マトリックスリモデリング現象が観察され、最終的には糸球体硬化に至る事が知られている。したがって、ヒトメサンギウム細胞の機能調節物質は、ヒトメサンギウム細胞が関与する腎疾患の治療剤として有用であると考えられる。例えば、メサンギウム細胞の機能調節物質の例としては、SB-505124 （Byfield et al., Mol. Pharmacol. 65: 744-752, 2004）、TGF-β RIキナーゼ阻害剤I及びII（Calbiochem社, San Diego, CA）、GSK-1（WO2004065392）、SD-208（Uhl et al., Cancer Res. 64: 7954-7961, 2004）等の低分子化合物が挙げられる。これらの化合物はTGF-β受容体キナーゼ活性を阻害して、メサンギウム細胞でのマトリックス産生を抑制することが知られている。また、losartanなどのアンジオテンシン受容体ブロッカーはメサンギウム細胞でのTGF-β産生を抑制することが知られている（Perlman et al., Ann Clin Lab Sci. 34(3): 277-86, 2004）。
すなわち、本発明のスクリーニング方法により見いだされたメサンギウム細胞の機能調節物質は、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、アルポート症候群、糸球体腎炎、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎等の腎疾患の治療剤として使用することができる。
The present invention also provides a human mesangial cell function regulator found by the above-described screening of the present invention. The function of mesangial cells includes regulation of the filtration function of the glomeruli, production of various physiologically active substances, and enhancement of extracellular matrix (matrix) production observed at the onset of glomerulonephritis. In renal diseases such as IgA nephropathy, diabetic nephropathy, and Alport syndrome, abnormal matrix remodeling phenomenon due to glomerular mesangial cells is observed, and it is known that it eventually leads to glomerulosclerosis. Therefore, it is considered that a substance that regulates the function of human mesangial cells is useful as a therapeutic agent for renal diseases involving human mesangial cells. For example, SB-505124 (Byfield et al., Mol. Pharmacol. 65: 744-752, 2004), TGF-β RI kinase inhibitors I and II (Calbiochem, San Francisco) Diego, CA), low molecular weight compounds such as GSK-1 (WO2004065392), SD-208 (Uhl et al., Cancer Res. 64: 7954-7961, 2004). These compounds are known to inhibit TGF-β receptor kinase activity and suppress matrix production in mesangial cells. Angiotensin receptor blockers such as losartan are known to suppress TGF-β production in mesangial cells (Perlman et al., Ann Clin Lab Sci. 34 (3): 277-86, 2004).
That is, mesangial cell function-regulating substances found by the screening method of the present invention are glomerulonephritis, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, Alport syndrome, glomerulonephritis, lupus nephritis, focal glomerulosclerosis, chronic It can be used as a therapeutic agent for renal diseases such as glomerulonephritis, acute progressive nephritis, nephrotic syndrome, membranous nephropathy, crescent nephritis, mesangial proliferative nephritis, and membranous proliferative glomerulonephritis.
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
ヒトメサンギウム細胞の培養
初代ヒトメサンギウム細胞（MC）はCambrex社（Walkersville, MD）より入手した。該細胞は18歳の男性より調製されたもので、37℃にて95％空気と5％の二酸化炭素ガスの環境下、MsGM増殖培地（Cambrex）中で培養した。
Culture of human mesangial cells Primary human mesangial cells (MC) were obtained from Cambrex (Walkersville, MD). The cells were prepared from an 18 year old male and were cultured in MsGM growth medium (Cambrex) at 37 ° C. in an environment of 95% air and 5% carbon dioxide gas.
組換えレンチウイルスの調製
293FT細胞はInvitrogen社（Carlsbad, CA）より入手し、10%のウシ胎児血清（HyClone社, Logan, UT以下、FBS）、1%の非必須アミノ酸溶液及び1%のペニシリンとストレプトマイシン溶液（100 U/ml and 100 μg/mL）を加えたダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium、以下DMEM）にて培養した。細胞培養の全製品は特に記載がなければGibco-Invitrogen社（Grand Island, NY）より入手した。
Preparation of recombinant lentivirus
293FT cells were obtained from Invitrogen (Carlsbad, Calif.), 10% fetal bovine serum (HyClone, Logan, UT, hereinafter FBS), 1% non-essential amino acid solution and 1% penicillin and streptomycin solution (100 U / ml and 100 μg / mL) was added to Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter DMEM). All cell culture products were obtained from Gibco-Invitrogen (Grand Island, NY) unless otherwise specified.
組換えレンチウイルスはViraPower Lentiviral Expression System（Invitrogen社, Carlsbad, CA）を製造者の使用説明書に従って用いて調製した。全長のSV40T抗原（SV40 TAg; Genbank NC＿001669, SEQ ID NO:1, 塩基番号の2691-5163番）を、293FT細胞のゲノムDNAから、センスプライマーとして5'-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATC（SEQ ID NO:2）を、アンチセンスプライマーとして5'-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG（SEQ ID NO:3）を用いてPCRにより増幅し、pLenti6/V5-D TOPOベクターへ挿入し、pLenti6-TAgを得た。コザックモチーフを使用説明書に従い設計した。次にtsA58点変異を、PCR突然変異法を用いて挿入した。最初にpLenti6-TAgから5'-AAGCGGGTTGATAGCCTACA（センスＡ；SEQ ID NO:4）と5'- ATTCAAGCAAAACAGCTGCTAATG（アンチセンスＡ；SEQ ID NO:5）とのプライマーの組み合わせにより、そして5'-CATTAGCAGCTGTTTTGCTTGAAT（センスＢ；SEQ ID NO:6）と5'-TTACAAATCTGGCCTGCAGT（アンチセンスＢ；SEQ ID NO:7）とのプライマーの組み合わせにより二つの断片を増幅した。次に該二断片をアニールし、センスＡプライマーとアンチセンスＢプライマーを用いて再増幅した。得られた点変異が導入された断片をHpaIとPstIにより消化し、pLenti6-TAgの同一サイトに再構成して、温度感受性のTAgプラスミド（pLenti6-tsTAg）を得た。 Recombinant lentivirus was prepared using ViraPower Lentiviral Expression System (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's instructions. The full-length SV40T antigen (SV40 TAg; Genbank NC — 001669, SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 2691-5163), 5′-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATC (SEQ ID NO: 2) as a sense primer from the genomic DNA of 293FT cells, Amplification was performed by PCR using 5′-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG (SEQ ID NO: 3) as an antisense primer, and inserted into the pLenti6 / V5-D TOPO vector to obtain pLenti6-TAg. A Kozak motif was designed according to the instructions for use. The tsA58 point mutation was then inserted using PCR mutagenesis. First from pLenti6-TAg to a primer combination of 5'-AAGCGGGTTGATAGCCTACA (sense A; SEQ ID NO: 4) and 5'-ATTCAAGCAAA A CAGCTGCTAATG (antisense A; SEQ ID NO: 5) and 5'-CATTAGCAGCTG Two fragments were amplified by a primer combination of T TTTGCTTGAAT (sense B; SEQ ID NO: 6) and 5′-TTACAAATCTGGCCTGCAGT (antisense B; SEQ ID NO: 7). The two fragments were then annealed and reamplified using a sense A primer and an antisense B primer. The obtained fragment into which the point mutation was introduced was digested with HpaI and PstI and reconstituted at the same site of pLenti6-TAg to obtain a temperature-sensitive TAg plasmid (pLenti6-tsTAg).
全長ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム１（hTERT; Genbank NM＿003219；SEQ ID NO:8）を、結腸癌細胞株の全RNAよりPCRにより増幅した。第一鎖DNAをhTERTの3'非コードプライマーである5'-TGACAGGGCTGCTGGTGTCTG（SEQ ID NO:9）とReverTra Ace逆転写システム（TOYOBO社, Osaka）を用いて合成した。hTERTのアミノ末端側の半分のcDNA（NM＿003219の1-2304番目）を 5'-CACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGA（センスプライマー；SEQ ID NO:10）と5'-GCCTTCTGGACCACGGCATACCGA（アンチセンスプライマー；SEQ ID NO:11）とを用いて、カルボキシル末端側の半分のcDNA（NM＿003219の1977-3399番目）を 5'-CACCGGCACTGTTCAGCGTGCTCAACTACGAG（センスプライマー；SEQ ID NO:12） と5'-TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC （アンチセンスプライマー；SEQ ID NO:13）とを用いて、それぞれ増幅した。各cDNAをpLenti6/V5-D TOPOベクターにライゲートした。コザック配列を使用説明書に従い導入した。 次に、ベクター中のSpeIとアミノ末端側の半分由来のEcoRVサイト間の断片をカルボキシル末端側の半分由来の同じサイト中に再クローニングして全長hTERTプラスミドを得た（pLenti6-hTERT）。pLenti6-tsTAgとpLenti6-hTERTのDNA配列は全て確認をした。 Full-length human telomerase reverse transcriptase isoform 1 (hTERT; Genbank NM — 003219; SEQ ID NO: 8) was amplified by PCR from total RNA of a colon cancer cell line. First strand DNA was synthesized using 5′-TGACAGGGCTGCTGGTGTCTG (SEQ ID NO: 9), which is a 3 ′ non-coding primer of hTERT, and a ReverTra Ace reverse transcription system (TOYOBO, Osaka). HTERT half cDNA (1-2304 of NM_003219) 5'-CACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGA (sense primer; SEQ ID NO: 10) and 5'-GCCTTCTGGACCACGGCATACCGA (antisense primer; SEQ ID NO: 11) Using carboxy-terminal half cDNA (NM_003219, 1977-3399) 5'-CACCGGCACTGTTCAGCGTGCTCAACTACGAG (sense primer; SEQ ID NO: 12) and 5'-TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC (antisense primer; SEQ ID NO: 13) Was amplified respectively. Each cDNA was ligated into the pLenti6 / V5-D TOPO vector. The Kozak sequence was introduced according to the instructions for use. Next, a fragment between SpeI in the vector and the EcoRV site derived from the amino-terminal half was recloned into the same site derived from the carboxyl-terminal half to obtain a full-length hTERT plasmid (pLenti6-hTERT). All DNA sequences of pLenti6-tsTAg and pLenti6-hTERT were confirmed.
次にpLenti6-tsTAg又は pLenti6-hTERTを、ほぼコンフレントな293FT細胞にヘルパープラスミド（pLP1、pLP2そしてpLP/VSVG）と共にトランスフェクトし、それぞれtsTAg（LtV-tsTAg）又はhTERT（LtV-hTERT）をコードするレンチウイルスを生成した。37℃において二日間のインキュベーションの後、レンチウイルスを生成する293FT細胞の馴化培地を回収し、4℃にて15分間3000rpmにて遠心分画した。上清を試験管に分画して使用するまで-80°Cにて保存した。各レンチウイルスの希釈試料をHT1080繊維芽細胞に感染させて、ブラストシジン（10 μg/mL）耐性コロニー数を計測することにより、各ウイルスの収量（TU:形質導入単位/mL）を決定した。LtV-tsTAg及び LtV-hTERTに対する収量は3 x 105 及び5 x 104 TUであった。組換えウイルスの作成までの手順を図１に記載する。 PLenti6-tsTAg or pLenti6-hTERT is then transfected into nearly confluent 293FT cells with helper plasmids (pLP1, pLP2, and pLP / VSVG), encoding tsTAg (LtV-tsTAg) or hTERT (LtV-hTERT), respectively. Lentivirus was generated. After two days of incubation at 37 ° C., the conditioned medium of 293FT cells producing lentivirus was collected and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was fractionated into test tubes and stored at −80 ° C. until use. Diluted samples of each lentivirus were infected with HT1080 fibroblasts, and the number of colonies resistant to blasticidin (10 μg / mL) was counted to determine the yield of each virus (TU: transduction unit / mL). Yields for LtV-tsTAg and LtV-hTERT were 3 × 10 5 and 5 × 10 4 TU. The procedure up to the production of the recombinant virus is described in FIG.
ヒトメサンギウム細胞の不死化
不死化のために0.5-1.0 x 105個の初代ヒトメサンギウム細胞を6穴プレートにて終夜培養し、第2継代の段階で3 x 104 TUのLtV-tsTAgとなるよう調節した6 μg/mlのポリブレン(Sigma社, St Louis, MO) を含む1 mLウイルス上清に感染させた。培養液に32℃にて2 μg/mLのブラストシジンを添加することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。次に限界希釈クローン化を行い、単クローン細胞株を得た。最終的に167クローンを拾い、拡大培養した28クローンを9継代目にて保存した。全てのtsTAg感染細胞は19継代目以内に細胞危機（細胞死）を引き起こした。これらのクローンの内、#4, #130 及び #142を6穴プレート中、11から13継代時にLtV-hTERT（1 x 104 TU）を用いて更に感染させ、限界希釈クローニングを再び行った。その後、69クローンを拾い、拡大培養した30クローンを保存した。これらの細胞株は、5%のFBS、2 mMのグルタミン、1%のペニシリン、ストレプトマイシン及び2 μg/mLブラストシジンを添加したMCDB-131培地中、32℃、95％空気と5%二酸化炭素中で維持した。
Immortalization of human mesangial cells 0.5-1.0 x 10 5 primary human mesangial cells were cultured overnight in a 6-well plate for immortalization, and at the second passage, 3 x 10 4 TU of LtV-tsTAg A 1 mL virus supernatant containing 6 μg / ml polybrene (Sigma, St Louis, MO) was prepared. Stablely transfected cells were selected by adding 2 μg / mL blasticidin to the culture at 32 ° C. Next, limiting dilution cloning was performed to obtain a monoclonal cell line. Finally, 167 clones were picked up, and 28 expanded clones were stored at the 9th passage. All tsTAg-infected cells caused a cell crisis (cell death) within the 19th passage. Of these clones, # 4, # 130 and # 142 were further infected with LtV-hTERT (1 x 10 4 TU) in 6-well plates at passage 11 to 13, and limiting dilution cloning was performed again. . Thereafter, 69 clones were picked and 30 expanded clones were stored. These cell lines were grown in MCDB-131 medium supplemented with 5% FBS, 2 mM glutamine, 1% penicillin, streptomycin and 2 μg / mL blasticidin at 32 ° C., 95% air and 5% carbon dioxide. Maintained at.
不死化ヒトメサンギウム細胞の選択
実施例３で得られたクローンから、(a) tsTAg発現の32℃から37℃への温度シフトにおける制御、(b) 32℃及び37℃におけるマーカータンパク質の発現、及び(c) TGF-βに応答して培養液中でのPAI-1又はCOL4の発現を指標として不死化ヒトメサンギウム細胞を選択した。以下に、その実験方法と結果を示す。
Selection of immortalized human mesangial cells From the clone obtained in Example 3, (a) control in the temperature shift of tsTAg expression from 32 ° C to 37 ° C, (b) expression of the marker protein at 32 ° C and 37 ° C, and (c) Immortalized human mesangial cells were selected using the expression of PAI-1 or COL4 in the culture medium in response to TGF-β as an index. The experimental method and results are shown below.
（１）TGF-βに対する応答とマーカータンパク質のウエスタンブロッティングによる検出
不死化したメサンギウム細胞は32℃にて培養し、次に37℃にて6日間培養して、分化誘導した。刺激試験では、該細胞を0.5% FBSを含有する培地で血清飢餓下、24時間後に32℃又は37℃にて各実施例で示す量のTGF-β（R&D Systems社, Minneapolis, MN）を加え、培養した。メサンギウム細胞を1 mMのフェニルメタンスルフォニル・フルオライド（Cell Signaling社, Beverly, MA、以下PMSF）を含む1倍濃度の溶解バッファー（Cell Signaling社, Beverly, MA）にて氷上溶解し、全タンパク質を抽出した。培養皿より溶解物を剥離し、超音波破砕機を用いて（アウトプット１、TOMY社, Tokyo）5秒間超音波処理した。超音波処理物を4℃にて15000rpmで10分間遠心処理を施して、上清中のタンパク質含量をブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bio-Rad社, Hercules, CA, USA）を用いて測定した。2-メルカプトエタノールを含有するLDSサンプルバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）（以下、LDS-2ME）中でタンパク質還元処理後、標品は使用するまで-80°Cにて保存した。細胞培養培地も同バッファーを加え-80°Cにて保存した。
(1) Response to TGF-β and detection of marker protein by Western blotting Immortalized mesangial cells were cultured at 32 ° C and then cultured at 37 ° C for 6 days to induce differentiation. In the stimulation test, the cells were added with TGF-β (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) In the amount shown in each example at 32 ° C. or 37 ° C. after 24 hours of serum starvation in a medium containing 0.5% FBS. And cultured. Mesangial cells are lysed on ice with 1x lysis buffer (Cell Signaling, Beverly, MA) containing 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (Cell Signaling, Beverly, MA; PMSF) to extract total protein. did. The lysate was peeled off from the culture dish and sonicated for 5 seconds using an ultrasonic crusher (Output 1, TOMY, Tokyo). The sonicated product was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the protein content in the supernatant was measured using the Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). After protein reduction treatment in LDS sample buffer (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) (Hereinafter referred to as LDS-2ME) containing 2-mercaptoethanol, the sample was stored at −80 ° C. until use. The cell culture medium was also added at the same buffer and stored at -80 ° C.
電気泳動前に標品を70℃にて10分間インキュベートした。次に、同量の全タンパク量を含む細胞溶解液又は同量の培養液を4-12% NuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen社, Carlsbad, CA）にロードして、NuPAGE MOPS-SDS running buffer（Invitrogen社, Carlsbad, CA）を用いて電気泳動をした。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド（以下、PVDF）膜（Immobilon-P; Millipore社, Bedford, MA）に転写した後に、0.1％トゥイーン20を含有するトリス緩衝生理食塩水（以下、TBS-T）中、5％無脂肪ドライミルクにて冷室にて終夜ブロッキングした。次に該調製膜を抗PAI-1一次抗体（1:1000希釈、マウスモノクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）、抗COL4一次抗体（1:5000希釈、ウサギポリクローナル、abcam社, Cambridge, UK）、抗FN一次抗体（1:3000希釈、マウスモノクローナル、Sigma社, St. Louis, MO）、抗SV40 TAg 一次抗体（1:2000希釈、ウサギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）、hTERT（1:1000希釈、ヤギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）又は抗β−アクチン一次抗体（1:3000希釈、ヤギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）と室温にて1時間、TBS-T中でインキュベートした。膜をTBS-Tにて3回洗浄し、更にワサビペルオキシダーゼ（以下、HRP-）をコンジュゲートした、抗マウス二次抗体、抗ウサギ二次抗体（1:10000希釈、Amersham Bioscience社, Little Chalfont Buckinghamshire, UK）又は抗ヤギ二次抗体（1:10000希釈、Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA）の何れかとともにTBS-T中で室温にて1時間インキュベートした。次に膜を洗浄して、高感度化学発光ECLプラスシステム（Amersham Bioscience社, Little Chalfont Buckinghamshire, UK）とLumiImager（Roche Diagnostics社, Penzberg, Germany）を用いて可視化した。 Samples were incubated at 70 ° C. for 10 minutes before electrophoresis. Next, a cell lysate containing the same amount of total protein or the same amount of culture solution was loaded onto a 4-12% NuPAGE Bis-Tris gel (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And the NuPAGE MOPS-SDS running buffer ( Invitrogen, Carlsbad, CA). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA), and then tris-buffered saline containing 0.1% Tween 20 (TBS). -T), 5% non-fat dry milk was blocked in a cold room overnight. Next, the prepared membrane was treated with anti-PAI-1 primary antibody (1: 1000 dilution, mouse monoclonal, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), anti-COL4 primary antibody (1: 5000 dilution, rabbit polyclonal, abcam, Cambridge, UK). ), Anti-FN primary antibody (1: 3000 dilution, mouse monoclonal, Sigma, St. Louis, MO), anti-SV40 TAg primary antibody (1: 2000 dilution, rabbit polyclonal, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), hTERT (1: 1000 dilution, goat polyclonal, Santa Cruz, Santa Cruz, CA) or anti-β-actin primary antibody (1: 3000 dilution, goat polyclonal, Santa Cruz, Santa Cruz, CA) for 1 hour at room temperature, Incubated in TBS-T. The membrane was washed 3 times with TBS-T, and further conjugated with horseradish peroxidase (HRP-), anti-mouse secondary antibody, anti-rabbit secondary antibody (1: 10000 dilution, Amersham Bioscience, Little Chalfont Buckinghamshire) , UK) or anti-goat secondary antibody (1: 10000 dilution, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) for 1 hour at room temperature in TBS-T. The membrane was then washed and visualized using a highly sensitive chemiluminescent ECL plus system (Amersham Bioscience, Little Chalfont Buckinghamshire, UK) and LumiImager (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany).
図２は、野生型株（wt）、SV40tsT単形質導入株（#130）、SV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT及び#4hT）の４クローンについて、温度シフトがtsT抗原及びhTERTの発現に及ぼす影響を示す。図中、#130で示すtsTのみを導入した細胞株においては、32℃から37℃に温度シフトを行うことによって、tsTの発現量が抑制された。このことから、温度感受性変異型tsTを用いて培養液の温度を非許容温度である37℃にシフトさせることにより、ヒトメサンギウム細胞においてT抗原の発現を調節することが可能であることが確認された。また、#130hT株においては#130株では観察されなかったhTERTの発現が認められ、hTERTの発現は同様に二段階の形質導入により取得された#4hT株でも認められた。 FIG. 2 shows that for 4 clones of wild-type strain (wt), SV40tsT single transduced strain (# 130), SV40tsT and hTERT double transduced strains (# 130hT and # 4hT), the temperature shift is tsT antigen and hTERT. The effect on expression is shown. In the figure, in the cell line into which only tsT indicated by # 130 was introduced, the expression level of tsT was suppressed by performing a temperature shift from 32 ° C. to 37 ° C. This confirms that it is possible to regulate the expression of T antigen in human mesangial cells by shifting the temperature of the culture solution to a non-permissive temperature of 37 ° C. using temperature-sensitive mutant tsT. It was. In addition, expression of hTERT that was not observed in # 130 strain was observed in # 130hT strain, and expression of hTERT was also observed in # 4hT strain obtained by two-step transduction.
図３は、４種類のSV40tsT及びhTERTの二重形質導入株について、培養温度シフトがtsT抗原及びメサンギウム細胞マーカー（COL4、FN及びPAI-1）の発現に及ぼす影響を示す。37℃に温度シフトさせることにより、tsT抗原の発現が抑制されるのに対し、メサンギウム細胞マーカーであるCOL4、FN、PAI-1などが誘導発現されることが示された。すなわち、非許容温度に温度シフトしてT抗原の発現を抑制することにより、tsT抗原及びhTERTの二重形質導入株を、より分化型の形質を示すメサンギウム細胞に形質転換させることが可能であった。 FIG. 3 shows the effect of culture temperature shift on the expression of tsT antigen and mesangial cell markers (COL4, FN and PAI-1) for four types of SV40 tsT and hTERT double transduced strains. By shifting the temperature to 37 ° C., the expression of tsT antigen was suppressed, whereas mesangial cell markers such as COL4, FN, and PAI-1 were induced and expressed. That is, it is possible to transform a tsT antigen and hTERT double transduced strain into a mesangial cell exhibiting a more differentiated trait by shifting the temperature to a non-permissive temperature and suppressing the expression of T antigen. It was.
（２）マーカータンパク質の免疫染色
上述のウエスタンブロッティングの結果を、更に別の試験法である免疫染色により確認した。メサンギウム細胞株、HuVEC細胞及びHepG2細胞を96穴又は24穴細胞培養プレートで培養して、免疫蛍光染色により調べた。不死化メサンギウム細胞株は32℃にて培養し、37℃で6日間培養することにより分化誘導した。HepG2細胞とHuVECはAmerican Type Culture Collection (ATCC)から得て、それぞれ、10%のFBSと1%のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM培地、及び, 10%のFBS、50 μg/mLのヘパリン（Sigma社, St Louis, MO）と30 μg/mLの内皮細胞成長添加物（endothelial cells growth supplement）（BD Bioscience社, Bedford MA、以下ECGS）を添加したRPMI 1640培地にて培養した。HepG2細胞とHuVECは37°C にて、95％空気5％二酸化炭素中で培養した。培養後、細胞を-20°Cにて１０分間、メタノールアセトン（4:1）で固定した。リン酸緩衝生理食塩水（以下、PBS）にて洗浄後、細胞を4℃にて10%FBSを含有するPBSでブロッキングした。固定させた細胞をウサギ抗COL4抗体（1:500希釈、abcam社, Cambridge, MA）、マウス抗FN抗体（1:500希釈, Sigma社, St. Louis, MO）、マウス抗α平滑筋アクチン（以下、αSMA）抗体（1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark）、ウサギ抗フォンビルブラント因子抗体（1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark）、マウス抗サイトケラチン18抗体（1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA）あるいはマウス抗サイトケラチン19抗体（1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA）のいずれかを含有する、10%FBSを含むPBSにてインキュベートした。PBSで洗浄後、細胞をAlexa 488ラベルした抗ウサギ二次抗体（1:500希釈, Molecular Probes社, Eugene, OR）又はCy3ラベルした抗マウス二次抗体（1:500希釈, Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡BZ-8000（Keyence社, Osaka）を使用して各マーカーの発現を調べた。
(2) Immunostaining of marker protein The results of the above-mentioned Western blotting were confirmed by immunostaining, which is yet another test method. Mesangial cell lines, HuVEC cells and HepG2 cells were cultured in 96-well or 24-well cell culture plates and examined by immunofluorescence staining. The immortalized mesangial cell line was cultured at 32 ° C and induced to differentiate by culturing at 37 ° C for 6 days. HepG2 cells and HuVEC were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC), DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin, and 10% FBS, 50 μg / mL heparin (Sigma), respectively. And St. Louis, MO) and 30 μg / mL endothelial cells growth supplement (BD Bioscience, Bedford MA, hereinafter referred to as ECGS) were cultured in RPMI 1640 medium. HepG2 cells and HuVEC were cultured at 37 ° C in 95% air 5% carbon dioxide. After culturing, the cells were fixed with methanol acetone (4: 1) at -20 ° C for 10 minutes. After washing with phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS), the cells were blocked with PBS containing 10% FBS at 4 ° C. Rabbit anti-COL4 antibody (1: 500 dilution, abcam, Cambridge, MA), mouse anti-FN antibody (1: 500 dilution, Sigma, St. Louis, MO), mouse anti-α smooth muscle actin ( ΑSMA) antibody (1: 500 dilution, Dako, Glostrup, Denmark), rabbit anti-von Willebrand factor antibody (1: 500 dilution, Dako, Glostrup, Denmark), mouse anti-cytokeratin 18 antibody (1: 200) Incubated in PBS containing 10% FBS containing either diluted, Chemicon, Temecula, CA) or mouse anti-cytokeratin 19 antibody (1: 200 diluted, Chemicon, Temecula, CA). After washing with PBS, cells were treated with Alexa 488-labeled anti-rabbit secondary antibody (1: 500 dilution, Molecular Probes, Eugene, OR) or Cy3-labeled anti-mouse secondary antibody (1: 500 dilution, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). The cells were washed, and the expression of each marker was examined using a fluorescence microscope BZ-8000 (Keyence, Osaka).
図４で示すとおり、tsTAgとhTERTを二重形質導入することにより得られた不死化ヒトメサンギウム細胞株である#130hT-3株と#142hT-18株においては、培養温度を32℃から37℃へ温度シフトさせた結果、メサンギウム細胞マーカーであるαSMAが発現していることが観察された。同時にメサンギウム細胞マーカーCOL4及びPAI-1をウエスタンブロッティングにより検出したところ、図３の結果と同様に、COL4及びPAI-1が発現していることが示された。 As shown in FIG. 4, in the immortalized human mesangial cell lines # 130hT-3 and # 142hT-18 obtained by double transduction of tsTAg and hTERT, the culture temperature was changed from 32 ° C. to 37 ° C. As a result of the temperature shift to α, it was observed that αSMA, a mesangial cell marker, was expressed. At the same time, when mesangial cell markers COL4 and PAI-1 were detected by Western blotting, it was shown that COL4 and PAI-1 were expressed, as in the results of FIG.
また、SV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT-9）とコントロール細胞株であるHepG2及びHuVECを用いて、各種のメサンギウム細胞マーカー（COL4、FN、αSMA）及びメサンギウム細胞に対するネガティブマーカー（フォンビルブラント因子(第VIII因子)、サイトケラチン18及びサイトケラチン19）の発現を蛍光顕微鏡で検出した。結果を図５及び６に示す。本試験においても、tsTAgの非許容温度である37℃にシフトすることにより、分化型マーカーであるCOL4、FN及びαSMAの発現が誘導されていることが示された。これに対し、HepG2及びHuVECではこれらメサンギウム細胞マーカーの発現は弱いか若しくは認められなかった（図５）。一方、ネガティブマーカーであるフォンビルブラント因子及びサイトケラチン18及び19については、HuVEC及びHepG2でそれぞれ発現が認められるが、増殖型及び分化型のメサンギウム細胞では発現が観察されなかった（図６）。 In addition, using SV40tsT and hTERT double transduced strains (# 130hT-9) and control cell lines HepG2 and HuVEC, various mesangial cell markers (COL4, FN, αSMA) and negative markers for mesangial cells (von Expression of virubrand factor (factor VIII), cytokeratin 18 and cytokeratin 19) was detected with a fluorescence microscope. The results are shown in FIGS. Also in this test, it was shown that the expression of differentiation-type markers COL4, FN and αSMA was induced by shifting to 37 ° C. which is a non-permissive temperature of tsTAg. On the other hand, expression of these mesangial cell markers was weak or not observed in HepG2 and HuVEC (FIG. 5). On the other hand, the negative markers von Willebrand factor and cytokeratin 18 and 19 were observed in HuVEC and HepG2, respectively, but no expression was observed in proliferating and differentiated mesangial cells (FIG. 6).
これらの検討結果に基づき、メサンギウム細胞の形質を保持したクローンが得られたことが示された。更なる検討に用いるためにクローン#130hT-1及び#130hT-9を選抜した。これらのクローンは、初代メサンギウム細胞株と同等の生育速度を示し、かつ60継代以上にわたって連続して培養することが可能であった。 Based on these examination results, it was shown that a clone retaining the mesangial cell trait was obtained. Clones # 130hT-1 and # 130hT-9 were selected for use in further studies. These clones showed the same growth rate as the primary mesangial cell line and could be continuously cultured for more than 60 passages.
分化型メサンギウム細胞を用いた細胞ベースのスクリーニング方法の条件検討
SV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT-9）を用いて、分化型形質の発現条件を検討した。具体的には、TGF-βの濃度の変化および血清飢餓の有無がCOL4発現に及ぼす影響を、実施例４で示した免疫蛍光顕微鏡下での観察により調べた。図７に示された結果より、血清飢餓の有無のいずれの場合にも、TGF-β刺激による濃度依存的なCOL4の発現亢進が観察された。尚、発現亢進の程度は血清飢餓条件の方が強いことが示された。
Examination of cell-based screening methods using differentiated mesangial cells
The expression conditions of the differentiated trait were examined using a double transduced strain of SV40tsT and hTERT (# 130hT-9). Specifically, the influence of changes in TGF-β concentration and the presence or absence of serum starvation on COL4 expression was examined by observation under the immunofluorescence microscope described in Example 4. From the results shown in FIG. 7, concentration-dependent enhancement of COL4 expression by TGF-β stimulation was observed in both cases with and without serum starvation. It was shown that the degree of enhanced expression was stronger under serum starvation conditions.
ALK5阻害剤による影響の検討
実施例５と同様の試験をTGF-βの濃度を1.0 ng/mLに固定した上で、更に血清飢餓の有無とALK5阻害剤であるSB-505124の有無によるCOL4発現に対する影響を観察した。SB-505124 （Byfield et al., Mol. Pharmacol. 65: 744-752, 2004）は化学合成法により合成した。細胞株は#130hT-9株を使用した。血清飢餓の有無、TGF-βによる刺激の有無に関らず、ALK-5阻害剤であるSB-505124によりCOL4発現が強く抑制された（図８）。抑制の程度は血清欠乏条件下のほうが強いことが示唆された。
Examination of the effect of ALK5 inhibitor COL4 expression by the same test as in Example 5 with TGF-β concentration fixed at 1.0 ng / mL and further with or without serum starvation and with or without ALK5 inhibitor SB-505124 The effect on was observed. SB-505124 (Byfield et al., Mol. Pharmacol. 65: 744-752, 2004) was synthesized by chemical synthesis. The cell line # 130hT-9 was used. Regardless of serum starvation or TGF-β stimulation, COL4 expression was strongly suppressed by the ALK-5 inhibitor SB-505124 (FIG. 8). The degree of suppression was suggested to be stronger under serum-deficient conditions.
また、温度シフトによる分化誘導をしていない#130hT-9株を使用して、ALK-5阻害剤がTGF-βに応答したPAI-1発現に及ぼす影響を、実施例４で示したウエスタンブロッティング法により調べたところ、SB-505124の存在によりTGF-βに応答したPAI-1発現が強く抑制されることが示された（図９）。このことから、温度シフトによる分化型形質への誘導を行わない不死化ヒトメサンギウム細胞を用いても、細胞機能アッセイを実施できることが示唆された。 The effect of ALK-5 inhibitor on PAI-1 expression in response to TGF-β using the # 130hT-9 strain not induced for differentiation by temperature shift is shown in the Western blotting shown in Example 4. Examination by the method showed that the presence of SB-505124 strongly suppressed PAI-1 expression in response to TGF-β (FIG. 9). This suggests that the cell function assay can be performed even using immortalized human mesangial cells that are not induced to differentiated traits by temperature shift.
TGF-β刺激によるPAI-1及びCOL4の発現亢進のELISA法によるアッセイ
実施例５及び実施例６で示された細胞機能アッセイを定量的に実施するために、ELISA法を検討した。具体的には、細胞培養液中のPAI-1及びCOL4の量をELISA法により解析した。
Assay of PAI-1 and COL4 expression enhancement by TGF-β stimulation by ELISA In order to quantitatively perform the cell function assay shown in Example 5 and Example 6, ELISA was examined. Specifically, the amounts of PAI-1 and COL4 in the cell culture medium were analyzed by ELISA.
（１）PAI-1分泌のELISA法によるアッセイ
PAI-1アッセイについては、0.5%のFBS含有培地にて血清飢餓後、不死化メサンギウム細胞を32℃にてALK-5阻害剤の存在又は非存在下、1.0 ng/mLの用量のTGF-βとインキュベートした。実施例４で取得した#130hTクローンの内の４株を試験に供した。細胞培養液試料は48時間経過時点で回収し使用するまでは-80°Cにて保存した。PAI-1 ELISAについては、96穴のイムノプレートに抗PAI-1モノクローナル抗体（1 μg/mL, American diagnostica, Stamford, CT）を100 mM NaHCO3中で固相化した。ブロッキングバッファー（0.2% I-block (Tropix社, Bedford, MA)を含有する 0.05%のトゥイーン20を含むPBS（以下、PBS-T）中）にてブロッキング後、試料（1:5希釈）又は標準PAI-1（Chemicon社, Temecula, CA）を種々の濃度でウエル当たり50μLにて加えて、室温にて1時間から2時間の間インキュベートした。ウエルをPBS-Tにて3回洗浄し、続けてブロッキングバッファー中のヤギ抗PAI-1モノクローナル抗体（0.5 μg/mL, R&D Systems社, Minneapolis, MN）とともに1時間インキュベートした。PBS-T洗浄後、ウエルをブロッキングバッファー中のアルカリフォスファターゼ（以下、AP）をコンジュゲートした抗ヤギ抗体（1:6000希釈, Zymed社, South San Francisco, CA）とともに1時間インキュベートした。ウエルをPBS-Tにて4回洗浄し、ウエル当たり100 μLのSIGMA FAST p-ニトロフェニルリン酸溶液（Sigma社, St.Louis, MO）を各ウエルに加えた。AP活性を405nmの吸収増加により分光光度法により測定した。試料中のPAI-1量を同じアッセイにおける既知濃度の標準PAI-1により作成された対照曲線から、GraphPad Prismソフトウエア（GraphPad社, San Diego, CA）を使用して計算した。図１０Ａは標準PAI-1により作成された標準曲線を示し、図１０Ｂは試料中のPAI-1の定量値を示す。図１０Ｂから、４種類のSV40tsT及びhTERTの二重形質導入株における、TGF-βに応答したPAI-1の発現亢進をELISA法により定量的に検出しうることが示された。
(1) Assay of PAI-1 secretion by ELISA
For the PAI-1 assay, after serum starvation in 0.5% FBS-containing medium, immortalized mesangial cells were treated with TGF-β at a dose of 1.0 ng / mL in the presence or absence of an ALK-5 inhibitor at 32 ° C. And incubated. Four of the # 130hT clones obtained in Example 4 were used for the test. Cell culture fluid samples were collected at 48 hours and stored at -80 ° C until use. For PAI-1 ELISA, an anti-PAI-1 monoclonal antibody (1 μg / mL, American diagnostica, Stamford, CT) was immobilized in 100 mM NaHCO 3 on a 96-well immunoplate. After blocking with blocking buffer (PBS containing 0.05% Tween 20 containing 0.2% I-block (Tropix, Bedford, MA) (hereinafter PBS-T)), sample (1: 5 dilution) or standard PAI-1 (Chemicon, Temecula, Calif.) Was added at various concentrations at 50 μL per well and incubated at room temperature for 1 to 2 hours. The wells were washed 3 times with PBS-T and subsequently incubated for 1 hour with goat anti-PAI-1 monoclonal antibody (0.5 μg / mL, R & D Systems, Minneapolis, Minn.) In blocking buffer. After washing with PBS-T, the wells were incubated for 1 hour with an anti-goat antibody (1: 6000 dilution, Zymed, South San Francisco, Calif.) Conjugated with alkaline phosphatase (hereinafter AP) in blocking buffer. The wells were washed 4 times with PBS-T, and 100 μL per well of SIGMA FAST p-nitrophenyl phosphate solution (Sigma, St. Louis, MO) was added to each well. AP activity was measured spectrophotometrically with increased absorption at 405 nm. The amount of PAI-1 in the sample was calculated using GraphPad Prism software (GraphPad, San Diego, Calif.) From a control curve generated with a known concentration of standard PAI-1 in the same assay. FIG. 10A shows a standard curve created with standard PAI-1, and FIG. 10B shows the quantitative value of PAI-1 in the sample. FIG. 10B shows that the enhanced expression of PAI-1 in response to TGF-β can be detected quantitatively by ELISA in four types of SV40tsT and hTERT double transduced strains.
（２）COL4のELISA法によるアッセイ
COL4アッセイについては、不死化ヒトメサンギウム細胞を、通常の培地の条件で、コラーゲンタイプIを被覆した培養プレート（Nippon Beckton Dickinson社、Tokyo）上で32℃又は37℃にて、ALK-5阻害剤の存在又は非存在下で、6日間インキュベートした。実施例４で選抜した#130hT-9の32継代目の細胞と55継代目の細胞を試験に供した。COL4 ELISAの手順はPAI-1と基本的に同じ手順であったが、ただし、以下の実験材料を使用した：ウサギ抗COL4ポリクローナル抗体（2 μg/mL, Rockland社, Gilbertsville, PA）、マウス抗COL4モノクローナル抗体（1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA）、APコンジュゲートした抗マウスIg抗体（1:1000希釈, Zymed社, South San Francisco, CA）及びヒトCOL4標準（Collagen Research Center社, Tokyo）。
(2) COL4 ELISA assay
For the COL4 assay, immortalized human mesangial cells were treated with ALK-5 inhibitors at 32 ° C or 37 ° C on a culture plate (Nippon Beckton Dickinson, Tokyo) coated with collagen type I under normal medium conditions. Incubated for 6 days in the presence or absence of. The cells at passage 32 and passage 55 of # 130hT-9 selected in Example 4 were used for the test. The COL4 ELISA procedure was essentially the same as PAI-1, except that the following experimental materials were used: rabbit anti-COL4 polyclonal antibody (2 μg / mL, Rockland, Gilbertsville, PA), mouse anti COL4 monoclonal antibody (1: 1000 dilution, Chemicon, Temecula, CA), AP-conjugated anti-mouse Ig antibody (1: 1000 dilution, Zymed, South San Francisco, CA) and human COL4 standard (Collagen Research Center, Tokyo).
図１１は、継代数の異なるSV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT-9）から誘導した分化型メサンギウム細胞を用いて、TGF-β刺激によるCOL4発現量を比較した結果を示す。継代数の違いに基づくCOL4発現量に大きな相違は観察されず、TGF-βの濃度の上昇（0.03、0.10、0.33、1.0、3.3、10.0 ng/mL）に依存してCOL4発現量が増大した。また、継代数が大きい#130hT-9クローンを用いた場合でも、継代数が小さいクローンと同様に、COL4発現量を指標にTGF-βに対する応答性を評価できることが示された。このことは、本発明にしたがって作製した不死化ヒトメサンギウム細胞が、継代数によらず、安定的に分化型マーカーを発現する能力を保持していることを示す。 FIG. 11 shows the results of comparison of COL4 expression levels by stimulation with TGF-β using differentiated mesangial cells derived from SV40tsT and hTERT double transduced strains (# 130hT-9) having different passage numbers. No significant difference was observed in the COL4 expression level based on the passage number, and the COL4 expression level increased depending on the increase in TGF-β concentration (0.03, 0.10, 0.33, 1.0, 3.3, 10.0 ng / mL). . Moreover, it was shown that even when the # 130hT-9 clone having a large passage number was used, the responsiveness to TGF-β could be evaluated using the COL4 expression level as an index, as in the case of the clone having a small passage number. This indicates that the immortalized human mesangial cells prepared according to the present invention retain the ability to stably express the differentiation marker regardless of the passage number.
次に、SV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT-9）から誘導した分化型メサンギウム細胞を用いて、TGF-β刺激によるCOL4の発現亢進に及ぼす３種類のALK-5阻害剤の阻害効果を調べた。ここではSB-505124と共に、TGF-β RIキナーゼ阻害剤I及びIIをCalbiochem社（San Diego, CA）より得て使用した。継代数32の#130hT-9を血清非飢餓条件で1 ng/mLのTGF-βの存在下で、37℃にて6日間培養した。結果を図１２に示す。阻害剤の濃度上昇に依存してCOL4発現阻害の程度が増大する相関関係が示された。この結果から、本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞を用いることにより、ヒトメサンギウム細胞の形質を調節する物質が分化型メサンギウム細胞形質を示す細胞マーカーの発現に及ぼす影響をELISA法により評価できることが示された。 Next, using the differentiated mesangial cells derived from the SV40tsT and hTERT double transduced strain (# 130hT-9), inhibition of three types of ALK-5 inhibitors on the enhancement of COL4 expression by TGF-β stimulation The effect was investigated. Here, TGF-β RI kinase inhibitors I and II were obtained from Calbiochem (San Diego, Calif.) And used together with SB-505124. Passage # 32 # 130hT-9 was cultured at 37 ° C. for 6 days in the presence of 1 ng / mL TGF-β under serum non-starvation conditions. The results are shown in FIG. There was a correlation in which the degree of inhibition of COL4 expression increased with increasing inhibitor concentration. From this result, it was shown that by using the immortalized human mesangial cells of the present invention, the influence of substances that regulate the characteristics of human mesangial cells on the expression of cell markers exhibiting differentiated mesangial cell characteristics can be evaluated by ELISA. It was.
TGF-β又はBMP2によるSmadリン酸化の検出
不死化ヒトメサンギウム細胞を24時間0.5％のFBSを含む培地で血清飢餓させて、続けて1 μMのALK-5阻害剤の存在又は非存在下、TGF-β（1 ng/mL）又はBMP2（300 ng/mL, R&D Systems社, Minneapolis, MN）を用いて32℃にて30分間刺激した。コンプリートミニ（Complete mini）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics社， Penzberg， Germany）、フォスファターゼ阻害剤カクテル1及び2（Sigma社, St. Louis, MO）及び1 mMのPMSFを含む細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解した。各30 μgの標品を実施例４のウエスタンブロット法で示した方法でイムノブロットした。即ち、NuPAGE 4-12%ゲル上で電気泳動しPVDF膜に転写した後に、ウサギ抗Smad1（Upstate社, Lake Placid, NY）、ウサギ抗リン酸化Smad1（Ser463/465）（1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA）、ウサギ抗Smad2/3（1:1000希釈, Upstate社, Lake Placid, NY）、ウサギ抗リン酸化Smad2（Ser465/467）（1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA）、マウス抗Stat3（Cell Signaling社, Beverly, MA）又はウサギ抗リン酸化Stat3（Tyr705）抗体（(1:1000希釈, Cell Signaling社, Beverly, MA）を用いて、タンパク質をイムノブロットした後、HRPをコンジュゲートした二次抗体により検出した。膜をLumiImager中でECL plusを用いて可視化した。
Detection of Smad phosphorylation by TGF-β or BMP2 Immortalized human mesangial cells were serum starved for 24 hours in medium containing 0.5% FBS, followed by the presence or absence of 1 μM ALK-5 inhibitor in TGF Stimulation was carried out for 30 minutes at 32 ° C. using -β (1 ng / mL) or BMP2 (300 ng / mL, R & D Systems, Minneapolis, Minn.). Complete mini protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany), phosphatase inhibitor cocktails 1 and 2 (Sigma, St. Louis, MO) and cell lysis buffer containing 1 mM PMSF Cells were lysed. 30 μg of each sample was immunoblotted by the method shown in the Western blot method of Example 4. That is, after electrophoresis on a NuPAGE 4-12% gel and transfer to a PVDF membrane, rabbit anti-Smad1 (Upstate, Lake Placid, NY), rabbit anti-phosphorylated Smad1 (Ser463 / 465) (1: 1000 dilution, Chemicon) , Temecula, CA), rabbit anti-Smad2 / 3 (1: 1000 dilution, Upstate, Lake Placid, NY), rabbit anti-phosphorylated Smad2 (Ser465 / 467) (1: 1000 dilution, Chemicon, Temecula, CA) After immunoblotting the protein using mouse anti-Stat3 (Cell Signaling, Beverly, MA) or rabbit anti-phosphorylated Stat3 (Tyr705) antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling, Beverly, MA), HRP The membrane was visualized in the LumiImager using ECL plus.
図１３に、２種類のSV40tsT及びhTERTの二重形質導入株（#130hT-1及び#130hT-9）を用いて、TGF-β、BMP2及びALK-5阻害剤であるSB-505124がSmad1及びSmad2/3のリン酸化に及ぼす影響をウエスタンブロッティング法により検証した結果を示す。ヒトメサンギウム細胞において、TGF-βに応答したPAI-1発現が、ALK-5からのPAI-1に対する転写因子であるSmad2/3のリン酸化カスケードを介して作用していることが示された。即ち、ALK-5阻害剤であるSB-505124の作用によりSmad2/3のリン酸化が阻害され、その結果PAI-1発現が抑制されることが示された。BMP2によるSmad1のリン酸化は、刺激後30分の時点では、SB-505124で抑制されなかった。この結果から、本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞を用いて細胞内カスケードの分子動態を観察することにより、ヒトメサンギウム細胞の形質を調節する物質の作用メカニズムを解明できることが示された。 FIG. 13 shows that two types of SV40tsT and hTERT double transduced strains (# 130hT-1 and # 130hT-9) were used, and TGF-β, BMP2 and ALK-5 inhibitor SB-505124 was converted to Smad1 and The result which verified the influence which it has on the phosphorylation of Smad2 / 3 by the Western blotting method is shown. In human mesangial cells, it was shown that PAI-1 expression in response to TGF-β acts through the phosphorylation cascade of Smad2 / 3, a transcription factor for PAI-1 from ALK-5. That is, it was shown that phosphorylation of Smad2 / 3 was inhibited by the action of SB-505124, which is an ALK-5 inhibitor, and as a result, PAI-1 expression was suppressed. Phosphorylation of Smad1 by BMP2 was not inhibited by SB-505124 at 30 minutes after stimulation. From these results, it was shown that the mechanism of action of substances that regulate the traits of human mesangial cells can be elucidated by observing the molecular dynamics of the intracellular cascade using the immortalized human mesangial cells of the present invention.
本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞及び分化型ヒトメサンギウム細胞は、ヒトメサンギウム細胞の機能を調節する物質のスクリーニングに有用である。このスクリーニング方法により見いだされた薬剤は、糖尿病性腎症、IgA腎症、アルポート症候群、糸球体腎炎、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎等に対する治療剤として用いることができる。 The immortalized human mesangial cells and differentiated human mesangial cells of the present invention are useful for screening for substances that regulate the function of human mesangial cells. Drugs found by this screening method are diabetic nephropathy, IgA nephropathy, Alport syndrome, glomerulonephritis, lupus nephritis, focal glomerulosclerosis, chronic glomerulonephritis, acute progressive nephritis, nephrotic syndrome, membrane It can be used as a therapeutic agent for nephropathy, crescent nephritis, mesangial proliferative nephritis, membranoproliferative glomerulonephritis and the like.
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