JP4914956B2

JP4914956B2 - DNA vaccine

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Publication number: JP4914956B2
Application number: JP2000291792A
Authority: JP
Inventors: 哲朗俣野
Original assignee: DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES
Current assignee: DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 2000-09-26
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2020-09-26
Also published as: JP2001169784A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡワクチンに関し、例えば、エイズ（ＡＩＤＳ：Acquired Immune Deficiency Syndrome（後天性免疫不全症候群））用のＤＮＡワクチンに関する。より詳細には、本発明は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（本明細書中、ＨＩＶとも記す）またはサル免疫不全ウイルス（本明細書中、ＳＩＶとも記す）などのウイルスの感染の予防、並びに、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズ発症などのようなウイルス感染によるウイルス疾患の発症の予防及び／治療のために用いることができるＤＮＡワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトにおけるエイズの原因となるＨＩＶは、レトロウイルスの一種であり、１型及び２型などが知られている。ＨＩＶは、血液を媒介として例えば感染者との性交渉あるいは患者の血液輸血などによって感染し、そして感染により血液中のＴ細胞が破壊され、免疫機能が著しく低下し、カポシ肉腫、カリニ肺炎等に罹患して死に至る疾患である。
ＨＩＶ感染者数は近年、加速度的に増加しており、特にタイ、アメリカ合衆国などの諸国においては、エイズが国民の死亡原因の上位に位置しており、その予防および治療法を確立することは極めて重要である。エイズに対する予防および治療法については現在までに多くの研究がなされている。中でも、エイズワクチン開発は、社会的にも必要度が高く、最重要課題である。このエイズワクチンに関する研究は、主にマカクサルにおけるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染などの霊長類モデルにおいておこなわれている（Johnson,R.P., Curr.Opin.Immunol. 8, 554-560(1996)；及びAlmond, N.M.他、AIDS 12, 133-140(1998））。
【０００３】
一般に、ワクチンにより誘導される感染防御免疫としては、主に中和抗体による液性免疫とＴリンパ球による細胞性免疫の２つが考えられており、エイズワクチンにおいても両者の重要性は指摘されている(Dittmer, U. 他、Nature Med. 5,189-193 (1999))。このうち、液性免疫については、ＨＩＶの構造上の特異性および多様性の問題等のため、充分有効な免疫誘導が容易ではない(Shibata, R.他、Nature Med. 5,204-210 (1999))。一方、近年特に、ＨＩＶあるいはＳＩＶ感染抑制における細胞性免疫の重要性が指摘されている(Geretti, A.M. 他、J.Gen.Virol, 79, 415-421 (1998); Matano, T. 他、J. Virol, 72, 164-169 (1998); Scmits, J.E. 他、Science 283, 857-860 (1999); Jin, X. 他、J. Exp. Med. 189, 991-998 (1999))。しかし、現時点では、これらの感染防御免疫を充分有効かつ安全に誘導するエイズワクチンは開発されていない。
【０００４】
エイズワクチンの１つとして注目されているものに弱毒化生ウイルスワクチンがある。これは、病原性を持つＨＩＶに遺伝子操作を施すなどして病原性を消失させたウイルスを免疫原として使用する方法である。弱毒化したウイルスは接種された宿主に対して効果が長期間持続する強い免疫原性を誘導する。弱毒化生ウイルスワクチンは霊長類を用いた動物実験レベルにおいて比較的良好な有効性が確認されているが(Daniel,M.D.,他、Science 258, 1938-1941(1992)；Shibata,R.,他、J.Virol. 70, 4361-4369(1996)；及びShibata,R.,他、J.Virol. 71, 814-8148(1997))、ウイルスの病原性が回復したり、他のウイルスにより汚染されている可能性が残る等といった安全性の問題が未解決であるため実用化には至っていない（Baba,T.W.,他、Science 267, 1820-1825(1995)；及びBaba,T.W.,他、Nature Med. 5, 194-203(1999)）。
【０００５】
比較的安全と考えられるエイズワクチンとしては、サブユニットワクチン・ウイルスベクターワクチン・ＤＮＡワクチンが主なものであり、それぞれ、アジュパンドとの併用あるいは他の方法との併用等も試みられてきている(Letvin, N.L. 他、Science 280, 1875-1880(1998))。サブユニットワクチンは、ＨＩＶの蛋白質あるいはそれに含まれるペプチドを合成・精製し免疫原として用いるものであるが、有効な抗エイズ感染防御免疫は誘導できていない。抗原存続時間が短いこと、細胞性免疫誘導機能が弱いこと等の理由が考えられている。ウイルスベクターワクチンはワクシニアウイルスベクター等の組み換えウイルスベクターを用いてＨＩＶ蛋白質を抗原として発現させるものであるが、ウイルスベクター由来のウイルス抗原に対する免疫反応が強く、ＨＩＶ抗原に対する免疫誘導能は不充分である。従って、他の方法との併用を中心に検討されている。ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを投与することにより、ＨＩＶ抗原を発現させるものである。細胞性免疫誘導能が比較的良好なこと等から近年特に注目されているが、充分有効な抗エイズ感染防御免疫は誘導できていない。(ウイルス複製を起こす弱毒化生ウイルスワクチンと比較して、)抗原発現量が低いことおよび抗原発現時間が短いこと等の理由が考えられている。以上のように、現時点では、安全性と有効性の両方を満たすエイズワクチンは開発されていない（Burton,D.R.他、Nature Med. 4, 495-498(1998)；Lu, S.,他、J.Virol. 70, 3978-3991(1996)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は新規なＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、安全性が高いと同時に十分な感染防御免疫を誘導できるＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＳＨＩＶ（ヒトおよびサル由来のキメラの免疫不全ウイルス）のｅｎｖ遺伝子の一部をＦＭＬＶのｅｎｖ遺伝子に置き換えることによって作製した組み換えウイルスＤＮＡとＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡとを一緒にサルに投与することにより、安全かつ有効にＳＩＶ感染防御細胞性免疫を誘導できることを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
【０００８】
好ましくは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、レトロウイルスのＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡである。
好ましくは、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
好ましくは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、コードされる蛋白質が免疫原性を有し、当該蛋白質によってウイルス粒子が再構成されるようなＤＮＡである。
好ましくは、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡを含む組み換えウイルスＤＮＡ由来のウイルスがＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたはサルの細胞には感染不可能で、ＦＭＬＶレセプターを発現する細胞には感染可能であるようなＤＮＡである。
【０００９】
好ましくは、本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡであり、より好ましくは、レトロウイルスのＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡであり、さらに好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡである。
本発明の一態様によれば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
本発明の別の態様によれば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、本発明の組み換えウイルスＤＮＡを含む、ワクチンが提供され、好ましくはエイズワクチンが提供される。
本発明のワクチンは好ましくは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターと一緒に用いられる。
本発明の別の側面によれば、本発明の組み換えウイルスＤＮＡと、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターとを含むワクチンが提供され、好ましくはエイズワクチンが提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施方法および実施態様について詳細に説明する。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ（好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのようなレトロウイルスのＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと該ウイルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ）と、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有するキメラＤＮＡであることを特徴とする。
本明細書で言うウイルスの種類は特に限定されず、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよく、また一本鎖ウイルスでも二本鎖ウイルスでもよい。好ましいウイルスの具体例としては、レトロウイルスが挙げられる。
本明細書で言うレトロウイルスは通常の意味を有し、ＲＮＡウイルスの中で遺伝子ＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環をもつウイルスである。レトロウイルスの具体例としては、例えば、マウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−II、ある種の癌ウイルス、並びにエイズウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）など）などが挙げられる。レトロウイルスは通常、タンパク質をコードする３種の遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをもっている。
本明細書で言う「ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）」または「サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）」とは、ヒトまたはサルに感染する免疫不全ウイルスの全てを包含する最も広い意味を有し、あらゆるウイルスタイプまたはそれらの変異体の全てを包含する。
【００１２】
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含み、特に好ましくはＨＩＶまたはＳＩＶなどのレトロウイルス由来のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部とＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含む。
即ち、本発明のウイルスＤＮＡによりコードされるウイルスのコアタンパク質は完全蛋白質でも部分蛋白質でもよい。Ｇａｇ蛋白質及び／又はＰｏｌ蛋白質などのコアタンパク質の部分蛋白質をコードするＤＮＡを用いる場合には、コードされる部分蛋白質が免疫原性を有するようなＤＮＡが好ましく、またコードされる部分蛋白質によってもウイルス粒子が再構成され得るようなＤＮＡが好ましい。本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好ましくは、Ｇａｇ蛋白質の完全蛋白質とＰｏｌ蛋白質の完全蛋白質をコードするＤＮＡを有する。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは更に、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを有する。Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡについても、コアタンパク質と同様に、完全蛋白質をコードするＤＮＡでも部分蛋白質をコードするＤＮＡでもよいが、好ましくは完全Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡである。また、Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡは、ＨＩＶまたはＳＩＶ由来のＥｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡの一部のみをＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部をコードするＤＮＡに置き換えたものでもよい。この場合、ＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部をコードするＤＮＡを有する本発明の組み換えＤＮＡ由来のウイルスは、ＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたはサルの細胞には感染せず、ＦＭＬＶレセプターを発現する細胞のみに感染できることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、コアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、Ｅｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有するが、各々のＤＮＡのコピー数は少なくとも１以上であれば、そのコピー数は限定されず、２コピー以上のＤＮＡ断片を１つの組み換えウイルスＤＮＡ中に含んでいてもよい。
また、上記３種類の蛋白質の少なくとも一部をコードする各々のＤＮＡの位置関係も特には限定されない。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Adachi,A.,他、J.Virol.59,284-291(1986);及びShibata,R.,他、J.Virol.69,4453-4462(1986)）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（Kestler,H.,他、Science.248,1109-1112(1990)）またはＨＩＶとＳＩＶの一部ずつを含んで成るキメラウイルス（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)等に記載）遺伝子などのような任意の公知のウイルス遺伝子を出発材料として使用して、その中に含まれるＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードする領域を、常法のＤＮＡ組換え技術を用いてフレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡに置き換えることによって作製することができる。
【００１４】
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好ましくは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターと一緒にワクチンとして用いられる。ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターは好ましくは発現プラスミドベクターである。
発現ベクターの作製において有用なベクターとしては、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターを含むベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１５】
構成性プロモーターの具体例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力なプロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターの具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質誘導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００１６】
ＦＭＬＶレセプターの発現ベクターの構築のために用いるベクターは、プロモーター（例えば、上記の構成性または誘導性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことが好ましい。ベクターはさらに、エンハンサー要素、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０あるいはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来）、スプライシングシグナル・イントロン配列などのＲＮＡプロセシング配列、あるいはＣｐＧモチーフ等の免疫刺激ＤＮＡ配列の１又は２以上のコピーを含んでいてもよい。
また、ベクターは、細菌の複製起点配列および／または抗生物質耐性（例えば、カナマイシン）あるいは非抗生物質耐性（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）に用いられ得る選択マーカー用のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明はまた、上記した本発明の組み換えＤＮＡを含む、ワクチンを提供する。ウイルスとしてＨＩＶまたはＳＩＶなどのエイズウイルスを選択した場合には、本発明の組み換えＤＮＡを含むワクチンはエイズワクチンとして使用できる。
本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味する。本明細書において、「エイズワクチン」という用語は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染予防ワクチン、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズ発症の予防ワクチン、並びにＨＩＶまたはＳＩＶ感染症の治療ワクチンを含む広い意味で用いられる。
【００１８】
本発明のワクチンはヒトまたはサルなどの哺乳動物に投与され、投与を受けた動物には、対応するウイルス疾患に対する免疫が生じる。本発明の組み換えＤＮＡによってコードされるウイルスの蛋白質が生体内で合成され、これが抗原となって細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されて細胞性免疫が喚起され（場合によってはＢ細胞も抗体産生細胞へと分化し、体液性免疫も喚起される）、ウイルスに対する免疫が生じることになる。細胞性免疫が喚起されることは、エイズなどのウイルス疾患の発症や進行の抑制にも有用であることから、本発明のワクチンを用いる免疫は、エイズなどのウイルス疾患の予防のみでなく治療にも役立つものである。
【００１９】
本発明のワクチンは、例えば、薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬など）またはアジュバンドと一緒に配合して医薬組成物の形態で提供することができる。
【００２０】
本発明で用いることができる薬学的に許容可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクションするのに適したものである。このような薬学的に許容可能な担体の具体例としては、リポソーム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランスフェクション試薬が挙げられる。当業者はこのようなトランスフェクション試薬を用いて、本発明で用いるＤＮＡを適宜処方することができる。
【００２１】
医薬組成物を調製するために用いることができる免疫用アジュバントは当技術分野で周知である。当業者は、医薬組成物を形成するための適切なアジュバントを適宜選択することができる。
本発明で用いることができるアジュバントの具体例としては、ＣｐＧアジュバント(Krieg A. 他、Nature 374, 546-549 (1995))などが挙げられる。
本発明のワクチンは、カプセル剤、懸濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の投与形態で用いることができる。
【００２２】
また、本発明のワクチンは、他のワクチンと併用することができる。この場合、同時に投与する場合と前後して投与する場合がありうる。具体例としては、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチン、他のＤＮＡワクチン等との併用がある。
【００２３】
単回投与量のワクチンＤＮＡを含む医薬組成物を調製するために担体物質と組み合わせるべきワクチンＤＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方法、用いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現される抗原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活性（免疫原性）、被験者の性別、年齢、体重、全体的な健康状態、予防または治療の対象となるウイルス疾患の種類やタイプ等を含む多くの要因に依存する。投与すべきＤＮＡの量はまた、薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬）およびアジュバンドの種類および量にも依存する。
【００２４】
本発明のワクチンをヒトに投与する場合、対象となるウイルス疾患の予防または治療に有効な量で投与されるが、一般的には、１μｇ〜２０００μｇを筋肉あるいは皮膚に直接投与する。遺伝子銃を使用して本発明のワクチンを投与することもできる。皮下注入、皮内導入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内又は吸入投与、経口投与も可能であり、投与経路は特に限定されない。また、追加免疫接種を行うことも可能である。
【００２５】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのウイルスのｅｎｖ遺伝子をフレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のｅｎｖ遺伝子に置き換えることによって作成したキメラ組み換えウイルスＤＮＡを、ＦＭＬＶのレセプターをコードするＤＮＡと一緒に投与することによって、複製により比較的長期の高い抗原発現量を達成して有効性を獲得すると同時に、感染される細胞をＦＭＬＶのレセプターをコードするＤＮＡを保持する細胞に限定することにより安全性を確保することにも成功したものである。本発明は従来にない全く新しいシステムによるワクチンを提供するものであり、これにより有効性および安全性の両方の面で優れたワクチンを提供することが可能になった。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２６】
【実施例】
（１）材料と方法
（ａ）ＤＮＡの調製
ＳＨＩＶ MD14YE（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）のＥｎｖ表面蛋白質（ＳＵ）をコードする遺伝子断片を取り除き、ＦＭＬＶｅｎｖ遺伝子（Patuleia,M.C.他、Cancer Res. 27:726-730(1967)；及びMatano,T.,他、J.Virol. 67, 2026-2033(1993)）（フレンドリッチの番号付によるヌクレオチド５７６９−７８０５［GenBank accession no.X02794］（Koch,W.,他、J.Virol. 45:1-9(1983),26））に置き換え、ＦＭＳＩＶ感染性クローンＤＮＡ（ＦＭＳＩＶＤＮＡ）を得た。ｎｅｆ遺伝子の５’側を欠失させた。即ち、ＦＭＳＩＶＤＮＡは、ＳＩＶ由来のＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ及びｖｐｘと、ＨＩＶ−１由来のｔａｔ及びｒｅｖと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖを有する。図２に、ＦＭＳＩＶＤＮＡの構造を示す。図２において、白い部分はＳＩＶ由来の領域を示し；点線の部分はＨＩＶ−１由来の領域を示し；黒い部分はＦＭＬＶ由来の領域を示す。
なお、参考のために図１には、ＨＩＶ−１由来のｇａｇとｐｏｌと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み換えウイルスＤＮＡであるＦＭＨＩＶの構造を示す模式図を示す。
【００２７】
２種類のｍＣＡＴ１ＤＮＡ（ｍＣＡＴ１発現プラスミドＤＮＡ）を使用した。一つ目のｐＪＥＴ（Albritton,L.M.,他、Cell 57, 659-666(1989)）は、J.M. Cunningham氏から供与されたものである。二つ目のｐＣＭＶｍＣＡＴ１は、ｐＣＭＶβ（クローンテック社）からβ−ｇａｌ遺伝子を取り除き、ｍＣＡＴ１をコードする遺伝子に置き換えることによって構築した。
【００２８】
（ｂ）マカクサル
動物個体におけるＦＭＳＩＶの複製の確認実験には、１頭のカニクイサルを使用した。ワクチン接種実験には、年齢が同じ5頭の雄の赤毛サルを使用した。サルは全てＳＩＶ、ＳＲＶ（サルＤ型レトロウイルス）、およびサルＴリンパ球性白血病ウイルス１型に対して陰性であることを試験した。血液採取、リンパ節（ＬＮ）生検、ワクチン接種、およびウイルス接種はケタミン麻酔下で行った。
【００２９】
（ｃ）ＤＮＡ−ＰＣＲ
ＤＮＡはリンパ節（ＬＮ）リンパ球から調製し、ネスティドＤＮＡＰＣＲは既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）行った。１ｓｔＰＣＲで用いたプライマーはTGGCAGATTGAGCCCTGG（配列番号１）およびCCTCTTCCTCTGACAGGCC（配列番号２）である。２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーは、AAGCTAGTGTGTGTTCCCATC（配列番号３）およびAACTCGAGCTTCCAAACTCTTCTGGG（配列番号４）である。
【００３０】
（ｄ）ＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）のＳＩＶＧａｇ特異的誘導
ＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞)は、既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）全血液試料から調製し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Hyclone）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Life Technologies）中で培養した。ＳＩＶＧａｇを発現する組み換えセンダイウイルスベクター（SeV-SIVgag）に感染したＰＢＭＣをＳＩＶＧａｇ特異的刺激用細胞として使用し、対照センダイウイルスベクター（SeV-Control）に感染したＰＢＭＣを非特異的刺激用細胞として使用した（Hasan,M.他、J.Gen.Virol., 78, 2813-2820(1997)）。ＳＩＶＧａｇ特異的刺激培養を、９６ウエルプレートのウエル当たり５×１０⁵のＰＢＭＣと１×１０⁵のＧａｇ特異的刺激用細胞とを混合することにより開始し、非特異的刺激培養を、５×１０⁵のＰＢＭＣと１×１０⁵の非特異的刺激用細胞とを混合することにより開始した。混合培養開始後３日目から、細胞を１０ユニット／ｍｌのヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Boehringer-Mannheim）を含有する培地中で培養した。上清を３日目と６日目に回収し、上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡ（Biosourse）で定量した。このアッセイにおける検出の下限値は１５ｐｇ／ｍｌである。ＮＤは未測定を示す。
【００３１】
（ｅ）ＣＴＬアッセイ
Ｇａｇ特異的刺激培養におけるＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。それぞれのサル個体から得たＰＢＭＣにヘルペスウイルスパピオを感染させて確立したＢ細胞株に、ＳＩＶＧａｇを発現する組み換えワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−ＳＩＶｇａｇ）を感染させた細胞を、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬの標的細胞として使用し、対照ワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）を感染させたＢ細胞を、非特異的標的細胞として使用した（Voss,G.,他、J.Virol.Methods 39, 185-95(1992)；及びMackett,M., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 7415-9 (1982)）。⁵¹Ｃｒ−放出アッセイは既報の通り（Voss,G.,他、Virology 208, 770-775(1995)）行った。アッセイでは１０％を超える値について陽性と判断した。
【００３２】
（ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ
血漿ＲＮＡをHigh Pure Viral RNAキット（Boehringer-Mannheim）を使用して抽出した。逆転写および１ｓｔＰＣＲはＲＮＡＰＣＲキット（Takara）を用いて行った。以下のＳＩＶｅｎｖ−特異的プライマーを使用した；１ｓｔＰＣＲで用いたプライマーは、ATGGGATGTCTTGGGAATC（配列番号５）およびCCAAATCTGCAGAGTACCAAG（配列番号６）であり、２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーは、CAGCTTGGAGGAATGCG（配列番号７）およびCTTGTTCCAAGCCTGTGC（配列番号８）である。ＲＮＡ試料の定量は、既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)；及びReed,L.J.,他、Am.J.Hyg.27, 493-497(1938)）、限界希釈法に基づいておこなった。このアッセイにおける検出の下限値は１．０×１０²コピー／ｍｌであった。
【００３３】
（２）方法と結果
（ａ）ＦＭＳＩＶ複製
ＦＭＳＩＶＤＮＡは、キメラのサル/ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染性クローンＤＮＡからそのｅｎｖをＦＭＬＶｅｎｖに置き換えることによって構築した（図２を参照）。ＦＭＳＩＶの発現および感染を培養霊長類細胞株で試験した。
【００３４】
図３には、ＦＭＳＩＶの発現の結果を示す。細胞を１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Life Technologies）中で培養し、６ウエルプレートの各ウエル中のＣＯＳ−１細胞にリポフェクトアミン（Life Technologies）を用いて２μｇの図２に示したＤＮＡをトランスフェクションし、上清を２日後に回収した。上清中のｐ２７の濃度はＥＬＩＳＡ（Coulter）により定量した。図３において、ＦＭＬＶはＦＭＬＶ感染性クローンＤＮＡ（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(1993)）を示し、ＦＭＳＩＶはＦＭＳＩＶ感染性クローンＤＮＡを示し、ＳＨＩＶはＳＨＩＶ MD14YE感染性クローンＤＮＡを示す。
【００３５】
図４には、ＦＭＬＶＥｎｖの発現の結果を示す。ＤＮＡトランスフェクションまたはＦＭＳＩＶ感染の２日後に、細胞を［³⁵Ｓ］メチオニン及び［³⁵Ｓ］システインを含有する［³⁵Ｓ］Ｐｒｏ−ｍｉｘ（Amersham）で標識した。ポリクローナル抗−ｇｐ７０（ＭＬＶＳＵ）抗体（National Cancer Institute, lot79S000713）を用いて細胞ライセート（レーン１〜４）又はウイルスペレット（レーン５〜６）の免疫沈降を既報の通り（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(1993)；及びMatano,T.,他、J.Gen.Virol.76, 3165-3169(1995)）行った。図４において、レーン１と６はＦＭＬＶＥｎｖ発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン２はＳＨＩＶ MD14YEＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン３と５はＦＭＳＩＶＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン４はｍＣＡＴ１発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、ＦＭＳＩＶを感染させたＣＯＳ−１細胞の結果を示す。
【００３６】
図３および図４の結果から分かるように、ＦＭＳＩＶＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞は、その上清中にＳＩＶＧａｇキャプシド蛋白質ｐ２７を発現し（図３を参照）、ＦＭＬＶＥｎｖは上清からのウイルスペレットに検出された（図４を参照）。これらの結果は、ＦＭＬＶＥｎｖを有するキメラＳＩＶであるＦＭＳＩＶの産生を示している。
【００３７】
ＦＭＳＩＶ上清を使用して偽トランスフェクションまたはｍＣＡＴ１をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に感染させ、ＦＭＳＩＶ感染性を試験した。
６ウエルプレートの各ウエルのＣＯＳ−１細胞に偽−またはｍＣＡＴ１−発現プラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、１日後、１ｍｌのＦＭＳＩＶまたはＳＨＩＶ（ＦＭＳＩＶまたはＳＨＩＶ MD14YEをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞からの濾過上清）と一緒に培養した。４時間のインキュベーション後に、上清を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、培養液を加えて培養した。３日後、上清を回収し、そのｐ２７濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５に示す。
【００３８】
図５に示される通り、ｐ２７産生は、ｍＣＡＴ１でトランスフェクションした後ＦＭＳＩＶを加えた細胞のみで観察された。免疫沈降分析によって、ＦＭＬＶＥｎｖの発現をＦＭＳＩＶを感染させたｍＣＡＴ１トランスフェクションＣＯＳ−１細胞で確認した（図４を参照）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶはＣＯＳ−１細胞には感染できないが、ｍＣＡＴ１発現ＣＯＳ−１細胞には感染できることを示している。
【００３９】
ＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方を投与した場合にインビボにおいてＦＭＳＩＶの複製を誘導できるかどうかを試験するために、１００μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと１００μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡとを１頭のカニクイサルの外科的に露出した左側鼠蹊リンパ節（ＬＮ）に注入した。１００μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡのみを対照として反対側(右側)の鼠蹊ＬＮに注入した。ＤＮＡ注入の１週間後に得た各ＬＮからＤＮＡを調製し、ネスティドＰＣＲに付した。ＳＩＶ２−ＬＴＲ環状ＤＮＡ（Coffin,J.M.,他、Retroviruses, CSHL press, N.Y.(1997)）は、右側のＬＮでは検出されず左側のＬＮで検出された（図６を参照）。図６において、レーン１は、ＦＭＳＩＶＤＮＡを注入した右側のＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示し、レーン２は、ＦＭＳＩＶとｍＣＡＴ１のＤＮＡを注入した左側のＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示す。２−ＬＴＲ環状ＤＮＡを示す予測されたＰＣＲ産物は、４４５ベースペア（ｂｐ）の長さであった（図６において矢印で示す）。レーン３は、ＤＮＡ分子量マーカーを示す（Life Technologies）。
上記の結果は、インビボでのＦＭＳＩＶ複製を示している。
【００４０】
（ｂ）細胞性免疫応答の誘導
以下の表１に示す通り５頭の年齢が同じ雄の赤毛サルを用いることによって各々のワクチン投与系を評価した。
【００４１】
【表１】

【００４２】
３頭の赤毛サル（２０２９７１１０２０（＃２０）、２０２９７１１０２１（＃２１）および２０２９７１１０１８（＃１８））にＦＭＳＩＶＤＮＡおよびｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方をワクチン接種した。マカクサル＃２０には、最初のＤＮＡ注入後０、１、２、６及び１２週目に、１００μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと１００μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡの筋肉内投与、および５μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと５μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。マカクサル＃２１および＃１８には、０、１、２、６及び１２週目に、２００μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと２００μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと１０μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。マカクサル＃１８にはさらに２回の追加の処置を施した。先ず、１μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと１μｇのｍＣＡＴ１ＤＮＡを外科的に露出した鼠蹊ＬＮに遺伝子銃によって０週目に注入した。次に、皮膚から調製した同原ファイブロブラスト様細胞にＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡを各々インビトロでトランスフェクションした。２日後に、両方の細胞を混合し、１日間一緒に培養し、マカクサル＃１８に筋肉内注入した。マカクサル２０２９７１１０１７（＃１７）には、０、１、２、６及び１２週目に、２００μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。このマカクサル＃１７における、ＦＭＳＩＶＤＮＡのみの投与は、従来のような複製を生じないタイプのＤＮＡワクチンに相当する対照ワクチンとして用いられた。
【００４３】
ワクチン接種により誘発されるＳＩＶＧａｇ特異的細胞性免疫を調べる目的で、ワクチン接種開始後７週目と１４週目にマカクサルから採取した血液より分離したＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞）を、ＳＩＶＧａｇ発現細胞との混合培養によって刺激した。混合培養開始後３日目および６日目に回収した上清中におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ)の濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した（この結果を図７に示す）。ＩＦＮ−γは、ＴＨ１サイトカインの一つである（Leonard, W.J., p.741-774, In paul, W.E.(ed.), Fundamental immunology, 4th ed., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)）。図７の黒グラフは、ＳＩＶＧａｇ特異的刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度であり、白グラフは、対照実験となる非特異的刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度である。
【００４４】
対照実験としてＦＭＳＩＶＤＮＡのみをワクチン接種したマカクサル＃１７においては、ＳＩＶＧａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導は認められなかった。一方、ＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方をワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、＃２１及び＃１８）では、３頭すべてにおいて、ＳＩＶＧａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導が検出された(図７参照)。マカクサル＃２１は、７週目においてマカクサル＃２０よりも効率的なＩＦＮ−γ誘導を示したが、これらはともに１４週目には同様のレベルのＩＦＮ−γ誘導を示した。ＳＩＶＧａｇ特異的ＴＨ１サイトカイン誘導はマカクサル＃１８において最も効率的であった。
【００４５】
さらにＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ(細胞傷害性Ｔリンパ球）活性を測定した。ここでは、ＳＩＶＧａｇ発現組み換えワクシニアウイルスベクター(Ｖｖ−ＳＩＶｇａｇ)を感染させたＢ細胞を、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用し（図８中において、Ｏで示す）、対照ワクシニアウイルスベクター(Ｖｖ−Ｃｏｎｔｒｏｌ)を感染させたＢ細胞を、非特異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用した（図８中において、×で示す）。
図８に示す通り、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ活性はＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方をワクチン接種した３頭のマカクサル(＃２０、＃２１、＃１８)全てにおいて検出されたが、ＦＭＳＩＶＤＮＡのみを投与したマカクサル＃１７では検出されなかった。これらの結果は、ＦＭＳＩＶＤＮＡのみによるワクチンと比較して、本発明によるＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方を用いたワクチンは、ＳＩＶ特異的細胞性免疫を、より効率よく誘導することを示している。
【００４６】
（ｃ）ＳＩＶｍａｃ２３９感染に対する抵抗性
ワクチン接種した４頭の赤毛サル(＃１７、＃２０、＃２１、＃１８)および未接種の対照マカクサル２０２９７１１０２２（＃２２）に対して、２４週目に、１００ＴＣＩＤ₅₀のＳＩＶｍａｃ２３９ウイルス（Kestler,H.,他、Science 248, 1109-1112(1990)；およびLewis,M.G.,他、AIDS Res.Hum.Retroviruses 10, 213-220(1994)）を静脈内接種した（表１を参照）。
ＳＩＶ接種後、血漿中のＳＩＶＲＮＡコピー数（図９）、血漿中のｐ２７濃度（図１０）、体重（図１１）、末梢血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（図１２）を測定した。図１０のｐ２７濃度の検出下限値は１００ｐｇ／ｍｌである。図１１において、体重の相対値(Relative body weight)は、ＳＩＶ接種時点の体重を１００とし、このＳＩＶ接種時点の体重に対する相対値で示した。また、ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の測定（図１２）においては、モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ４抗体（Becton Dickinson, CD4-PE[Leu-3a]）及びモノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ２９抗体（Coulter, 4B4-FITC）を用いてフローサイトメトリーを行って測定した。
【００４７】
ワクチン未接種の対照マカクサル＃２２において、血漿中のＳＩＶウイルス量は、ＳＩＶ接種後２週目にピーク(ＳＩＶＲＮＡコピー数は１×１０⁷／ｍｌ以上、ｐ２７濃度は１×１０⁴／ｍｌ以上)を示し、その後も高値(ＳＩＶＲＮＡコピー数は１×１０⁷／ｍｌ以上、ｐ２７濃度は１×１０³／ｍｌ以上)を維持した（図９、図１０）。ＳＩＶ接種後、著しい体重減少および末梢血中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の減少が認められ（図１１、図１２）、１７週目に重症の下痢を伴って死亡した。解剖所見として、リンパ節・脾臓の萎縮がみられ、リンパ球は脱落(涸渇)していた。
【００４８】
ＦＭＳＩＶＤＮＡのみをワクチン接種したマカクサル＃１７は、ワクチン未接種の対照マカクサル＃２２と比較して、ＳＩＶ接種後の血漿ＳＩＶウイルス量は低値を示し、ＳＩＶ接種後２週目のＳＩＶＲＮＡコピー数はマカクサル＃２２の約１／１０であった(図９)。血漿ｐ２７も低値であったが、検出可能レベルであった（図１０）。血漿ウイルス量は、ＳＩＶ感染急性期の後、一度は低下したが(ＳＩＶＲＮＡコピー数はおおよそ約１×１０⁵／ｍｌ、ｐ２７は検出限界レベル以下)、１５週目から再び上昇し始めた(図９、図１０)。体重はＳＩＶ感染急性期にわずかな減少を示し、その後増加に転じたが、１５週目に再度減少し始めた（図１１）。マカクサル＃２２と同様、末梢血中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数は、ＳＩＶ接種後減少した（図１２）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶＤＮＡのみによるワクチン接種では、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)の発病を防止するのに不十分であることを示している。
【００４９】
ＦＭＳＩＶＤＮＡ及びｍＣＡＴ１ＤＮＡをワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、＃２１及び＃１８）では、ＳＩＶ接種後、感染は成立したが、血漿ＳＩＶウイルス量は、ＦＭＳＩＶＤＮＡのみのワクチン接種をしたマカクサル＃１７と比較して有意に低値を示した。血漿中ＳＩＶＲＮＡコピー数は、マカクサル＃１７の場合の１／１０以下であり、マカクサル＃２２の１／１００以下であった（図９）。血漿中ｐ２７は検出されなかった（図１０）。体重変化については、ＳＩＶ感染急性期に若干の増加遅延を示しただけであった（図１１）。末梢血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数については、マカクサル＃２０及び＃２１では、ＳＩＶ感染急性期に一時的な減少を示したが、１２週目には接種前のレベルに回復した（図１２）。マカクサル＃１８では、末梢血液中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の有意な減少は認められなかった。よって、ＦＭＳＩＶＤＮＡおよびｍＣＡＴ１ＤＮＡのワクチン接種により、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)の発病を遅延または防止できる可能性が示された。以上の結果は、本発明によるＦＭＳＩＶＤＮＡおよびｍＣＡＴ１ＤＮＡの両方を用いたワクチンが、従来の方法より効率よく感染防御免疫を誘導できること、つまりその有効性を示している。
【００５０】
図３、図４、図５、図６に示した結果から、培養細胞レベルだけでなく、サル個体レベルにおいても、ＦＭＳＩＶの複製は、ＦＭＳＩＶＤＮＡ単独投与では誘導できないが、ＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両者を投与することにより可能となることが明らかとなった。従って、このＦＭＳＩＶ複製は、ｍＣＡＴ１発現細胞のみに限局されていると考えられる。さらに、ワクチン接種後３週目、１４週目、２４週目の血漿中ＦＭＳＩＶＲＮＡを、ＦＭＬＶｅｎｖ特異的プライマーを用いたＰＣＲにて調べたが、検出レベル以下であった。これらの結果は、このＦＭＳＩＶ複製の安全性を示している。
以上により、本発明によるＦＭＳＩＶＤＮＡとｍＣＡＴ１ＤＮＡの両者を用いたワクチンは、安全かつ効果的にエイズウイルスに対する防御免疫を付与することができることが確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、ＨＩＶまたはＳＩＶの感染の予防、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズの予防あるいは治療などに効果的でかつ安全なＤＮＡワクチンを提供することができる。
【００５２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１由来のｇａｇとｐｏｌと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み換えＤＮＡであるＦＭＨＩＶの構造を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例で用いたキメラ組み換えＤＮＡであるＦＭＳＩＶの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、ＦＭＳＩＶの発現を示すグラフである。
【図４】図４は、ＦＭＬＶＥｎｖの発現を示す写真である。
【図５】図５は、ＦＭＳＩＶの感染を示すグラフである。
【図６】図６は、サル個体でのＦＭＳＩＶ複製を示す写真である。
【図７】図７は、ＩＦＮ−γのＳＩＶＧａｇ特異的誘導を示すグラフである。
【図８】図８は、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＳＩＶを接種したサルにおける血漿ＳＩＶＲＮＡコピー数（コピー／ｍｌ）の変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＳＩＶを接種したサルにおける血漿ｐ２７濃度（ｐｇ／ｍｌ）の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＳＩＶを接種したサルにおける体重の変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＳＩＶを接種したサルにおける血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（／μｌ）の変化を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA vaccine, for example, a DNA vaccine for AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome). More particularly, the invention relates to the prevention of infection of viruses such as, for example, human immunodeficiency virus (also referred to herein as HIV) or simian immunodeficiency virus (also referred to herein as SIV), and For example, the present invention relates to a DNA vaccine that can be used for the prevention and / or treatment of viral diseases caused by viral infections such as the development of AIDS due to HIV or SIV infection.
[0002]
[Prior art]
HIV that causes AIDS in humans is a type of retrovirus, and

types

1 and 2 are known. HIV is transmitted through blood, for example, by sexual intercourse with an infected person or by blood transfusion of a patient, and the infection destroys T cells in the blood, significantly reducing immune function, causing Kaposi's sarcoma, carini pneumonia, etc. It is a disease that causes illness and death.
In recent years, the number of people living with HIV has been increasing at an accelerating rate. Especially in countries such as Thailand and the United States, AIDS is one of the top causes of death in the nation, and it is extremely difficult to establish prevention and treatment methods. is important. Much research has been done to date on the prevention and treatment of AIDS. Above all, the development of AIDS vaccine is highly necessary socially and is the most important issue. Research on this AIDS vaccine has been conducted primarily in primate models such as simian immunodeficiency virus (SIV) infection in macaques (Johnson, RP, Curr. Opin. Immunol. 8, 554-560 (1996); and Almond, NM et al., AIDS 12, 133-140 (1998)).
[0003]
In general, two types of protective immunity induced by vaccines are considered: humoral immunity with neutralizing antibodies and cellular immunity with T lymphocytes. The importance of both is pointed out in AIDS vaccines. (Dittmer, U. et al., Nature Med. 5,189-193 (1999)). Among these, humoral immunity is not easy to induce sufficiently effective immunity due to problems such as structural specificity and diversity of HIV (Shibata, R. et al., Nature Med. 5,204-210 (1999)). ). On the other hand, in recent years, the importance of cellular immunity in suppressing HIV or SIV infection has been pointed out (Geretti, AM et al., J. Gen. Virol, 79, 415-421 (1998); Matano, T. et al., J Virol, 72, 164-169 (1998); Scmits, JE et al., Science 283, 857-860 (1999); Jin, X. et al., J. Exp. Med. 189, 991-998 (1999)). However, at present, no AIDS vaccine has been developed that induces these protective immunity sufficiently effectively and safely.
[0004]
One of the AIDS vaccines attracting attention is a live attenuated virus vaccine. This is a method of using, as an immunogen, a virus whose pathogenicity has been eliminated by genetic manipulation of pathogenic HIV. Attenuated virus induces strong immunogenicity that lasts for a long time against the inoculated host. Live attenuated virus vaccines have been found to be relatively effective at the level of animal experiments using primates (Daniel, MD, et al., Science 258, 1938-1941 (1992); Shibata, R., et al. , J. Virol. 70, 4361-4369 (1996); and Shibata, R., et al., J. Virol. 71, 814-8148 (1997)), the pathogenicity of the virus is restored or contaminated by other viruses Have not yet been put into practical use because of the unsolved safety issues such as the possibility of being released (Baba, TW, et al., Science 267, 1820-1825 (1995); and Baba, TW, et al., Nature Med. 5, 194-203 (1999)).
[0005]
As AIDS vaccines that are considered to be relatively safe, subunit vaccines, viral vector vaccines, and DNA vaccines are the main ones, and they have been used in combination with Ajupande or other methods, respectively (Letvin , NL et al., Science 280, 1875-1880 (1998)). Subunit vaccines are those that synthesize and purify HIV proteins or peptides contained therein and use them as immunogens. However, effective anti-AIDS protective immunity cannot be induced. Reasons such as a short antigen lifetime and a weak cellular immunity induction function are considered. Viral vector vaccines use recombinant virus vectors such as vaccinia virus vectors to express HIV proteins as antigens, but have a strong immune response against viral antigens derived from viral vectors and insufficient immunity-inducing ability against HIV antigens. . Therefore, it has been studied mainly in combination with other methods. A DNA vaccine expresses an HIV antigen by administering a DNA containing a gene encoding an HIV protein. In recent years, it has attracted particular attention because of its relatively good ability to induce cellular immunity. However, it cannot induce sufficiently effective anti-AIDS protective immunity. Reasons such as low antigen expression level and short antigen expression time are considered (compared to attenuated live virus vaccine that causes virus replication). As described above, at present, no AIDS vaccine has been developed that satisfies both safety and efficacy (Burton, DR et al., Nature Med. 4, 495-498 (1998); Lu, S., et al., J Virol. 70, 3978-3991 (1996)).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel DNA vaccine. Another object of the present invention is to provide a DNA vaccine that is highly safe and can induce sufficient protective immunity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have obtained a recombinant viral DNA prepared by replacing a part of the env gene of SHIV (human and monkey-derived chimeric immunodeficiency virus) with the env gene of FMLV. And the DNA encoding the FMLV receptor were administered together to monkeys, and it was confirmed that SIV-infected protective cell immunity could be induced safely and effectively, and the present invention was completed.
That is, according to the present invention, there is provided a recombinant viral DNA having a DNA encoding at least a part of the viral core protein and a DNA encoding at least a part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV). The
[0008]
Preferably, the DNA encoding at least a part of the viral core protein is a DNA encoding at least a part of the retroviral Gag protein and a DNA encoding at least a part of the retroviral Pol protein.
Preferably, the retrovirus is human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV).
Preferably, the DNA encoding at least a part of the viral core protein is such that the encoded protein is immunogenic and the viral particles are reconstituted by the protein.
Preferably, the DNA encoding at least part of the Env protein of Friend Murine Leukemia Virus (FMLV) is incapable of infecting human or monkey cells in which a virus derived from a recombinant viral DNA containing the DNA does not express FMLV receptor. The DNA is such that it can infect cells expressing the FMLV receptor.
[0009]
Preferably, the recombinant viral DNA of the present invention is a recombinant viral DNA having a DNA encoding a viral core protein and a DNA encoding at least a part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV), more preferably Is a recombinant viral DNA having a DNA encoding a retroviral Gag protein, a DNA encoding a retroviral Pol protein, and a DNA encoding at least a part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV) More preferably, a DNA encoding a human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV) Gag protein and a human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV) Pol protein. A DNA that over de, a recombinant viral DNA and a DNA encoding at least a portion of the Env protein of Friend murine leukemia virus (FMLV).
According to one embodiment of the present invention, a DNA encoding at least a part of the human immunodeficiency virus (HIV) Gag protein, a DNA encoding at least a part of the human immunodeficiency virus (HIV) Pol protein, and a friend Recombinant viral DNA is provided having DNA encoding at least a portion of the Env protein of murine leukemia virus (FMLV).
According to another aspect of the present invention, DNA encoding at least part of the Gag protein of simian immunodeficiency virus (SIV), DNA encoding at least part of the Pol protein of simian immunodeficiency virus (SIV), Recombinant viral DNA is provided having DNA encoding at least a portion of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV).
[0010]
According to another aspect of the present invention, there is provided a vaccine, preferably an AIDS vaccine, comprising the recombinant viral DNA of the present invention.
The vaccine of the present invention is preferably used together with an expression vector having DNA encoding the FMLV receptor.
According to another aspect of the present invention, there is provided a vaccine comprising the recombinant viral DNA of the present invention and an expression vector having DNA encoding the FMLV receptor, preferably an AIDS vaccine.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the implementation method and embodiment of this invention are demonstrated in detail.
The recombinant viral DNA of the present invention comprises at least a DNA encoding at least a portion of a viral core protein, preferably a retroviral Gag protein such as human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV). A chimeric DNA having a DNA encoding a part thereof, a DNA encoding at least a part of the Pol protein of the virus), and a DNA encoding at least a part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV). Features.
The kind of virus referred to herein is not particularly limited, and may be a DNA virus or an RNA virus, and may be a single-stranded virus or a double-stranded virus. Specific examples of preferable viruses include retroviruses.
As used herein, a retrovirus has a normal meaning and is a virus having a life cycle in which RNA is converted into DNA among RNA viruses. Specific examples of retroviruses include, for example, murine leukemia virus, rous sarcoma virus, HTLV-I and HTLV-II, certain cancer viruses, and AIDS viruses (eg, human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus). (SIV) etc.). Retroviruses usually have three genes encoding proteins, gag, pol and env.
As used herein, “human immunodeficiency virus (HIV)” or “monkey immunodeficiency virus (SIV)” has the broadest meaning encompassing all immunodeficiency viruses that infect humans or monkeys, and any virus Includes all types or variants thereof.
[0012]
The recombinant viral DNA of the present invention contains DNA encoding at least part of the core protein of the virus, and particularly preferably encodes at least part of Gag protein derived from retrovirus such as HIV or SIV and at least part of Pol protein. Containing DNA.
That is, the viral core protein encoded by the viral DNA of the present invention may be a complete protein or a partial protein. When DNA encoding a partial protein of a core protein such as Gag protein and / or Pol protein is used, DNA in which the encoded partial protein has immunogenicity is preferable. DNA is preferred so that the particles can be reconstituted. The recombinant viral DNA of the present invention preferably has DNA encoding the complete protein of Gag protein and the complete protein of Pol protein.
The recombinant viral DNA of the present invention further has a DNA encoding at least part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV). Similarly to the core protein, the DNA encoding the Env protein may be a DNA encoding a complete protein or a DNA encoding a partial protein, but is preferably a DNA encoding a complete Env protein. The DNA encoding the Env protein may be a DNA in which only a part of the DNA encoding the Env protein derived from HIV or SIV is replaced with a DNA encoding a part of the Env protein of FMLV. In this case, the recombinant DNA-derived virus of the present invention having a DNA encoding a part of the Env protein of FMLV does not infect human or monkey cells that do not express FMLV receptor, but only cells that express FMLV receptor. Preferably it can be infected.
[0013]
The recombinant viral DNA of the present invention has DNA encoding at least a part of the core protein and DNA encoding at least a part of the Env protein, and the number of copies of each DNA is at least 1 or more. The number of copies is not limited, and two or more DNA fragments may be contained in one recombinant viral DNA.
Further, the positional relationship of each DNA encoding at least a part of the above three types of proteins is not particularly limited.
The recombinant viral DNA of the present invention is a human immunodeficiency virus (HIV) (Adachi, A., et al., J. Virol. 59,284-291 (1986); and Shibata, R., et al., J. Virol. 69,4453- 4462 (1986)) or simian immunodeficiency virus (SIV) (Kestler, H., et al., Science. 248, 1109-1112 (1990)) or a chimeric virus comprising each part of HIV and SIV (Shibata, R , Et al., Described in J. Infect. Dis. 176, 362-373 (1997), etc.) using any known viral gene such as a gene as a starting material, and at least the Env protein contained therein The region encoding a part can be prepared by replacing at least a part of the Env protein of Friend Mouse Leukemia Virus (FMLV) with a conventional DNA recombination technique.
[0014]
The recombinant viral DNA of the present invention is preferably used as a vaccine together with an expression vector having DNA encoding the FMLV receptor. The expression vector having DNA encoding the FMLV receptor is preferably an expression plasmid vector.
Vectors useful in the production of expression vectors include, but are not limited to, vectors containing constitutive promoters, inducible promoters, tissue specific promoters, and the like.
[0015]
Specific examples of constitutive promoters include, for example, viruses such as promoters derived from cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV40), or herpes simplex virus (HSV). Strong promoters.
A specific example of the tissue-specific promoter is the muscle β-actin promoter.
Examples of inducible promoters include growth hormone-regulated promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, antibiotic-inducible promoters, zinc-inducible metallothionein promoters, and the like.
[0016]
The vector used for the construction of the expression vector for the FMLV receptor preferably includes an expression control sequence including a promoter (eg, the constitutive or inducible promoter described above) DNA sequence. The vector further comprises one or more of an enhancer element, a polyadenylation signal (eg, derived from SV40 or bovine growth hormone (BGH)), an RNA processing sequence such as a splicing signal intron sequence, or an immunostimulatory DNA sequence such as a CpG motif. It may contain a copy.
The vector may also include a bacterial origin of replication sequence and / or a DNA sequence for a selectable marker that can be used for antibiotic resistance (eg, kanamycin) or non-antibiotic resistance (eg, β-galactosidase gene). .
[0017]
The present invention also provides a vaccine comprising the above-described recombinant DNA of the present invention. When an AIDS virus such as HIV or SIV is selected as the virus, the vaccine containing the recombinant DNA of the present invention can be used as an AIDS vaccine.
As used herein, the term “vaccine” means a substance that can generate an immune response. As used herein, the term “AIDS vaccine” is used in a broad sense, including HIV or SIV infection prevention vaccine, HIV or SIV infection prevention vaccine, and HIV or SIV infection treatment vaccine.
[0018]
The vaccine of the present invention is administered to mammals such as humans or monkeys, and the animals that receive the administration are immunized against the corresponding viral disease. A viral protein encoded by the recombinant DNA of the present invention is synthesized in vivo, and this is used as an antigen to activate cytotoxic T cells to stimulate cellular immunity (in some cases, B cells are also antibody-producing cells). And humoral immunity is also aroused), resulting in immunity against the virus. Arousing cellular immunity is also useful in suppressing the onset and progression of viral diseases such as AIDS. Therefore, immunization using the vaccine of the present invention is not only for the prevention but also treatment of viral diseases such as AIDS. Is also useful.
[0019]
The vaccine of the present invention can be provided, for example, in the form of a pharmaceutical composition formulated with a pharmaceutically acceptable carrier (such as a transfection reagent) or adjuvant.
[0020]
Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the present invention are those suitable for transfection of DNA vaccines into living cells. Specific examples of such a pharmaceutically acceptable carrier include known transfection reagents such as liposomes, gold particles, and cationic polymers. Those skilled in the art can appropriately formulate the DNA used in the present invention using such a transfection reagent.
[0021]
Immunological adjuvants that can be used to prepare pharmaceutical compositions are well known in the art. A person skilled in the art can appropriately select an appropriate adjuvant for forming a pharmaceutical composition.
Specific examples of adjuvants that can be used in the present invention include CpG adjuvant (Krieg A. et al., Nature 374, 546-549 (1995)).
The vaccine of the present invention can be used in any dosage form such as a capsule, suspension, elixir or solution.
[0022]
Moreover, the vaccine of this invention can be used together with another vaccine. In this case, it can be administered simultaneously or before and after administration. Specific examples include combined use with subunit vaccines, viral vector vaccines, and other DNA vaccines.
[0023]
The amount of vaccine DNA to be combined with a carrier material to prepare a pharmaceutical composition containing a single dose of vaccine DNA is generally expressed by the route of administration and method of administration, the base sequence used and the type of expression vector. A number of factors including the stability and activity of the antigenic protein or peptide (immunogenicity), gender of the subject, age, weight, overall health, type and type of viral disease to be prevented or treated, etc. Dependent. The amount of DNA to be administered also depends on the type and amount of pharmaceutically acceptable carrier (transfection reagent) and adjuvant.
[0024]
When the vaccine of the present invention is administered to humans, it is administered in an amount effective for the prevention or treatment of the target viral disease. Generally, 1 μg to 2000 μg is administered directly to muscle or skin. A gene gun can also be used to administer the vaccine of the present invention. Subcutaneous injection, intradermal introduction, transdermal injection, and other administration methods such as intraperitoneal, intravenous or inhalation administration, and oral administration are also possible, and the administration route is not particularly limited. A booster immunization can also be performed.
[0025]
The present invention relates to chimeric recombinant viral DNA generated by replacing the env gene of a virus such as human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV) with the env gene of friend mouse leukemia virus (FMLV). A cell that retains the DNA encoding the FMLV receptor while at the same time achieving a relatively long and high antigen expression level by replication by administering together with the DNA encoding the receptor to obtain efficacy It has also succeeded in ensuring safety by limiting to. The present invention provides a vaccine based on a completely new system that has never existed before, and it has become possible to provide a vaccine that is excellent in both efficacy and safety.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0026]
【Example】
(1) Materials and methods
(A) Preparation of DNA
The gene fragment encoding the Env surface protein (SU) of SHIV MD14YE (Shibata, R., et al., J. Infect. Dis. 176, 362-373 (1997)) was removed, and the FLVenv gene (Patuleia, MC et al., Cancer Res 27: 726-730 (1967); and Matano, T., et al., J. Virol. 67, 2026-2033 (1993)) (nucleotides 5769-7805 [GenBank accession no. X02794] according to friendrich numbering) Koch, W., et al., J. Virol. 45: 1-9 (1983), 26)) to obtain FMSIV infectious clone DNA (FMSIV DNA). The 5 ′ side of the nef gene was deleted. That is, FMSIV DNA has LIV derived from SIV, gag, pol, vif and vpx, tat and rev derived from HIV-1 and env derived from FMLV. FIG. 2 shows the structure of FMSIV DNA. In FIG. 2, the white part shows the region derived from SIV; the dotted line part shows the region derived from HIV-1; the black part shows the region derived from FMLV.
For reference, FIG. 1 shows a schematic diagram showing the structure of FMHIV, which is a chimeric recombinant virus DNA having gag and pol derived from HIV-1 and env derived from FMLV.
[0027]
Two types of mCAT1 DNA (mCAT1 expression plasmid DNA) were used. The first pJET (Albritton, LM, et al., Cell 57, 659-666 (1989)) was provided by JM Cunningham. The second pCMVmCAT1 was constructed by removing the β-gal gene from pCMVβ (Clontech) and replacing it with a gene encoding mCAT1.
[0028]
(B) Macaque monkey
One cynomolgus monkey was used in experiments to confirm FMSIV replication in animal individuals. For vaccination experiments, five male red-haired monkeys of the same age were used. All monkeys were tested negative for SIV, SRV (monkey D retrovirus), and monkey T lymphocytic leukemia virus type 1. Blood collection, lymph node (LN) biopsy, vaccination, and virus inoculation were performed under ketamine anesthesia.
[0029]
(C) DNA-PCR
DNA was prepared from lymph node (LN) lymphocytes, and nested DNA PCR was performed as previously reported (Shibata, R., et al., J. Infect. Dis. 176, 362-373 (1997)). Primers used in 1st PCR are TGGCAGATTGAGCCCTGG (SEQ ID NO: 1) and CCTCTTCCTCTGACAGGCC (SEQ ID NO: 2). The primers used in 2nd PCR are AAGCTAGTGTGTGTTCCCATC (SEQ ID NO: 3) and AACTCGAGCTTCCAAACTCTTCTGGG (SEQ ID NO: 4).
[0030]
(D) SIV Gag-specific induction of TH1 cytokine (IFN-γ)
PBMC (peripheral blood mononuclear cells) was prepared from whole blood samples as previously reported (Shibata, R., et al., J. Infect. Dis. 176, 362-373 (1997)), and 10% fetal bovine serum (FBS The cells were cultured in RPMI-1640 (Life Technologies) supplemented with (Hyclone). PBMC infected with a recombinant Sendai virus vector (SeV-SIVgag) expressing SIVGag was used as a cell for SIV Gag-specific stimulation, and PBMC infected with a control Sendai virus vector (SeV-Control) was used as a non-specific stimulation cell. Used (Hasan, M. et al., J. Gen. Virol., 78, 2813-2820 (1997)). SIV Gag-specific stimulation cultures were performed at 5 x 10 per well of a 96 well plate. ^Five 1 × 10 with PBMC ^Five Starting with a mixture of Gag-specific stimulating cells and a non-specific stimulation culture at 5 × 10 5 ^Five 1 × 10 with PBMC ^Five Starting with a mixture of non-specific stimulating cells. From the third day after the start of the mixed culture, the cells were cultured in a medium containing 10 units / ml human interleukin-2 (IL-2) (Boehringer-Mannheim). The supernatant was collected on

days

3 and 6, and the IFN-γ concentration in the supernatant was quantified by ELISA (Biosourse). The lower limit of detection in this assay is 15 pg / ml. ND indicates unmeasured.
[0031]
(E) CTL assay
PBMC in Gag-specific stimulation culture was used as effector cells. Cells infected with a recombinant vaccinia virus vector (Vv-SIVgag) expressing SIV Gag in a B cell line established by infecting PBMC obtained from each monkey individual with herpesvirus papio were used as SIV Gag-specific CTLs. B cells used as target cells and infected with a control vaccinia virus vector (Vv-Control) were used as non-specific target cells (Voss, G., et al., J. Virol. Methods 39, 185-95 ( 1992); and Macckett, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-9 (1982)). ⁵¹ The Cr-release assay was performed as previously reported (Voss, G., et al., Virology 208, 770-775 (1995)). The assay judged positive for values above 10%.
[0032]
(F) RT-PCR
Plasma RNA was extracted using the High Pure Viral RNA kit (Boehringer-Mannheim). Reverse transcription and 1st PCR were performed using an RNA PCR kit (Takara). The following SIVenv-specific primers were used; primers used in 1st PCR were ATGGGATGTCTTGGGAATC (SEQ ID NO: 5) and CCAAATCTGCAGAGTACCAAG (SEQ ID NO: 6), and primers used in 2nd PCR were CAGCTTGGAGGAATGCG (SEQ ID NO: 7) and CTTGTTCCAAGCCTGTGC ( SEQ ID NO: 8). RNA samples were quantified as previously reported (Shibata, R., et al., J. Infect. Dis. 176, 362-373 (1997); and Reed, LJ, et al., Am. J. Hyg. 27, 493-497. (1938)), based on the limiting dilution method. The lower limit of detection in this assay is 1.0 × 10 ² Copy / ml.
[0033]
(2) Method and results
(A) FMSIV replication
FMSIV DNA was constructed from chimeric simian / human immunodeficiency virus (SHIV) infectious clone DNA by replacing its env with FLVenv (see FIG. 2). FMSIV expression and infection were tested in cultured primate cell lines.
[0034]
FIG. 3 shows the results of FMSIV expression. Cells were cultured in DMEM (Life Technologies) supplemented with 10% FBS, and 2 μg of DNA shown in FIG. 2 using Lipofectamine (Life Technologies) on COS-1 cells in each well of a 6-well plate. And the supernatant was collected 2 days later. The concentration of p27 in the supernatant was quantified by ELISA (Coulter). In FIG. 3, FMLV indicates FMLV infectious clone DNA (Matano, T., et al., J. Virol. 67, 2026-2033 (1993)), FMSIV indicates FMSIV infectious clone DNA, and SHIV indicates SHIV MD14YE infection. Sex clone DNA is shown.
[0035]
FIG. 4 shows the results of expression of FMLVEnv. Two days after DNA transfection or FMSIV infection, the cells were [ ³⁵ S] methionine and [ ³⁵ S] containing cysteine [ ³⁵ S] Labeled with Pro-mix (Amersham). Immunoprecipitation of cell lysates (lanes 1-4) or virus pellets (lanes 5-6) using a polyclonal anti-gp70 (MLV SU) antibody (National Cancer Institute, lot79S000713) as previously reported (Matano, T., et al. J. Virol. 67, 2026-2033 (1993); and Matano, T., et al., J. Gen. Virol. 76, 3165-3169 (1995)). In FIG. 4,

lanes

1 and 6 show the results of COS-1 cells transfected with FMLV Env expression plasmid DNA, lane 2 shows the results of COS-1 cells transfected with SHIV MD14YE DNA, and

lanes

3 and 5 show the results. The results of COS-1 cells transfected with FMSIV DNA are shown, and lane 4 shows the results of COS-1 cells transfected with mCAT1 expression plasmid DNA and infected with FMSIV.
[0036]
As can be seen from the results of FIGS. 3 and 4, COS-1 cells transfected with FMSIV DNA express SIV Gag capsid protein p27 in its supernatant (see FIG. 3), and FMLV Env is expressed from the supernatant. (See FIG. 4). These results indicate the production of FMSIV, a chimeric SIV with FMLV Env.
[0037]
FMSIV supernatant was used to infect COS-1 cells transfected with mock transfection or mCAT1 and tested for FMSIV infectivity.
COS-1 cells in each well of a 6-well plate were transfected with mock- or mCAT1-expression plasmid DNA and one day later on filtration from COS-1 cells transfected with 1 ml FMSIV or SHIV (FMSIV or SHIV MD14YE) Cultivated together with Kiyo). After 4 hours of incubation, the supernatant was removed, the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and the medium was added to culture. After 3 days, the supernatant was collected and its p27 concentration was measured by ELISA. The results are shown in FIG.
[0038]
As shown in FIG. 5, p27 production was observed only in cells transfected with mCAT1 and then FMSIV added. By immunoprecipitation analysis, the expression of FMLVEnv was confirmed in mCAT1 transfected COS-1 cells infected with FMSIV (see FIG. 4). These results indicate that FMSIV cannot infect COS-1 cells, but can infect mCAT1-expressing COS-1 cells.
[0039]
To test whether FMSIV DNA and mCAT1 DNA can both induce FMSIV replication in vivo, 100 μg FMSIV DNA and 100 μg mCAT1 DNA were surgically exposed to the left of one cynomolgus monkey. Injection into the vagina lymph node (LN). Only 100 μg FMSIV DNA was injected into the contralateral (right) sputum LN as a control. DNA was prepared from each LN obtained one week after DNA injection and subjected to nested PCR. SIV 2-LTR circular DNA (Coffin, JM, et al., Retroviruses, CSHL press, NY (1997)) was not detected in the right LN but was detected in the left LN (see FIG. 6). In FIG. 6, lane 1 shows the result of DNA prepared from the right lymphocyte of LN injected with FMSIV DNA, and lane 2 shows the DNA prepared from the left lymphocyte of LN injected with FMSIV and mCAT1 DNA. The results are shown. The predicted PCR product showing 2-LTR circular DNA was 445 base pairs (bp) long (indicated by arrows in FIG. 6). Lane 3 shows DNA molecular weight markers (Life Technologies).
The above results indicate FMSIV replication in vivo.
[0040]
(B) Induction of cellular immune response
Each vaccination system was evaluated by using male redhead monkeys of the same age as shown in Table 1 below.
[0041]
[Table 1]

[0042]
Three redhead monkeys (2029711020 (# 20), 2029711021 (# 21) and 2029711018 (# 18)) were vaccinated with both FMSIV DNA and mCAT1 DNA. Macaque monkey # 20 contains 100 μg FMSIV DNA and 100 μg mCAT1 DNA intramuscularly, and 5 μg FMSIV DNA and 5 μg mCAT1 DNA genes at 0, 1, 2, 6 and 12 weeks after the first DNA injection. Administration by gun was performed. Macaque monkeys # 21 and # 18 were given intramuscular administration of 200 μg FMSIV DNA and 200 μg mCAT1 DNA and gene guns of 10 μg FMSIV DNA and 10 μg mCAT1 DNA at 0, 1, 2, 6 and 12 weeks Administration was performed. Macaque monkey # 18 received two additional treatments. First, 1 μg of FMSIV DNA and 1 μg of mCAT1 DNA were injected into the surgically exposed sputum LN at 0 weeks with a gene gun. Next, the same fibroblast-like cells prepared from the skin were each transfected with FMSIV DNA and mCAT1 DNA in vitro. Two days later, both cells were mixed, cultured together for 1 day, and injected intramuscularly into macaque # 18. Macaque monkey 2029711017 (# 17) received intramuscular administration of 200 μg FMSIV DNA and 10 μg FMSIV DNA with a gene gun at 0, 1, 2, 6 and 12 weeks. The administration of FMSIV DNA alone in this macaque monkey # 17 was used as a control vaccine corresponding to a conventional type of DNA vaccine that does not produce replication.
[0043]
For the purpose of examining SIVGag-specific cellular immunity induced by vaccination, PBMC (peripheral blood mononuclear cells) isolated from blood collected from macaques at 7 and 14 weeks after the start of vaccination were expressed as SIVGag-expressing cells. And stimulated by mixed culture. The concentration of interferon gamma (IFN-γ) in the supernatant collected on day 3 and day 6 after the start of mixed culture was measured using ELISA (the results are shown in FIG. 7). IFN-γ is one of TH1 cytokines (Leonard, WJ, p.741-774, In paul, WE (ed.), Fundamental immunology, 4th ed., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)). The black graph in FIG. 7 is the IFN-γ concentration in the SIV Gag-specific stimulation culture supernatant, and the white graph is the IFN-γ concentration in the non-specific stimulation culture supernatant as a control experiment.
[0044]
In control macaque monkey # 17 vaccinated with only FMSIV DNA, no IFN-γ induction by SIVGag-specific stimulation was observed. On the other hand, in 3 macaque monkeys (# 20, # 21 and # 18) vaccinated with both FMSIV DNA and mCAT1 DNA, IFN-γ induction by SIVGag-specific stimulation was detected in all 3 animals (FIG. 7). reference). Macaque monkey # 21 showed more efficient IFN-γ induction than macaque monkey # 20 at week 7, both of which showed similar levels of IFN-γ induction at week 14. SIVGag-specific TH1 cytokine induction was most efficient in macaque # 18.
[0045]
Furthermore, SIVGag-specific CTL (cytotoxic T lymphocyte) activity was measured. Here, B cells infected with a SIVGag-expressing recombinant vaccinia virus vector (Vv-SIVgag) were used as target cells in the SIVGag-specific CTL reaction (indicated as O in FIG. 8) and a control vaccinia virus vector (Vv -Control) infected B cells were used as target cells in non-specific CTL reaction (indicated by x in FIG. 8).
As shown in FIG. 8, SIVGag-specific CTL activity was detected in all three macaques (# 20, # 21, # 18) vaccinated with both FMSIV DNA and mCAT1 DNA, but only FMSIV DNA was administered. It was not detected in macaque monkey # 17. These results indicate that the vaccine using both FMSIV DNA and mCAT1 DNA according to the present invention induces SIV-specific cellular immunity more efficiently than the vaccine based on FMSIV DNA alone.
[0046]
(C) Resistance to SIVmac239 infection
100 TCID at 24 weeks against 4 vaccinated redhead monkeys (# 17, # 20, # 21, # 18) and unvaccinated control macaques 2029711022 (# 22) ₅₀ SIVmac239 virus (Kestler, H., et al., Science 248, 1109-1112 (1990); and Lewis, MG, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 10, 213-220 (1994)) were inoculated intravenously (Table 1).
After SIV inoculation, plasma SIV RNA copy number (FIG. 9), plasma p27 concentration (FIG. 10), body weight (FIG. 11), and number of CD4-positive CD29-positive cells in peripheral blood (FIG. 12) were measured. The lower limit of detection of the p27 concentration in FIG. 10 is 100 pg / ml. In FIG. 11, the relative value of the body weight (Relative body weight) is shown as a relative value with respect to the body weight at the time of SIV inoculation, with the body weight at the time of SIV inoculation being 100. In the measurement of the number of CD4 positive CD29 positive cells (FIG. 12), monoclonal mouse anti-human CD4 antibody (Becton Dickinson, CD4-PE [Leu-3a]) and monoclonal mouse anti-human CD29 antibody (Coulter, 4B4- FITC) was used for flow cytometry.
[0047]
In the unvaccinated control macaque # 22, plasma SIV viral load peaks at 2 weeks after SIV inoculation (SIV RNA copy number is 1 × 10 ⁷ / Ml or more, p27 concentration is 1 × 10 ^Four / Ml or higher), and subsequently high (SIV RNA copy number is 1 × 10 ⁷ / Ml or more, p27 concentration is 1 × 10 ^Three / Ml or more) was maintained (FIGS. 9 and 10). After SIV inoculation, significant weight loss and a decrease in the number of CD4-positive CD29-positive cells in peripheral blood were observed (FIGS. 11 and 12), and the patient died with severe diarrhea at 17 weeks. Anatomical findings showed atrophy of lymph nodes and spleen, and lymphocytes were missing (depleted).
[0048]
Macaque monkey # 17 vaccinated with FMSIV DNA alone showed a lower plasma SIV viral load after SIV vaccination compared to unvaccinated control macaque # 22, and SIV RNA copy number 2 weeks after SIV vaccination Was about 1/10 of macaque monkey # 22 (FIG. 9). Plasma p27 was also low but at a detectable level (FIG. 10). Plasma viral load decreased once after the acute phase of SIV infection (SIV RNA copy number was approximately 1 × 10 ^Five / Ml, p27 was below the detection limit level), and began to rise again from the 15th week (FIGS. 9 and 10). Body weight showed a slight decrease in the acute phase of SIV infection and then began to increase, but began to decrease again at 15 weeks (FIG. 11). Similar to macaque monkey # 22, the number of CD4-positive CD29-positive cells in peripheral blood decreased after SIV inoculation (FIG. 12). These results indicate that vaccination with FMSIV DNA alone is insufficient to prevent the onset of disease (immune deficiency) due to SIV infection.
[0049]
In three macaque monkeys (# 20, # 21 and # 18) vaccinated with FMSIV DNA and mCAT1 DNA, infection was established after SIV inoculation, but the plasma SIV viral load was the macaque monkey vaccinated only with FMSIV DNA. The value was significantly lower than that of # 17. Plasma SIV RNA copy number was 1/10 or less of

macaque monkey #

17 and 1/100 or less of macaque monkey # 22 (FIG. 9). Plasma p27 was not detected (FIG. 10). Regarding the change in body weight, only a slight increase delay was shown in the acute phase of SIV infection (FIG. 11). Regarding the number of CD4-positive CD29-positive cells in the peripheral blood, macaque monkeys # 20 and # 21 showed a temporary decrease in the acute phase of SIV infection, but recovered to the level before inoculation at 12 weeks (FIG. 12). ). In macaque # 18, no significant decrease in the number of CD4-positive CD29-positive cells in peripheral blood was observed. Therefore, it was shown that the vaccination with FMSIV DNA and mCAT1 DNA could delay or prevent the onset of a disease (immune deficiency) due to SIV infection. The above results indicate that a vaccine using both FMSIV DNA and mCAT1 DNA according to the present invention can induce protective immunity more efficiently than the conventional method, that is, its effectiveness.
[0050]
From the results shown in FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, and FIG. 6, FMSIV replication cannot be induced by administration of FMSIV DNA alone, not only at the cultured cell level but also at the monkey individual level, but the FMSIV DNA and mCAT1 DNA It became clear that it became possible by administering both. Therefore, this FMSIV replication is considered to be limited only to mCAT1-expressing cells. Furthermore, plasma FMSIV RNA at 3 weeks, 14 weeks and 24 weeks after vaccination was examined by PCR using FMLVenv-specific primers, but was below the detection level. These results indicate the safety of this FMSIV replication.
From the above, it was confirmed that the vaccine using both FMSIV DNA and mCAT1 DNA according to the present invention can confer protective immunity against AIDS virus safely and effectively.
[0051]
【Effect of the invention】
According to the present invention, it is possible to provide an effective and safe DNA vaccine for prevention of HIV or SIV infection, prevention or treatment of AIDS caused by HIV or SIV infection, and the like.
[0052]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of FMHIV, which is a chimeric recombinant DNA having gag and pol derived from HIV-1 and env derived from FMLV.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of FMSIV, which is a chimeric recombinant DNA used in the examples.
FIG. 3 is a graph showing the expression of FMSIV.
FIG. 4 is a photograph showing the expression of FMLV Env.
FIG. 5 is a graph showing FMSIV infection.
FIG. 6 is a photograph showing FMSIV replication in monkey individuals.
FIG. 7 is a graph showing SIVGag-specific induction of IFN-γ.
FIG. 8 is a graph showing SIVGag specific CTL activity.
FIG. 9 is a graph showing changes in plasma SIV RNA copy number (copy / ml) in monkeys inoculated with SIV.
FIG. 10 is a graph showing changes in plasma p27 concentration (pg / ml) in monkeys inoculated with SIV.
FIG. 11 is a graph showing changes in body weight in monkeys inoculated with SIV.
FIG. 12 is a graph showing changes in the number of CD4-positive CD29-positive cells (/ μl) in blood in monkeys inoculated with SIV.

Claims

DNA encoding the human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV) Gag protein, DNA encoding the human immunodeficiency virus (HIV) or simian immunodeficiency virus (SIV) Pol protein, and a friend mouse Recombinant viral DNA having DNA encoding Env protein of leukemia virus (FMLV).

A vaccine comprising the recombinant viral DNA of claim 1.

The vaccine according to claim 2, which is used together with an expression vector having DNA encoding FMLV receptor.

A vaccine comprising the recombinant viral DNA according to claim 1 and an expression vector having DNA encoding an FMLV receptor.