JP4926497B2 - Anti-PCB monoclonal antibody - Google Patents
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Description
本発明は、抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製に用いられる化合物及びハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関する。 The present invention relates to an anti-PCB monoclonal antibody and a method for producing the same, a compound and a hybridoma used for the production of the anti-PCB monoclonal antibody, and a PCB measurement method using the anti-PCB monoclonal antibody.
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）は、安定性や絶縁性の高さから、変圧器及びコンデンサー等の電気絶縁材、並びに熱媒体などとして広く使用されてきたが、人体や環境への有害性が確認されたことから製造や使用が禁止された。ＰＣＢは、難分解性で環境中に残留し、食物連鎖を通じて生物に蓄積され、人の健康や生態系に影響を及ぼす性質を有する残留性有機汚染物質の代表的な化学物質として規制されており、ＰＣＢを含む廃棄物は、適正に処理されるまで、生活環境の保全上支障のないように保管することが義務づけられている。
しかし、適正処理が行われずに保管されていたＰＣＢ廃棄物は、保管の長期化により、紛失や漏洩の発生が問題視され、平成１３年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法」（ＰＣＢ特措法）が施行された。このＰＣＢ特措法により、１５年以内に全てのＰＣＢ廃棄物の適正処理が義務付けられた。
PCBs (polychlorinated biphenyls) have been widely used as electrical insulation materials such as transformers and capacitors, and heat media due to their high stability and insulation properties, but they have been confirmed to be harmful to the human body and the environment. Therefore, production and use were prohibited. PCB is regulated as a representative chemical substance of persistent organic pollutants that have persistent properties, remain in the environment, accumulate in living organisms through the food chain, and affect human health and ecosystems. In addition, it is obliged to store waste containing PCBs so as not to hinder the maintenance of the living environment until they are properly treated.
However, PCB waste that has been stored without proper treatment has been regarded as a problem of loss or leakage due to prolonged storage. In 2001, “Promotion of proper treatment of polychlorinated biphenyl waste” The Special Measures Law (PCB Special Measures Law) was enforced. The PCB Special Measures Law mandates proper disposal of all PCB waste within 15 years.
例えば、絶縁油の場合、保管されている絶縁油以外にも、過去においてＰＣＢを絶縁油として使用していた変圧器において置換された代替絶縁油も、前記変圧器内に微量に残留したＰＣＢに汚染されていることが知られており、このような変圧器中代替絶縁油も含め、大量のＰＣＢ濃度を検査し、迅速に処理の必要性の有無を明確にする必要がある。また、処理を行ったＰＣＢ廃棄物に対し、処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度を検査することも極めて重要である。 For example, in the case of insulating oil, in addition to stored insulating oil, alternative insulating oil that has been replaced in a transformer that has used PCB as insulating oil in the past is also reduced to a small amount of PCB remaining in the transformer. It is known that it is contaminated, and it is necessary to inspect a large amount of PCB concentration, including alternative insulating oil in such a transformer, and to clarify the necessity of processing quickly. In addition, it is also very important to inspect the PCB waste concentration after processing and the PCB concentration in the environment after processing.
従来のＰＣＢ分析方法としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフ−高分解能質量分析（ＨＲＧＣ−ＨＲＭＳ）や、電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ‐ＥＣＤ法）が用いられている（非特許文献１参照）。これらの方法は分解能が高く、また定量下限も低いが、分析に要する時間が長く、分析の妨害となる夾雑成分を除去する試料の操作が煩雑であり、コスト負担が大きいという問題がある。このため、簡便かつ迅速な分析方法で、測定現場で簡易に測定可能な方法が求められていた。 As a conventional PCB analysis method, for example, a high resolution gas chromatograph-high resolution mass spectrometry (HRGC-HRMS) or a gas chromatograph method with an electron capture detector (GC-ECD method) is used as an official method. (Refer nonpatent literature 1). These methods have high resolution and a low quantification limit, but have a problem that the time required for analysis is long, the operation of a sample for removing contaminant components that interfere with analysis is complicated, and the cost burden is large. For this reason, there has been a demand for a simple and quick analysis method that can be easily measured at the measurement site.
これに対し、簡便かつ迅速な分析方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法（イムノアッセイ）が提案されている。前記免疫学的測定法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等があるが、これらいずれの測定方法においても、検出対象であるＰＣＢに対して特異的に反応する抗ＰＣＢ抗体が重要な要素となる。 On the other hand, as a simple and rapid analysis method, an immunological measurement method (immunoassay) using an antigen-antibody reaction has been proposed. Examples of the immunological measurement method include radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), and any of these measurement methods is specific to the PCB to be detected. Reactive anti-PCB antibodies are an important factor.
抗ＰＣＢ抗体としては、ＰＣＢが水難溶性であるため、ＰＣＢが抽出された有機極性溶媒や、ＰＣＢを水溶液に溶存させるために用いる極性溶媒を含む試料溶液に耐性を有し、抗原認識可能であることが求められており、例えば、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中でも抗原認識特性が実質的に低下しない抗モノクローナル抗体（特許文献１参照）等が提案されている。また、多数の異性体が存在するＰＣＢにおいては、交差反応性が制御された特異性の高い抗ＰＣＢ抗体が求められており、例えば、コプラナーＰＣＢの一つである3,3’,5,5’-四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）に対して特異性を持つ抗体（特許文献２参照）等が提案されている。 As an anti-PCB antibody, since PCB is poorly water-soluble, it has resistance to a sample solution containing an organic polar solvent from which PCB is extracted and a polar solvent used for dissolving PCB in an aqueous solution, and can recognize an antigen. For example, an anti-monoclonal antibody (see Patent Document 1) that does not substantially reduce antigen recognition properties even in a 50 (v / v)% organic solvent aqueous solution has been proposed. In addition, for PCBs having a large number of isomers, highly specific anti-PCB antibodies with controlled cross-reactivity are required. For example, 3,3 ′, 5,5, which is one of coplanar PCBs. An antibody having specificity for '-tetrachlorobiphenyl (PCB80) (see Patent Document 2) and the like have been proposed.
一方、ＰＣＢ異性体の中でも、使用禁止までの期間においてコンデンサー、熱媒体、潤滑油、及び蛍光灯安定器等に最も多く含まれ、汎用性が高かった三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢを効率的に検出し、高感度に定量できる抗ＰＣＢ抗体が求められている。
しかしながら、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、未だ満足なものが提供されておらず、改良が求められているのが現状である。
On the other hand, among PCB isomers, PCBs containing a large amount of biphenyl trichloride, which is the most abundant in condensers, heat media, lubricants, fluorescent lamp ballasts, etc. There is a need for anti-PCB antibodies that can be detected and quantified with high sensitivity.
However, PCBs containing a high amount of biphenyl trichloride (for example, Kanto) are highly specific to low chlorinated PCBs having a low number of chlorine, such as biphenyl trichloride, and do not deteriorate the binding property to PCBs in the presence of a polar solvent. Anti-PCB monoclonal antibodies with high sensitivity and excellent quantification of Kanechlor 300 (KC300) manufactured by Kagaku Kogyo Co., Ltd. and PCBs derived from Arocrol 1242 (Ar.1242) manufactured by Mitsubishi Monsanto (currently Mitsubishi Chemical), etc. are still available. At present, satisfactory products are not provided and improvements are required.
本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法、及び該抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the above-described problems and achieve the following objects. That is, the present invention has a high specificity for low-chlorinated PCBs such as biphenyl trichloride with a low number of chlorine, and PCBs containing a large amount of biphenyl trichloride without lowering the binding property to PCBs in the presence of a polar solvent. For example, Kanechlor 300 (KC300) manufactured by Kaneka Chemical Industry, PCB derived from Arrochlor 1242 (Ar.1242) manufactured by Mitsubishi Monsanto (currently Mitsubishi Chemical), etc.) is highly sensitive and anti-PCB monoclonal with excellent quantification. It is an object to provide an antibody, a method for producing the anti-PCB monoclonal antibody, and a PCB measurement method using the anti-PCB monoclonal antibody.
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、四塩化ビフェニル及び三塩化ビフェニルをハプテンとし、該ハプテンを、特定のリンカーを介してキャリアータンパク質に結合した化合物を用いることにより、従来既存の抗ＰＣＢ抗体よりも３塩素化物に対する親和性が極めて高く、低塩素化物の検出下限値が極めて低い抗ＰＣＢモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive studies, and as a result, by using a compound in which tetraphenyl biphenyl and triphenyl biphenyl are used as haptens and the hapten is bound to a carrier protein via a specific linker. The inventors have found that an anti-PCB monoclonal antibody having an extremely high affinity for trichlorinated compounds and a very low detection limit of low chlorinated compounds than conventional anti-PCB antibodies can be obtained, and the present invention has been completed.
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（１）で表される構造を有し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体の調製に用いられることを特徴とする化合物である。
＜２＞ 下記構造式（２）で表される構造を有する前記＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞ 前記構造式（２）中、ｎが５であり、Ｘがヘモシアニンである前記＜２＞に記載の化合物である。
This invention is based on the said knowledge by this inventor, and as a means for solving the said subject, it is as follows. That is,
<1> A compound having a structure represented by the following structural formula (1) and used for the preparation of an anti-PCB monoclonal antibody.
<2> The compound according to <1>, having a structure represented by the following structural formula (2).
<3> The compound according to <2>, wherein n is 5 and X is hemocyanin in the structural formula (2).
＜４＞ 下記構造式（３）で表される構造を有する前記＜１＞に記載の化合物である。
＜５＞ 前記構造式（３）中、ｎが５であり、Ｘがヘモシアニンである前記＜２＞に記載の化合物である。
<4> The compound according to <1>, having a structure represented by the following structural formula (3).
<5> The compound according to <2>, wherein in the structural formula (3), n is 5, and X is hemocyanin.
＜６＞ 前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の化合物を用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の化合物を免疫源としてマウスを免疫し、免疫した前記マウスの脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することを含む前記＜６＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
<6> A method for producing an anti-PCB monoclonal antibody, wherein the compound according to any one of <1> to <5> is used.
<7> Obtained by immunizing a mouse using the compound according to any one of <1> to <5> as an immunogen, collecting spleen cells of the immunized mouse, and fusing the spleen cells and myeloma cells. The method for producing an anti-PCB monoclonal antibody according to <6>, further comprising culturing a hybridoma.
＜８＞ 前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造されたことを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜９＞ 三塩化ビフェニルに対する親和性が、他の塩素数のＰＣＢに対する親和性よりも高い前記＜８＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
<8> An anti-PCB monoclonal antibody produced by the method for producing an anti-PCB monoclonal antibody according to any one of <6> to <7>.
<9> The anti-PCB monoclonal antibody according to <8>, wherein the affinity for biphenyl trichloride is higher than the affinity for PCBs having other chlorine numbers.
＜１０＞ 前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマである。
＜１１＞ 下記構造式（４）で表される構造を有する化合物を用いて作製された前記＜１０＞に記載のハイブリドーマである。
＜１２＞ 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０７４４である前記＜１１＞に記載のハイブリドーマである。
＜１３＞ 下記構造式（５）で表される構造を有する化合物を用いて作製された前記＜１０＞に記載のハイブリドーマである。
＜１４＞ 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０５４７である前記＜１３＞に記載のハイブリドーマである。
<10> A hybridoma characterized by producing the anti-PCB monoclonal antibody according to any one of <8> to <9>.
<11> The hybridoma according to <10>, produced using a compound having a structure represented by the following structural formula (4).
<12> The hybridoma according to <11>, wherein the accession number is FERM P-20744.
<13> The hybridoma according to <10>, produced using a compound having a structure represented by the following structural formula (5).
<14> The hybridoma according to <13>, wherein the accession number is FERM P-20547.
＜１５＞ 前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１６＞ 前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＰＣＢ測定用キットである。
<15> A method for measuring PCB, comprising using the anti-PCB monoclonal antibody according to any one of <8> to <9>.
<16> A kit for measuring PCB, comprising the anti-PCB monoclonal antibody according to any one of <8> to <9>.
本発明によると、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法、及び該抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することができる。 According to the present invention, a PCB containing a large amount of biphenyl trichloride (eg, biphenyl trichloride) having high specificity for low chlorinated PCBs having a low number of chlorine and having a low binding property to PCB in the presence of a polar solvent (for example, , Kanechlor 300 (KC300) manufactured by Kaneka Chemical Industry, PCB derived from Arrochlor 1242 (Ar.1242) manufactured by Mitsubishi Monsanto (currently Mitsubishi Chemical), etc.) In addition, a method for producing the anti-PCB monoclonal antibody and a method for measuring PCB using the anti-PCB monoclonal antibody can be provided.
（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、ハプテンとしてＰＣＢと、リンカーと、免疫原性を有する高分子量物質とからなる複合体を用い、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造される。
ＰＣＢは、単独では抗原性を持たないため、ＰＣＢを認識する抗体を作製するために、前記化合物（以下、「抗体調製用化合物」という）を調製し、これを免疫源（抗原）として用い、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製する。
(Anti-PCB monoclonal antibody)
<Method for producing anti-PCB monoclonal antibody>
The anti-PCB monoclonal antibody of the present invention is produced by the method for producing an anti-PCB monoclonal antibody of the present invention using a complex comprising PCB, a linker, and an immunogenic high molecular weight substance as a hapten.
Since PCB does not have antigenicity by itself, in order to produce an antibody that recognizes PCB, the above-mentioned compound (hereinafter referred to as “antibody preparation compound”) is prepared and used as an immunogen (antigen). The anti-PCB monoclonal antibody is prepared.
＜＜抗体調製用化合物（免疫源）＞＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の調製に用いられる前記抗体調製用化合物は、下記構造式（１）で表される構造を有する化合物である。
<< Compound for antibody preparation (immunogen) >>
The compound for antibody preparation used for the preparation of the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention is a compound having a structure represented by the following structural formula (1).
前記ハプテンとしてのＰＣＢは、三塩化ビフェニル、及び四塩化ビフェニルのいずれかであることが好ましく、また、少なくとも１つの塩素がオルト位（２位又は６位）に配されたものが好ましく、例えば、下記構造式（２）及び（３）で表される化合物がより好ましく、下記構造式（２）で表される化合物が特に好ましい。 The PCB as the hapten is preferably any of biphenyl trichloride and biphenyl tetrachloride, and preferably one in which at least one chlorine is arranged in the ortho position (the 2nd or 6th position). Compounds represented by the following structural formulas (2) and (3) are more preferable, and compounds represented by the following structural formula (2) are particularly preferable.
前記構造式（１）〜（３）中、Ｘで表されるタンパク質（「キャリアータンパク質」ということがある）としては、免疫原性を有し、かつ前記ハプテンとしてのＰＣＢをリンカーを介して連結する際に、該リンカーと結合可能な反応基を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン等が挙げられる。これらの中でも、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。 In the structural formulas (1) to (3), as the protein represented by X (sometimes referred to as “carrier protein”), it has immunogenicity and the PCB as the hapten is linked via a linker. In this case, there is no particular limitation as long as it has a reactive group capable of binding to the linker, and it can be appropriately selected according to the purpose. For example, mussel derived hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rabbit serum albumin, goat serum albumin, bovine gamma globulin and the like. Among these, mussel-derived hemocyanin (KLH) is preferable.
また、前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記構造式（１）〜（３）中、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ−で表される構造となって前記ハプテンと前記タンパク質とを連結するものが好ましく、ｎは、４〜６が好ましく、５がより好ましい。 The linker is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. In the structural formulas (1) to (3), the linker is represented by —O— (CH 2 ) n —CONH—. The structure in which the hapten and the protein are linked is preferable, and n is preferably 4 to 6, and more preferably 5.
本発明の抗体調製用化合物の模式図の一例を、図１に示す。 An example of a schematic diagram of the compound for antibody preparation of the present invention is shown in FIG.
前記抗体調製用化合物の調製方法としては、特に制限はなく、公知の合成方法により調製することができ、例えば、前記リンカーと前記ハプテンとしてのＰＣＢとからなる化合物を、例えば下記に示す方法により合成し、これを前記タンパク質（キャリアータンパク質）を含む溶液中に添加し、前記リンカーを前記タンパク質に結合させることにより調製する方法が挙げられる。 The method for preparing the antibody preparation compound is not particularly limited, and can be prepared by a known synthesis method. For example, a compound comprising the linker and PCB as the hapten is synthesized by, for example, the method shown below. In addition, a method may be mentioned in which this is added to a solution containing the protein (carrier protein) and the linker is bound to the protein.
得られた前記抗体調製用化合物は、必要に応じて反応液を免疫源として使用するのに好適な生理的リン酸緩衝液などの中性溶液に置換し、ろ過や透析等の公知の方法により精製することが好ましい。 The obtained compound for antibody preparation is replaced with a neutral solution such as a physiological phosphate buffer suitable for use as an immunogen, if necessary, by a known method such as filtration or dialysis. It is preferable to purify.
＜＜ハイブリドーマ＞＞
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記抗体調製用化合物を免疫源として動物を免疫し、免疫した前記動物の脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することにより製造される。
<< Hybridoma >>
The anti-PCB monoclonal antibody, for example, immunizes an animal using the antibody preparation compound as an immunogen, collects spleen cells of the immunized animal, and cultures a hybridoma obtained by fusing the spleen cells and myeloma cells. It is manufactured by doing.
免疫する前記動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ等の哺乳動物が好ましく、マウスがより好ましい。
前記動物の免疫方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記抗体調製用化合物を、アジュバントとともに、皮下、静脈内、腹腔内に注射等により投与する方法が挙げられる。前記抗体調製用化合物は、例えば、最初に投与した後（初回免疫後）２週間程度の間隔で２〜３回投与されることが好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ （ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）等が好ましい。
As the animal to be immunized, mammals such as mice, rats, rabbits and dogs are preferable, and mice are more preferable.
The animal immunization method is not particularly limited and can be appropriately selected from known methods. For example, the antibody preparation compound is administered together with an adjuvant by subcutaneous, intravenous, intraperitoneal injection, or the like. Is mentioned. The compound for antibody preparation is preferably administered 2 to 3 times at intervals of about 2 weeks after the first administration (after the first immunization).
The adjuvant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, RIBI Adjuvant (MPL + TDM Emulsion) manufactured by Corixa Corporation is preferable.
前記抗体調製用化合物の最後の投与から数日後から数ヶ月後に、脾臓を摘出し、抗体産生可能な細胞が単離される。前記抗体産生可能な細胞は、ミエローマ細胞と融合され、その後所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングすることにより、前記ハイブリドーマが得られる。
前記ミエローマ細胞としては、例えば、Ｂｕｌｂ／ｃマウス由来の骨髄腫細胞株、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等が挙げられる。
前記抗体産生可能な細胞とミエローマ細胞との融合方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができるが、例えば、ポリエチレングリコール法が好ましい。
Several days to several months after the last administration of the antibody preparation compound, the spleen is removed and cells capable of producing antibodies are isolated. The antibody-producing cells are fused with myeloma cells, and then the hybridoma is obtained by screening for fused cells that produce the desired antibody.
Examples of the myeloma cells include Bulb / c mouse-derived myeloma cell lines, Sp2 / 0-Ag14, and the like.
The method for fusing the antibody-producing cells and myeloma cells is not particularly limited and may be appropriately selected from known methods. For example, the polyethylene glycol method is preferred.
前記所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識を用いた方法が挙げられ、具体的には、担体に固定化した抗原（抗体調製用化合物）に前記ハイブリドーマ培養上清を添加し、前記抗原に結合した前記抗体を、標識した二次抗体を用いて蛍光センサーで検出する一次スクリーニング、及び、前記ハイブリドーマ培養上清に過剰量の抗原（ＰＣＢ）を添加して平衡化した後、前記抗原と結合しなかった前記抗体について、前記担体に固定化した前記抗原（抗体調製用化合物）との結合を測定する二次スクリーニングからなり、前記一次スクリーニングと前記二次スクリーニングとの差から、所望の抗原と結合する抗体を特定する方法等が挙げられる。 The method for screening the fused cells producing the desired antibody is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include a method using a label. Primary screening in which the hybridoma culture supernatant is added to an immobilized antigen (antibody preparation compound), and the antibody bound to the antigen is detected with a fluorescent sensor using a labeled secondary antibody, and the hybridoma culture After adding an excess amount of antigen (PCB) to the supernatant for equilibration, the antibody that did not bind to the antigen is measured for binding to the antigen (compound for antibody preparation) immobilized on the carrier. It consists of a secondary screening, and a method for identifying an antibody that binds to a desired antigen, based on the difference between the primary screening and the secondary screening.
以下、Ｂｕｌｂ／ｃマウスを用いた本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法の例を説明する。 Hereinafter, an example of a method for producing the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention using a Bulb / c mouse will be described.
−マウスの免疫−
前記抗体調製用化合物（タンパク質量にして約０．３ｍｇ）をＣｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合し、Ｂｕｌｂ／ｃマウス（メス、５週齢）に対し皮下注射により免疫する。初回免疫の２週間後と４週間後に、初回と同量の前記抗体調製用化合物をＣｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射する。更に１週間以上経過した後、同量の前記抗体調製用化合物を、腹腔又は尾部静脈に注射し、その４〜５日後に脾臓を摘出する。
-Mouse immunity-
The compound for antibody preparation (protein amount of about 0.3 mg) is mixed with RIBI Advantant (MPL + TDM Emulsion) manufactured by Corixa Corporation, and immunized by subcutaneous injection into Bull / c mice (female, 5 weeks old). Two weeks and four weeks after the first immunization, the same amount of the compound for antibody preparation as the first immunization is mixed with RIBI Adjuvant (MPL + TDM Emulsion) manufactured by Corixa Corporation, and then injected subcutaneously. After one week or more has passed, the same amount of the compound for antibody preparation is injected into the abdominal cavity or tail vein, and the spleen is removed 4 to 5 days later.
−ハイブリドーマの作製−
前記脾臓由来の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、ポリエチレングリコール溶液中でミエローマ細胞と２分間混合することにより、融合反応を行う。
前記ミエローマ細胞としては、例えば、凍結保存されていたものを細胞融合実験の約１０日前に解凍し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養したものが好ましい。また、状態の良いミエローマ細胞を調製するために、細胞融合を行う前日には必ず培地交換を行うことが好ましい。
-Production of hybridoma-
The spleen-derived cells are washed with RPMI 1640 medium, and then mixed with myeloma cells in a polyethylene glycol solution for 2 minutes to carry out a fusion reaction.
The myeloma cells are preferably, for example, those that have been cryopreserved and thawed about 10 days before the cell fusion experiment and cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum. In order to prepare myeloma cells in good condition, it is preferable to always change the medium on the day before cell fusion.
融合反応後、得られた融合細胞は、例えば、２０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地（Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ培地）に懸濁後、９６穴マイクロプレート等に分注する。融合反応の翌日及び５日後に、培養液を新しいＨＡＴ培地（含２０％牛胎児血清）に交換し、以後、ほぼ４日に１度の頻度で培養液を新しいＨＴ培地（含１０％牛胎児血清）に交換することが好ましい。 After the fusion reaction, the obtained fused cells are suspended in, for example, a HAT medium (Hypoxanthin Aminoopterin Thymidine medium) containing 20% fetal bovine serum, and then dispensed into a 96-well microplate or the like. On the next day and 5 days after the fusion reaction, the culture medium was replaced with a new HAT medium (containing 20% fetal calf serum). Thereafter, the culture medium was replaced with a new HT medium (containing 10% fetal calf approximately once every four days). It is preferable to replace it with serum.
−ハイブリドーマのスクリーニング−
ハイブリドーマのスクリーニングは、細胞融合して得た融合細胞の培養上清を分析することにより行うことができる。具体的には、細胞融合から２週間以上経過したハイブリドーマの培養上清を分析し、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを選択することが好ましい。以下に分析方法の一例として、蛍光標識した二次抗体を用い、蛍光光度計により分析する方法を説明するが、該分析方法に限定されるものではない。
二次抗体の標識としては、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、金コロイドなどが好適に挙げられる。
-Screening for hybridomas-
Hybridoma screening can be performed by analyzing the culture supernatant of fused cells obtained by cell fusion. Specifically, it is preferable to select a hybridoma that secretes a desired antibody by analyzing the culture supernatant of the hybridoma that has passed 2 weeks or more after cell fusion. Hereinafter, as an example of the analysis method, a method of analyzing with a fluorometer using a fluorescently labeled secondary antibody will be described, but the method is not limited thereto.
Suitable examples of the secondary antibody label include peroxidase, biotin, and gold colloid.
−−抗体分析−−
（１）抗原ビーズの作製
図１に示す前記抗体調製用化合物におけるリンカーと同じリンカーと、ハプテン（例えば、二塩化フェノール）とを有する化合物を合成し、キャリアータンパク質（例えば、卵白アルブミン）と結合させて複合体としたハイブリドーマスクリーニング用抗原を調製し、これをビーズ（例えば、アガロースビーズ等）に固定化する。
前記ビーズに対し、前記ハイブリドーマスクリーニング用抗原を固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて、前記ハイブリドーマスクリーニング用抗原が結合されていない前記ビーズの表面をブロッキングする。
--- Antibody analysis-
(1) Preparation of antigen beads A compound having the same linker as the linker in the antibody preparation compound shown in FIG. 1 and a hapten (for example, phenol dichloride) is synthesized and bound to a carrier protein (for example, ovalbumin). Thus, a hybridoma screening antigen prepared as a complex is prepared and immobilized on beads (for example, agarose beads).
After immobilizing the antigen for hybridoma screening on the beads, the surface of the beads to which the antigen for hybridoma screening is not bound is blocked using a bovine serum albumin (BSA) solution.
（２）蛍光光度計による測定
蛍光光度計による測定としては、例えば、前記（１）で調製した前記抗原ビーズに、前記ハイブリドーマの培養上清を作用させた後、前記抗原ビーズをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）緩衝液によって洗浄し、蛍光物質にて標識した二次抗体を作用させ、次いで、ＰＢＳ緩衝液により洗浄したビーズの蛍光強度を測定することにより行うことができる。
前記二次抗体には前記蛍光物質が結合されているため、洗浄後、前記抗原ビーズ上に残った蛍光の強度から、前記ハイブリドーマ培養上清中の所望の抗体の有無を判断することができる。前記蛍光強度は、蛍光光度計等を適宜用いて測定することができる。
(2) Measurement with Fluorometer The measurement with a fluorimeter includes, for example, the culture supernatant of the hybridoma acting on the antigen beads prepared in (1) above, and then the antigen beads are mixed with PBS (phosphate buffer). (saline) buffer solution, a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is allowed to act, and then the fluorescence intensity of the beads washed with PBS buffer solution is measured.
Since the fluorescent substance is bound to the secondary antibody, the presence or absence of the desired antibody in the hybridoma culture supernatant can be determined from the intensity of fluorescence remaining on the antigen beads after washing. The fluorescence intensity can be measured using a fluorometer or the like as appropriate.
前記ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に限定されないが、上記の方法により作製され、樹立されたものが好ましく、具体的にはＳｋ３Ａ１１株、及びＳｚｋ２Ｅ４株がより好ましく、Ｓｋ３Ａ１１株が特に好ましい。 The hybridoma is not particularly limited as long as it produces the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention that recognizes PCB, but is preferably prepared and established by the above-described method, specifically, the Sk3A11 strain and the Szk2E4 strain. Is more preferable, and the Sk3A11 strain is particularly preferable.
前記Ｓｋ３Ａ１１株は、下記構造式（４）、具体的には図１に示す抗体調製用化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１７年１２月２２日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７４４として寄託されている。
前記Ｓｚｋ２Ｅ４株は、下記構造式（５）に示す抗体調製用化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１７年５月２６日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４７として寄託されている。 The Szk2E4 strain is a hybridoma prepared using an antibody preparation compound represented by the following structural formula (5), and was commissioned on May 26, 2005 to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited under the number FERM P-20547.
＜＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の産生及び精製＞＞
前記ハイブリドーマを、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ等）を用いて培養し、得られた培養液の上清を、抗ＰＣＢモノクローナル抗体溶液とすることができる。
また、前記ハイブリドーマを培養して得た培地から、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の濃縮方法や精製方法により精製することができる。
<< Production and purification of anti-PCB monoclonal antibody >>
The hybridoma can be cultured using a medium (for example, DMEM containing 10% fetal bovine serum), and the supernatant of the obtained culture solution can be used as an anti-PCB monoclonal antibody solution.
The method for purifying the anti-PCB monoclonal antibody from the medium obtained by culturing the hybridoma is not particularly limited and can be appropriately selected from known methods according to the purpose. For example, ultrafiltration It can be purified by a concentration method or purification method such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography or the like.
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価＞
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、ＰＣＢとの親和性、特に塩素数の異なるＰＣＢの間で異なる親和性を比較することにより、ＰＣＢに対する親和性、及び反応の特異性（交差反応性）を評価することができる。
前記親和性は、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０値）により評価することができる。
前記特異性（交差反応性）は、例えば、３塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値と、４〜６塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値とを比較することにより、具体的にはそれぞれのＩＣ５０値の比を求めることにより評価することができる。
<Evaluation of anti-PCB monoclonal antibody>
The anti-PCB monoclonal antibody is to evaluate the affinity for PCB and the specificity of the reaction (cross-reactivity) by comparing the affinity with PCB, in particular, different affinity between PCBs having different chlorine numbers. Can do.
The affinity can be evaluated by the antigen concentration (IC 50 value) that inhibits the binding of the anti-PCB monoclonal antibody to PCB by 50%.
The ratio of the specificity (cross reactivity), for example, 3 and an IC 50 value for the chlorinated PCB, by comparing the an IC 50 value for the 4-6 chlorinated PCB, specifically each IC 50 values for Can be evaluated by obtaining
前記ＩＣ５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、蛍光光度計による測定データを、下記式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。 The IC 50 value calculation method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the measurement data obtained by a fluorometer is applied to the approximate expression represented by the following formula (1). It is possible to analyze by obtaining.
測定データは、抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％として相対値に変換した後、グラフ作成ソフトウェアOrigin version 6.0（OriginLab製）を用いて最適なＰ１及びＰ２を決定する。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ５０値とする。
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。
The measurement data is converted to a relative value with the fluorescence intensity value when no antigen is added as 100%, and then optimum P1 and P2 are determined using graph generation software Origin version 6.0 (manufactured by OriginLab).
The approximate expression obtained in this way is the binding curve between the antibody and the antigen, and the value of x (= P1) when y = 50% is the IC 50 value.
It is known that when the antibody concentration is sufficiently small with respect to the IC 50 value (for example, 1/10 or less), the IC 50 value and the equilibrium dissociation constant (Kd) are almost the same.
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）を標準試料として評価することができる。
前記カネクロールは、それぞれ下記表１に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているため、例えば、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、三塩化ビフェニルに高い特異性を示すため、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）の中でもＫＣ−３００に対して最も高い特異性を示す。
The specificity of the anti-PCB monoclonal antibody for PCBs having different chlorine numbers can be evaluated using, for example, Kanechlor (KC-300, KC-400, KC-500, KC-600, KC-1000) as a standard sample. .
Since the Kanechlor contains PCBs having different chlorine numbers in the ratios shown in Table 1 below, for example, the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention exhibits high specificity for biphenyl trichloride. KC-300, KC-400, KC-500, KC-600, KC-1000) are the most specific to KC-300.
（ＰＣＢ測定方法）
本発明のＰＣＢ測定方法は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用い、試料中のＰＣＢを免疫学的に検出、定量する方法、具体的には、免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、蛍光センサー法等が挙げられる。
(PCB measurement method)
The PCB measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method using the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, using the anti-PCB monoclonal antibody, Of immunologically detecting and quantifying PCBs of urine, specifically, immunochromatography, radioimmunoassay, fluorescence immunoassay, immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (EIA, ELISA), chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) , Immunoturbidimetric method (TIA), latex immunoturbidimetric method (LTIA), fluorescent sensor method and the like.
測定対象のＰＣＢは低分子化合物であるため、競合法により測定することが好ましく、前記競合法としては、担体（例えば、マイクロプレートのウェル、ビーズ、チューブ等）に抗原を固定化する間接競合法（間接競合ＥＬＩＳＡ法）、前記担体に抗体を固定化する直接競合法（直接競合ＥＬＩＳＡ法）が挙げられる。同様に、結合平衡除外法も好ましく、前記結合平衡除外法としては、前記担体に前記抗原を固定化する方法が挙げられる。 Since the PCB to be measured is a low molecular weight compound, it is preferably measured by a competition method. As the competition method, an indirect competition method in which an antigen is immobilized on a carrier (for example, a well of a microplate, a bead, or a tube). (Indirect competition ELISA method) and direct competition method (direct competition ELISA method) in which an antibody is immobilized on the carrier. Similarly, a binding equilibrium exclusion method is also preferable, and examples of the binding equilibrium exclusion method include a method of immobilizing the antigen on the carrier.
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法において、前記担体に固定化する抗原（以下、「固定化抗原」という）は、前記抗体調製用抗原のハプテンとは異なるハプテンを有するものが好ましく、該固定化抗原のハプテンとしては、例えば、二塩化フェノールが挙げられる。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法は、前記固定化抗原を前記担体上に固定化し、前記担体の前記固定化抗原が結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、該担体に試料と前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを加え、前記固定化抗原と前記試料中のＰＣＢとを前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対して前記間接競合法においては競合反応させ、前記結合平衡除外法においては結合平衡除外化反応させる。
前記固定化担体と結合しなかった前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を洗浄除去した後、二次抗体として標識した抗体を加え、前記固定化抗原と結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合させ、洗浄を行った後、前記標識の発色又は発光を測定する。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
In the indirect competition method and the binding equilibrium exclusion method, the antigen to be immobilized on the carrier (hereinafter referred to as “immobilized antigen”) preferably has a hapten different from the hapten of the antibody preparation antigen. Examples of the hapten of the conjugated antigen include phenol dichloride.
In the indirect competition method and the binding equilibrium exclusion method, the immobilized antigen is immobilized on the carrier, and a portion of the carrier to which the immobilized antigen is not bound is blocked with a blocking agent. Next, a sample and the anti-PCB monoclonal antibody are added to the carrier, the immobilized antigen and PCB in the sample are subjected to a competitive reaction with the anti-PCB monoclonal antibody in the indirect competition method, and the binding equilibrium is excluded. In the method, the reaction is excluded from binding equilibrium.
After washing and removing the anti-PCB monoclonal antibody that did not bind to the immobilized carrier, an antibody labeled as a secondary antibody was added, and the anti-PCB monoclonal antibody bound to the immobilized antigen was bound and washed. The color development or luminescence of the label is measured. For the absorbance and light intensity obtained, the rate of decrease relative to the value when no sample was added was determined, and this was used as the inhibition rate, using a calibration curve obtained in advance from the inhibition rate when PCB of a known concentration was added. The PCB concentration in the sample can be calculated.
前記直接競合法においても、前記試料中のＰＣＢと競合させる標識抗原は、前記抗体調製用抗原のハプテンとは異なるハプテンを有する化合物と酵素とを結合してなるものが好ましく、該標識抗原のハプテンとしては、例えば、二塩化フェノールが挙げられる。
前記直接競合法は、前記担体に前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を固定化し、結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、試料と前記標識抗原とを加え、前記試料中のＰＣＢと前記標識抗原とを競合反応させる。前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合しなかった前記標識抗原を洗浄除去した後、反応生成物の発色又は発光を測定する。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
Also in the direct competition method, the labeled antigen that competes with the PCB in the sample is preferably formed by binding a compound having a hapten different from the hapten of the antibody preparation antigen and an enzyme. Examples thereof include phenol dichloride.
In the direct competition method, the anti-PCB monoclonal antibody is immobilized on the carrier, and the unbound portion is blocked with a blocking agent. Next, the sample and the labeled antigen are added, and the PCB in the sample and the labeled antigen are subjected to a competitive reaction. After washing away the labeled antigen that did not bind to the anti-PCB monoclonal antibody, color development or luminescence of the reaction product is measured. For the absorbance and light intensity obtained, the rate of decrease relative to the value when no sample was added was determined, and this was used as the inhibition rate, using a calibration curve obtained in advance from the inhibition rate when PCB of a known concentration was added. The PCB concentration in the sample can be calculated.
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する場合、及び酵素としてアルカリホスファターゼを用い、基質にｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する場合には、発色を吸光度で測定することができる。一方、基質の反応生成物が蛍光である場合や、蛍光物質を用いて標識されている場合には、蛍光光度計等を用いて蛍光を測定することができる。また、化学発光物質を用いる場合には、発光を化学発光測定器等により測定することができ、金コロイドを用いる場合には、透過光度等を透過光量測定器等により測定することができる。 The label is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. For example, when peroxidase is used as an enzyme, hydrogen peroxide is used as a substrate, and o-phenylenediamine or tetramethylbenzidine is used as a color former. When alkaline phosphatase is used as the enzyme and p-nitrophenyl phosphate is used as the substrate, color development can be measured by absorbance. On the other hand, when the reaction product of the substrate is fluorescent or is labeled with a fluorescent substance, the fluorescence can be measured using a fluorometer or the like. When a chemiluminescent substance is used, the luminescence can be measured with a chemiluminescence measuring instrument or the like, and when using a gold colloid, the transmitted light intensity or the like can be measured with a transmitted light quantity measuring instrument or the like.
前記試料としては、例えば、被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液液抽出してなる試料、及び前記被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液液抽出し、抽出された前記ＰＣＢを含む前記極性溶媒を吸着剤で固相抽出し、前記吸着剤に吸着した成分を所望の溶媒に転溶させてなる試料などが挙げられる。 Examples of the sample include a sample obtained by liquid-liquid extraction of PCB in a test substance with a polar solvent, and the polar solvent containing PCB extracted by liquid-liquid extraction of the PCB in the test substance with a polar solvent. And a sample obtained by solid-phase extraction with an adsorbent and dissolving the component adsorbed on the adsorbent in a desired solvent.
前記極性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等が挙げられ、これらの中でも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。 The polar solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide, acetonitrile, sulfolane, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone and the like. Among these, dimethyl sulfoxide (DMSO) is preferable.
前記液液抽出において、前記被験物質と前記極性溶媒との混合比（質量比）としては、（前記被験物質）：（前記極性溶媒）＝１：１〜：１：１０が好ましい。 In the liquid-liquid extraction, the mixing ratio (mass ratio) of the test substance and the polar solvent is preferably (the test substance) :( the polar solvent) = 1: 1 to 1:10.
前記被験物質としては、少なくともＰＣＢを含む可能性がある物質（ＰＣＢ汚染物）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などが挙げられる。これらの中でも、絶縁油が好適に挙げられる。
前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。
The test substance is not particularly limited as long as it is a substance (PCB contaminant) that may contain at least PCB, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, insulating oil, oil other than insulating oil (For example, vegetable oils, animal oils, synthetic oils, mineral oils, etc.), factory wastewater, soil, exhaust gas, animal blood and body fluids, wastes such as members used in the treatment of insulating oils, and the like. Among these, insulating oil is preferably exemplified.
As said insulating oil, the insulating oil after performing PCB decomposition processes, such as a dechlorination process, is also mentioned suitably.
前記試料中の極性溶媒の濃度としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する前記親和性が著しく劣化しない限り、特に制限はなく、例えば、１〜２０質量％であることが好ましく、１０〜２０質量％であることがより好ましい。
なお、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、２０質量％の極性溶媒を含む試料溶液中において、７０〜９０％の親和性を有する。
The concentration of the polar solvent in the sample is not particularly limited as long as the affinity of the anti-PCB monoclonal antibody for PCB is not significantly deteriorated, and is preferably 1 to 20% by mass, for example, 10 to 20% by mass. % Is more preferable.
The anti-PCB monoclonal antibody of the present invention has an affinity of 70 to 90% in a sample solution containing 20% by mass of a polar solvent.
（ＰＣＢ測定用キット）
本発明のＰＣＢ測定用キットは、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含み、試料中のＰＣＢを検出可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体、標識された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対する二次抗体、標識された抗原（ハプテン）としてのＰＣＢ、緩衝液、検出試薬、及び標準試料（例えば、カネクロール）等を含む。前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、標識されていてもよい。
また、前記ＰＣＢ測定用キットとしては、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含め、必用な試薬がフィルター等の担体に吸着されてなる免疫クロマトグラフィー用試験紙の形態であってもよい。
(PCB measurement kit)
The PCB measurement kit of the present invention is not particularly limited as long as it contains the anti-PCB monoclonal antibody of the present invention and can detect PCB in a sample, and can be appropriately selected according to the purpose. A PCB monoclonal antibody, a secondary antibody against the labeled anti-PCB monoclonal antibody, PCB as a labeled antigen (hapten), a buffer solution, a detection reagent, a standard sample (for example, Kanechlor), and the like. The anti-PCB monoclonal antibody may be labeled.
The PCB measurement kit may be in the form of an immunochromatographic test paper in which necessary reagents including the anti-PCB monoclonal antibody are adsorbed on a carrier such as a filter.
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
（１）抗体調製用化合物の合成
免疫原を有する前記抗体調製用化合物として、ハプテンとして３塩素化物ＰＣＢ（三塩化ビフェニル）を、リンカーを介してキャリアータンパク質（スカシガイ由来のヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と表す））に結合したものを以下の方法により合成した。該抗体調製用化合物の模式図は、図１に示すとおりである。
Example 1
(1) Synthesis of Compound for Antibody Preparation As the compound for antibody preparation having an immunogen, trichlorinated PCB (biphenyl trichloride) is used as a hapten, and carrier protein (kashigai-derived hemocyanin (hereinafter referred to as “KLH”) via a linker. ))) Was synthesized by the following method. A schematic diagram of the antibody preparation compound is as shown in FIG.
前記３塩素化物ＰＣＢと、前記リンカーとからなる化合物（以下、「Ｓ３分子」という）を水酸化ビフェニルへの塩素付加反応後、さらにＢｒ（ＣＨ２）５ＣＯＯＣ２Ｈ５を反応させ、さらに加水分解し、さらに活性エステル化することにより合成した。
得られた前記Ｓ３分子１ｍｇを１００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これを３ｍｇのＫＬＨを含む９ｍＬの１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．８）と混合し、これを一晩放置して、Ｓ３分子とＫＬＨとの複合体を作製した。次いで、未反応のＳ３分子を除くとともに、反応溶液をマウスの免疫に適した中性溶液にするために、脱塩カラム（エコノパック１０ＤＧカラム、日本バイオ・ラッド社製）を用いてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した。こうして前記抗体調製用化合物溶液を得た。
A compound comprising the trichlorinated PCB and the linker (hereinafter referred to as “S3 molecule”) is subjected to a chlorine addition reaction to biphenyl hydroxide, followed by further reacting with Br (CH 2 ) 5 COOC 2 H 5 and further hydrolyzing. And then synthesized by active esterification.
1 mg of the obtained S3 molecule was dissolved in 100 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO). This was mixed with 9 mL of 100 mM borate buffer (pH 9.8) containing 3 mg of KLH, and this was left overnight to prepare a complex of S3 molecule and KLH. Next, in order to remove unreacted S3 molecules and to make the reaction solution a neutral solution suitable for immunization of mice, a PBS buffer solution using a desalting column (Econopack 10DG column, manufactured by Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) (PH 7.0). Thus, the compound solution for antibody preparation was obtained.
（２）マウスの免疫
前記（１）で調製した前記抗体調製用化合物を抗原として、マウス（Ｂｕｌｂ／ｃ、メス、５週齢）に免疫した。
初回免疫は、前記抗体調製用化合物（タンパク質量として約０．３ｍｇ）をＣｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射した。該初回免疫の２週間後と４週間後に、同量の前記抗体調製用化合物を、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射した。その後、１週間以上経過した後、同量の前記抗体調製用化合物を、腹腔又は尾部静脈に注射し、その４〜５日後に脾臓を摘出した。
(2) Immunization of mice Mice (Bulb / c, female, 5 weeks old) were immunized with the antibody preparation compound prepared in (1) as an antigen.
For the first immunization, the compound for antibody preparation (about 0.3 mg as protein amount) was mixed with RIBI Adjuvant (MPL + TDM Emulsion) manufactured by Corixa Corporation, and then injected subcutaneously. Two weeks and four weeks after the initial immunization, the same amount of the compound for antibody preparation was mixed with RIBI Adjuvant (MPL + TDM Emulsion) manufactured by Corixa Corporation and then injected subcutaneously. Thereafter, after one week or more had elapsed, the same amount of the compound for antibody preparation was injected into the abdominal cavity or tail vein, and the spleen was removed 4 to 5 days later.
（３）ハイブリドーマの作製
前記（２）で摘出した脾臓から調製した脾臓細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で洗浄した後、ミエローマ細胞ＮＳ０株（理化学研究所）とともにポリエチレングリコール（重合度１，５００、日本ロシュ社製）溶液中で２分間混合し、細胞融合を行った。前記ミエローマ細胞は、凍結保存されていたものを細胞融合実験の約１０日前に解凍し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を約４０ｍＬ添加して培養し、細胞融合の前日に培地交換を行った。
(3) Production of hybridoma Spleen cells prepared from the spleen removed in (2) above were washed with RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen) and then polyethylene glycol (polymerization degree 1, 1, with myeloma cell NS0 strain (RIKEN)). (500, manufactured by Nippon Roche Co., Ltd.) in the solution for 2 minutes to perform cell fusion. The myeloma cells that had been cryopreserved were thawed about 10 days before the cell fusion experiment, cultured with about 40 mL of RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum, and the medium was changed the day before cell fusion. It was.
融合反応後の融合細胞を、２０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地約１２０ｍＬに懸濁後、９６穴マイクロプレート６枚に２００μＬずつ分注した。
細胞融合の翌日及び５日後に１００μＬの培養液を、２０％牛胎児血清を含む新しいＨＡＴ培地に交換した。以後、ほぼ４日に１度の頻度で１００μＬの培養液を、１０％牛胎児血清を含む新しいＨＡＴ培地に交換した。
The fused cells after the fusion reaction were suspended in about 120 mL of HAT medium containing 20% fetal bovine serum, and then dispensed in 200 μL aliquots onto six 96-well microplates.
The next day and 5 days after cell fusion, 100 μL of the culture solution was replaced with fresh HAT medium containing 20% fetal bovine serum. Thereafter, 100 μL of the culture solution was replaced with fresh HAT medium containing 10% fetal calf serum almost once every four days.
（４）ハイブリドーマのスクリーニング
(a)産生抗体分析用抗原ビーズの作製
図１に示す前記抗体調製用化合物と同じリンカーを有する二塩化フェノールを合成し、卵白アルブミン（ＯＶＡ）との複合体を調製した。得られた複合体を、アガロースビーズ（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に固定化し、産生抗体分析用抗原ビーズを調製した。前記産生抗体分析用抗原ビーズ約１ｍＬに、前記複合体約０．１ｍｇを固定化した後、１０ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液１ｍＬを用い、前記複合体が結合していないビーズ表面をブロッキングした。
(4) Hybridoma screening
(a) Production of antigen beads for analysis of produced antibody Phenol dichloride having the same linker as the antibody preparation compound shown in FIG. 1 was synthesized to prepare a complex with ovalbumin (OVA). The obtained complex was immobilized on agarose beads (NHS-activated Sepharose, manufactured by Amersham Biosciences) to prepare antigen beads for production antibody analysis. After immobilizing about 0.1 mg of the complex to about 1 mL of the antigen beads for analyzing the produced antibody, 1 mL of a 10 mg / mL bovine serum albumin (BSA) solution is used, and the surface of the bead to which the complex is not bound is used. Blocked.
(b)蛍光光度計による測定
前記産生抗体分析用抗原ビーズに対し、０．２５ｍＬ／分の流速で２分間（合計０．５ｍＬ）の前記ハイブリドーマ培養上清を作用させた。前記ハイブリドーマの培養上清は、細胞融合から２週間以上経過したものを用いた。
前記産生抗体分析用抗原ビーズを、０．２５ｍＬ／分の流速で０．５分間、ＰＢＳ緩衝液によって洗浄した後、蛍光物質Ｃｙ５にて標識した二次抗体５ｎＭ（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、Jackson Immunoresearch社製）を、０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。
続いて、前記産生抗体分析用抗原ビーズをＰＢＳ緩衝液によって、０．２５ｍＬ／分の流速で０．５分間、さらに１．５ｍＬ／分の流速で１．５分間洗浄した。
洗浄後、前記産生抗体分析用抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を蛍光光度計（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製、ＫｉｎＥｘＡ ３０００）を用いて測定し、前記ハイブリドーマ培養上清中、所望の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の有無を判断した。
(b) Measurement with a fluorimeter The hybridoma culture supernatant was allowed to act on the antigen beads for analysis of the produced antibody at a flow rate of 0.25 mL / min for 2 minutes (total 0.5 mL). The culture supernatant of the hybridoma was used after 2 weeks or more from cell fusion.
The antigen beads for production antibody analysis were washed with PBS buffer at a flow rate of 0.25 mL / min for 0.5 minutes, and then secondary antibody 5 nM (goat anti-mouse IgG antibody, Jackson Immunoresearch labeled with fluorescent substance Cy5). Was applied for 96 seconds (total 0.4 mL) at a flow rate of 0.25 mL / min.
Subsequently, the antigen beads for analyzing the produced antibody were washed with PBS buffer at a flow rate of 0.25 mL / min for 0.5 minutes, and further at a flow rate of 1.5 mL / min for 1.5 minutes.
After washing, the intensity of the fluorescence remaining on the antigen beads for production antibody analysis was measured using a fluorimeter (manufactured by Sapidyne, KinExA 3000), and the presence or absence of a desired anti-PCB monoclonal antibody in the hybridoma culture supernatant. Judged.
測定の結果、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する安定なハイブリドーマが得られ、これをＳｋ３Ａ１１株とした。
前記Ｓｋ３Ａ１１株細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、該コロニーを液体培地に移し、培養を続けた。
As a result of the measurement, a stable hybridoma producing an anti-PCB monoclonal antibody was obtained, and this was designated as Sk3A11 strain.
The Sk3A11 strain cells formed a colony derived from a single cell using a methylcellulose medium, and then transferred the colony to a liquid medium and continued the culture.
（５）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製
前記（４）で樹立したハイブリドーマＳｋ３Ａ１１株のコロニーを、２４穴プレート上のＲＰＭＩ１６４０培地を基本とするＨＡＴ培地に移し４日間培養した後、培養液の一部を１０ｍｌの前記ＨＡＴ培地を入れた５０ｍｌの角形フラスコに移し、コンフルエントに達する直前まで培養し、Ｓｋ３Ａ１１株によって分泌された抗体を培養上清からプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｋ３Ａ１１抗体」という）を得た。
(5) Preparation of anti-PCB monoclonal antibody The colony of the hybridoma Sk3A11 strain established in (4) above was transferred to a HAT medium based on RPMI1640 medium on a 24-well plate and cultured for 4 days. It is transferred to a 50 ml square flask containing 10 ml of the HAT medium, cultured until just reaching confluence, the antibody secreted by the Sk3A11 strain is purified from the culture supernatant by affinity chromatography using protein A, and anti-PCB monoclonal An antibody (hereinafter referred to as “Sk3A11 antibody”) was obtained.
（６）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価
前記（５）で得た抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）０．３ｍｇ／ｍＬは、５０倍希釈したものを抗体溶液とし、ＰＣＢの測定に用いた。
また、比較対象として、市販の抗ＰＣＢ抗体（ＲＤＩ社製、ＰＣＢ３５、以下「ＲＤＩ抗体」という）を用いた。前記ＲＤＩ抗体は、０．１％ＢＳＡを含むＰＣＢ緩衝液を用いて２，０００倍に希釈したものを抗体溶液とし、ＰＣＢの測定に用いた。
(6) Evaluation of anti-PCB monoclonal antibody The anti-PCB monoclonal antibody (Sk3A11 antibody) 0.3 mg / mL obtained in the above (5) was diluted 50 times into an antibody solution and used for PCB measurement.
For comparison, a commercially available anti-PCB antibody (RDI, PCB35, hereinafter referred to as “RDI antibody”) was used. The RDI antibody was diluted 2,000 times with a PCB buffer containing 0.1% BSA to prepare an antibody solution, which was used for PCB measurement.
ＰＣＢの標準試料として、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００）を測定対象とした。前記カネクロールはＤＭＳＯを用いて希釈し、２％ＤＭＳＯで測定を行う場合には、前記カネクロールを含むＤＭＳＯ溶液２０μＬと、ＰＢＳ緩衝液４８０μＬとを混合したものに、前記抗体溶液５００μＬを加えて１ｍＬとした測定試料を調製した。 Kanechlor (KC-300, KC-400, KC-500) was used as a measurement target as a standard sample of PCB. When the canechlor is diluted with DMSO and measured with 2% DMSO, 500 μL of the antibody solution is added to a mixture of 20 μL of the DMSO solution containing the canechlor and 480 μL of PBS buffer. A measurement sample with 1 mL was prepared.
該測定試料を、抗原を固定化したビーズ（以下、「抗原ビーズ」という）に供給し、前記（４）と同様にして蛍光光度計（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製、ＫｉｎＥｘＡ ３０００）を用いて測定し、親和性、交差反応性を評価した。
なお、蛍光標識以外の標識由来の信号強度を測定することによっても、得られた値から以下の方法により親和性及び交差反応性を求め、定量することができる。
具体的には、前記標識が金コロイドの場合には、前記担体の透過光量を信号強度とし、透過光量測定装置（例えば、柴田科学社製、Ｉｍｎｙ等）を用いて測定することができる。
The measurement sample was supplied to beads immobilized with an antigen (hereinafter referred to as “antigen beads”), and measured using a fluorometer (KinExA 3000, manufactured by Sapidyne) in the same manner as in (4) above. And cross-reactivity were evaluated.
In addition, also by measuring the signal intensity derived from labels other than a fluorescent label, affinity and cross-reactivity can be obtained and quantified from the obtained values by the following method.
Specifically, when the label is a colloidal gold, the amount of light transmitted through the carrier is used as the signal intensity, and measurement can be performed using a transmitted light amount measurement device (for example, Imny, manufactured by Shibata Kagaku Co., Ltd.).
（i）親和性の測定
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体について、異なる塩素数のＰＣＢを含む各カネクロールとの親和性を比較するために、蛍光光度計による測定データを近似式に当てはめ、ＩＣ５０値を求めた。前記近似式として、下記式（１）を用いた。
(I) Measurement of affinity In order to compare the affinity of each anti-PCB monoclonal antibody with each of Kanechlor containing PCBs having different chlorine numbers, the measurement data obtained by a fluorometer was applied to an approximate expression, and the IC 50 value was calculated. Asked. As the approximate expression, the following expression (1) was used.
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）とがほぼ一致することが知られているため、親和性の評価として、該平衡解離定数（Ｋｄ）を用いた。 It is known that when the antibody concentration is sufficiently small with respect to the IC 50 value (for example, 1/10 or less), the IC 50 value and the equilibrium dissociation constant (Kd) are almost the same. The equilibrium dissociation constant (Kd) was used as an affinity evaluation.
カネクロールを含まない２％ＤＭＳＯ溶液中の前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、前記抗原ビーズとの結合量を１００として、濃度を変えたカネクロールを含む２％ＤＭＳＯ溶液中の前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、前記抗原ビーズとの結合量の測定結果を、図２〜５に示す。また、図２〜５の結果から求めた平衡解離定数（Ｋｄ値）を、下記表２に示す。 The anti-PCB monoclonal antibody in 2% DMSO solution containing 2% DMSO containing 2% DMSO in a 2% DMSO solution containing no canechlor, and the amount of binding between the antigen beads and the antigen beads as 100. The measurement results of the binding amount with the antigen beads are shown in FIGS. The equilibrium dissociation constants (Kd values) determined from the results of FIGS.
（ii）交差反応性
交差反応性は、それぞれ、下記式により算出した。結果を下記表２に示す。
Ｓｋ３Ａ１１の交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（２）
ＲＤＩの交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（３）
(Ii) Cross reactivity Cross reactivity was calculated by the following formula. The results are shown in Table 2 below.
Crossreactivity Sk3A11 (%) = (KC300 IC 50 values / an IC 50 value of the sample)
... Formula (2)
RDI cross-reactivity (%) = (KC300 IC 50 values / an IC 50 value of the sample)
... Formula (3)
図２〜５、及び表２の結果から、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、３塩素化物ＰＣＢを最も多く含有するＫＣ−３００に対して最も強い親和性を示し、その親和性の強さはＲＤＩ抗体の約２５倍であった。ＫＣ−４００に対する親和性もＳｋ３Ａ１１抗体の方がＲＤＩ抗体よりも約３．３倍強かった。一方、ＫＣ−５００とＫＣ−６００に対する親和性は、ＲＤＩ抗体の方がＳｋ３Ａ１１抗体よりも強く、特にＫＣ−６００に対しては、ＲＤＩ抗体の方がＳｋ３Ａ１１抗体よりも約２４倍強いことがわかった。 From the results of FIGS. 2 to 5 and Table 2, the Sk3A11 antibody showed the strongest affinity for KC-300 containing the most trichlorinated PCB, and the strength of the affinity was about 25 times that of the RDI antibody. It was twice. The affinity for KC-400 was also about 3.3 times stronger for the Sk3A11 antibody than for the RDI antibody. On the other hand, the affinity for KC-500 and KC-600 shows that the RDI antibody is stronger than the Sk3A11 antibody, and in particular, for KC-600, the RDI antibody is about 24 times stronger than the Sk3A11 antibody. It was.
また、図２に示されたように、ＲＤＩ抗体は、ＫＣ−３００濃度１ｐｐｂ以下では、ＫＣ−３００を全く含まない試料と同じ相対信号値１００％を示しているのに対し、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、１ｐｐｂのＫＣ−３００に対して相対信号値約５０％を示しており、かつ０．１ｐｐｍを下回る濃度においても相対信号値の変化がみられる。このことは、ＲＤＩ抗体では１ｐｐｂ以下のＫＣ−３００を測定できないのに対し、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、０．１〜１ｐｐｂ以下のＫＣ−３００を測定できることを示している。
これらの結果から、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）は、従来の抗ＰＣＢ抗体において検出が困難であった３塩素化物ＰＣＢを高感度に測定可能な抗体として有用であることがわかった。
In addition, as shown in FIG. 2, the RDI antibody shows the same relative signal value 100% as the sample containing no KC-300 at a KC-300 concentration of 1 ppb or less, whereas the Sk3A11 antibody The relative signal value is about 50% with respect to 1 ppb KC-300, and a change in the relative signal value is observed even at a concentration below 0.1 ppm. This indicates that the RDI antibody cannot measure 1 ppb or less of KC-300, whereas the Sk3A11 antibody can measure 0.1 to 1 ppb or less of KC-300.
From these results, it was found that the anti-PCB monoclonal antibody (Sk3A11 antibody) of the present invention is useful as an antibody capable of measuring trichlorinated PCB, which was difficult to detect with conventional anti-PCB antibodies, with high sensitivity. .
（実施例２）
前記免疫原を有する前記抗体調製用化合物として、ハプテンとして四塩化ビフェニルを用い、ハイブリドーマＳｚｋ２Ｅ４株を得て、これを培養して抗体を作製した以外は、実施例１と同様にして抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製し、得られた抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｚｋ２Ｅ４抗体」という）を用いて、カネクロールに対する親和性及び交差反応性を評価した。
また、実施例１と同様に、比較対象として、ＲＤＩ抗体を用いた。結果を図６〜８、及び表３に示す。
(Example 2)
The anti-PCB monoclonal antibody was prepared in the same manner as in Example 1 except that the antibody preparation compound having the immunogen was obtained by using biphenyl tetrachloride as a hapten to obtain a hybridoma Szk2E4 strain and culturing the hybridoma Szk2E4 strain. Using the obtained anti-PCB monoclonal antibody (hereinafter referred to as “Szk2E4 antibody”), the affinity and cross-reactivity for canechlor were evaluated.
Further, as in Example 1, an RDI antibody was used as a comparison target. The results are shown in FIGS.
−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する耐性−
Ｓｚｋ２Ｅ４抗体とＲＤＩ抗体のＤＭＳＯに対する耐性を比較した。
ＤＭＳＯ濃度の異なる抗体の溶液を調製し、実施例１と同様にして前記抗原ビーズに供給し、該抗原ビーズに固定された抗原に対する結合性を測定した。
ＲＤＩ抗体は、６％以上のＤＭＳＯが存在する溶液中において前記抗原に対する結合性が低下し、２０％ＤＭＳＯ存在下では測定に利用できなかったのに対し、Ｓｚｋ１２Ｅ４抗体は、２０％のＤＭＳＯが存在する溶液中においても、前記抗原に対する結合性を保っていた。結果を図９に示す。
-Resistance to dimethyl sulfoxide (DMSO)-
The resistance of Szk2E4 antibody and RDI antibody to DMSO was compared.
Antibody solutions with different DMSO concentrations were prepared, supplied to the antigen beads in the same manner as in Example 1, and the binding to the antigen immobilized on the antigen beads was measured.
The RDI antibody decreased in binding to the antigen in a solution containing 6% or more of DMSO and could not be used for measurement in the presence of 20% DMSO, whereas the Szk12E4 antibody had 20% DMSO. Even in the solution, the binding to the antigen was maintained. The results are shown in FIG.
図６〜８の結果から、Ｓｚｋ２Ｅ４抗体は、３塩素化物ＰＣＢを最も多く含有するＫＣ−３００に対して最も強い親和性を示し、その親和性がＲＤＩ抗体よりも強いことがわかり、さらに図９の結果から、Ｓｚｋ２Ｅ４抗体は、極性溶媒に対する高い耐性を示すことがわかった。また、表３の結果からも、塩素数の少ないＰＣＢにより強い親和性を示すことが明らかとなり、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４抗体）は、従来の抗ＰＣＢ抗体において検出が困難であった三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢを高感度に測定可能な抗体として有用であることがわかった。 From the results of FIGS. 6-8, it can be seen that the Szk2E4 antibody showed the strongest affinity for KC-300 containing the largest amount of trichlorinated PCB, and the affinity was stronger than that of the RDI antibody. From the results, it was found that the Szk2E4 antibody exhibits high resistance to polar solvents. Also, from the results in Table 3, it was clear that PCBs with a small number of chlorine showed strong affinity, and the anti-PCB monoclonal antibody (Szk2E4 antibody) of the present invention was difficult to detect in the conventional anti-PCB antibody. It has been found that low chlorinated PCBs having a low number of chlorine such as biphenyl trichloride are useful as antibodies capable of measuring with high sensitivity.
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量であるため、組成が未知の絶縁油等、特に低塩素化物ＰＣＢを多量に含有する可能性のある検査対象を、最小限の誤差で高感度に検出、定量することができ、廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等の検査に好適に使用することができる。 The anti-PCB monoclonal antibody of the present invention is highly specific for low chlorinated PCBs such as biphenyl trichloride with a low number of chlorines, and contains a large amount of biphenyl trichloride without lowering the binding property to PCBs in the presence of a polar solvent. Since the PCB (for example, PCB derived from Kanekurol 300 (KC300) manufactured by Kaneka Chemical Industry, Arocrol 1242 (Ar.1242) manufactured by Mitsubishi Monsanto (now Mitsubishi Chemical), etc.) is highly sensitive and quantitative, It is possible to detect and quantify the inspection object that may contain a large amount of low chlorinated PCBs, such as insulating oil with unknown composition, with high sensitivity and minimal PCB error. It can be suitably used for inspection of PCB concentration in the environment.
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