JP5004209B2 - Method for expressing toxic protein - Google Patents
Method for expressing toxic protein Download PDFInfo
- Publication number
- JP5004209B2 JP5004209B2 JP2006223042A JP2006223042A JP5004209B2 JP 5004209 B2 JP5004209 B2 JP 5004209B2 JP 2006223042 A JP2006223042 A JP 2006223042A JP 2006223042 A JP2006223042 A JP 2006223042A JP 5004209 B2 JP5004209 B2 JP 5004209B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- actin
- protein
- seq
- fusion protein
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本願発明は、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質を、該毒性を低下あるいは中和させるタンパク質との融合タンパク質として発現させる工程を含む、上記毒性を有するタンパク質の効率的製造方法、上記融合タンパク質自体及び該融合タンパク質をコードする遺伝子自体に関する。
The present invention includes an efficient method for producing a protein having toxicity, comprising a step of expressing a protein having toxicity to a host cell as a fusion protein with a protein that reduces or neutralizes the toxicity, and the fusion protein itself. And the gene encoding the fusion protein itself.
従来の遺伝子工学的手法によれば、発現ホストに対して毒性のある組換えタンパク質は、発現量が低かったり、発現していないクローンのみが選択的に増殖してしまうなどの理由で、大量発現と精製が困難であった。
このような問題点については、大腸菌などで発現させる場合は、発現を誘導するまで強力に翻訳を阻害したり（非特許文献１参照）、発現プラスミドのコピー数を低く抑えておくこと（非特許文献２参照）で、部分的な解決が図られている。しかし、こうした手段によっても発現が困難なタンパク質は多数存在する。たとえば、アクチンのように、真核細胞の発現系でなければ機能的な組換えタンパク質が得られないものも多数存在し、その場合は、効率的な翻訳の抑制と誘導が困難であった。昆虫細胞の発現系を用いるという手段はあるが（非特許文献３参照）、この場合も大量発現が可能かどうかはケースバイケースであり、従来の遺伝学的解析の結果から考えて、毒性の強い変異アクチンの発現は困難であろうと推測される。このため、とくに真核細胞の発現系において、毒性のある組換えタンパク質を効率的に発現できるような、新たな技術の開発が待たれていた。
According to conventional genetic engineering techniques, recombinant proteins that are toxic to the expression host are expressed in large quantities because the expression level is low or only clones that do not express selectively grow. And purification was difficult.
Regarding such problems, when expressing in E. coli or the like, translation is strongly inhibited until expression is induced (see Non-Patent Document 1), or the copy number of the expression plasmid is kept low (Non-Patent Document 1). (Ref. 2), a partial solution is attempted. However, there are many proteins that are difficult to express by such means. For example, there are many proteins such as actin that cannot be used to obtain functional recombinant proteins unless they are expressed in eukaryotic cells. In this case, it is difficult to efficiently suppress and induce translation. Although there is a means of using an insect cell expression system (see Non-Patent Document 3), in this case as well, whether large-scale expression is possible is a case-by-case, considering the results of conventional genetic analysis, It is speculated that the expression of strong mutant actin will be difficult. For this reason, development of a new technology capable of efficiently expressing a toxic recombinant protein has been awaited, particularly in an eukaryotic cell expression system.
本発明の課題は、上記従来手段の問題を解消することにあり、具体的には、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質を生産する場合において、そのタンパク質が使用する宿主細胞に対して毒性を有している場合でも、該タンパク質を効率的かつ安定的に大量生産する手段を提供しようとするものである。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the conventional means. Specifically, when producing a recombinant protein using a genetic engineering technique, it is toxic to the host cell used by the protein. Even if it has, it is intended to provide a means for efficiently and stably mass-producing the protein.
本発明者は上記課題を解決するため、鋭意研究の結果、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質を、該タンパク質の毒性を低下ないしは中和するタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現させ、得られた融合タンパク質をタンパク分解酵素で切断することにより、上記毒性を有するタンパク質を製造する方法を創出した。この方法によれば、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質であっても、この宿主細胞を使用して遺伝子工学的手法により、効率的に大量生産が可能となる。すなわち本発明は以下の（１）〜（１４）に示されるとおりである。 In order to solve the above problems, the present inventor has obtained, as a result of intensive research, expressing a protein having toxicity to host cells as a fusion protein with a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity of the protein. A method for producing the above toxic protein was created by cleaving the fused protein with a proteolytic enzyme. According to this method, even a protein that is toxic to the host cell can be mass-produced efficiently by genetic engineering techniques using the host cell. That is, the present invention is as shown in the following (1) to (14).
（１） 以下の（ａ）〜(ｆ)の工程を含むことを特徴とする、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質の製造方法。
（ａ）宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡと、該毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を、タンパク分解酵素の切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーポリヌクレオチドを介して結合せしめて融合遺伝子を調製する工程。
（ｂ）上記融合遺伝子をベクターに挿入し、組み換えベクターを得る工程。
（ｃ）上記組み換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得る工程
（ｄ）上記形質転換体を培養し、培養物から融合タンパク質を得る工程。
（ｅ）得られた融合タンパク質をタンパク分解酵素で切断し、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質を得る工程。
（ｆ）切断されたタンパク質の混合液から、毒性を中和するために融合したタンパク質を除去し、宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質を精製する過程。
（２） 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする、融合タンパク質の製造方法。
（ａ）宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡと、該毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を、タンパク分解酵素の切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーポリヌクレオチドを介して結合せしめて融合遺伝子を調製する工程。
（ｂ）上記融合遺伝子をベクターに挿入し、組み換えベクターを得る工程。
（ｃ）上記組み換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得る工程
する工程。
（ｄ）上記形質転換体を培養し、培養物から融合タンパク質を得る工程。
（３） 宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または該毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子に、精製用のタグをコードするヌクレオチド配列が結合していることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４） 宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質が、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンであり、毒性を低下あるいは中和するタンパク質がプロフィリン、またはチモシンであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５） タンパク質分解酵素の切断部位が、キモトリプシンであることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６） 宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質、及び該毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドが、タンパク分解酵素の切断部位のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドを介して結合していることを特徴とする、融合タンパク質。
（７） 宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質、または該毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドのＣ末端に精製用のタグが付加されていることを特徴とする上記（６）に記載の融合タンパク質。
（８） 上記精製用タグがポリヒスチジンタグまたはＦＬＡＧタグであることを特徴とする上記（７）に記載の融合タンパク質。
（９） 宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質が、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンであり、該毒性を低下あるいは中和するタンパク質が、プロフィリン、またはチモシンであることを特徴とする、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１０） タンパク質分解酵素の切断部位がキモトリプシンであることを特徴とする、上記（６）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１１） 配列番号１または５に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１または５に示されるアミノ酸配列においてそれぞれ１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質であって、優性変異アクチンの宿主細胞に対する毒性が低下乃あるいは中和され、蛋白分解酵素により切断されて内在性アクチンの阻害活性を有するタンパク質を産生することを特徴とする、融合タンパク質。
（１２） 配列番号３または７に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、融合タンパク質。
（１３） 上記（６）〜（１２）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（１４） 配列番号２または６に記載の塩基配列を有するか、あるいは該塩基配列において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加された塩基配列を有する遺伝子であって、該遺伝子が、優性変異アクチンの宿主細胞に対する毒性が低下乃あるいは中和されており、かつ蛋白分解酵素により切断されて内在性アクチンの阻害活性を有す優性変異アクチンを産生する融合タンパク質をコードするものであることを特徴とする、遺伝子。
（１５） 配列番号４または８に示される塩基配列を有することを特徴とする、遺伝子。
（１６） 上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の遺伝子が挿入されていることを特徴とする、組換えベクター。
（１７） 上記（１６）に記載の組み換えベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
(1) A method for producing a protein having toxicity to a host cell, comprising the following steps (a) to (f):
(A) a linker comprising a nucleotide sequence encoding a proteolytic enzyme cleavage site, a gene DNA encoding a protein having toxicity to a host cell, and a gene encoding a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity A step of preparing a fusion gene by binding via a polynucleotide.
(B) A step of inserting the fusion gene into a vector to obtain a recombinant vector.
(C) A step of obtaining a transformant by introducing the recombinant vector into a host cell (d) A step of culturing the transformant and obtaining a fusion protein from the culture.
(E) A step of cleaving the obtained fusion protein with a proteolytic enzyme to obtain a protein having toxicity to the host cell.
(F) A process of removing a fused protein to neutralize toxicity from a mixture of cleaved proteins and purifying a protein having toxicity to a host cell.
(2) A method for producing a fusion protein comprising the following steps (a) to (d):
(A) a linker comprising a nucleotide sequence encoding a proteolytic enzyme cleavage site, a gene DNA encoding a protein having toxicity to a host cell, and a gene encoding a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity A step of preparing a fusion gene by binding via a polynucleotide.
(B) A step of inserting the fusion gene into a vector to obtain a recombinant vector.
(C) A step of obtaining a transformant by introducing the recombinant vector into a host cell.
(D) A step of culturing the transformant to obtain a fusion protein from the culture.
(3) A nucleotide sequence encoding a purification tag is bound to a gene encoding a protein having toxicity to a host cell, or a gene encoding a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity. The production method according to (1) or (2) above, wherein
(4) A protein having toxicity to a host cell is a dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin, and a protein that reduces or neutralizes the toxicity is profilin or thymosin (1) The manufacturing method in any one of (3).
(5) The production method according to any one of (1) to (4) above, wherein the proteolytic enzyme cleavage site is chymotrypsin.
(6) A protein having toxicity to a host cell and a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity are bound via a linker peptide having an amino acid sequence of a cleavage site of a proteolytic enzyme. A fusion protein.
(7) The protein according to (6), wherein a purification tag is added to a C-terminus of a protein having toxicity against a host cell, or a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity. Fusion protein.
(8) The fusion protein according to (7), wherein the purification tag is a polyhistidine tag or a FLAG tag.
(9) The protein having toxicity to the host cell is a dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin, and the protein that reduces or neutralizes the toxicity is profilin or thymosin. The fusion protein according to any one of (6) to (8) above.
(10) The fusion protein according to any one of (6) to (9) above, wherein the proteolytic enzyme cleavage site is chymotrypsin.
(11) Fusion having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 5, or having the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 5 A fusion protein, wherein the protein has a reduced or neutralized toxicity to a host cell of a dominant mutant actin and is cleaved by a proteolytic enzyme to produce a protein having an endogenous actin inhibitory activity.
(12) A fusion protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 7.
(13) A gene encoding the protein according to any one of (6) to (12) above.
(14) a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6, or having a base sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted or added in the base sequence, It encodes a fusion protein that produces a dominant mutant actin that has a reduced or neutralized toxicity to the host cell of the dominant mutant actin and that is cleaved by a proteolytic enzyme and has an inhibitory activity against endogenous actin. A gene characterized by
(15) A gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 8.
(16) A recombinant vector in which the gene according to any one of (13) to (15) is inserted.
(17) A transformant in which the recombinant vector according to (16) is introduced.
本願発明によれば、従来、発現が困難であった宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質であっても、極めて効率的に該タンパク質を大量生産することが可能となる。特に、本発明は、真核細胞発現系において、発現困難な毒性の強い組換えタンパク質を、発現可能にする点で有用な技術である。
According to the present invention, even if a protein has been toxic to a host cell that has heretofore been difficult to express, the protein can be mass-produced extremely efficiently. In particular, the present invention is a useful technique in that a highly toxic recombinant protein that is difficult to express can be expressed in a eukaryotic cell expression system.
宿主細胞に対して毒性を有するタンパク質を組換えタンパク質として発現させようとすると、宿主細胞の増殖や当該組換えタンパク質の発現が阻害されたり、なんらかの原因で発現が抑制されたクローンが選択的に増殖するなどの理由で、大量発現が困難になってしまうケースが多い。
一方、多くのタンパク質の活性は他のタンパク質などの制御因子によって調節されており、過剰発現させると細胞に対して毒性をもつタンパク質についても、その毒性を低下あるいは中和するタンパク質やペプチドなどが知られている場合が多い。本発明は、該毒性タンパク質を、その毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現させ、該毒性タンパク質とその毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドを常に１：１のモル比で近傍に存在させて、該毒性タンパク質の毒性が効率的かつ安定に阻害された状態にして、毒性タンパク質の大量発現を可能にするものである。
したがって、本発明の毒性タンパク質とは、宿主細胞に対し、本来的に毒性を有するタンパク質あるいは過剰発現によって毒性を発揮するタンパク質で、宿主細胞の増殖や組み換え遺伝子の発現を阻害するタンパク質をいう。
When a protein that is toxic to the host cell is expressed as a recombinant protein, the growth of the host cell, the expression of the recombinant protein is inhibited, or a clone whose expression is suppressed for some reason is selectively propagated. In many cases, mass expression becomes difficult due to reasons such as
On the other hand, the activity of many proteins is regulated by regulatory factors such as other proteins. For proteins that are toxic to cells when overexpressed, proteins and peptides that reduce or neutralize their toxicity are known. In many cases. In the present invention, the toxic protein is expressed as a fusion protein with a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity, and the toxic protein and the protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity are always in a 1: 1 molar ratio. By being present in the vicinity in a ratio, the toxicity of the toxic protein is efficiently and stably inhibited, and enables large-scale expression of the toxic protein.
Therefore, the toxic protein of the present invention refers to a protein that is inherently toxic to the host cell or a protein that exhibits toxicity by overexpression, and that inhibits the growth of the host cell and the expression of the recombinant gene.
このような毒性を有するタンパク質と該タンパク質の毒性を阻害するタンパク質の組み合わせとして、例えば、優性変異アクチンとチモシンまたはプロフィリン、トリプシンとトリプシンインヒビター、DNaseIとアクチン等が挙げらることができる。後二者に関しては、毒性タンパク質と制御タンパク質が１；１の複合体を形成し、その結果、毒性が中和されることが知られている。
本発明においては、まず、上記毒性を有するタンパク質コードする遺伝子と上記毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とを蛋白分解酵素の切断部位のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを介して結合させるか、あるいはさらに精製用のタグをコードするポリヌクレオチドを毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子に結合させた融合遺伝子を調製し、ベクターに挿入し、この組み換えバクターを用いて、宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞の培養物から、上記融合遺伝子に対応する融合タンパク質を採取する。次いで、この融合タンパク質を蛋白分解酵素で切断し、酵素反応液から上記毒性を有するタンパク質を分離する。
Examples of the combination of a protein having such toxicity and a protein that inhibits the toxicity of the protein include dominant mutant actin and thymosin or profilin, trypsin and trypsin inhibitor, DNaseI and actin, and the like. For the latter two, it is known that the toxic protein and the control protein form a 1: 1 complex, resulting in neutralization of toxicity.
In the present invention, first, a gene encoding a linker peptide having an amino acid sequence at the cleavage site of a proteolytic enzyme is used to encode a gene encoding the protein having toxicity and a gene encoding a protein or peptide that reduces or neutralizes the toxicity. A fusion gene is prepared by linking via a nucleotide or by further linking a polynucleotide encoding a purification tag to a gene encoding a protein or peptide that reduces or neutralizes toxicity, and is inserted into a vector. A recombinant cell is used to transform a host cell, and a fusion protein corresponding to the fusion gene is collected from the host cell culture. Next, this fusion protein is cleaved with a proteolytic enzyme, and the toxic protein is separated from the enzyme reaction solution.
酵素反応液から毒性を有するタンパク質を精製する際には、一般的な生化学的手法を用いることができるが、精製用のタグに対するアフィニティレジンを用いれば、毒性を低下あるいは中和するタンパク質またはペプチドはレジンに結合するので、非結合分画にこれを容易に回収することもできる。
上記宿主細胞内における融合タンパク質の発現においては、融合タンパク質自体は宿主細胞に対して毒性を示さないため、過剰発現が可能であり、その結果、上宿主細胞に対して毒性を示すタンパク質であっても大量生産が可能となる。
上記タンパク分解酵素としては、発現した融合タンパク質をタンパク分解酵素で切断する際、製造目的の毒性を有するタンパク質が切断されないタンパク質分解酵素を選択し、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の設計においては、この選択されたタンパク分解酵素の切断部位のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドをコードするように設計する。
When purifying a protein having toxicity from an enzyme reaction solution, a general biochemical method can be used. However, if an affinity resin for a purification tag is used, a protein or peptide that reduces or neutralizes toxicity. Binds to the resin and can be easily recovered in the unbound fraction.
In the expression of the fusion protein in the host cell, since the fusion protein itself does not show toxicity to the host cell, it can be overexpressed. As a result, the protein is toxic to the host cell. Can be mass-produced.
As the proteolytic enzyme, when the expressed fusion protein is cleaved with the proteolytic enzyme, a proteolytic enzyme that does not cleave the toxic protein for the purpose of production is selected, and the base sequence of the polynucleotide encoding the linker peptide is designed. Is designed to encode a linker peptide having the amino acid sequence of the cleavage site of the selected proteolytic enzyme.
本願発明の方法は、広く普遍性を有し、製造目的の毒性を有するタンパク質は特定のものには限定されないが、例えば、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチン、トリプシン、DNaseI等が挙げられる。
トリプシンは、基質特異性の低いタンパク質分解酵素であり、本来は消化酵素であるが、細胞培養などで産業的にも広く利用されている。基質特異性が低いので、宿主細胞の内在性タンパク質も分解してしまうため毒性が強く、一般的には阻害ペプチドと融合したトリプシノーゲンの形で発現されるが、宿主細胞の内在性タンパク質分解酵素により一部のトリプシノーゲンがトリプシンに変換されると自己触媒的にトリプシンが生成され、強い細胞毒性を発揮する。実際、組換えトリプシノーゲンをコードする遺伝子を発現させてもほとんどがトリプシンに変換されてしまうことが知られている(Woodward et al., Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from trangenic plants. Biotechnol. Appl. Biochem. 38:123-130, 2003)。
DnaseIは、膵臓由来の強力なDNA exonulceaseで、原核細胞においては強い細胞毒性を示す(Doroty et al., Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNaseI, in Escherichia coli using a tightly controlled T7-promoter-based vector. Gene 136:337-340, 1993)。しかし単量体アクチンと1:1の複合体を形成し、酵素活性を失うことが知られている(Lindberg, Biochim. Biophys. Acta 82:237-248, 1964)。
The method of the present invention has wide universality, and the protein having toxicity for the purpose of production is not limited to a specific one. For example, dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin, trypsin, DNase I and the like can be mentioned. It is done.
Trypsin is a proteolytic enzyme with low substrate specificity and is originally a digestive enzyme, but is widely used industrially in cell culture and the like. Because of its low substrate specificity, it is highly toxic because it also degrades host cell endogenous proteins, and is generally expressed in the form of trypsinogen fused to an inhibitory peptide. When some trypsinogen is converted to trypsin, trypsin is generated autocatalytically and exhibits strong cytotoxicity. In fact, it is known that even when a gene encoding recombinant trypsinogen is expressed, most of it is converted to trypsin (Woodward et al., Maize (Zea mays) -derived bovine trypsin: characterization of the first large- scale, commercial protein product from trangenic plants. Biotechnol. Appl. Biochem. 38: 123-130, 2003).
DnaseI is a powerful DNA exonulcease derived from the pancreas and exhibits strong cytotoxicity in prokaryotic cells (Doroty et al., Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNaseI, in Escherichia coli using a tightly controlled T7-promoter-based vector Gene 136: 337-340, 1993). However, it is known to form a 1: 1 complex with monomeric actin and lose enzyme activity (Lindberg, Biochim. Biophys. Acta 82: 237-248, 1964).
以下に、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンの例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
アクチンは、そのフォールディングに真核細胞のシャペロンを必要とするため、大腸菌発現系による発現は不可能である。一方、アクチンはすべての真核細胞の増殖にとって必須なタンパク質であり、その発現量は厳密にコントロールされているため、真核細胞で組換えアクチン遺伝子を大量発現することは困難である。とくに、現在われわれが研究対象としている優性変異アクチンは、内在性アクチンの機能を阻害するため毒性が強いと予想される。優性変異アクチンとは、それ自身がアクチンとしての機能を持たないだけではなく、野生型アクチンと共存したときに、野生型アクチンの機能をも損なってしまうような変異アクチンの総称である。例えば、Ｇ64D変異アクチン（配列番号９）は、ショウジョウバエの間接飛翔筋で特異的に発現されるアクチンの変異として同定され、この変異アクチンのみをもつハエが飛翔能を失うのみならず、変異アクチン遺伝子１コピーに対し、正常アクチン遺伝子が３コピーあっても、飛翔能は完全に阻害される（An, H. S., and K. Mogami. (1986) J. Mol. Biol. 260: 492-505.）
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by giving examples of dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin.
Since actin requires a eukaryotic chaperone for its folding, it cannot be expressed by an E. coli expression system. On the other hand, actin is an essential protein for the growth of all eukaryotic cells, and its expression level is strictly controlled, so that it is difficult to express a large amount of recombinant actin gene in eukaryotic cells. In particular, the dominant mutant actin that we are currently studying is expected to be highly toxic because it inhibits the function of endogenous actin. Dominant mutant actin is a general term for mutant actin that not only does not have a function as an actin itself, but also impairs the function of the wild type actin when coexisting with the wild type actin. For example, G64D mutant actin (SEQ ID NO: 9) has been identified as an actin mutation that is specifically expressed in Drosophila indirect flight muscles, and flies having only this mutant actin not only lose flight ability but also a mutant actin gene. Even if there are 3 normal actin genes compared to 1 copy, flight ability is completely inhibited (An, HS, and K. Mogami. (1986) J. Mol. Biol. 260: 492-505.)
一方、例えば、E206A/R207A,/E208A三重変異アクチン（配列番号１０）は、酵母アクチンの変異として同定されたもので、この変異アクチンのみをもつ細胞が増殖できないのみならず、この変異アクチン遺伝子と野生型アクチン遺伝子と１コピーずつもつ細胞も増殖できない（Wertman, K. F., D. G. Drubin, and D. Botstein (1992) Genetics 132: 337-350.）。このように、宿主がもつ内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンは、大量発現はひときわ困難であることが容易に推測可能である。 On the other hand, for example, E206A / R207A, / E208A triple mutant actin (SEQ ID NO: 10) was identified as a mutation in yeast actin, and not only cells having only this mutant actin can not grow, but also this mutant actin gene and Cells with one copy of the wild-type actin gene cannot grow (Wertman, KF, DG Drubin, and D. Botstein (1992) Genetics 132: 337-350.). Thus, it can be easily estimated that dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin possessed by the host is extremely difficult to express in large quantities.
アクチンは、細胞内で重合してアクチンフィラメントを形成することでその生理的機能を発揮するタンパク質である。一方、プロフィリンは、アクチンモノマー結合性タンパク質として知られ、重合能を失ったADP結合アクチンモノマーと１：１の複合体を形成してADPとATPの交換反応を促進し、ATP結合アクチンを再生して重合能を回復させることが生理的機能であると考えられている。しかしプロフィリンと結合したアクチンモノマーは重合することができず、プロフィリンから解離しなければ重合できないことが知られている。また、チモシンもアクチンモノマーと結合することにより、細胞内でアクチンフィラメントの重合を阻害していることが知られている。すなわち、これらタンパク質は、アクチンモノマーが細胞内で過剰にならないように制御する作用を有する。 Actin is a protein that exerts its physiological function by polymerizing in cells to form actin filaments. Profilin, on the other hand, is known as an actin monomer-binding protein, forms a 1: 1 complex with ADP-binding actin monomer that has lost its ability to polymerize, promotes the exchange reaction between ADP and ATP, and regenerates ATP-binding actin. Thus, it is considered that restoring the polymerization ability is a physiological function. However, it is known that an actin monomer bound to profilin cannot be polymerized and cannot be polymerized unless it is dissociated from profilin. It is also known that thymosin also inhibits actin filament polymerization in cells by binding to actin monomers. That is, these proteins have an action of controlling the actin monomer so that it does not become excessive in the cell.
本発明において、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンを目的タンパク質とする場合においては、毒性を低下あるいは中和するタンパク質として、上記プロフィリン、チモシンのようなアクチン作用を一定に制御するタンパク質を利用し、アクチンとこれら制御タンパク質との融合タンパク質として、宿主細胞内で発現させる。発現した融合タンパク質におけるアクチン部分は、プロフィリン等の制御タンパク質部分と分子内複合体を形成し、重合に関与できなくなるので、内在性アクチンの機能を阻害することはない。したがってこの融合タンパク質が過剰になっても、宿主細胞に対して優性変異アクチンの毒性を発揮することがない。 In the present invention, when a dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin is used as a target protein, a protein that controls actin action such as the above-mentioned profilin and thymosin as a protein that reduces or neutralizes toxicity And is expressed in a host cell as a fusion protein of actin and these regulatory proteins. The actin moiety in the expressed fusion protein forms an intramolecular complex with a regulatory protein moiety such as profilin and cannot participate in polymerization, and thus does not inhibit the function of endogenous actin. Therefore, even if this fusion protein becomes excessive, the toxicity of the dominant mutant actin to the host cell is not exhibited.
本発明の方法に従って、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異アクチンを製造するには、優性変異アクチンと、プロフィリン又はチモシン等の制御タンパク質をコードする融合遺伝子を調製するが、優性変異アクチン遺伝子と制御タンパク質遺伝子との間には、タンパク質分解酵素の切断部位を有するリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入する。このようなタンパク分解酵素の切断部位としては、優性変異アクチンを切断しないキモトリプシンの切断部位を選択することが望ましい。なお、優性変異アクチン中にもキモトリプシン切断部位は存在するが、該切断部位は優性変異にアクチン表面に露出しておらずほとんど切断されない。また、アクチンのＮ末端は複雑な翻訳後修飾を受けることが知られているので、Ｎ末端側の配列は改変しない方がのぞましい。したがって、プロフィリンまたはチモシン遺伝子は、アクチン遺伝子の３‘末端側に連結する。また、プロフィリンまたはチモシン遺伝子の３‘末端側には、精製用のタグをコードするヌクレオチド配列を付すが、このようなタグとしては、例えば、６ｘＨｉｓまたはＦＬＡＧ配列が望ましい。 In order to produce a dominant mutant actin that inhibits the function of endogenous actin according to the method of the present invention, a fusion gene encoding a dominant mutant actin and a regulatory protein such as profilin or thymosin is prepared. A nucleotide sequence encoding a linker peptide having a cleavage site for a proteolytic enzyme is inserted between the gene and the regulatory protein gene. As a cleavage site for such a proteolytic enzyme, it is desirable to select a cleavage site for chymotrypsin that does not cleave dominant mutant actin. A chymotrypsin cleavage site also exists in the dominant mutant actin, but the cleavage site is not exposed to the dominant mutation on the actin surface and is hardly cleaved. In addition, since it is known that the N-terminus of actin undergoes complex post-translational modifications, it is desirable that the sequence on the N-terminal side should not be altered. Therefore, the profilin or thymosin gene is linked to the 3 'end of the actin gene. In addition, a nucleotide sequence encoding a purification tag is attached to the 3 'end side of the profilin or thymosin gene. As such a tag, for example, a 6xHis or FLAG sequence is desirable.
次いで、この融合遺伝子をベクターに組み込み、得られた組み換えベクターを用いて宿主細胞形質転換させるが、宿主細胞としては、細胞性粘菌やSf9昆虫由来細胞等の真核細胞が挙げられ、使用ベクターとしては、例えば細胞性粘菌の場合はpBIGやpTIKL、昆虫細胞の場合はpFastBac等の発現ベクターが挙げられる。
上記形質転換細胞を培養することにより得られる融合タンパク質の例として、図１を示すが、この図１の融合タンパク質は、優性変異アクチンとチモシンとの融合タンパク質であり、優性変異アクチンとチモシンとの間にはキモトリプシン切断部位のアミノ酸配列を有するリンカーペプチド部分が挿入された構造を有し、精製のためのポリヒスチジン配列を有している。
このような融合タンパク質の具体例としては、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列を有する優性変異アクチン−チモシン融合タンパク質、あるいは配列番号５又は７に示される優性変異アクチン−プロフィリン融合タンパク質があげられる。このうち配列番号１と３における優性変異アクチン部分は、細胞性粘菌の野生型actin 15のG64D変異体であり、配列番号５又は７における優性変異アクチン部分は、細胞性粘菌の野生型actin 15のE206A/R207A,/E208A３重変異体である。また、本発明においては、上記配列番号１、５に示される融合タンパク質のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質であって、宿主細胞に対する毒性が低下乃あるいは中和されており、蛋白分解酵素により切断されて内在性アクチンの阻害活性を有するタンパク質を産生する融合タンパク質も包含する。
Next, this fusion gene is incorporated into a vector, and host cells are transformed using the obtained recombinant vector. Examples of host cells include eukaryotic cells such as cellular slime molds and Sf9 insect-derived cells. Examples thereof include expression vectors such as pBIG and pTIKL for cellular slime molds, and pFastBac for insect cells.
FIG. 1 shows an example of a fusion protein obtained by culturing the transformed cells. The fusion protein of FIG. 1 is a fusion protein of a dominant mutant actin and thymosin, and is composed of a dominant mutant actin and thymosin. It has a structure in which a linker peptide portion having an amino acid sequence of a chymotrypsin cleavage site is inserted between them, and has a polyhistidine sequence for purification.
Specific examples of such a fusion protein include a dominant mutant actin-thymosin fusion protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, or a dominant mutant actin-profilin fusion protein shown in SEQ ID NO: 5 or 7. It is done. Among these, the dominant mutant actin moiety in SEQ ID NOs: 1 and 3 is a G64D mutant of wild-type actin 15 of cellular slime mold, and the dominant mutant actin moiety in SEQ ID NO: 5 or 7 is a wild-type actin of cellular slime mold 15 E206A / R207A, / E208A triple mutants. Further, in the present invention, a fusion protein having an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the fusion protein shown in SEQ ID NOs: 1 and 5, Also included are fusion proteins that have reduced or neutralized toxicity to host cells and are cleaved by proteolytic enzymes to produce proteins having endogenous actin inhibitory activity.
以下に、好ましい融合タンパク質の構造を示す。これらにおいては、融合タンパク質の下流側にポリヒスチジンタグ配列が付加されている。
Ｇ６４Ｄ変異アクチン−チモシン融合タンパク質（配列番号３）
（化１）
MDGEDVQALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRDILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYMMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLAYVALDFEAEMQTAASSSALEKSYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNVVLSGGTTMFPGIADRMNKELTALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKEEYDESGPSIVHRKCFASRGGSGGSGGSASDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESHHHHHHHH*
（下線部は、キモトリプシンの切断部位であるリンカー配列、リンカーより上流側はＧ６４Ｄ変異を有するDictyostelium discoideum Actlin15配列、 リンカーより下流側はヒト・チモシンβ配列、及び２重下線部は精製用のポリヒスチジンタグをそれぞれ表す。）
The structure of a preferable fusion protein is shown below. In these, a polyhistidine tag sequence is added downstream of the fusion protein.
G64D mutant actin-thymosin fusion protein (SEQ ID NO: 3)
(Chemical formula 1)
MDGEDVQALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKR D ILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYMMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLAYVALDFEAEMQTAASSSALEKSYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNVVLSGGTTMFPGIADRMNKELTALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKEEYDESGPSIVHRKCF ASRGGSGGSGGSAS DKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES HHHHHHHH *
(The underlined portion is a linker sequence which is a chymotrypsin cleavage site, the upstream side of the linker is a Dictyostelium discoideum Actlin15 sequence having a G64D mutation, the downstream side of the linker is a human thymosin β sequence, and the double underlined portion is a polyhistidine for purification. Represents each tag.)
E206A/R207A,/E208A変異アクチン-プロフィリン融合タンパク質（配列番号７）
（化２）
MDGEDVQALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYMMKILTERGYSFTTTAAAAIVRDIKEKLAYVALDFEAEMQTAASSSALEKSYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNVVLSGGTTMFPGIADRMNKELTALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKEEYDESGPSIVHRKCFASRGGSGGSGGSAMSWQQYVDEQLTGAGLSQGAILGANDGGVWAKSSGINITKPEGDGIAALFKNPAEVFAKGALIGGVKYMGIKGDPQSIYGKKGATGCVLVRTGQAIIVGIYDDKVQPGSAALIVEKLGDYLRDNGYHHHHHHHH*
（上記塩基配列中、下線部はキモトリプシンの切断部位であるリンカー配列、リンカーより上流側はE206A/R207A,/E208A変異を有するDictyostelium discoideum Act1in 15配列、下流側はDictyostelium discoideum Profilin I配列、及び二重下線部は精製用のポリヒスチジンタグをそれぞれ表す。）
E206A / R207A, / E208A mutant actin-profilin fusion protein (SEQ ID NO: 7)
(Chemical formula 2)
MDGEDVQALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYMMKILTERGYSFTTTA AAA IVRDIKEKLAYVALDFEAEMQTAASSSALEKSYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNVVLSGGTTMFPGIADRMNKELTALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKEEYDESGPSIVHRKCF ASRGGSGGSGGSA MSWQQYVDEQLTGAGLSQGAILGANDGGVWAKSSGINITKPEGDGIAALFKNPAEVFAKGALIGGVKYMGIKGDPQSIYGKKGATGCVLVRTGQAIIVGIYDDKVQPGSAALIVEKLGDYLRDNGY HHHHHHHH *
(In the above base sequence, the underlined portion is a linker sequence that is a chymotrypsin cleavage site, the upstream side of the linker is the Dictyostelium discoideum Act1in 15 sequence having the E206A / R207A, / E208A mutation, the downstream side is the Dictyostelium discoideum Profilin I sequence, and the double Underlined parts represent polyhistidine tags for purification.)
これら優性変異アクチンは、内在性アクチンの機能を阻害する優性変異であることが知られているものである。しかし該融合タンパク質においては、プロフィリンまたはチモシンの作用により優性変異アクチンの宿主細胞に対する毒性が低下乃あるいは中和され、精製後、蛋白分解酵素により切断されてアクチン作用を有するタンパク質を産生することができる。
一方、上記融合タンパク質の遺伝子の具体例としては、配列番号２に示される塩基配列を有する優性変異アクチン−チモシン融合タンパク質の遺伝子、あるいは配列番号６に示される塩基配列を有する優性変異アクチン−プロフィリン融合タンパク質の遺伝子が挙げられる。さらに、本発明においては、配列番号２あるいは６に示される塩基配列において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子であって、優性変異アクチンの宿主細胞に対する毒性が低下乃あるいは中和されており、かつ、蛋白分解酵素により切断されてアクチン作用を有するタンパク質を産生する融合タンパク質をコードする遺伝子も包含する。
These dominant mutant actins are known to be dominant mutations that inhibit the function of endogenous actin. However, in the fusion protein, the toxicity of dominant mutant actin to host cells is reduced or neutralized by the action of profilin or thymosin, and after purification, it is cleaved by a proteolytic enzyme to produce a protein having an actin action. it can.
On the other hand, as a specific example of the gene of the fusion protein, the gene of the dominant mutant actin-thymosin fusion protein having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the dominant mutant actin-profilin having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Examples include genes for fusion proteins. Furthermore, in the present invention, the gene has a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 6, and the toxicity of dominant mutant actin to host cells Also included is a gene encoding a fusion protein that is reduced or neutralized and that is cleaved by a proteolytic enzyme to produce a protein having an actin action.
以下に、好ましい融合タンパク質遺伝子の構造を示す。これらにおいては融合タンパク質遺伝子の下流側にポリヒスチジンタグをコードする配列が付加されている。
G6４D変異アクチン-チモシン融合遺伝子の塩基配列（配列番号４）
（化３）
ATGGATGGTGAAGACGTCCAAGCTTTAGTTATTGATAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGCCGGTTTTGCTGGTGACGATGCTCCACGTGCTGTTTTCCCATCAATTGTTGGTCGTCCAAGACACACTGGTGTTATGGTTGGTATGGGTCAAAAAGACTCATATGTAGGTGATGAAGCCCAATCAAAGAGAGATATCTTAACCCTCAAATACCCAATTGAACACGGTATCGTTACCAACTGGGATGATATGGAAAAAATCTGGCATCATACTTTCTACAATGAACTCCGTGTTGCACCAGAAGAACACCCAGTTTTGTTAACAGAAGCTCCATTAAATCCAAAAGCCAACAGAGAAAAAATGACCCAAATTATGTTTGAAACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTTGCCATTCAAGCCGTCTTATCCTTATATGCCTCTGGTCGTACCACCGGTATTGTTATGGATTCAGGTGATGGTGTCTCCCACACTGTACCAATCTATGAAGGTTATGCCTTACCACATGCCATCTTACGTTTAGATTTAGCTGGTCGTGATCTCACCGATTACATGATGAAAATCTTAACTGAACGTGGTTACTCATTCACCACCACTGCCGAAAGAGAAATCGTCAGAGATATCAAAGAGAAATTAGCCTACGTCGCCCTCGACTTTGAAGCTGAAATGCAAACTGCTGCCTCCTCGAGTGCCCTCGAAAAATCATACGAATTACCAGACGGTCAAGTTATCACCATTGGTAACGAACGTTTCCGTTGTCCAGAAGCCCTCTTCCAACCATCATTCTTAGGTATGGAATCTGCTGGTATCCACGAAACCACATACAACTCCATCATGAAATGTGATGTTGATATCCGTAAAGATTTATACGGTAATGTCGTCTTATCAGGTGGTACCACTATGTTCCCAGGTATTGCTGATCGTATGAACAAAGAATTAACTGCTTTAGCACCATCAACCATGAAAATTAAAATCATTGCTCCACCAGAACGTAAATACTCTGTCTGGATTGGTGGATCTATTTTAGCTTCACTCTCAACTTTCCAACAAATGTGGATCTCAAAAGAAGAATATGATGAATCTGGTCCATCAATTGTCCACAGAAAATGTTTCGCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTAGTGCATCAGATAAACCAGATATGGCTGAAATCGAGAAGTTCGATAAGTCAAAGCTTAAGAAAACTGAAACACAAGAAAAGAATCCATTACCATCAAAAGAGACAATTGAACAAGAGAAACAAGCAGGTGAATCACATCATCACCATCATCACCATCATTAA
（上記塩基配列中、下線部はリンカー配列をコードするヌクレオチド配列、リンカーより上流側はG64D変異を有するDictyostelium discoideum act15をコードする塩基配列、下流側はヒト・チモシンβのアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び二重下線は精製用のポリヒスチジンタグをコードする塩基配列をそれぞれ表す。）
The structure of a preferable fusion protein gene is shown below. In these, a sequence encoding a polyhistidine tag is added downstream of the fusion protein gene.
Base sequence of G64D mutant actin-thymosin fusion gene (SEQ ID NO: 4)
(Chemical formula 3)
ATGGATGGTGAAGACGTCCAAGCTTTAGTTATTGATAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGCCGGTTTTGCTGGTGACGATGCTCCACGTGCTGTTTTCCCATCAATTGTTGGTCGTCCAAGACACACTGGTGTTATGGTTGGTATGGGTCAAAAAGACTCATATGTAGGTGATGAAGCCCAATCAAAGAGAG A TTCGCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTAGTGCATCA GATAAACCAGATATGGCTGAAATCGAGAAGTTCGATAAGTCAAAGCTTAAGAAAACTGAAACACAAGAAAAGAATCCATTACCATCAAAAGAGACAATTGAACAAGAGAAACAAGCAGGTGAAT CACATCATCACCATCATCACCATCAT TAA
(In the above base sequence, the underlined nucleotide sequence encodes the linker sequence, the upstream side from the linker is the base sequence encoding Dictyostelium discoideum act15 having the G64D mutation, and the downstream side is the base sequence encoding the amino acid sequence of human thymosin β. , And double underline represent the base sequence encoding the polyhistidine tag for purification, respectively.
E206A/R207A,/E208A変異アクチン-プロフィリン融合遺伝子の塩基配列（配列番号８）
（化４）
ATGGATGGTGAAGATGTTCAAGCTTTAGTTATTGATAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGCCGGTTTTGCTGGTGACGATGCTCCACGTGCTGTTTTCCCATCAATTGTTGGTCGTCCAAGACACACTGGTGTTATGGTTGGTATGGGTCAAAAAGACTCATATGTAGGTGATGAAGCCCAATCAAAGAGAGGTATCTTAACCCTCAAATACCCAATTGAACACGGTATCGTTACCAACTGGGATGATATGGAAAAAATCTGGCATCATACTTTCTACAATGAACTCCGTGTTGCACCAGAAGAACACCCAGTTCTCTTAACCGAAGCTCCATTAAATCCAAAAGCCAACAGAGAAAAAATGACCCAAATTATGTTTGAAACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTTGCCATTCAAGCCGTCTTATCCTTATATGCCTCTGGTCGTACCACCGGTATTGTTATGGATTCAGGTGATGGTGTCTCCCACACTGTACCAATCTATGAAGGTTATGCCTTACCACATGCCATCTTACGTTTAGATTTAGCTGGTCGTGATCTCACCGATTACATGATGAAAATCTTAACTGAACGTGGTTACTCATTCACCACCACTGCCGCAGCTGCAATCGTCAGAGATATCAAAGAGAAATTAGCCTACGTCGCCCTCGACTTTGAAGCTGAAATGCAAACTGCTGCCTCATCATCAGCCCTCGAAAAATCATACGAATTACCAGACGGTCAAGTTATCACCATTGGTAACGAACGTTTCCGTTGTCCAGAAGCCCTCTTCCAACCATCATTCTTAGGTATGGAATCTGCTGGTATCCACGAAACCACATACAACTCCATCATGAAATGTGATGTTGATATCCGTAAAGATTTATACGGTAATGTCGTCTTATCAGGTGGTACAACTATGTTCCCAGGTATTGCTGATCGTATGAACAAAGAATTAACTGCTTTAGCACCATCAACCATGAAAATTAAAATCATTGCTCCACCAGAACGTAAATACTCTGTCTGGATTGGTGGATCTATTTTAGCTTCACTCTCAACTTTCCAACAAATGTGGATCTCAAAAGAAGAATATGATGAATCTGGTCCATCAATTGTCCACAGAAAATGTTTCGCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTAGTGCAATGAGCTGGCAACAATATGTCGATGAACAATTAACTGGTGCAGGACTTTCTCAAGGAGCAATTTTAGGTGCAAATGATGGTGGTGTTTGGGCTAAATCATCAGGTATTAATATTACTAAACCAGAAGGTGATGGTATAGCTGCTTTATTCAAAAATCCAGCTGAGGTATTTGCTAAGGGTGCTTTGATTGGTGGAGTAAAATATATGGGTATTAAGGGTGACCCACAAAGTATCTATGGTAAAAAGGGAGCAACTGGTTGTGTTCTTGTTAGAACAGGCCAAGCAATCATTGTTGGCATTTATGATGATAAAGTCCAACCAGGATCAGCTGCACTTATTGTTGAAAAGTTAGGTGATTACTTAAGAGATAATGGTTATCATCATCACCATCATCACCATCATTAA
（上記塩基配列中、下線部はリンカーをコードするヌクレオチド配列、リンカーより上流側はE206A/R207A,/E208A変異を有するDictyostelium discoideum act15をコードする塩基配列、下流側はDictyostelium discoideum pfiIをコードする塩基配列、及び二重下線は精製用のポリヒスチジンタグをコードする塩基配列をそれぞれ表す。）
E206A / R207A, / E208A Mutant Actin-Profilin Fusion Gene Base Sequence (SEQ ID NO: 8)
(Chemical formula 4)
C A GCT G C AATCGTCAGAGATATCAAAGAGAAATTAGCCTACGTCGCCCTCGACTTTGAAGCTGAAATGCAAACTGCTGCCTCATCATCAGCCCTCGAAAAATCATACGAATTACCAGACGGTCAAGTTATCACCATTGGTAACGAACGTTTCCGTTGTCCAGAAGCCCTCTTCCAACCATCATTCTTAGGTATGGAATCTGCTGGTATCCACGAAACCACATACAACTCCATCATGAAATGTGATGTTGATATCCGTAAAGATTTATACGGTAATGTCGTCTTATCAGGTGGTACAACTATGTTCCCAGGTATTGCTGATCGTATGAACAAAGAATTAACTGCTTTAGCACCATCAACCATGAAAATTAAAATCATTGCTCCACCAGAACGTAAATACTCTGTCTGGATTGGTGGATCTATTTTAGCTTCACTCTCAACTTTCCAACAAATGTGGATCTCAAAAGAAGAATATGATGAATCTGGTCCATCAATTGTCCACAGAAAATGTTTC GCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTAGTGCA ATGAGCTGGCAACAATATGTCGATGAACAATTAACTGGTGCAGGACTTTCTCAAGGAGCAATTTTAGGTGCAAATGATGGTGGTGTTTGGGCTAAATCATCAGGTATTAATATTACTAAACCAGAAGGTGATGGTATAGCTGCTTTATTCAAAAATCCAGCTGAGGTATTTGCTAAGGGTGCTTTGATTGGTGGAGTAAAATATATGGGTATTAAGGGTGACCCACAAAGTATCTATGGTAAAAAGGGAGCAACTGGTTGTGTTCTTGTTAGAACAGGCCAAGCAATCATTGTTGGCATTTATGATGATAAAGTCCAACCAGGATCAGCTGCACTTATTGTTGAAAAGTTAGGTGATTACTTAAGAGATAATGGTTAT CATCATCACCATCATCACCATCAT TAA
(In the above base sequence, the underlined nucleotide sequence encoding the linker, the upstream side of the linker is the base sequence encoding Dictyostelium discoideum act15 having the E206A / R207A, / E208A mutation, and the downstream side is the base sequence encoding Dictyostelium discoideum pfiI , And double underline represent the base sequence encoding the polyhistidine tag for purification, respectively.
上記遺伝子を使用して遺伝子工学的手法により得られる融合タンパク質は、宿主細胞から抽出、精製し、キモトリプシンで切断することにより優性変異アクチンを得る。融合タンパク質遺伝子にポリヒスチジンをコードする配列を付加した場合には、宿主細胞から融合遺伝子を抽出後、可溶性分画をニッケルアフィニティアガロースカラムクロマトグラフィーにより精製したのちキモトリプシンで切断する。酵素反応液から優性変異アクチン（例えば、G64DおよびE206A/R207A,/E208A）を単離するには、酵素反応液をイオン交換カラムクロマトグラフィーに通すことで精製するが、場合によっては、酵素反応溶液を再度ニッケルアフィニティカラムに通し、ポリヒスチジンタグと結合したプロフィリンまたはチモシンを選択的に除去することができ、ポリヒスチジンタグの付加は優性変異アクチンの製造、単離において極めて有効である。
A fusion protein obtained by genetic engineering techniques using the above gene is extracted from a host cell, purified, and cleaved with chymotrypsin to obtain a dominant mutant actin. When a sequence encoding polyhistidine is added to the fusion protein gene, after extracting the fusion gene from the host cell, the soluble fraction is purified by nickel affinity agarose column chromatography and then cleaved with chymotrypsin. In order to isolate dominant mutant actin (for example, G64D and E206A / R207A, / E208A) from the enzyme reaction solution, the enzyme reaction solution is purified by passing it through ion exchange column chromatography. Can be passed again through a nickel affinity column to selectively remove the profilin or thymosin bound to the polyhistidine tag, and the addition of the polyhistidine tag is extremely effective in the production and isolation of dominant mutant actin.
以下に、本発明の実施例を示すが、本願発明はこれに限定されない。
〔実施例１〕
融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
（１）E206A/R207A/E208A変異アクチン−プロフィリン融合タンパク質をコードする遺伝子含有プラスミドの調製
ａ）pTIKLAct15の構築
細胞性粘菌のact15 遺伝子(accession # M14146)をGFP融合タンパク質の形で発現するプラスミドpBIG GFP-actin (Asano et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 59:17-27, 2004)をテンプレート、5’actttcatgcaatctagataaaaa（配列番号３０）および
5’aacgaattcacgcgttagctagcgaaacattttctgtggacaat（配列番号３１）をプライマーとするＰＣＲを行い、5’側にXbaI、3’側にNheI-stop-MluI-EcoRIを付加したact15 のpromoterとcoding sequenceを含む増幅産物を得、これをpGEM7-Zf(-)(Promega)のXbaI/EcoRIサイトにサブクローンしてpGEMact15を得た。次に、pLD1A15SN(Robinson and Spudich, J Cell Biol. 150:823-838, 2000)をMluIとBamHIで切断して5’側にMluI、3’側にBamHIをもつact15 terminator 配列を切り出し、これを、pGEMact15のMluI/BamHIサイトに挿入して、 pGEMact15NheMluTermを得た。次に、挿入配列全体をXbaIとSacIで切り出し、pTIKL (Liu et al., PNAS 95: 14124-14129, 1998)のXbaI/SacIサイトに挿入して、act15の発現プラスミドであるpTIKLAct15を得た。
Although the Example of this invention is shown below, this invention is not limited to this.
[Example 1]
Preparation of gene encoding fusion protein
(1) Preparation of E206A / R207A / E208A Mutant Actin-Profilin Fusion Protein-Containing Plasmid a) Construction of pTIKLAct15 Plasmid expressing cellular slime mold act15 gene (accession # M14146) in the form of a GFP fusion protein pBIG GFP-actin (Asano et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 59: 17-27, 2004) as a template, 5'actttcatgcaatctagataaaaa (SEQ ID NO: 30) and
Perform PCR using 5'aacgaattcacgcgttagctagcgaaacattttctgtggacaat (SEQ ID NO: 31) as a primer to obtain an amplification product containing act15 promoter and coding sequence with XbaI on the 5 'side and NheI-stop-MluI-EcoRI on the 3' side. Was subcloned into the XbaI / EcoRI site of pGEM7-Zf (-) (Promega) to obtain pGEMact15. Next, pLD1A15SN (Robinson and Spudich, J Cell Biol. 150: 823-838, 2000) was cut with MluI and BamHI to cut out an act15 terminator sequence having MluI on the 5 ′ side and BamHI on the 3 ′ side. And inserted into the MluI / BamHI site of pGEMact15 to obtain pGEMact15NheMluTerm. Next, the entire insert sequence was excised with XbaI and SacI and inserted into the XbaI / SacI site of pTIKL (Liu et al., PNAS 95: 14124-14129, 1998) to obtain pTIKLAct15, an expression plasmid for act15.
ｂ）pTIKLAPの構築
細胞性粘菌Ax2株から定法に従ってTotal RNAを抽出し、
5’ccagtgagcagagtgacgaggactcgagctcaagcttttttttttttttttt（配列番号３２）プライマーとReverTra Ace 逆転写酵素(Toyobo)を用いて定法に従いfirst strandを合成した。Cetrisepスピンカラムによりプライマーを除去した後、これをテンプレート、5’gtcgacaatgagctggcaacaatatgtcg（配列番号３３）および
5’gaggactcgagctcaagctt（配列番号３４）をプライマーとするPCRを行い、増幅産物をpGEM T easyベクター(Promega)にサブクローンして、pfiI 遺伝子(accession # X61581)を含むプラスミドを選択し、pGEMpfiIとした。
次に、pGEMpfiIをテンプレート、
5’agctagcagaggtggatccggaggttctggaggtagtgcaatgagctggcaacaatatgtc（配列番号３５）と5’aacgcgttaatgatggtgatgatggtgatgatgataaccattatctcttaagtaat（配列番号３６）をプライマーとしたPCRを行い、5’側にNheIサイトとASRGGSGGSGGSA（配列番号３７）というリンカーをコードする配列を、3’側にHHHHHH-stop（配列番号２７）をコードする配列とMluIサイトをもつpfiIを含む増幅産物をpGEM-T easyにサブクローンして、pGEMPfiIを得た。配列をDNAシーケンスにより確認後、インサート全体をNheIとMluIで切り出し、pTIKLA15のNheI/MluIに挿入して、アクチン・プロフィリン融合タンパク質を発現するpTIKLAPを得た。
b) Construction of pTIKLAP Total RNA was extracted from the cellular slime mold Ax2 strain according to a conventional method,
First strand was synthesized according to a conventional method using 5′ccagtgagcagagtgacgaggactcgagctcaagcttttttttttttttttt (SEQ ID NO: 32) primer and ReverTra Ace reverse transcriptase (Toyobo). After removing the primer with a Cetrisep spin column, this was used as a template, 5'gtcgacaatgagctggcaacaatatgtcg (SEQ ID NO: 33) and
PCR was performed using 5′gaggactcgagctcaagctt (SEQ ID NO: 34) as a primer, the amplified product was subcloned into the pGEM T easy vector (Promega), and a plasmid containing the pfiI gene (accession # X61581) was selected to obtain pGEMpfiI.
Next, pGEMpfiI as a template,
Perform PCR using 5'agctagcagaggtggatccggaggttctggaggtagtgcaatgagctggcaacaatatgtc (SEQ ID NO: 35) and 5'aacgcgttaatgatggtgatgatggtgatgatgataaccattatctcttaagtaat (SEQ ID NO: 36) as a primer on the 5 'side and the GS 37 on the GS side as a GS An amplification product containing pfiI having a sequence encoding HHHHHH-stop (SEQ ID NO: 27) and an MluI site was subcloned into pGEM-T easy to obtain pGEMPfiI. After confirming the sequence by DNA sequencing, the entire insert was excised with NheI and MluI and inserted into NheI / MluI of pTIKLA15 to obtain pTIKLAP that expresses the actin-profilin fusion protein.
ｃ）pTIKLE206A/R207A/E208AAPの構築
上記（１）ａ）で得たpGEMact15をテンプレートとし、5’GCTGCAATCGTACGCGATATCAAAGAAAAATTAGCCTA８配列番号３８）および5’GATATCGCGTACGATTGCAGCTGCGGCAGTGGTGGTGAATGA（配列番号３９）をプライマーとするＰＣＲを行い、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿後、増幅産物をBsiWIおよびDpnIで切断し、アガロース電気泳動をおこない、約4 kbpのバンドを精製した。これを、polynucleotide kinase処理およびT4 DNA ligaseによるライゲーション処理により環状化し、大腸菌DH5αを形質転換した。ミニプレップを行ってBsiWI切断サイトのあるものを選び、さらにＤＮＡシーケンサーにより、三重変異E206A/R207A/E208AをコードするA617C/A619G/G620C/A621T/A623C変異があり、かつその他の変異がないことを確認し、pGEMact15E206A/R207A/E208Aとした。これをEco105IとNheIで切断して変異部位を含む断片を切り出し、pTIKLAPの対応する断片と置換し、pTIKLE206A/R207A/E208AAPを得た。
このプラスミドはＥ206A/R207A,/E208A三重変異アクチン・プロフィリン融合タンパク質をコードするA617C/A619G/G620C/A621T/A623C変異アクチン・プロフィリン融合遺伝子（配列番号８）を有する。
c) Construction of pTIKLE206A / R207A / E208AAP PCR using pGEMact15 obtained in (1) above as a template, 5'GCTGCAATCGTACGCGATATCAAAGAAAAATTAGCCTA8 SEQ ID NO: 38) and 5'GATATCGCGTACGATTGCAGCTGCGGCAGTGGTGGTGAATGA (SEQ ID NO: 39) as a primer After ethanol precipitation, the amplified product was cleaved with BsiWI and DpnI, and subjected to agarose electrophoresis to purify a band of about 4 kbp. This was circularized by polynucleotide kinase treatment and ligation treatment with T4 DNA ligase, and E. coli DH5α was transformed. Perform a miniprep to select one with a BsiWI cleavage site, and then use a DNA sequencer to confirm that there is an A617C / A619G / G620C / A621T / A623C mutation encoding the triple mutation E206A / R207A / E208A and no other mutations. It confirmed and it was set as pGEMact15E206A / R207A / E208A. This was cut with Eco105I and NheI to cut out a fragment containing the mutation site and replaced with the corresponding fragment of pTIKLAP to obtain pTIKLE206A / R207A / E208AAP.
This plasmid has the A617C / A619G / G620C / A621T / A623C mutant actin / profilin fusion gene (SEQ ID NO: 8) encoding the E206A / R207A, / E208A triple mutant actin / profilin fusion protein.
（２）Ｇ６４Ｄ変異アクチン−チモシン融合タンパク質をコードする遺伝子含有プラスミドの調製
ａ）pTIKLARPの構築
発現プラスミドpTIKLAP中のact15内に効率的に変異を導入するため、act15コード領域をユニークサイト(AatII, HpaI, XhoI, KpnI, NheI)で区切られた４つの領域(Frag1, Frag2, Frag3, Frag4)に分ける操作を行った（ただしAatIIサイトは、act15コード領域の13-18残基に位置し、12残基目までは上記分割領域に含まれない）。このため、pBIG GFP-actinをテンプレートとし、以下の４組プライマーを用いたPCRを行った。
Frag1用：5’GACGTCCAAGCTTTAGTTATTGATAA（配列番号１１）と5’GTTAACAAAACTGGGTGTTCTTCTGGTG3’ （配列番号１２）、
Frag2用：5’GTTAACAGAAGCTCCATTAAATCCAAAA（配列番号１３）と5’CTCGAGGAGGCAGCAGTTTGCATTT3’ （配列番号１４）、
Frag3用：5’CTCGAGTGCCCTCGAAAAATCATAC（配列番号１５）と5’GGTACCACCTGATAAGACGACATTAC3’ （配列番号１６）、
Frag4用：5’GGTACCACTATGTTCCCAGGTATTG（配列番号１７）と5’GCTAGCGAAACATTTTCTGTGGACAAT3’（配列番号１８）。
(2) Preparation of a gene-containing plasmid encoding a G64D mutant actin-thymosin fusion protein a) Construction of pTIKLARP In order to efficiently introduce mutation into act15 in the expression plasmid pTIKLAP, the act15 coding region is assigned to a unique site (AatII, HpaI , XhoI, KpnI, NheI) (Frag1, Frag2, Frag3, Frag4) was performed (however, the AatII site is located at residues 13-18 of the act15 coding region, 12 residues The basic area is not included in the divided area). Therefore, PCR was performed using pBIG GFP-actin as a template and the following four sets of primers.
For Frag1: 5'GACGTCCAAGCTTTAGTTATTGATAA (SEQ ID NO: 11) and 5'GTTAACAAAACTGGGTGTTCTTCTGGTG3 '(SEQ ID NO: 12),
For Frag2: 5'GTTAACAGAAGCTCCATTAAATCCAAAA (SEQ ID NO: 13) and 5'CTCGAGGAGGCAGCAGTTTGCATTT3 '(SEQ ID NO: 14),
For Frag3: 5'CTCGAGTGCCCTCGAAAAATCATAC (SEQ ID NO: 15) and 5'GGTACCACCTGATAAGACGACATTAC3 '(SEQ ID NO: 16),
For Frag4: 5'GGTACCACTATGTTCCCAGGTATTG (SEQ ID NO: 17) and 5'GCTAGCGAAACATTTTCTGTGGACAAT3 '(SEQ ID NO: 18).
増幅産物は、pGEMT-easyまたはpUC19のSmaIサイトに挿入し、 配列をDNAシーケンスにより確認し、それぞれpGEM-F1, pGEM-F2, pUC19-F3,およびpUC19-F4とした。
次に、pBluescrptAct15P（東大・須藤和夫教授より分与）をテンプレート、5’GACGTCTTCACCATCCATTTTTATTTTTTATTTAATTTAA3’（配列番号１９）と5’CAGGAAACAGCTATGAC3’（配列番号２０）をプライマーとするPCRを行い、3’側にAatIIサイトまでのact15の18残基を付加したact15プロモーターを増幅し、これをpGEM-T easyに挿入してpGEM-a15pを得た。
pGEM-F1のSac I, Aat II切断により得られたFrag1を、pGEM-a15pのSac I/Aat IIサイトに挿入し、pGEM-pF1とした。同様にpGEM-F2のSacＩ, HpaＩ切断により得られたFrag2をpGEM-pF1のSacＩ/HpaＩサイトに挿入し、pGEM-pF1-2とした。次にpUC19-F3のPvuＩＩ、XhoＩ切断により得られたFrag3をpGEM-pF1-2のNaeＩ/XhoＩサイトに挿入し、pGEM-pF1-3とした。最後に、pUC19-F4をKpnＩで切断し、得られたFrag4をpGEM-pF1-3のKpnＩサイトに挿入して、サイレント変異により四つのユニークサイトをもつ変異型act15遺伝子ARを完成させ、pGEM-ARとした。なお、挿入されたFrag4の方向は配列を読むことにより確認した。pGEM-ARをXbaＩ、NheＩで切断し、得られたAR断片をpTIKL-APのXbaＩ、NheＩサイトに挿入して、pTIKLARPとした。
Amplified products were inserted into the SmaI site of pGEMT-easy or pUC19, and the sequences were confirmed by DNA sequencing to give pGEM-F1, pGEM-F2, pUC19-F3, and pUC19-F4, respectively.
Next, PCR was performed using pBluescrptAct15P (provided by Professor Kazuo Suto, University of Tokyo) as a template, 5'GACGTCTTCACCATCCATTTTTATTTTTTATTTAATTTAA3 '(SEQ ID NO: 19) and 5'CAGGAAACAGCTATGAC3' (SEQ ID NO: 20), and the AatII site on the 3 'side The act15 promoter added with 18 residues of act15 was amplified and inserted into pGEM-T easy to obtain pGEM-a15p.
Frag1 obtained by cutting Sac I and Aat II of pGEM-F1 was inserted into the Sac I / Aat II site of pGEM-a15p to obtain pGEM-pF1. Similarly, Frag2 obtained by cutting SacI and HpaI of pGEM-F2 was inserted into the SacI / HpaI site of pGEM-pF1 to obtain pGEM-pF1-2. Next, Frag3 obtained by cutting PUC19-F3 with PvuII and XhoI was inserted into the NaeI / XhoI site of pGEM-pF1-2 to obtain pGEM-pF1-3. Finally, pUC19-F4 is cleaved with KpnI, and the resulting Frag4 is inserted into the KpnI site of pGEM-pF1-3 to complete a mutant act15 gene AR having four unique sites by silent mutation. AR. The direction of the inserted Frag 4 was confirmed by reading the sequence. pGEM-AR was cleaved with XbaI and NheI, and the obtained AR fragment was inserted into the XbaI and NheI sites of pTIKL-AP to obtain pTIKLARP.
ｂ）チモシンβ４遺伝子の合成
発現のホストである細胞性粘菌はヒトとコドン使用頻度が大きく異なるので、ヒト・チモシンβ4遺伝子をそのまま細胞性粘菌で発現させると発現効率が低下する恐れがあった。そこで、細胞性粘菌のコドンバイアスを考慮しつつ、ヒト・チモシンβ4をコードする遺伝子は以下に述べるPCRを用いた合成法によって得た。まずチモシンβ4配列を二つの領域に分割し、それぞれを、二つのオリゴヌクレオチドによる相互伸長反応により合成した。伸長反応条件は通常のPCRの条件を用い、オリゴヌクレオチドは以下の二組を用いた。
5’GGTTCTGGAGGTAGTGCATCAGATAAACCAGATATGGCTGAAA（配列番号２１）
と5’CTTAAGCTTTGACTTATCGAACTTCTCGATTTCAGCCATATCTGG（配列番号２２）及び、
5’CTTAAGAAAACTGAAACACAAGAAAAGAATCCATTACCATCAAAAGAGACAATTGAAC（配列番号２３）
と5’ATGATGGTGATGATGTGATTCACCTGCTTGTTTCTCTTGTTCAATTGTCTCTTTTGA（配列番号２４）
（下線部は、互いのオリゴヌクレオチドがアニーリングする領域を示す。）
反応産物はそれぞれpUC19のSmaIサイトに挿入し、配列を確認して、それぞれpUC19-Thymo1とpUC19-Thymo2とした。pUC19-Thymo2をEcoRＩとAflＩＩで切断し、得られた断片をpUC19-Thymo1のEcoRＩ/AflＩＩサイトに挿入し、 pUC19-Thymosinを得た。
b) Synthesis of thymosin β4 gene Cellular slime molds, which are hosts for expression, differ greatly in codon usage from humans. Therefore, expression of human thymosin β4 gene in cellular slime molds may reduce the expression efficiency. It was. Therefore, the gene encoding human thymosin β4 was obtained by a synthesis method using PCR described below, taking into account the codon bias of cellular slime molds. First, the thymosin β4 sequence was divided into two regions, and each was synthesized by a mutual extension reaction with two oligonucleotides. The extension reaction conditions were normal PCR conditions, and the following two oligonucleotides were used.
5'GGTTCTGGAGGTAGTGCATCAGATAAA CCAGATATGGCTGAAA (SEQ ID NO: 21)
And 5'CTTAAGCTTTGACTTATCGAACTTCTCGA TTTCAGCCATATCTGG (SEQ ID NO: 22), and
5'CTTAAGAAAACTGAAACACAAGAAAAGAATCCATTACCA TCAAAAGAGACAATTGAAC (SEQ ID NO: 23)
And 5'ATGATGGTGATGATGTGATTCACCTGCTTGTTTCTCTT GTTCAATTGTCTCTTTTGA (SEQ ID NO: 24)
(The underlined portion indicates a region where each oligonucleotide anneals.)
Each reaction product was inserted into the SmaI site of pUC19 and the sequence was confirmed to be pUC19-Thymo1 and pUC19-Thymo2, respectively. pUC19-Thymo2 was cleaved with EcoRI and AflII, and the resulting fragment was inserted into the EcoRI / AflII site of pUC19-Thymo1 to obtain pUC19-Thymosin.
ｃ）pTIKLARTの構築
上記ｂ）で得られたpUC19-Thymosinをテンプレートとし、
5’GCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTA（配列番号２５）と
5’ACGCGTTAATGATGGTGATGATGGTGATGATGTGATTCACCT（配列番号２６）をプライマーとするPCRを行い、5’側にNheIサイト、3’側にHHHHHH（配列番号２７）をコードする配列とstopコドンおよびMluIサイトを付加した人工チモシン４遺伝子を得て、これをpUC19のSmaIサイトに挿入し、pUC19-link-Thymosin-Hisを得た。次に、pUC19-link-Thymosin-HisをNheIとMluIで切断し、得られた断片を上記（２）ａ）で得られたpTIKLARPのNheI/MluIサイトに導入して、pfiI遺伝子を人工チモシン遺伝子で置換したpTIKLARTを得た
c) Construction of pTIKLART Using pUC19-Thymosin obtained in b) above as a template,
5'GCTAGCAGAGGTGGATCCGGAGGTTCTGGAGGTA (SEQ ID NO: 25) and
PCR using 5'ACGCGTTAATGATGGTGATGATGGTGATGATGTGATTCACCT (SEQ ID NO: 26) as a primer, artificial thymosin 4 gene added with a NheI site on the 5 'side, a sequence encoding HHHHHH (SEQ ID NO: 27) on the 3' side, a stop codon and an MluI site And inserted into the SmaI site of pUC19 to obtain pUC19-link-Thymosin-His. Next, pUC19-link-Thymosin-His is cleaved with NheI and MluI, and the resulting fragment is introduced into the NheI / MluI site of pTIKLARP obtained in (2) a) above, so that the pfiI gene is artificial thymosin gene. Obtained pTIKLART substituted with
ｄ）pTIKLG64DARTの構築
上記（１）ａ）で得られたpGEM-F1をテンプレート、5’ATCTTAACCCTCAAATA（配列番号２８）と5’ ATCTCTCTTTGATTGGG（配列番号２９）をプライマーとしてPCRを行った。増幅産物をpolynucleotide kinaseおよびT4 DNA ligaseで処理して環状化させ、さらにDpnI処理によって不要なテンプレートの分解を行ったあと、大腸菌の形質転換を行った。得られたコロニーから、EcoRVサイトが形成されているものを選び、さらにDNAシーケンサーにより配列を確認してpGEM-G64Dを得た。pGEM-G64DをAatIIとHpaIで切断して変異部位を含むFrag1を切り出し、これをpTIKLARTのAat II/Hpa Iサイトに挿入することにより、pTIKLG64DARTを得た。
この組換えプラスミドはＧ６４D変異（アクチンにおいてはＮ末のメチオニンが翻訳後除去されるので、成熟タンパク質においては63番のグリシンからアスパラギン酸への置換にあたる）アクチン・チモシン融合タンパク質をコードするG191A変異アクチン・チモシン融合遺伝子（配列番号４）を有する。
d) Construction of pTIKLG64DART PCR was performed using pGEM-F1 obtained in (1) a) above as a template and 5′ATCTTAACCCTCAAATA (SEQ ID NO: 28) and 5 ′ ATCTCTCTTTGATTGGG (SEQ ID NO: 29) as primers. The amplified product was treated with polynucleotide kinase and T4 DNA ligase to be circularized, and unnecessary templates were decomposed by DpnI treatment, followed by transformation of E. coli. From the obtained colonies, those having an EcoRV site were selected, and the sequence was confirmed by a DNA sequencer to obtain pGEM-G64D. pTIKLG64DART was obtained by cleaving pGEM-G64D with AatII and HpaI to cut out Frag1 containing the mutation site and inserting it into the Aat II / Hpa I site of pTIKLART.
This recombinant plasmid has a G64D mutation (in the actin, the N-terminal methionine is post-translationally removed, so in the mature protein, it corresponds to the replacement of the 63rd glycine with aspartic acid). A G191A mutant actin encoding an actin / thymosin fusion protein -It has a thymosin fusion gene (SEQ ID NO: 4).
〔実施例２〕G64D変異アクチン・チモシン融合タンパク質の発現、および同蛋白質からのG64D変異アクチンの製造
野生型Dictyostelium discoidem Ax2株を、electroporation 法(文献Egelhoff et al., 1991)により、実施例１（２）ｄ）で得られたpTIKLG64DART で形質転換し、温度21度において形質転換体を12 mg/mL G418を含むHL5培地中(文献Sussman, 1987)で選択培養し、さらに1-3 LのHL5培地で大量培養した。
得られた細胞を遠心(1700×g, 5 min)によって集菌した。以後の操作はすべて4 ℃または氷上にて行った。細胞ペレットは10 mM Tris-HCl pH 7.4で二度洗浄し、細胞重量の2倍量のBinding buffer 1 (10 mM Imidazole pH 7.4, 10 mM Hpes pH7.4, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)を加え、懸濁した。さらにBinding Buffer 2 (Binding Buffer1プラス2.5% Triton X-100およびタンパク質分解酵素阻害剤) を細胞重量の2倍量を加えることで溶菌させ、遠心(40,000×g, 30 min)した。上澄み液はNi Sepharose High Performance(GEヘルスケアバイオサイエンス社)と一時間混合し、G64D変異アクチン・チモシン融合タンパク質を吸着させた。Ni Sepharose High Performanceをwash buffer (20 mM Imidazole pH 7.4, 300 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)で洗浄した後、elution buffer (300 mM Imidazole pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)によってG64Dアクチン・チモシン融合タンパク質を溶出させた。
[Example 2] Expression of G64D mutant actin-thymosin fusion protein and production of G64D mutant actin from the same protein Wild type Dictyostelium discoidem Ax2 strain was prepared by electroporation (Reference Egelhoff et al., 1991) in Example 1 (Reference Egelhoff et al., 1991). 2) Transformation with pTIKLG64DART obtained in d), and transformant was selectively cultured in HL5 medium containing 12 mg / mL G418 (reference Sussman, 1987) at a temperature of 21 ° C., and further 1-3 L of HL5 Large-scale culture was performed in the medium.
The obtained cells were collected by centrifugation (1700 × g, 5 min). All subsequent operations were performed at 4 ° C or on ice. The cell pellet was washed twice with 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and binding buffer 1 (10 mM Imidazole pH 7.4, 10 mM Hpes pH 7.4, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 1) mM ATP, 7 mM β-mercaptoethanol) was added and suspended. Further, Binding Buffer 2 (Binding Buffer 1 plus 2.5% Triton X-100 and a protease inhibitor) was lysed by adding twice the cell weight and centrifuged (40,000 × g, 30 min). The supernatant was mixed with Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare Bioscience) for 1 hour to adsorb the G64D mutant actin-thymosin fusion protein. Ni Sepharose High Performance was washed with wash buffer (20 mM Imidazole pH 7.4, 300 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 , 0.1 mM ATP, 7 mM β-mercaptoethanol), and then elution buffer (300 mM Imidazole pH 7.4, 50 mM NaCl , 0.1 mM ATP, 7 mM β-mercaptoethanol), and G64D actin-thymosin fusion protein was eluted.
Ni Sepharose High Performanceからの溶出液をキモトリプシン切断バッファ（10 mM Hepes pH 7.4, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, 0.1 mM DTT, 0.01% NaN3 ）に対して透析した後、超遠心(300,000×g, 15 min)を行い、上澄み液をG64D変異アクチン・チモシン融合タンパク質の粗精製液とした。これに、タンパク質の重量比で1,000 : 1になるようにTLCK処理済みキモトリプシンを加え、25℃で20分間消化反応を行った。反応は0.2 mM PMSF添加で停止させた。未消化のG64D変異アクチン・チモシン融合タンパク質、遊離したチモシン。およびその他の不純物を除くため反応液を再度Ni Sepharose High Performanceに通した。素通り液をEcono-Pac High Q Cartridgeに通し、G64D変異アクチンを吸着させた。Econo-Pac High Q Cartridgeを150 mM NaClを含むキモトリプシン切断バッファで洗浄し、300 mM NaClを含むキモトリプシン切断バッファによってG64D変異アクチンを溶出させた。溶出液はキモトリプシン切断バッファに対して透析した後、超遠心(300,000×g, 15 min, 4℃)した。上澄み液をG-bufferに対して透析し、これを精製G64D変異アクチンとした。培養液1 Lから0.6 mgのG64D変異アクチン（配列番号１１）が得られた。各精製段階における電気泳動の結果を図２に示す。図中の各レーンは以下のとおりである。 The eluate from Ni Sepharose High Performance was dialyzed against chymotrypsin cleavage buffer (10 mM Hepes pH 7.4, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 , 0.1 mM ATP, 0.1 mM DTT, 0.01% NaN 3 ), and then ultracentrifuged (300,000 × g, 15 min) was performed, and the supernatant was used as a crude purified solution of G64D mutant actin-thymosin fusion protein. To this was added TLCK-treated chymotrypsin so that the protein weight ratio was 1,000: 1, and a digestion reaction was performed at 25 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 0.2 mM PMSF. Undigested G64D mutant actin-thymosin fusion protein, free thymosin. In order to remove impurities and other impurities, the reaction solution was again passed through Ni Sepharose High Performance. The flow-through solution was passed through Econo-Pac High Q Cartridge to adsorb G64D mutant actin. Econo-Pac High Q Cartridge was washed with chymotrypsin cleavage buffer containing 150 mM NaCl, and G64D mutant actin was eluted with chymotrypsin cleavage buffer containing 300 mM NaCl. The eluate was dialyzed against chymotrypsin cleavage buffer and then ultracentrifuged (300,000 × g, 15 min, 4 ° C.). The supernatant was dialyzed against G-buffer to obtain purified G64D mutant actin. 0.6 mg of G64D mutant actin (SEQ ID NO: 11) was obtained from 1 L of the culture broth. The results of electrophoresis at each purification stage are shown in FIG. Each lane in the figure is as follows.
Lane 1； 粗精製G64D変異アクチン・チモシン融合タンパク質。
Lane 2； キモトリプシン限定分解後。
Lane 3； 2nd Ni-アフィニティクロマトグラフィー素通り分画。
Lane 4； Q-Sepharoseからの溶出分画。
Lane 5, 6； 同分画を重合条件下で超遠心したペレット(5)と上澄(6)
Lane 1; Crudely purified G64D mutant actin-thymosin fusion protein.
Lane 2; After limited chymotrypsin degradation.
Lane 3; 2 nd Ni- affinity chromatography effluent fraction.
Lane 4; Elution fraction from Q-Sepharose.
Lane 5, 6; Pellet (5) and supernatant (6) after ultracentrifugation of the same fraction under polymerization conditions
〔実施例３〕E206A/R207A,/E208A変異アクチン・プロフィリン融合タンパク質の発現、および同蛋白質からのE206A/R207A,/E208A変異アクチンの製造
なお、E206A/R207A,/E208A三重変異アクチンは、酵母Saccharomyces cerevisiae において優性致死であることが示されている（Wertman, K. F., D. G. Drubin, and D. Botstein (1992) Genetics 132: 337-350.）。
Example 3 Expression of E206A / R207A, / E208A Mutant Actin Profilin Fusion Protein and Production of E206A / R207A, / E208A Mutant Actin from the Protein E206A / R207A, / E208A Triple Mutant Actin is yeast It has been shown to be dominant lethal in Saccharomyces cerevisiae (Wertman, KF, DG Drubin, and D. Botstein (1992) Genetics 132: 337-350.).
実施例１（１）ｃ）で得られたpTIKLE206A/R207A,/E208AAPを用いて野生型Dictyostelium discoidem Ax2株の形質転換を行った。
なお、形質転換、形質転換体の選択培養、および大量培養は実施例２と同様に行った。
以後の操作はすべて4 ℃または氷上にて行った。細胞は、低速遠心(1700×g, 5 min)によって収穫し、さらにを10 mM Tris-HCl pH 7.4で二度洗浄した。細胞ペレットを細胞重量の2倍量のBinding buffer 1 (10 mM Imidazole pH 7.4, 10 mM Hpes pH7.4, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)に懸濁した。
The wild type Dictyostelium discoidem Ax2 strain was transformed using pTIKLE206A / R207A, / E208AAP obtained in Example 1 (1) c).
In addition, transformation, selective culture of the transformant, and mass culture were performed in the same manner as in Example 2.
All subsequent operations were performed at 4 ° C or on ice. The cells were harvested by low speed centrifugation (1700 × g, 5 min) and further washed twice with 10 mM Tris-HCl pH 7.4. The cell pellet was suspended in Binding buffer 1 (10 mM Imidazole pH 7.4, 10 mM Hpes pH 7.4, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM ATP, 7 mM β mercaptoethanol) twice the cell weight. .
さらにBinding Buffer 2 (Binding Buffer1プラス 1% Triton X-100,プロテアーゼ阻害剤) を細胞重量の2倍量を加えることで溶菌させ、ただちに遠心(40,000×g, 30 min)した。上澄み液を、細胞重量の1/5容のHighTrap Hisレジン (アマシャム・ファルマシア)と30分混合し、アクチン・プロフィリン融合タンパク質を吸着させた。次に、HighTrap Hisレジンをwash buffer (20 mM Imidazole pH 7.4, 300 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)で洗浄した後、wash bufferからelution buffer (400 mM imidazole pH 7.4, 25 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, 7 mM βメルカプトエタノール)へのリニアグラジエントによってアクチン・プロフィリン融合タンパク質を含むタンパク質を溶出した。溶出分画は、キモトリプシン切断buffer (10 mM Hepes pH 7.4, 25 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM ATP, 0.1 mM DTT)に対して一晩透析した後、超遠心(300,000×g, 15 min)を行い、上澄み液をアクチン・プロフィリン融合タンパク質（配列番号７）粗精製液とした。収量は、培養液1 Lあたり約10 mgであった。 Further, Binding Buffer 2 (Binding Buffer 1 plus 1% Triton X-100, protease inhibitor) was lysed by adding twice the cell weight and immediately centrifuged (40,000 × g, 30 min). The supernatant was mixed with 1/5 volume of HighTrap His resin (Amersham Pharmacia) for 30 minutes to adsorb the actin / profilin fusion protein. Next, the HighTrap His resin was washed with a wash buffer (20 mM Imidazole pH 7.4, 300 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 , 0.1 mM ATP, 7 mM β mercaptoethanol), and then washed from the wash buffer to an elution buffer (400 mM imidazole pH 7.4, 25 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM ATP, 7 mM β-mercaptoethanol) was used to elute the protein containing the actin-profilin fusion protein. The elution fraction was dialyzed overnight against chymotrypsin cleavage buffer (10 mM Hepes pH 7.4, 25 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM ATP, 0.1 mM DTT) and then ultracentrifuged (300,000 × g, 15 min The supernatant was used as a crude purified solution of actin / profylline fusion protein (SEQ ID NO: 7). The yield was about 10 mg per liter of culture solution.
粗精製液の総タンパク質とキモトリプシンが重量比で200 : 1になるようにTLCK処理済みキモトリプシンを加え、25℃で10分間消化反応を行った。反応は0.2 mM PMSF添加で停止させた。このE206A/R207A,/E208A変異アクチンは、重合能に欠陥があるので、以下の方法によりさらに精製を行った。切断したE206A/R207A,/E208A変異アクチン・プロフィリン溶液をG bufferに対して６時間透析し、Q-Sepharoseカラムに吸着させた。カラムをwash buffer (10 mM imidazole pH 7.4, 0.1 mM ATP, 0.2mM CaCl2, 0.2mM DTT, 0.005%NaN3)で洗った後、同bufferから同buffer＋1 M NaClのリニアグラジエントで溶出を行い、E206A/R207A,/E208A変異アクチンを含む分画を回収した。これをG bufferに対して一晩透析し、超遠心処理(300,000×g, 15 min)を行った上澄を精製E206A/R207A,/E208A変異アクチン分画とした。約10 gの菌体量から0.2 mgの精製E206A/R207A,/E208A変異アクチン（配列番号１２）が得られた。各精製段階における電気泳動の結果を図３に示す。図中の各レーンは以下のとおりである。 TLCK-treated chymotrypsin was added so that the weight ratio of total protein and chymotrypsin in the crude purified solution was 200: 1, and a digestion reaction was performed at 25 ° C. for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 0.2 mM PMSF. Since these E206A / R207A and / E208A mutant actin has a defect in polymerization ability, it was further purified by the following method. The cleaved E206A / R207A, / E208A mutant actin / profilin solution was dialyzed against G buffer for 6 hours and adsorbed onto a Q-Sepharose column. The column was washed with a wash buffer (10 mM imidazole pH 7.4, 0.1 mM ATP, 0.2 mM CaCl 2 , 0.2 mM DTT, 0.005% NaN3), and then eluted from the same buffer with a linear gradient of the same buffer + 1 M NaCl, and E206A / Fractions containing R207A, / E208A mutant actin were collected. This was dialyzed overnight against G buffer, and the supernatant subjected to ultracentrifugation (300,000 × g, 15 min) was used as a purified E206A / R207A, / E208A mutant actin fraction. 0.2 mg of purified E206A / R207A, / E208A mutant actin (SEQ ID NO: 12) was obtained from an amount of about 10 g of cells. The results of electrophoresis at each purification stage are shown in FIG. Each lane in the figure is as follows.
Lane 1: E206A/R207A,/E208A変異アクチン・プロフィリン融合タンパク質の粗精製分画。
Lane 2: 骨格筋アクチン。
Lane 3: キモトリプシン処理後。
Lane 4: Q-Sepharose イオン交換クロマトグラフィー後。
Lane 1: A crudely purified fraction of E206A / R207A, / E208A mutant actin / profilin fusion protein.
Lane 2: Skeletal muscle actin.
Lane 3: After chymotrypsin treatment.
Lane 4: After Q-Sepharose ion exchange chromatography.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006223042A JP5004209B2 (en) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Method for expressing toxic protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006223042A JP5004209B2 (en) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Method for expressing toxic protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008043275A JP2008043275A (en) | 2008-02-28 |
| JP5004209B2 true JP5004209B2 (en) | 2012-08-22 |
Family
ID=39177636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006223042A Expired - Fee Related JP5004209B2 (en) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Method for expressing toxic protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5004209B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5071762B2 (en) * | 2006-09-29 | 2012-11-14 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Protein expression method |
| CN106755246A (en) * | 2016-12-13 | 2017-05-31 | 国肽生物科技(北京)有限公司 | The extracting method of thymic peptide |
| CN109457007A (en) * | 2018-12-25 | 2019-03-12 | 河北肽都生物科技有限公司 | A kind of preparation method of thymic peptide |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004024095A (en) * | 2002-06-25 | 2004-01-29 | Sekisui Chem Co Ltd | Method for producing protein, fused protein and protein |
-
2006
- 2006-08-18 JP JP2006223042A patent/JP5004209B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2008043275A (en) | 2008-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100784478B1 (en) | A Prepartion method for a protein with new function through simultaneous incorporation of functional elements | |
| Beard et al. | [11] Purification and domain-mapping of mammalian DNA polymerase β | |
| Pedersen-Lane et al. | High-level expression of human thymidylate synthase | |
| JP2002524052A5 (en) | ||
| JPH08333395A (en) | Human proinsulin derivative and production of human insulin | |
| JP3344618B2 (en) | Chaperone expression plasmid | |
| Rosenthal et al. | A multifunctional Urechis caupo protein, PAPS synthetase, has both ATP sulfurylase and APS kinase activities | |
| CN110408635B (en) | Application of nucleic acid construct containing streptavidin element in protein expression and purification | |
| WO1996003519A1 (en) | Ubiquitin-lytic peptide fusion gene constructs, protein products deriving therefrom, and methods of making and using same | |
| CN109312329B (en) | Method for improving mutation introduction efficiency in genomic sequence modification technique, and molecular complex used therefor | |
| JP5004209B2 (en) | Method for expressing toxic protein | |
| US8536407B2 (en) | Heat resistant plants and plant tissues comprising a variant adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase small subunit protein and methods of use thereof | |
| JP3462313B2 (en) | Mutant uricase, mutant uricase gene, novel recombinant DNA, and method for producing mutant uricase | |
| CA2298106C (en) | A recombinant expression vector of human parathyroid hormone | |
| JPH06315386A (en) | Dna fragement, vector containing the same fragment, transformant transformed by the same vector and production of protein using the same vector | |
| CN109136209B (en) | Enterokinase light chain mutant and application thereof | |
| US7109015B2 (en) | Removal of N-terminal methionine from proteins by engineered methionine aminopeptidase | |
| EP1316612B1 (en) | Isozymes of lacrimator component synthase and gene encoding the same | |
| CN113249351B (en) | Herbicide-resistant gene, polypeptide and application thereof in plant breeding | |
| JP5071762B2 (en) | Protein expression method | |
| JP4870574B2 (en) | Peptide and protein processing | |
| US20030049686A1 (en) | Method for manufacturing mutnat library of proteins with various sizes and sequences | |
| US20080166732A1 (en) | Novel human poly(a)polymerase gamma (pap gamma) | |
| JPH0622765A (en) | Dna compound for coding activity of riboflavin synthetase of s. cerevisiae and recombinant dna expressing vector | |
| JP2790970B2 (en) | Stabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by quintuple substitution |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110705 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110905 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120228 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120309 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120515 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120517 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150601 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |