JP4979593B2 - 分子間の非共有結合性相互作用の破壊のための手段および方法 - Google Patents
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Description
非共有的結合性の力の3つの基本的種類がある。すなわち、イオン相互作用、疎水性相互作用および水素結合である。
何らかのpHで、タンパク質は、互いにまたは他の種類の分子とそれが結合することに関与しうる荷電基を有している。例えば、アスパラギン酸(Asp)やグルタミン酸(Glu)残基の負に荷電したカルボキシル基は、リジン(Lys)やアルギニン(Arg)残基の正に荷電したプロトン化アミノ基により引き寄せられうる。
イオン相互作用は、pHの変化に高い感受性がある。pHが落ちると、H+ はアスパラギン酸(Asp)およびグルタミン酸(Glu)のカルボキシル基(COO-)に結合し、それらの負の電荷を中和し、そしてH+ はリジン(Lys)およびアルギニン(Arg)のアミノ(NH2)基の窒素原子上の占有されていない電子対に結合して、それらに正の電荷を与える。その結果、分子上の正味の電荷が変化する(より正に荷電する)だけでなく、その側鎖または主鎖の集団が他の分子およびイオンとイオン(静電気的な)相互作用を有する機会の多くが変えられる。pHが上昇すると、H+がAspおよびGluのCOOH基から除去されて、それらに負の電荷を与え(COO-)、そしてH+がLysおよびArgのNH3+基から除去されて、それらの正電荷を除去する。その結果、分子上の正味の電荷が変化し(より負に荷電する)、そしてやはり、その側鎖または主鎖の集団が他の分子またはイオンと静電気的な相互作用を有する機会の多くが変えられる。
イオン相互作用は塩濃度にも感受性がある。塩濃度の上昇は、荷電残基に競合イオンを供与することによりイオン的な結合の強度を下げる。
フェニルアラニンおよびロイシンのようなアミノ酸の側鎖(R基)は非極性であり、この故に水のような極性分子とはほとんど相互作用しない。この理由のために、球状タンパク質中の非極性残基の多くは分子の内側を向いており、一方、アスパラギン酸やリジンのような極性基群は、溶媒にさらされる表面にある。非極性残基が2つの異なる分子の表面にさらされている場合には、それら2つの“油性”の非極性表面が、互いに緊密に近寄り、それらの間の極性水分子を追いやることが、エネルギー的により有利である。
疎水性相互作用の強度は、pHまたは塩濃度の変化によって、感知できるほど影響されない。
水素結合は、強く電気陰性の原子(例えば、酸素、窒素)が水素原子に近づくときはいつも生じ、該水素原子は第2の強く電気陰性の原子と共有結合的に結合されている。
いくつかの一般例がある;タンパク質中の別々のペプチド結合の-C=O基とH-N-基の間(αヘリックスおよびβコンフォメーションを生じる);タンパク質中のセリンおよびスレオニン残基中の-C=O基とヒドロキシル(H-O-)基およびシステインのSH基の間、さらに糖の中のそれらとの間。
に示されている。もう一つの過ヨウ素酸塩感受性化合物である4-アミノ-4-デオキシ-L-スレオニン酸(ジオール含有アミノ酸構成ブロック)の合成は
に示されている。
に示されているものである。
方法:
MHC多量体およびMHC多量体の複合体(MHCテトラマー)の作成:
MHCクラス1複合体(MHC多量体)が、軽微な改変を施されて前述のとおりに準備された(1)。HLA-A2.1-ペプチド多量体が以下の3つのペプチドを伴い産生された:インフルエンザA型マトリックス58-66(配列GILGFVFTL)および2のインフルエンザA型マトリックス58-66変異体GIL*FVFTLおよびGILGFVF*L(*は3-アミノ-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸である)。MHCクラス1ペプチド多量体がその後精製され、BirAによりビオチン化され、精製され、そして16%グリセロール中に-20℃で保存された。
MHC多量体または、表示されている場合には、野生型インフルエンザA型マトリックス58-66エピトープあるいはこのエピトープのG4*またはT8*変異体を含むMHC多量体のテトラマー複合体が、MHCクラス1結合性ペプチドの存在下または非存在下において20 mM Tris-HCl、pH 7.0/150mM NaCl/ 0.5 mM ジチオトレイトール(DTT)中で、紫外線(CAMAG、366 nm)に1時間さらされた。その後、複合体はペプチド不含MHCクラス1複合体の解離を誘導するために、15-45分間37℃にさらされた(2)。サンプルは、その後、MHCの解離を判定するためにゲルろ過クロマトグラフィーにより分析され、またはMHC多量体の4量体の複合体(MHCテトラマー)を産生するためにフィコエリトリン標識されたストレプトアビジンとともに温置された。MHCテトラマーはゲルろ過クロマトグラフィーにより精製され、その後の使用まで16%グリセロール中で-20℃で保存された。
融解された末梢血単核球(PBMC)サンプルおよびCTLクローンが5分間、PE標識をされたMHCテトラマーとともに37℃で温置され、FITC標識をされた抗CD8抗体が添加され、そして温置が15分間室温で引き続き行われた。FACS分析に先立って、細胞は、死細胞をゲートで除去することができるようにヨウ化プロピジウムで染色された。サンプルは、FACScaliburおよびCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより分析された。前方および側方散乱パラメーターがリンパ球集団を定義付けるため用いられた。
望むときに解離するペプチド-MHC複合体の形成。
その結合ペプチドが望むときに遊離されうるMHC多量体の産生の可能性を試験するために、野生型インフルエンザA型マトリックス58-66エピトープ、あるいは紫外線感受性β-アミノ酸3によりアミノ酸4または8のいずれかが置換された本エピトープの2つの変異体を有する、HLA-A2.1多量体を作成した(図1)。MHCクラス1多量体形成は3つのペプチド全てにとって効率がよく、そして形成された多量体はゲルろ過クロマトグラフィーにより精製された。生じたペプチド-MHC多量体が解離を誘発されうるかどうかを評価するために、該3種の多量体が、紫外線にさらされ、残りのペプチド不含MHCクラス1分子の解離を誘発するために37℃で温置され、その後ゲルろ過クロマトグラフィーにより分析された。母体となったインフルエンザA型エピトープを含むペプチド-MHC複合体は紫外線暴露に対してまったく非感受性であったのに対し(図2A上のパネル)、G4*(データは示されていない)またはT8*エピトープ(図2A下のパネル)のいずれかを含むMHCクラス1多量体の暴露は、回収されたMHC複合体の量に実質的な減少をもたらす。さらに、残存物質の溶出時間が出発物質の溶出時間よりも若干長かったことから示唆されるように、残存物質は、少なくとも一部的に、ペプチド-MHCクラス1多量体よりもむしろ遊離MHCクラス1重鎖から成るようである。
MHCクラス1結合性リガンドの添加が、紫外線暴露後の紫外線感受性MHC複合体の解離を防ぐことができるかどうかを評価するために、同じ反応が、2つの異なるHLAA2.1結合性ペプチド(HY311-319;MART126-35(A2L変異体))のうちの1つ、あるいはHLA A3-結合性ペプチドGP100(614-622)のいずれかの存在下で行われた。母体となったインフルエンザA型エピトープを含むMHCクラス1分子に、3つのペプチドのうちのいずれか添加をすることは、多量体が紫外線に暴露されたかどうかに関わらず、MHCクラス1多量体の回収に影響せず、これはこの母体MHC多量体が両方の状況下で安定であるという知見(データは示さない)と一致する。重要なことに、HLA-A2.1と相互作用することが予想されないHLA A3-結合性ペプチドの添加は、紫外線感受性G4*(示されていない)またはT8*ペプチドを含むMHC多量体の回収の実質的な増大をもたらさないが(図2B)、いずれかのHLA A2.1結合性ペプチドの添加は回収量の相当な増加をもたらす(図2B)。これらのデータは、G4*またはT8*を含むMHC多量体を紫外線にさらすことで産生されるペプチド不含MHC分子は、既知のHLA-A2.1リガンドと効果的に結合しうるが、対照ペプチドとは結合しえない、という知見と一致する。
HLA-A2.1リガンドの添加により保護された紫外線感受性MHCクラス1多量体がこれらのリガンドに結合したかどうかを直接的に立証するために、MART126-35(A2L変異体)、インフルエンザA型マトリックス58-66、HY(SMCY)311-319またはCMVpp65 495-503ペプチドのいずれかの存在下で産生されたMHC多量体が精製され、MHC多量体のテトラマー複合体に変えられた。生じたMHCテトラマーはその後、MART1特異的T細胞クローン(図3)またはCMV pp65 495-503およびインフルエンザA型マトリックス58-66に特異的なCD8+T細胞を有する供血者からの末梢血単核球(図4)を染めるために用いられた。試験された全ての場合において、ペプチド交換後に産生されたMHCテトラマーは、従来のMHCテトラマーと比較して同等の感受性および特異性で抗原特異的T細胞を結合する。これらの実験は、ペプチド交換により産生されたMHC多量体は、通常のペプチド-MHC多量体と構造的に区別することができず、pMHC-TCR相互作用(この場合、オリゴマー化に続く)を探査するのに用いられうることの公式の証拠を提供する。
MHCクラス1多量体の紫外線感受性4量体複合体においてもペプチド交換がなされうるかを立証するために、T8*を含むMHC多量体が4量体複合体に転化され、その後CMV pp65 495-503、MART1 26-35(A2L変異体)、またはHY(SMCY)311-319ペプチドのいずれかの存在下で紫外線にさらされた。生じた4量体MHC複合体はその後、CMV陽性の供血者の末梢血単核球を染色するために、追加精製をすることなく用いられた。注目すべきことに、CMV pp65 495-503エピトープの存在下でT8*を含むMHCテトラマーの紫外線暴露により産生されたMHCテトラマーは、通常のCMV pp65 495-503特異的MHCテトラマーと同じ頻度および同様の強度で、CMV特異的T細胞を検出する(図5)。この結合の特異性は、MART1 26-35(A2L変異体)またはHY(SMCY)311-319ペプチドのいずれかとの並行反応で調整されたMHCテトラマーは、この供血者のCD8+リンパ球への測定可能な結合を示さない、という事実により強調される。
紫外線交換技術が、標識を搭載するリガンドが結合することを受容できるMHC分子の産生に用いられた。MHC交換反応は、テトラメチルローダミン染料により標識されたペプチドリガンドの存在下で行われた。図6に示されているように、これらの反応のその後の分析は、この技術が、標識されたリガンド(この場合は蛍光ペプチド)の結合を許すために用いられうることを明らかにする。その結果、MHC交換技術は、そのような結合を増強または妨害しうる化合物(例えば、ペプチドおよび他の小さな分子)を選抜することにも用いられうる。そのような選抜の原理は、ここでは蛍光異方性を用いて例示され、図7に概説されている。
本データは、選択のペプチドにより占有されたMHC複合体の産生のための新規な方法を示す。そのような複合体の産生における主な制限は、ペプチド不含MHC分子の不安定性であった。その結果、組み換えMHC分子の産生のために現在幅広く認められている技術は、それぞれ一つのリガンドについてのリガンドに占有されたMHC分子の一バッチの別々の製造である。これは、非常な時間の消費と費用のかかる生産過程という結果になり、たった1つの適用のために向けられた小さなバッチを与えることになる。ここで、我々は、MHC複合体それ自身の安定性には直接的に影響しない条件への曝露による、それまで結合していたリガンドの選択的な遊離により、選択のリガンドによって占有されたMHC分子が産生されうることを示す。本一連の実験では、MHCに結合したリガンドの解離は、光感受性のペプチド変異体の使用によりなされた。しかしながら、そのような解離は、他の定義された条件に感受性のあるペプチド変異体の使用により、同様によくなされうることは明らかである。特に、化学的な開裂に感受性のペプチド変異体を用いたペプチドMHC複合体の開発が、この点において有益であると判る。加えて、化学的または光誘発的な改変を通じた、MHCに対する結合リガンドの減少された親和性を誘導することにより、ペプチド開裂なしでも解離がなされうる。さらに、ここではMHCクラス1分子について、リガンド交換のアプローチが開発されたが、このアプローチはリガンドに占有されたMHCクラス2分子または非古典的MHC分子(CD1およびQa1分子により例示される)を調整するためにも、同様に有効である。
図1
光開裂法:1A)1の構造、改変されていないインフルエンザA型58-66エピトープ。1B)光開裂反応。1C)3の構造、T8*改変光開裂性インフルエンザA型58-66エピトープ。
紫外線誘発ペプチド交換の生化学的分析。2A)紫外線感受性リガンドを含むMHC多量体は紫外線曝露に感受性である。2B)紫外線にさらされた紫外線感受性MHC多量体はMHC結合性ペプチドの添加により安定化されうる。
紫外線感受性MHC多量体から産生されたMHCテトラマーは抗原特異的CTLクローンを染色する。紫外線感受性MHC多量体が、表示されたペプチドの存在下で紫外線にさらされ、MHC多量体のテトラマー複合体に転化された。このように産生された、HY(SMCY)311-319ペプチド(左下のパネル)またはMART126-35(A2L変異体)ペプチド(右下のパネル)のいずれかを含むテトラマーが、MART126-35特異的CTLクローンを染色するために用いられた。対照として、同じクローンが同じエピトープを含む古典的MHCクラス1テトラマーを用いて染色された(上のパネル)。
紫外線感受性MHC多量体から産生されたMHCテトラマーは、抗原特異的末梢血T細胞を染色する。紫外線感受性MHC多量体は表示されたペプチドの存在下で紫外線にさらされ、MHCテトラマーに転化された。このように産生された、CMV pp65 495-503ペプチド(左下のパネル)またはインフルエンザA型マトリックス58-66ペプチド(右下のパネル)のいずれかを含むテトラマーが、CMV pp65 495-504およびインフルエンザA型マトリックス58-66に特異的なCD8+T細胞を有する供血者からの末梢血単核球を染色するために用いられた。対照として、同じPBMCが、同じエピトープを含む古典的MHCクラス1テトラマーを用いて染色された。
紫外線感受性MHCテトラマーから産生されたMHCテトラマーは抗原特異的末梢血T細胞を染色する。紫外線感受性MHCテトラマーが表示されたペプチドの存在下で紫外線にさらされ、追加精製されていない抗原特異的T細胞を染色するために使用された。CMV pp65 495-503ペプチド(左から2番目のパネル)、あるいはMART126-35(A2L変異体)またはHY(SMCY)311-319ペプチド(2つの右側のパネル)のいずれかを含むMHCテトラマーが、CMV pp65 495-503 CD8+T細胞を有する供血者からの末梢血単核球を染色するために用いられた。対照として、同じPBMCが、CMV pp65 495-503ペプチドを含む古典的MHCクラス1テトラマーを用いて染色された(左側のパネル)。
照射前の光解離性ペプチド/HLA A2.1複合体のゲルろ過のグラフ(1)、救助なしでの照射後(2)、C*がテトラメチルローダミン染料により標識されているペプチドFLPSDC*FPSVの存在下での照射後(3)。左パネル)230 nmでの紫外線検出、右パネル)蛍光検出(励起530 nm、発光550 nm)。
蛍光異方性スクリーン。ペプチド不含MHC分子が暫時のリガンドの開裂により産生される。蛍光エピトープの結合が、蛍光異方性の測定または蛍光検出により観察された。この方法により、そのような結合を妨害または容易にするペプチド性または非ペプチド性リガンドが同定されうる。
ジオールに基づく化学的開裂可能な暫時のペプチドおよび対応する開裂産物。ジオールを含む部分が四角で囲まれている。
NaIO4によるMHC結合性ペプチドの開裂。ジオール含有構成ブロックを位置8(上)または4(示されていない)に有するHLA-A2.1結合性M1ペプチドのペプチド変異体が、化学的な合成により製造された。ペプチドはその後、1 mM NaIO4への1時間の曝露の前(下)または後(上)に、LC-MSにより分析された。
Claims (19)
- 非共有結合性相互作用の領域を介して互いに結合する少なくとも2の構成員を含む多量体タンパク質において、該構成員の第1は、化学的または物理的な信号により活性化されると、該第1の構成員中の共有結合を開裂し、該非共有結合性相互作用の強度を減少させる条件的反応基を含み、該第1の構成員はペプチドを含み、かつ第2の構成員は主要組織適合複合体(MHC)分子またはそのペプチド結合性部分を含み、かつ該条件的反応基が光感受性または過ヨウ素酸塩感受性基を含む、上記多量体タンパク質。
- 該光感受性基が3-アミノ-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸を含む、請求項1に記載の多量体タンパク質。
- 該過ヨウ素酸塩感受性基がジヒドロキシ部分を含む、請求項1に記載の多量体タンパク質。
- 該MHC分子または該MHC分子のペプチド結合性部分のペプチド結合性の溝にペプチド抗原を含み、かつ該ペプチド抗原が条件的反応基を含む、請求項1に記載の多量体タンパク質。
- 請求項1に記載の多量体タンパク質を含む組成物。
- さらに追加的ペプチドを含む請求項5に記載の組成物。
- 該追加的ペプチドが該MHC分子のペプチド結合性の溝中で結合することができる抗原性ペプチドである、請求項6に記載の組成物。
- 一時的ペプチドを、MHC分子に対する弱められた結合親和性を示す少なくとも2のより小さなペプチドへと、活性化されると開裂する少なくとも1の条件的反応基を有する該一時的ペプチドを含むMHC分子を製造することを含む、MHC分子またはそのペプチド結合性部分を製造する方法であって、該条件的反応基が光感受性または過ヨウ素酸塩感受性基を含む、前記方法。
- さらに、該条件的反応基を活性化することを含む請求項8に記載の方法。
- さらに、該MHC分子のペプチド結合性の溝へ結合するための所望のペプチドを該MHC分子またはそのペプチド結合性部分に備えることを含む、請求項9に記載の方法。
- 開裂した一時的ペプチドを該MHC分子から効果的に除去する条件下で、該所望ペプチドとともに該MHC分子を温置することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の多量体タンパク質と追加ペプチドを含むMHC分子複合体とを含む組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一つに記載の少なくとも2の多量体または請求項12に記載の組成物を含む複合体。
- 請求項1〜4のいずれか一つに記載の少なくとも2の多量体、請求項5〜7のいずれか一つに記載の組成物、または請求項12に記載の組成物を含む、固体表面。
- さらに、該所望ペプチドが該MHC分子に結合することを検出することを含む、請求項8〜11のいずれか一つに記載の方法。
- 該結合が、該ペプチドに関連づけられた標識を検出することにより検出される、請求項15に記載の方法。
- 該ペプチドが該標識を含む、請求項16に記載の方法。
- 該ペプチドの該MHC分子への該結合が蛍光異方性の手段により測定される、請求項15〜17のいずれか一つに記載の方法。
- 被検または対照化合物の存在下で該所望ペプチドの結合を判定するための、請求項15〜18のいずれか一つに記載の方法。
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