JP4959068B2 - Cell tissue regeneration substrate - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸からなり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを含有する細胞組織再生用基材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の再生医工学分野の著しい発展により、各種の動物細胞の培養を基本とする組織再生が行われるようになり、種々の組織を再建する試みが行われている（細胞工学、14:12 (1995)）。組織再生において最も重要なファクターの一つに細胞の足場（scaffold）の構築がある。
【０００３】
再生医工学が最も進んだ分野の一つに皮膚再生があり、その研究成果として、（１）ヒアルロン酸とアミノ基あるいはイミノ基を有する高分子化合物とのイオン複合体からなる水不溶性の医療材料（特開平６−７３１０３号）、（２）ヒアルロン酸と架橋剤ジ（もしくはビ）ヒドラジン又はジ（もしくはビ）ヒドラジドとの縮合反応による水不溶性の生体適合性材料（特開平９−５９３０３号）、（３）コラーゲンに線維芽細胞を播種して、表皮角化細胞を重層することによる培養人工皮膚（Plast. Reconstr. Surg. 93: 537、1994）等がある。
【０００４】
軟骨の再生においても積極的な検討が行われており、前述されたような（１）コラーゲンを用いた基材を足場とした軟骨再生（Biomaterials. 17, 155-162 (1996)、（２）ＰＶＡ、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンからなる人工軟骨素材（特開平１−２６８５５９号）、（３）不溶性のベンジルエステル化ヒアルロン酸を用いた細胞培養基材（US5939323、J. Biomed. Mater. Res. 42:2, 172-81 (1998)、J. Biomed. Mater. Res. 46:3, 337-346 (1999)、J. Orthop. Res. 18:5,773-380 (2000)、（４）ゼラチンと塩基性線維芽細胞増殖因子の混合物による軟骨組織修復治療剤（特開平７−２３３０８５号）、（４）エステル架橋ヒアルロン酸を用いた軟骨細胞培養基材（J. Orthop. Res. 17, 205-213 (1999)、）（５）ポリ乳酸、ポリグリコール酸を用いた組織再生基材（特表平１０−５１３３８６号）等について報告がなされており、現在も精力的に種々の材料が検討されている。
【０００５】
コラーゲンまたはゼラチンは細胞担体として広く用いられているが、動物組織から抽出したものであるため感染の危険性を完全に否定できず、更に両者ともタンパク性の物質であるために、その抗原性が危惧される。また、それ以外の材料として検討の行われているポリ乳酸やポリグリコール酸は炎症を誘発しやすく、更に、多孔性セラミックは基材内で細胞が生育しにくい等の課題がある。
【０００６】
よって、組織再生基材として、コラーゲンやゼラチン等の既存材料より生体適合性に優れる細胞増殖により適した材料の構築ができれば、細胞組織再生基材として非常に有効なものとなることが考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特長を最大限生かすために、何ら化学的架橋剤や化学修飾剤を使用することなく、またカチオン性の高分子化合物と複合体を形成することなくヒアルロン酸そのものを難水溶性にする手段はこれまで開発されていなかった。我々は、架橋剤等を使用しないでヒアルロン酸単独からなる難水溶性ヒアルロン酸ゲルを簡便な方法で製造することを初めて見出し（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６号）、今回、この難水溶性ヒアルロン酸ゲルの軟骨組織や歯周辺組織の組織再生用基材への適用の可能性を鋭意検討した結果、その有用性を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）ヒアルロン酸からなり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを含有する細胞組織再生用基材、（２）実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、次の（ａ）、（ｂ）の要件を満たすヒアルロン酸ゲルを含有することを特徴とする細胞組織再生用基材、
（ａ）中性の３７℃の水溶液で１２時間での溶解率が５０％以下である、（ｂ）ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで可溶化されたヒアルロン酸が分岐構造を有し、該可溶化されたヒアルロン酸中に、分岐度が０．５以上の分子量フラクションを部分的に含む、
（３）実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されていないヒアルロン酸ゲルが、シート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状からなる群より選択した１種であることを特徴とする（２）記載の細胞組織再生用基材、（４）シート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状であり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されていないヒアルロン酸ゲルと生理活性物質を含む細胞組織再生用基材、（５）生理活性物質が、細胞増殖因子、抗生物質、タンパク、オリゴ糖、又は核酸からなる群より選択した１種であることを特徴とする（５）記載の細胞組織再生用基材、（６）再生させる組織が、関節軟骨、肋軟骨、気管軟骨、咽頭軟骨、頭蓋骨、歯槽骨、歯周組織、セメント質、歯根膜、腱、又は靱帯からなる群より選択した１種であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞組織再生基材、（７）生体内の組織欠損部分に充填することにより欠損細胞組織の再生を促進させるために用いる（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞組織再生用基材、（８）軟骨細胞、幹細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、又はＥＳ細胞を播種して細胞を基材に生着させた後に、これを生体内の組織欠損部分に充填することにより欠損組織の再生を促進させるために用いる（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞組織再生用基材である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明でいう改質とは、本来、水溶性であるヒアルロン酸を難溶化することを意味する。
【００１１】
また、本発明でいうヒアルロン酸ゲルとは、三次元網目構造をもつ高分子及びその膨潤体である。三次元網目構造はヒアルロン酸の架橋構造によって形成されている。
【００１２】
その一例としては、ヒアルロン酸のｐＨ３．５以下の水溶液を凍結し、次いで解凍することによりシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状の中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを得ることができる。より具体的には以下に述べる。
【００１３】
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０5〜約１×１０7ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等をして得たものでも同様に好ましく使用できる。
なお、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで分解、可溶化することができる。可溶化されたヒアルロン酸が架橋構造を保持している場合、分岐点を有するヒアルロン酸として高分子溶液論的に直鎖状のヒアルロン酸と区別することができる。
本発明でいうヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件としては、水溶液のｐＨ１．５、温度６０℃が適当である。ヒアルロン酸のグリコシド結合の加水分解による主鎖切断反応が、中性の水溶液中と比較して、酸性やアルカリ性の水溶液中で著しく促進される。更に酸加水分解反応は、反応温度が高い方が促進される。
本発明ではＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法を用い、ＧＰＣで分離された分子量フラクションの分子量と分岐度をオンラインで連続的に測定した。本発明では、同一溶出体積のフラクションの可溶化されたヒアルロン酸の分子量と対照となる直鎖状ヒアルロン酸の分子量を比較して分岐度を計算する溶出体積法を使って分岐度の測定を行った。分岐度は可溶化されたヒアルロン酸の高分子鎖１コ当たりに存在する分岐点の数であり、可溶化されたヒアルロン酸の分子量に対してプロットされる。
可溶化されたヒアルロン酸は、ＧＰＣ溶媒で希釈して濃度を調製し、
０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後測定に供した。
本発明でいうヒアルロン酸ゲル中に、ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でも安定に存在する架橋構造がある場合、可溶化されたヒアルロン酸に分岐構造が高分子溶液論的に確認される。本発明でいうヒアルロン酸ゲルの分岐度は、
０．５以上である。
【００１４】
ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整するために使用する酸は、ｐＨ３．５以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等を使用することが望ましい。
ヒアルロン酸の水溶液のｐＨは、ヒアルロン酸のカルボキシル基が充分な割合でプロトン化するｐＨに調整する。調整されるｐＨはヒアルロン酸塩の対イオンの種類、ヒアルロン酸の分子量、水溶液濃度、凍結及び解凍の条件、並びに生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められるが、本発明では、ｐＨ３．５以下、好ましくは、ｐＨ２．５以下に調整することである。
凍結、解凍はヒアルロン酸の調整された酸性水溶液を、任意の容器に入れた後、所定の温度で凍結させ、凍結が終わった後、所定の温度で解凍させる操作を少なくとも１回行う。凍結、解凍の温度と時間は、容器の大きさ、水溶液量によりヒアルロン酸の酸性水溶液が凍結、解凍する温度と時間の範囲内で適宜決められるが、一般には、氷点以下の凍結温度、氷点以上の解凍温度が好ましい。
凍結、解凍時間を短くできることから、更に好ましくは−５℃以下の凍結温度、５℃以上の解凍温度が選ばれる。また、時間は、その温度で凍結、解凍が終了する時間以上であれば特に制限されない。
ヒアルロン酸の調整された酸性水溶液を凍結し、次いで解凍する操作の繰り返し回数は、使用するヒアルロン酸の分子量、水溶液濃度、水溶液のｐＨ、凍結及び解凍の温度と時間、並びに生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められる。通常は１回以上繰り返すことが好ましい。
また、凍結、解凍の操作を繰り返すごとに、その凍結、解凍の温度及び時間を変えても構わない。
【００１５】
ヒアルロン酸の調整された酸性溶液の凍結解凍により得られたヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の酸加水分解を避けるために、酸性に調整するために用いた酸等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除くためには、通常は水性溶媒による洗浄か透析をする。
【００１６】
使用する溶媒は、ヒアルロン酸ゲルの機能を損なわないものであれば特に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられる。
【００１７】
また、洗浄・透析方法は、特に制限はないが、通常は、バッチ法、濾過法、カラム等に充填して通液する方法等が、また、透析の場合、透析膜、限外ろ過膜による方法等が好適に用いられる。これらの条件は、液量、回数等を含めて、除きたい成分を目標の濃度以下にできる条件であればよく、ヒアルロン酸ゲルの形態や用途により適宜選択することが可能である。
【００１８】
この洗浄・透析されたヒアルロン酸ゲルは、その使用目的に応じて、溶媒中に浸漬した状態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるいは凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で細胞培養用基材として供される。
【００１９】
ヒアルロン酸ゲルの成形加工等の処理は、作製時には、ヒアルロン酸の調整された酸性溶液の凍結時の容器や手法の選択によりシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、繊維状、又チューブ状の所望の形態のヒアルロン酸ゲルの作製が可能である。例えば、板上にキャスティングして凍結することによりフィルム状及びシート状の形態が得られるし、水と混和しない有機溶剤と激しく混合撹拌しながら凍結・解凍することにより破砕状の形態が得られる。
【００２０】
ヒアルロン酸の分子量、濃度、凍結法などの条件を変えることで、生体吸収性や細孔の大きさの異なる種々の難水溶性ヒアルロン酸ゲルが得られる。なかでも、細孔の大きさが１００〜２００μｍのものが細胞を保持するのに望ましいが、それ以外の細孔を持つゲルも調製可能である。
【００２１】
本発明の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを含有する細胞組織培養用基材は、それ自体で、あるいは他の生理活性物質、生体適合性物質、抗生物質等と組合わせて利用できる。組み合わせの方法としては、ゲル製造時にそれらを共存させてゲル内に取り込ませる方法や、細胞組織培養基材として細胞培養時に培地中に共存させる方法がある。
【００２２】
生理活性物質としては、培養する細胞の成長を促進する因子が重要であり、例えば、インシュリン、肝細胞成長因子、トンラスフォーミング成長因子、神経成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、トランスフェリン、インターロイキン、及びインターフェロン等が挙げられる。
【００２３】
生体適合性物質としては、培養する細胞の接着を促進する物質が重要であり、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アルブミン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、及び核酸等が挙げられる。また記載された多糖はオリゴ糖としても利用できる。
【００２４】
抗生物質としては、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びアンホテリシンＢ等が挙げられる。
【００２５】
以上の方法で得られたヒアルロン酸ゲルによる細胞組織培養基材の利用法を以下に示す。組織の欠損部に充填できるように各種の形態に成形されたヒアルロン酸ゲルスポンジを、軟骨などの欠損部に外科的に移植することで周辺組織と融合し、組織を再生することができる。この際、増殖あるいは遊走してきた細胞の欠損部からの漏出を防ぐ目的で骨膜を保護する場合もある。
【００２６】
また、組織修復を促進させるために各種の細胞をヒアルロン酸ゲルスポンジに取り込ませた状態で使用することも可能である。ヒアルロン酸ゲルスポンジに取り込ませる細胞としては、軟骨細胞、幹細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、ＥＳ細胞などの細胞が分化、未分化に関わらず用いることができる。細胞を分化させる場合には、例えば幹細胞を骨芽細胞に分化させる場合は培養系中にデキサメサゾンを共存させるなど分化を誘導する物質とヒアルロン酸ゲルを組み合わせて使用する。これらの細胞をＤＭＥＭなどの各種の細胞培養培地と３７℃の標準的な細胞培養条件を用いて十分な量になるまで培養して、それを移植細胞としてスポンジ状のヒアルロン酸ゲルと混合して取り込ませる。これを即座に先ほどと同様に生体内の欠損部に充填することで、周辺組織と融合し、組織を再生することができる。この際、増殖あるいは遊走してきた細胞の欠損部からの漏出を防ぐ目的で骨膜を保護する場合もある。
【００２７】
更に、より細胞とスポンジ状のヒアルロン酸ゲルの親和性を高めるために、組織培養を行う際にスポンジ状のヒアルロン酸ゲル混合しておき、スポンジ状のヒアルロン酸ゲル内で細胞を増殖させることも可能である。この場合も各種の細胞培養培地と培養条件で細胞増殖を行わせることができ、細胞が十分な量になった後にこれを生体内の欠損部に充填することで、周辺組織と融合し、組織を再生することができる。この際、増殖あるいは遊走してきた細胞の欠損部からの漏出を防ぐ目的で骨膜を保護する場合もある。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
調製例１：スポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルの作製
分子量２×１０6ダルトンのヒアルロン酸を蒸留水に溶解し、１％の溶液を調製した。この水溶液に１Ｎ硝酸を添加しｐＨ１．５に調整した後、この溶液を平底の容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫で凍結した。５日後に取り出し２５℃で解凍し難水溶性ヒアルロン酸ゲルを得た。
次に、このゲルをｐＨ７の２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１００ｍｌに２４時間浸漬中和した後、蒸留水で十分にろ過洗浄し、乾燥してスポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを得た。
【００３０】
調製例２：スポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルの作製
分子量２×１０6ダルトンのヒアルロン酸を蒸留水に溶解し、２％の溶液を調製した。この水溶液に１Ｎ硝酸を添加しｐＨ１．５に調整した後、この溶液を平底の容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫で凍結した。５日後に取り出し２５℃で解凍し難水溶性ヒアルロン酸ゲルを得た。
次に、このゲルをｐＨ７の２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１００ｍｌに２４時間浸漬中和した後、蒸留水で十分にろ過洗浄し、乾燥してスポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを得た。
【００３１】
実施例１：難水溶性ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験
生理食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。調製例１で作製したスポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に浸漬し緩やかに攪拌した。３７℃でリン酸緩衝生理食塩水中に溶出するヒアルロン酸の割合を、リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度から求めた。
【００３２】
ヒアルロン酸濃度の測定
リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度は、ＧＰＣを使って、示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
【００３３】
その結果、調製例１で得られたヒアルロン酸ゲルの溶解率は、１２時間経過後では２％であり、２４時間経過後では４％であり、２４時間経過しても９６％のヒアルロン酸ゲルが残存していた。
【００３４】
よって、調製例１で得られたヒアルロン酸ゲルは、中性水溶液に難溶性であることが示唆された。
【００３５】
実施例２：難水溶性ヒアルロン酸ゲルの分岐度測定
【００３６】
調製例１、２で得られたスポンジ状の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを、ｐＨ１．５の塩酸水溶液１５ｍｌに浸漬し、６０℃、６時間の加水分解を行った。ゲルは加水分解により可溶化され、これをＧＰＣ溶媒で２倍に希釈して濃度を０．０５重量％に調製し、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳの測定を行った結果、分岐度０．５以上であった。
【００３７】
実施例３
１２週齢のウサギの大腿骨、脛骨から筋肉および靱帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断する。次いでＤＭＥＭ培地（３２単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および６０００単位／ｍｌヘパリンを含有）で骨髄内を洗浄した。３００×ｇ、５分間遠心分離して、細胞を分離した。前記骨髄から約１×１０9個の細胞を得た。
【００３８】
骨髄から採取した細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈した後、約２×１０8細胞個／１０ｃｍ直径培養皿へ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。
【００３９】
そして、以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から1ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほば集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コ−ルタ−社製）で計測し、そして５０００細胞個／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。
この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を移植細胞として用いた。
【００４０】
軟骨骨欠損モデルへの細胞とスポンジ状のヒアルロン酸ゲルの移植
成長の停止した生後５ヶ月の雌日本白色ウサギの、膝関節の大腿骨側の軟骨に直径５ｍｍ、深さ５ｍｍの穴をドリルで作製する。この大きな欠損では自発的な軟骨、骨再生が起こらないことが判明している。
【００４１】
５ｍｍ直径で高さ４ｍｍの調製例２で作製したスポンジ状のヒアルロン酸ゲルに間葉系幹細胞含有ＤＭＥＭ０．１ｍｌを添加して３７℃で２時間インキュベートした。５０万個の間葉系幹細胞５００，０００／０．１ｍｌ ＤＭＥＭ）を接着させたこのスポンジ状のヒアルロンゲル（ヒアルロン酸２％溶液から作製したもの）を欠損部へ移植して、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみ、細胞のみ、コラーゲン−細胞複合群とを比較した。９週間後に動物を屠殺して、関節の外見および切片を作製して組織像を検討した。
細胞を接着させたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルを移植すると、９週間以内に、軟骨、骨の顕著な再生が観察された。これに対して無処置の対照群、細胞のみ、コラーゲン−細胞複合群では、再生が認められなかった。スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみでもある程度、軟骨、骨の再生が観察された。すなわち、上記のことを図面で説明する。
【００４２】
図１は、ウサギ膝関節軟骨欠損処置後９週間での組織像（コントロール）を示す図である。図１より欠損後無処置のコントロールでは軟骨再生が認められなかった。図２は、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと間葉系細胞をウサギ膝関節軟骨欠損部へ移植してから９週間後の組織像を示す図である。欠損部で顕著な軟骨組織の再生が認められた。図３は、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみをウサギ膝関節軟骨欠損部へ移植してから９週間後の組織像を示す図である。スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみでもある程度の軟骨再生が観察された。
【００４３】
実施例４：スポンジ状のヒアルロン酸ゲル内での軟骨形成
５ｍｍ直径で高さ４ｍｍのスポンジ状のヒアルロン酸ゲルに実施例３の三代目の間葉系幹細胞含有ＤＭＥＭ０．１ｍｌを添加して３７℃で６時間インキュベートした。これを１６ｍｍ直径培養皿へ移して、更に１ｍｌの軟骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０-7Ｍデキサメサゾン、５０ｐｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β、６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５ｐｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５ｐｇ／ｍｌセレン酸、５．３５ｐｇ／ｍｌリノレイン酸、１．２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を添加して１および２週間インキュベートした。１週間以内に軟骨分化が起こり、２週目で顕著な軟骨形成が観察された。
【００４４】
実施例５：幹細胞とスポンジ状のヒアルロン酸ゲル複合体による歯周組織再生
１）ビーグル犬の口腔組織（歯槽骨）からの骨髄液の採取
麻酔下にて全顎のスケーリングを行った後、局所麻酔をし、下顎大臼歯部頬側歯肉、あるいは下顎前歯部唇側歯肉を全層弁で剥離。歯槽骨を露出させた後、歯科用ラウンドバーで直径約1ｍｍの穴を歯槽骨にあけ、骨髄液を浸出させ注射針で採取する（約０．５ｍｌ）。これを１０ｍｌのＤＭＥＭ培地（３２単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および６０００単位／ｍｌヘパリンを含有）に希釈して、３００×ｇ、５分間遠心分離して、細胞を分離した。前期骨髄から約１×１０9個の細胞を得た。
【００４５】
２）骨髄由来間葉系幹細胞の培養
骨髄から採取した幹細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈した後、約２×１０8細胞個／１０ｃｍ直径培養皿へ播種し。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から1ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほば集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測し、そして５０００細胞個／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、集密的（コンフルエント）になった三代目の継代培養皿から得た細胞を移植細胞として用いた。
【００４６】
３）歯槽骨欠損モデルの作製
予め、除石とブラッシングで実験動物の健康な歯周組織を確立させておく。
全麻下にて左右下顎第一小臼歯から第一大臼歯まで、歯肉溝切開を入れ、頬側歯肉を全層弁で剥離。左右下顎第二、第三、第四小臼歯近心根および第一大臼歯近心根に３×５ｍｍの裂開状の骨欠損を作製し、歯根面のルートプレーニングを施し、移植受容床を作製する。
【００４７】
４）ビーグル犬歯槽骨欠損部への間葉系幹細胞の移植
予め採取し、分離・培養した自家骨髄由来間葉系幹細胞を上記実験的歯槽骨欠損部に移植する。自家口腔骨髄由来間葉系幹細胞（５０万細胞個／１０μｌ ＤＭＥＭに溶解）は、移植直前にスポンジ状のヒアルロン酸ゲル（３×５ｍｍ）と混ぜ合わせて移植した。術後２ヶ月後、 組織学的に評価すると、無処置群あるいはスポンジ状のヒアルロンゲルのみの群では歯槽骨およびセメント質の再生はわずかで上皮の下方増殖が観察された。しかし、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと共に自家骨髄由来間葉系幹細胞を移植した群では顕著な歯槽骨とセメント質及び歯周靭帯の再生が観察された。すなわち、上記のことを図面で説明する。
図４は、ヒアルロン酸担体のみをビーグル犬歯槽骨欠損部へ移植してから２ヶ月後の組織像を示す図である。スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみの群では歯槽骨およびセメント質の再生はわずかで上皮の下方増殖が観察される。
図５は、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと自家骨髄由来間葉系幹細胞をビーグル犬歯槽骨欠損部へ移植してから２ヶ月後の組織像を示す図である。スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと自家骨髄由来間葉系幹細胞を移植した群では顕著な歯槽骨とセメント質及び歯周靭帯の再生が観察される。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、ヒアルロン酸からなり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを含有する細胞組織再生用基材を提供することができる。かかる本発明の細胞組織再生用基材は、架橋剤等を使用していないため、安全性及び生体適合性に優れ、軟骨細胞や幹細胞を基材の内部及び又は表面で培養することにより、組織再生に用いることができる等の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウサギ膝関節軟骨欠損処置後９週間での組織像（コントロール）を示す図である。
【図２】スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと間葉系細胞をウサギ膝関節軟骨欠損部へ移植してから９週間後の組織像を示す図である。
【図３】スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみをウサギ膝関節軟骨欠損部へ移植してから９週間後の組織像を示す図である。
【図４】スポンジ状のヒアルロン酸ゲルのみをビーグル犬歯槽骨欠損部へ移植してから２ヶ月後の組織像を示す図である。
【図５】スポンジ状のヒアルロン酸ゲルと自家骨髄由来間葉系幹細胞とをビーグル犬歯槽骨欠損部へ移植してから２ヶ月後の組織像を示す図である。
【符号の説明】
（Ａ） 再生した軟骨
（Ｂ） 歯根
（Ｃ） 再生したセメント質
（Ｄ） 再生した歯槽骨
（Ｅ） 残存セメント質
（Ｆ） 残存歯槽骨[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a substrate for cell tissue regeneration comprising a hyaluronic acid gel which is composed of hyaluronic acid, is not substantially modified by a chemical crosslinking agent or a chemical modifier, and is sparingly soluble in a neutral aqueous solution. .
[0002]
[Prior art]
With the recent remarkable development in the field of regenerative medical engineering, tissue regeneration based on the culture of various animal cells has been performed, and attempts have been made to reconstruct various tissues (Cell engineering, 14:12 ( 1995)). One of the most important factors in tissue regeneration is the construction of a cell scaffold.
[0003]
Skin regeneration is one of the most advanced fields of regenerative medical engineering. As a result of research, (1) water-insoluble medical materials consisting of ionic complexes of hyaluronic acid and a polymer compound having an amino group or imino group. (JP-A-6-73103), (2) Water-insoluble biocompatible material by condensation reaction of hyaluronic acid with a crosslinking agent di (or bi) hydrazine or di (or bihydrazide) (JP-A-9-59303) And (3) cultured artificial skin (Plast. Reconstr. Surg. 93: 537, 1994) by seeding fibroblasts on collagen and overlaying epidermal keratinocytes.
[0004]
Active research has also been conducted on cartilage regeneration. As described above, (1) cartilage regeneration using collagen as a scaffold (Biomaterials. 17, 155-162 (1996), (2) Artificial cartilage material composed of PVA, hyaluronic acid, hydroxyapatite and collagen (Japanese Patent Laid-Open No. 1-2688559), (3) Cell culture substrate using insoluble benzyl esterified hyaluronic acid (US5939323, J. Biomed. Mater. Res) 42: 2, 172-81 (1998), J. Biomed. Mater. Res. 46: 3, 337-346 (1999), J. Orthop. Res. 18: 5,773-380 (2000), (4) Gelatin Cartilage tissue repairing agent (JP-A-7-233085), and (4) a chondrocyte culture substrate using ester-crosslinked hyaluronic acid (J. Orthop. Res. 17, 205) -213 (1999),) (5) Tissue regeneration base material using polylactic acid and polyglycolic acid (Tokuheihei 10-5133) About 6 No.) such reports have been made, also vigorously variety of materials is currently being studied.
[0005]
Collagen or gelatin is widely used as a cell carrier, but since it is extracted from animal tissues, the risk of infection cannot be completely ruled out. Furthermore, both are proteinaceous substances, so their antigenicity is low. I'm worried. In addition, polylactic acid and polyglycolic acid, which are being studied as other materials, tend to induce inflammation, and porous ceramics have problems such as difficulty in growing cells in the substrate.
[0006]
Therefore, if a material suitable for cell growth that is more biocompatible than existing materials such as collagen and gelatin can be constructed as a tissue regeneration substrate, it can be considered to be very effective as a cell tissue regeneration substrate.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
In order to take full advantage of the excellent biocompatibility inherent in hyaluronic acid itself, it forms a complex with a cationic polymer compound without using any chemical cross-linking agent or chemical modifier. No means has been developed so far to make the hyaluronic acid itself water-insoluble. We have found for the first time that a water-insoluble hyaluronic acid gel consisting of hyaluronic acid alone without using a crosslinking agent or the like is produced by a simple method (PCT / JP98 / 03536). As a result of intensive studies on the applicability of cartilage tissue and tooth peripheral tissue to a tissue regeneration substrate, the present inventors have found its usefulness and completed the present invention.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention provides (1) a cellular tissue comprising hyaluronic acid gel which is composed of hyaluronic acid, is not substantially modified by a chemical cross-linking agent or chemical modifier, and is sparingly soluble in a neutral aqueous solution. A substrate for regeneration, (2) characterized by containing a hyaluronic acid gel that is not substantially modified by a chemical cross-linking agent or chemical modifier and satisfies the following requirements (a) and (b): A substrate for cell tissue regeneration,
(A) a neutral 37 ° C. aqueous solution having a dissolution rate in 12 hours of 50% or less, (b) hyaluronic acid solubilized by treating hyaluronic acid gel under accelerated acid hydrolysis conditions of hyaluronic acid The acid has a branched structure, and the solubilized hyaluronic acid partially contains a molecular weight fraction having a degree of branching of 0.5 or more.
(3) The hyaluronic acid gel substantially not modified by a chemical cross-linking agent or chemical modifier is selected from the group consisting of a sheet, film, crushed, sponge, lump, fiber, or tube. (1) a substrate for cell tissue regeneration according to (2), (4) a sheet, film, crushed, sponge, lump, fiber, or tube; A substrate for cell tissue regeneration comprising hyaluronic acid gel and a physiologically active substance not modified by a chemical cross-linking agent or a chemical modifier, (5) the physiologically active substance is a cell growth factor, antibiotic, protein, (5) The substrate for cell tissue regeneration described in (5), wherein the tissue to be regenerated is articular cartilage, costal cartilage, tracheal cartilage, pharynx Cartilage, skull, alveolar bone The cell tissue regeneration base material according to any one of claims 1 to 5, which is one selected from the group consisting of periodontal tissue, cementum, periodontal ligament, tendon, or ligament. (1) The substrate for cell tissue regeneration according to any one of (1) to (6), which is used for promoting regeneration of a defective cell tissue by filling a tissue defect portion in a living body, (8) chondrocytes In order to promote regeneration of a defective tissue by seeding stem cells, bone marrow cells, osteoblasts, or ES cells and engrafting the cells on a base material, and then filling the tissue in a tissue defect portion The substrate for cell tissue regeneration according to any one of (1) to (6) to be used.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0010]
The modification referred to in the present invention means that the inherently water-soluble hyaluronic acid is hardly soluble.
[0011]
The hyaluronic acid gel referred to in the present invention is a polymer having a three-dimensional network structure and a swollen body thereof. The three-dimensional network structure is formed by a crosslinked structure of hyaluronic acid.
[0012]
As an example, the aqueous solution of hyaluronic acid having a pH of 3.5 or less is frozen and then thawed to be hardly soluble in a neutral aqueous solution in the form of a sheet, film, crushed, sponge, lump, fiber, or tube. A hyaluronic acid gel can be obtained. More specifically, it will be described below.
[0013]
The hyaluronic acid used in the present invention may be extracted from animal tissue or manufactured by fermentation without regard to its origin.
The strain used in the fermentation method is a microorganism having the ability to produce hyaluronic acid, such as Streptococcus sp. No.), and a mutant that stably produces hyaluronic acid at a high yield, such as Streptococcus equi FM-300 described in JP-A-2-23489, is available. Those cultured and purified using the above mutant strains are used.
The molecular weight of hyaluronic acid used in the present invention is about 1 × 10 Five ~ 1x10 7 Those within the Dalton range are preferred. Moreover, as long as it has a molecular weight within the above range, those obtained by subjecting it to a hydrolysis treatment or the like from a higher molecular weight can also be preferably used.
In addition, the hyaluronic acid said to this invention is used by the concept also including the alkali metal salt, for example, the salt of sodium, potassium, and lithium.
The hyaluronic acid gel as referred to in the present invention can be decomposed and solubilized by treating the hyaluronic acid gel under the conditions of accelerated acid hydrolysis reaction of hyaluronic acid. When the solubilized hyaluronic acid retains a crosslinked structure, it can be distinguished from linear hyaluronic acid in terms of polymer solution as hyaluronic acid having a branching point.
As the conditions for the accelerated acid hydrolysis reaction of hyaluronic acid in the present invention, the pH of the aqueous solution and the temperature of 60 ° C. are suitable. The main chain cleavage reaction by hydrolysis of the glycosidic bond of hyaluronic acid is significantly accelerated in acidic and alkaline aqueous solutions as compared to neutral aqueous solutions. Further, the acid hydrolysis reaction is promoted at a higher reaction temperature.
In the present invention, the GPC-MALLS method was used, and the molecular weight and the degree of branching of the molecular weight fraction separated by GPC were continuously measured online. In the present invention, the degree of branching is measured using an elution volume method that calculates the degree of branching by comparing the molecular weight of the solubilized hyaluronic acid in the same elution volume fraction with the molecular weight of the linear hyaluronic acid as a reference. It was. The degree of branching is the number of branch points present per polymer chain of solubilized hyaluronic acid and is plotted against the molecular weight of solubilized hyaluronic acid.
Solubilized hyaluronic acid is diluted with GPC solvent to adjust the concentration,
It filtered for 0.2 micrometer membrane filter and used for the measurement.
When the hyaluronic acid gel referred to in the present invention has a crosslinked structure that exists stably even under the conditions of accelerated acid hydrolysis of hyaluronic acid, a branched structure is confirmed in the solubilized hyaluronic acid in a polymer solution theory. The degree of branching of the hyaluronic acid gel referred to in the present invention is as follows:
It is 0.5 or more.
[0014]
As the acid used for adjusting the pH of the aqueous solution of hyaluronic acid, any acid can be used as long as it can be adjusted to pH 3.5 or lower. In order to reduce the amount of acid used, it is preferable to use a strong acid such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid or the like.
The pH of the aqueous solution of hyaluronic acid is adjusted to a pH at which the carboxyl group of hyaluronic acid is protonated at a sufficient rate. The pH to be adjusted is appropriately determined according to various properties such as the type of counter ion of hyaluronate, the molecular weight of hyaluronic acid, the concentration of the aqueous solution, the conditions for freezing and thawing, and the strength of the gel to be formed. .5 or less, preferably, pH 2.5 or less.
Freezing and thawing are performed by placing an acidic aqueous solution of hyaluronic acid in an arbitrary container, freezing at a predetermined temperature, and thawing at a predetermined temperature after freezing. The temperature and time for freezing and thawing are appropriately determined within the range of the temperature and time for freezing and thawing the acidic aqueous solution of hyaluronic acid depending on the size of the container and the amount of the aqueous solution. The thawing temperature is preferred.
Since freezing and thawing time can be shortened, a freezing temperature of −5 ° C. or lower and a thawing temperature of 5 ° C. or higher are more preferable. The time is not particularly limited as long as it is longer than the time at which freezing and thawing are completed at that temperature.
The number of repetitions of freezing and then thawing the adjusted acidic aqueous solution of hyaluronic acid depends on the molecular weight of the hyaluronic acid used, the concentration of the aqueous solution, the pH of the aqueous solution, the temperature and time of freezing and thawing, and the strength of the gel produced It is determined as appropriate according to various characteristics. Usually, it is preferably repeated one or more times.
Further, each time the operation of freezing and thawing is repeated, the temperature and time for freezing and thawing may be changed.
[0015]
In order to avoid acid hydrolysis of hyaluronic acid, the hyaluronic acid gel obtained by freezing and thawing an acidic solution with adjusted hyaluronic acid needs to remove components such as acid used to adjust to acidic. In order to remove components such as acids, washing with an aqueous solvent or dialysis is usually performed.
[0016]
The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not impair the function of the hyaluronic acid gel. For example, water, physiological saline, phosphate buffer and the like are used, and preferably physiological saline, phosphoric acid A buffer solution or the like is used.
[0017]
The washing and dialysis methods are not particularly limited, but usually the batch method, filtration method, method of filling the column etc. and passing the liquid, etc. In the case of dialysis, dialysis membranes and ultrafiltration membranes are used. A method or the like is preferably used. These conditions include conditions such as the amount of liquid, the number of times, etc., as long as the components to be removed can be reduced to a target concentration or less, and can be appropriately selected depending on the form and use of the hyaluronic acid gel.
[0018]
This washed and dialyzed hyaluronic acid gel is immersed in a solvent, wet in a solvent, air-dried, dried under reduced pressure, or lyophilized, depending on the intended use. It serves as a base material for use.
[0019]
Processes such as molding of hyaluronic acid gel can be made in the form of sheets, films, crushed, sponges, fibers, or tubes, depending on the choice of container and method when freezing the acidic solution with adjusted hyaluronic acid. It is possible to produce a hyaluronic acid gel of the desired form. For example, film-like and sheet-like forms can be obtained by casting on a plate and freezing, and a crushed form can be obtained by freezing and thawing with vigorous mixing and stirring with an organic solvent immiscible with water.
[0020]
By changing the conditions such as the molecular weight, concentration and freezing method of hyaluronic acid, various poorly water-soluble hyaluronic acid gels having different bioabsorbability and pore sizes can be obtained. Among them, a pore having a pore size of 100 to 200 μm is desirable for retaining cells, but a gel having other pores can also be prepared.
[0021]
The substrate for cell tissue culture containing the poorly water-soluble hyaluronic acid gel of the present invention can be used by itself or in combination with other physiologically active substances, biocompatible substances, antibiotics and the like. As a combination method, there are a method of coexisting them during gel production and incorporating them into the gel, and a method of coexisting in a medium during cell culture as a cell tissue culture substrate.
[0022]
Factors that promote the growth of cultured cells are important as biologically active substances, such as insulin, hepatocyte growth factor, tonlas forming growth factor, nerve growth factor, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like Examples include growth factor, fibroblast growth factor, colony stimulating factor, erythropoietin, transferrin, interleukin, and interferon.
[0023]
As a biocompatible substance, a substance that promotes adhesion of cells to be cultured is important. For example, collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, albumin, chondroitin sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate, hyaluronic acid, and nucleic acid are included. Can be mentioned. The described polysaccharides can also be used as oligosaccharides.
[0024]
Antibiotics include streptomycin, penicillin, tobramycin, amikacin, gentamicin, neomycin, and amphotericin B.
[0025]
A method of using a cell tissue culture substrate with the hyaluronic acid gel obtained by the above method is shown below. A hyaluronic acid gel sponge molded in various forms so that it can be filled into a defect in the tissue can be surgically transplanted into the defect such as cartilage to fuse with the surrounding tissue and regenerate the tissue. At this time, the periosteum may be protected for the purpose of preventing leakage of the proliferated or migrated cells from the defective part.
[0026]
It is also possible to use various cells in a hyaluronic acid gel sponge in order to promote tissue repair. As cells to be incorporated into the hyaluronic acid gel sponge, cells such as chondrocytes, stem cells, bone marrow cells, osteoblasts, ES cells can be used regardless of whether they are differentiated or undifferentiated. When cells are differentiated, for example, when stem cells are differentiated into osteoblasts, a substance that induces differentiation such as coexistence of dexamethasone in a culture system and hyaluronic acid gel are used in combination. These cells are cultured with various cell culture media such as DMEM to a sufficient amount using standard cell culture conditions at 37 ° C., and then mixed with sponge-like hyaluronic acid gel as transplanted cells. Let it be captured. By immediately filling this into the defect in the living body as before, it is possible to fuse with the surrounding tissue and regenerate the tissue. At this time, the periosteum may be protected for the purpose of preventing leakage of the proliferated or migrated cells from the defective part.
[0027]
Furthermore, in order to increase the affinity between the cells and the sponge-like hyaluronic acid gel, it is possible to mix the sponge-like hyaluronic acid gel during tissue culture and grow the cells in the sponge-like hyaluronic acid gel. Is possible. In this case as well, cell growth can be performed in various cell culture media and culture conditions, and after the amount of cells has reached a sufficient amount, it is fused with the surrounding tissue by filling the defect in the living body. Can be played. At this time, the periosteum may be protected for the purpose of preventing leakage of the proliferated or migrated cells from the defective part.
[0028]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0029]
Preparation Example 1: Preparation of sponge-like slightly water-soluble hyaluronic acid gel
Molecular weight 2 × 10 6 Dalton hyaluronic acid was dissolved in distilled water to prepare a 1% solution. 1N nitric acid was added to this aqueous solution to adjust the pH to 1.5, and then this solution was put into a flat bottom container and frozen in a freezer set at −20 ° C. After 5 days, it was taken out and thawed at 25 ° C. to obtain a hardly water-soluble hyaluronic acid gel.
Next, this gel was neutralized by immersion in 100 ml of 25 mM phosphate buffered saline at pH 7 for 24 hours, then sufficiently filtered and washed with distilled water, and dried to obtain a sponge-like poorly water-soluble hyaluronic acid gel.
[0030]
Preparation Example 2: Preparation of sponge-like sparingly water-soluble hyaluronic acid gel
Molecular weight 2 × 10 6 Dalton hyaluronic acid was dissolved in distilled water to prepare a 2% solution. 1N nitric acid was added to this aqueous solution to adjust the pH to 1.5, and then this solution was put into a flat bottom container and frozen in a freezer set at −20 ° C. After 5 days, it was taken out and thawed at 25 ° C. to obtain a hardly water-soluble hyaluronic acid gel.
Next, this gel was neutralized by immersion in 100 ml of 25 mM phosphate buffered saline at pH 7 for 24 hours, then sufficiently filtered and washed with distilled water, and dried to obtain a sponge-like poorly water-soluble hyaluronic acid gel.
[0031]
Example 1: Solubility test of poorly water-soluble hyaluronic acid gel
A phosphate buffer component at a concentration of 50 mM was added to the physiological saline to prepare a pH 7 phosphate buffered saline. The sponge-like poorly water-soluble hyaluronic acid gel prepared in Preparation Example 1 was immersed in 50 ml of phosphate buffered saline and gently stirred. The proportion of hyaluronic acid eluted in phosphate buffered saline at 37 ° C. was determined from the hyaluronic acid concentration in phosphate buffered saline.
[0032]
Measurement of hyaluronic acid concentration
The hyaluronic acid concentration in the phosphate buffered saline was determined from the peak area of the differential refractive index detector using GPC.
[0033]
As a result, the dissolution rate of the hyaluronic acid gel obtained in Preparation Example 1 was 2% after 12 hours, 4% after 24 hours, and 96% hyaluronic acid gel after 24 hours. Remained.
[0034]
Therefore, it was suggested that the hyaluronic acid gel obtained in Preparation Example 1 is poorly soluble in a neutral aqueous solution.
[0035]
Example 2: Measurement of branching degree of poorly water-soluble hyaluronic acid gel
[0036]
The sponge-like sparingly water-soluble hyaluronic acid gel obtained in Preparation Examples 1 and 2 was immersed in 15 ml of a hydrochloric acid aqueous solution having a pH of 1.5 and hydrolyzed at 60 ° C. for 6 hours. The gel is solubilized by hydrolysis, diluted twice with GPC solvent to a concentration of 0.05% by weight, filtered through a 0.2 μm membrane filter, and then injected with 0.1 ml of GPC- As a result of measuring MALLS, the degree of branching was 0.5 or more.
[0037]
Example 3
A 12-week-old rabbit is excised from the femur and tibia except for muscles and ligaments, and both ends are cut. The bone marrow was then washed with DMEM medium (containing 32 units / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin, and 6000 units / ml heparin). Cells were separated by centrifugation at 300 × g for 5 minutes. About 1 x 10 from the bone marrow 9 Cells were obtained.
[0038]
After dilution of cells collected from bone marrow with DMEM medium containing 10% FBS, about 2 × 10 8 Cells were seeded on 10 cm diameter culture dishes. The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide gas. On the third day, the medium was changed to remove non-adherent cells (hematopoietic cells).
[0039]
Thereafter, the medium was changed once every three days. bFGF was added to the medium at 1 ng / ml from day 5. Around 10 days, it grew to almost confluence. These culture dishes were incubated with trypsin (0.05%) + EDTA (0.2 mM) for 5 minutes to isolate the cells. The cell number was counted with a Coulter counter (Z1 single, manufactured by Coulter), and 5000 cells / cm. 2 Cells were seeded at a density of
This operation was repeated, and the third-generation cells obtained from the second-generation subculture dish that became almost confluent were used as transplanted cells.
[0040]
Transplantation of cells and sponge-like hyaluronic acid gel into a cartilage bone defect model
A hole of 5 mm in diameter and 5 mm in depth is made in the cartilage on the femur side of the knee joint of a 5 month old female Japanese white rabbit who has stopped growing. It has been found that this large defect does not cause spontaneous cartilage and bone regeneration.
[0041]
To the sponge-like hyaluronic acid gel prepared in Preparation Example 2 having a diameter of 5 mm and a height of 4 mm, 0.1 ml of DMEM containing mesenchymal stem cells was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. This sponge-like hyaluron gel (prepared from a 2% solution of hyaluronic acid) to which 500,000 mesenchymal stem cells (500,000 / 0.1 ml DMEM) were adhered was transplanted into the defect, and sponge-like hyaluron was transplanted. The acid gel alone, the cells alone, and the collagen-cell complex group were compared. After 9 weeks, the animals were sacrificed, joint appearance and sections were prepared, and histology was examined.
When a sponge-like hyaluronic acid gel with cells attached thereto was transplanted, remarkable regeneration of cartilage and bone was observed within 9 weeks. In contrast, no regeneration was observed in the untreated control group, only the cells, and the collagen-cell complex group. Regeneration of cartilage and bone was observed to some extent with only sponge-like hyaluronic acid gel. That is, the above will be described with reference to the drawings.
[0042]
FIG. 1 is a view showing a histological image (control) at 9 weeks after treatment of rabbit knee joint cartilage defect. As shown in FIG. 1, cartilage regeneration was not observed in the untreated control after the defect. FIG. 2 is a view showing a histological image 9 weeks after transplantation of sponge-like hyaluronic acid gel and mesenchymal cells into a rabbit knee joint cartilage defect. Remarkable cartilage tissue regeneration was observed at the defect. FIG. 3 is a view showing a tissue image 9 weeks after transplanting only a sponge-like hyaluronic acid gel into a rabbit knee joint cartilage defect. Some degree of cartilage regeneration was observed only with the sponge-like hyaluronic acid gel.
[0043]
Example 4: Cartilage formation in a sponge-like hyaluronic acid gel
0.1 ml of the third-generation mesenchymal stem cell-containing DMEM of Example 3 was added to a sponge-like hyaluronic acid gel having a diameter of 5 mm and a height of 4 mm and incubated at 37 ° C. for 6 hours. This was transferred to a 16 mm diameter culture dish and further 1 ml of a culture medium for cartilage differentiation (αMEM, glucose 4.5 mg / ml, 10 -7 M dexamethasone, 50 pg / ml ascorbic acid diphosphate, 10 ng / ml TGF-β, 6.25 μg / ml insulin, 6.25 pg / ml transferrin, 6.25 pg / ml selenic acid, 5.35 pg / ml linolenic acid, 25 μg / ml bovine serum albumin) was added and incubated for 1 and 2 weeks. Cartilage differentiation occurred within 1 week and significant cartilage formation was observed at 2 weeks.
[0044]
Example 5 Periodontal tissue regeneration by a stem cell and sponge-like hyaluronic acid gel complex
1) Collection of bone marrow fluid from oral tissues (alveolar bone) of beagle dogs
After scaling the entire jaw under anesthesia, local anesthesia was performed, and the mandibular molar buccal gingiva or mandibular anterior labial gingiva was removed with a full-thickness valve. After the alveolar bone is exposed, a hole with a diameter of about 1 mm is made in the alveolar bone with a dental round bar, and the bone marrow fluid is leached and collected with an injection needle (about 0.5 ml). This was diluted in 10 ml of DMEM medium (containing 32 units / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin, and 6000 units / ml heparin) and centrifuged at 300 × g for 5 minutes to separate the cells. About 1 x 10 from the early bone marrow 9 Cells were obtained.
[0045]
2) Culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells
Stem cells collected from bone marrow are diluted with DMEM medium containing 10% FBS, and then about 2 × 10 8 Seed cells per 10 cm diameter culture dish. The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide gas. The medium was changed on the third day, and thereafter the medium was changed once every three days. bFGF was added to the medium at 1 ng / ml from day 5. Around 10 days, it grew to almost confluence. These culture dishes were incubated with trypsin (0.05%) + EDTA (0.2 mM) for 5 minutes to isolate the cells. The number of cells was counted with a Coulter counter (Z1 single, manufactured by Coulter) and 5000 cells / cm. 2 Cells were seeded at a density of This operation was repeated, and cells obtained from the third-generation subculture dish that became confluent were used as transplanted cells.
[0046]
3) Preparation of alveolar bone defect model
In advance, healthy periodontal tissue of experimental animals is established by stone removal and brushing.
A gingival crevice incision was made from the left and right lower first molars to the first molars under the full hemp, and the buccal gingiva was peeled off with a full-thickness valve. Create a 3 × 5mm dehiscence bone defect in the left, right, and lower mandibular second, third, and fourth premolar mesial roots and the first molar mesial root, apply root planing of the root surface, and create a transplantation bed .
[0047]
4) Transplantation of mesenchymal stem cells into beagle canine alveolar bone defect
Autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells collected in advance and separated and cultured are transplanted into the experimental alveolar bone defect. Autologous oral bone marrow derived mesenchymal stem cells (dissolved in 500,000 cells / 10 μl DMEM) were transplanted by mixing with sponge-like hyaluronic acid gel (3 × 5 mm) immediately before transplantation. Two months after the operation, histological evaluation revealed that alveolar bone and cementum regeneration was slight and epithelial downward growth was observed in the untreated group or the sponge-like hyaluron gel alone group. However, remarkable regeneration of the alveolar bone, cementum and periodontal ligament was observed in the group transplanted with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells together with sponge-like hyaluronic acid gel. That is, the above will be described with reference to the drawings.
FIG. 4 is a view showing a tissue image two months after transplanting only a hyaluronic acid carrier into a beagle canine alveolar bone defect. In the group of sponge-like hyaluronic acid gel alone, alveolar bone and cementum regeneration are slight, and epithelial downward growth is observed.
FIG. 5 is a view showing a tissue image two months after transplanting sponge-like hyaluronic acid gel and autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells into a beagle canine alveolar bone defect. In the group transplanted with sponge-like hyaluronic acid gel and autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells, remarkable regeneration of alveolar bone, cementum and periodontal ligament is observed.
[0048]
【Effect of the invention】
According to the present invention, there is provided a substrate for cell tissue regeneration comprising a hyaluronic acid gel which is composed of hyaluronic acid, is not substantially modified by a chemical cross-linking agent or a chemical modifier and is hardly soluble in a neutral aqueous solution. Can be provided. Since the base material for cell tissue regeneration of the present invention does not use a cross-linking agent or the like, it is excellent in safety and biocompatibility, and tissue is obtained by culturing chondrocytes and stem cells inside and / or on the base material. There are effects such as being able to be used for reproduction.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a histological image (control) at 9 weeks after a rabbit knee joint cartilage defect treatment.
FIG. 2 is a view showing a tissue image 9 weeks after transplantation of sponge-like hyaluronic acid gel and mesenchymal cells into a rabbit knee joint cartilage defect.
FIG. 3 is a view showing a tissue image 9 weeks after transplanting only a sponge-like hyaluronic acid gel into a rabbit knee joint cartilage defect.
FIG. 4 is a view showing a tissue image two months after transplanting only a sponge-like hyaluronic acid gel into a beagle canine alveolar bone defect.
FIG. 5 is a view showing a histological image two months after transplanting sponge-like hyaluronic acid gel and autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells into a beagle canine alveolar bone defect.
[Explanation of symbols]
(A) Regenerated cartilage
(B) Tooth root
(C) Recycled cementitious material
(D) Regenerated alveolar bone
(E) Residual cementum
(F) Residual alveolar bone
Claims (11)
前記ヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸を含む水溶液をｐＨ３．５以下に調整する工程、−５℃以下の凍結温度で５日間以上凍結する工程、を経て得られるヒアルロン酸ゲルである、
細胞組織再生用基材。
（ｃ）中性の３７℃の水溶液で１２時間経過後に９８％のヒアルロン酸ゲルが残存している、
（ｄ）中性の３７℃の水溶液で２４時間経過後に９６％のヒアルロン酸ゲルが残存している。Hyaluronic acid made of hyaluronic acid, substantially not modified by a chemical cross-linking agent or chemical modifier, hardly soluble in a neutral aqueous solution, and satisfying any of the following requirements (c) or (d) Containing gel ,
The hyaluronic acid gel is a hyaluronic acid gel obtained through a step of adjusting an aqueous solution containing hyaluronic acid to a pH of 3.5 or lower, a step of freezing at a freezing temperature of −5 ° C. or lower for 5 days or more,
Base material for cell tissue regeneration.
(C) 98% hyaluronic acid gel remains after 12 hours in a neutral 37 ° C. aqueous solution,
(D) 96% hyaluronic acid gel remains after 24 hours in a neutral 37 ° C. aqueous solution.
次の（ｂ）、前記（ｃ）、及び前記（ｄ）のヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸を含む水溶液をｐＨ３．５以下に調整する工程、−５℃以下で５日間凍結する工程、を経て得られるヒアルロン酸ゲルである、
請求項１に記載の細胞組織再生用基材。
（ｂ）ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで可溶化されたヒアルロン酸が分岐構造を有し、該可溶化されたヒアルロン酸中に、分岐度が０．５以上の分子量フラクションを部分的に含む。Containing a hyaluronic acid gel substantially not modified by a chemical cross-linking agent or a chemical modifier and satisfying the following requirement (b) :
The hyaluronic acid gel of the following (b), (c), and (d) is subjected to a step of adjusting an aqueous solution containing hyaluronic acid to pH 3.5 or lower, and a step of freezing at -5 ° C. or lower for 5 days. The resulting hyaluronic acid gel,
The substrate for cell tissue regeneration according to claim 1.
(B) Hyaluronic acid solubilized by treating hyaluronic acid gel under accelerated acid hydrolysis conditions of hyaluronic acid has a branched structure, and the degree of branching is 0.5 in the solubilized hyaluronic acid. The above molecular weight fraction is partially included.
前記（ｃ）及び前記（ｄ）のヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸を含む水溶液をｐＨ３．５以下に調整する工程、−２０℃で５日間凍結する工程、を経て得られるヒアルロン酸ゲルである、
請求項１に記載の細胞組織再生用基材。A hyaluronic acid gel substantially not modified by a chemical cross-linking agent or chemical modifier is selected from the group consisting of a sheet, film, crushed, sponge, lump, fiber, or tube Tanedea is,
The hyaluronic acid gels of (c) and (d) are hyaluronic acid gels obtained through a step of adjusting an aqueous solution containing hyaluronic acid to pH 3.5 or lower, and a step of freezing at −20 ° C. for 5 days.
The substrate for cell tissue regeneration according to claim 1 .
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