JP4886941B2

JP4886941B2 - Method of selecting tobacco-resistant tobacco

Info

Publication number: JP4886941B2
Application number: JP2001224791A
Authority: JP
Inventors: 晃生西; 智之田島; 総一郎野口; 秀明根岸
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2021-07-25
Also published as: JP2003033187A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタバコの育種方法に関し、特に、立枯病抵抗性のタバコを選抜するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ralstonia Solanacearumはトマト、ナス、ピーマン、タバコ等のナス科植物に土壌感染する病原菌で、本菌による病害はタバコでは立枯病と呼ばれている。本病害は、病勢の進展が早く症状も激しいことから、一度感染するとその被害は甚大である。タバコにおいても立枯病抵抗性品種の育成が進められているが、現在までに知られている抵抗性遺伝子は多遺伝子支配のものがほとんどであり、幼苗の段階での個体選抜が不可能なため、圃場検定に頼らざるをえないのが現状である。そのため、抵抗性検定において多大な労力、検定圃地面積、時間を必要とし、検定に供試できる系統数もごく少数に制限されている。これらが育種効率が向上しない一因とされており、効率的な抵抗性個体の選抜方法の開発が望まれている。
【０００３】
近年、目的の形質に連鎖したDNAマーカーを育種の選抜の際に利用した、いわゆるマーカー育種技術が開発されてきた。DNAマーカーとしては、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,Williams 1990,Nucleic Acids Res 18:6531-35) 、マイクロサテライトマーカー(Tautz 1989, Nucleic Acids Res 17:6463-71)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,Vos et al.1995,Nucleic Acids Res 23:4407-14)などが知られている。これらのDNAマーカーは、特に従来の育種方法で困難であった病害抵抗性、収量といった複数の遺伝子に支配される量的形質遺伝子座（QTL）に着目した品種の選抜に対して極めて有効である。タバコの立枯病抵抗性もQTLであることから、DNAマーカーの適用により育種効率の大幅な改善が期待できる。
【０００４】
このようなDNAマーカーの利用は、病害抵抗性品種の育成に極めて有効な手段であるが、タバコはゲノムサイズが大きく種間の変異が少ないため、DNAマーカーによる連鎖地図の整備もなされていない。また、現在のところRalstonia Solanacearum抵抗性と連鎖するQTLを同定した例はトマト（Philippe Thoquet et al.1996, Mol Plant-Microbe Interac 9:826-836, Philippe Thoquet et al.1996, Mol Plant-Microbe Interac 9:837-842,Mangin et al. 1999,Genetics Mar;151(3):1165-72., Wang et al.2000,Mol Plant Microbe Interact Jan;13(1):6-13）の他には報告されておらず、タバコについてはそのような例は全く知られていない。
【０００５】
上述のように、タバコの立枯病抵抗性を幼苗での個体選抜段階で判別する手段はいまだ確立されておらず、このことがタバコの育種の効率を低下させている一因にもなっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題を解決するために、本発明は、タバコの立枯病抵抗性を簡便に判別する手段を提供すると共に、立枯病抵抗性のタバコを選抜育種する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記方法を使用して育種された立枯病抵抗性のタバコを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、タバコの立枯病抵抗性と連鎖するDNAマーカーを同定することに成功し、本マーカーを利用した立枯病抵抗性個体の選抜方法を確立した。
【０００８】
すなわち、本発明は、立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、タバコゲノムDNA中に存在する配列番号3および4のDNA配列の多型を指標とし、その部位38塩基がアデニンであるDNAをもった個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、
（1）タバコから抽出したDNAをテンプレートとして、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅する工程と、
（2）得られた増幅産物をBfaＩで切断する工程とを含み、
前記増幅産物がBfaＩで切断された場合に、前記DNAの供給源である個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は上記方法であって、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅するためのプライマーとして、プライマー123-57.61 STSF3（CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT）および123-57.61 STSF5（GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC）を使用する方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
立枯病抵抗性DNAマーカーの同定は、AFLP法を使用して、図1に示すような手順で行った。
【００１４】
AFLP法は、Vos et al.(1995)の方法に従って行った。なお、AFLP法はDNAフィンガープリント法の一つであり、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism：制限酵素断片長多型）法とRAPD（Randam Amplified Polymorphic DNA）法を組み合わせた方法である。フィンガープリント法について概説すれば次の通りである。
【００１５】
DNAは、4種類の塩基（アデニン：A，チミン：T，グアニン：G，シトシン：C）から構成され、AとT、GとCがそれぞれ対をなし、ゲノムDNAの塩基対は数億〜数十億と膨大である。一口に「DNAの違いを調べる」と言っても，膨大な量の塩基配列を調べるのは非現実的である。そこで、制限酵素（例えばEcoRI）を用いてDNAを特定の塩基配列部位で切断し、電気泳動にかけ、DNA断片をサイズに従って分離することが考えられた。すなわち、比較するDNA間で塩基配列の差異（塩基置換，欠失等に基づく多型）があれば、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違い（RFLP）として検出される。その後、分子生物学の急速な進歩に伴い、PCRによって増殖したDNAの長さの違いによってDNA多型を迅速・簡便に検出するRAPD法が開発された。これら二つのフィンガープリント法を組合わせたAFLP法では、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違いを、PCRにより選択的に増幅させて検出する。AFLP法の優れた利点は、RFLP法やRAPD法の問題であった1反応あたりの多型情報の低さや再現性の低さが大幅に改善されたことにある。
【００１６】
今回、後述の実施例に示したように、AFLP法を用いることにより、タバコの立枯病抵抗性に連鎖するDNAマーカーが同定された。この立枯病抵抗性に連鎖したDNAマーカー付近のゲノムDNA配列は、W6およびみちのく1号において、一塩基を除き全く同一の塩基配列を示した。すなわち配列番号3に示したみちのく1号のDNA配列の部位38に位置するシトシン（C）が、W6では配列番号4に示したようにアデニン（A）に置換されている。また、W6由来の配列を有する品種は立枯病に抵抗性を示すが、みちのく1号由来配列を有する品種では罹病生であった。従って、このC/Aの一塩基の違いを検出することによって、立枯病抵抗性を判別することが可能となる。
【００１７】
本発明に使用するDNAマーカー配列において、C/Aの一塩基置換が生じている部位は、制限酵素BfaIの認識配列と一致している。従って、この部位を含む領域（配列番号3または4の部位38C/Aを含む配列）を増幅可能なPCRプライマー（たとえば表6に記載のプライマー）を使用してPCR増幅を行い、さらにそのPCR産物をBfaIによって消化し、切断の有無を確認することにより、マーカーDNAのタイプを判別することができる。前記PCR産物が切断された場合、立枯病抵抗性であると判断され、切断されない場合は抵抗性を持たないと判断される。前記PCR増幅は、たとえば抽出したDNAをテンプレートとしてPCRを行えばよい。DNAの抽出は、通常のフェノールクロロホルム法などに従って行えばよい。前記PCR増幅は、たとえばPCR9600を用い、表6に記載の配列のプライマー、123-57.61 STSF3（CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT）および123-57.61 STSF5（GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC）を使用してPCR増幅することができ、95℃（20秒）−57℃（30秒）−72℃（30秒）を35サイクル行って増幅することができる。得られた増幅産物をBfaＩで2時間消化処理した後、2.0％アガロース・ゲルで電気泳動を行う。アガロース・ゲルを、エチジウム・ブロマイドで染色した後、紫外線ランプで発光させて、BfaＩの消化の有無を断片の泳動度の違いで判別することができる。
【００１８】
本発明で使用するプライマーは、DNA自動合成機等を利用して、本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。また上記プライマーの塩基長は、当該DNA特異的なプライマーとして機能する塩基長であれば特に制限されない。通常１５〜３０程度、好ましくは２０〜３０程度、より好ましくは２０〜２５程度の塩基長であることができる。
【００１９】
本発明における多型の検出は、上記方法だけでなく、その他の一塩基多型を検出することが可能な方法で行うことができる。
【００２０】
上記のタバコ立枯病抵抗性を示すDNAマーカー配列の多型は、たとえばシーケンシングによって検出してもよい。このシーケンシングでは、配列番号3または4の部位38に位置するCまたはAを含む配列の周辺をシーケンスすればよく、通常の方法を使用して行うことができる。たとえば表6に記載のプライマーを使用したサンガー法などによってシーケンスすることができる。
【００２１】
本発明の多型を検出する方法の例としては、当該変異部位を含む塩基配列を解析する各種の方法、例えばサザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol.,98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、またはＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166,1986等参照）］等を例示することができる。
【００２２】
上記一塩基多型を含む配列を使用したDNAチップ等を使用して検出することもできるであろう。
【００２３】
本発明において、配列番号3または4の部位38を含むタバコ由来配列のDNA断片は、PCR法等のDNA増幅法またはDNA伸長法を含むDNA合成法を用いて、DNAを調製するためのテンプレートとしても有用であり、更に本発明に係る上記多型を検出するためのプローブとしても有用である。前記配列の例として、たとえば配列番号1、2、3または4の配列があげられるが、その塩基長に制限はない。
【００２４】
上記方法に使用されるプローブは、塩基置換を検出するためのプローブとしての機能的有効長を有するものであれば、特にその塩基長について制限はなく、通常約１０〜１００の、好ましくは１０〜５０、より好ましくは１０〜３０程度の塩基長からなることができる。
【００２５】
本発明の他の態様においては、上記方法を使用して選抜された、立枯病抵抗性タバコが提供される。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の方法を使用することにより、タバコ立枯病抵抗性を簡便に判別することが可能となる。その結果、幼苗における個体選抜段階において、容易に立枯病抵抗性個体を選別する手段が提供され、タバコ育種を効率的に行うことが可能となる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２８】
[実施例1]
タバコ立枯病抵抗性に連鎖するDNAマーカーの同定
1)倍化半数体系統（F1DH）の作成
立枯病に対して抵抗性を示すバーレー品種「W6」と、罹病性を示す「みちのく1号」を交配して、立枯病に対する抵抗性程度が罹病性から抵抗性に連続的に分離した固定系統（WMH系統）を作成した。「W6」と「みちのく1号」を交配し作成したF1から葯を採取し、葯培養を行った。再生した植物体にコルヒチン処理を施し染色体を倍化させ、遺伝的に固定した倍化半数体系統 (F1 doubled haploid;F1DH)を125系統作成した。
【００２９】
2)圃場検定
1998年、1999年の2ヵ年にわたり、立枯病が均一に発生する汚染圃場（静岡県磐田郡豊田町）において、125系統のF1DH（WMH系統）を1系統あたり15本、4反復栽培した。立枯病抵抗性の判定は、病徴の進展にあわせて複数回行った。罹病度については、0:健全株、1:下位葉が萎凋、２:中上位葉が萎凋、３:枯死の4段階とし、各系統の平均を求め、最低0（全て健全株）から100（全て枯死株）までの指数に換算し算出した（図2）。
【００３０】
3)マーカー解析
「W6」あるいは「みちのく１号」に特異的に存在するDNAマーカーを特定し、連鎖地図を作成するために、W6及びみちのく１号それぞれから抽出したDNAをAFLP法により解析した。播種後30日〜60日の各個体からフェノールクロロホルム法によりDNAを抽出した。
【００３１】
AFLP法は、Vos et al.(1995)の方法に従って行った。以下概要を大まかに示す。ゲノムDNAの切断に用いた制限酵素の組み合わせとして、PstＩ及びMseＩを選択した。抽出したDNAは、PstＩとMseＩで切断後、それぞれの酵素に対応した合成アダプターを連結した。アダプターの配列を表１に示す。
【００３２】
【表１】

【００３３】
アダプターを連結したゲノムDNAに対して、表２に示すAFLP選択プライマーを使用して、AFLP反応を行った。このプライマー中のNは、プライマーにおけるNの部分が可変であることを示している。PstＩプライマーとしては、5’側の一番最初のNがA,C,Gである48種類を使用し、MseＩプライマーとしては、5’側の一番最初のNがCである64種類のプライマーを使用した。これによりPstＩプライマーとMseＩプライマーの組み合わせの合計は48×64=3072となる。合計3072のプライマー組み合わせを使用して、AFLP反応を行った。PstＩプライマーは、バンドの有無を視覚的に判別できるように、蛍光色素FAM、HEX、TAMRAで標識して使用した（J Bios社に委託）。
【００３４】
【表２】

【００３５】
AFLP反応では、Gene Amp9600（Applied Biosystems社）を用い、94℃（1秒）−65℃（30秒）−72℃（２分）から１サイクルごとにアニーリング温度が１度づつ下がる反応を９サイクル、94℃（1秒）−56℃（30秒）−72℃（２分）を23サイクル行った。AFLP反応産物は核酸塩基配列解析機Prism377（Applied Biosystems社）で泳動を行い、バンドの有無を確認した。さらに、125系統のF1DH（WMH系統）それぞれについてもバンドの有無を検定し、「W6」、「みちのく１号」それぞれに特異的に存在し、かつ分離世代であるF1DH（WMH系統）でバンドの有無の分離が認めらるマーカーの選別を行った。その結果、84個のマーカーが得られた（表3）。
【００３６】
【表３】

【００３７】
4)データー解析
125系統のF1DH（WMH系統）を解析対象として、表３に示す84個のマーカーの有無を判定した。この結果をもとに、遺伝解析ソフトMap Mker Ver3.0を使用して遺伝連鎖解析を行い、遺伝連鎖地図を作成した。解析の設定はMinimam LOD;3.0、組換え価;0.4で行った。また、1999年度の圃場検定で得られた125系統の罹病指数と、前述の遺伝連鎖地図をもとに、QTL（量的形質遺伝子座）解析ソフトQ Geneを使用してQTL解析を行った。その結果、１つの遺伝連鎖群（G-5）において立枯病抵抗性に対して強い寄与度を示すQTL（LOD＞3.0）が認められ、この連鎖群にはマーカーが12個（M16,M35,M30,M84,M82,M83,M93,M94,M74,M108,M91,M107）座乗していた（図3）。みちのく1号に特異的に認められるM82マーカー（0.13kb）及びW6に特異的に認められるM84マーカー（0.13kb）が最も強い寄与度（LOD値；11.3）を示していた（図4）。
【００３８】
5) M82及びM84マーカーのクローニング
得られたM82及びM84の各フラグメントをシーケンスゲルから回収した。泳動したシーケンスゲルを蛍光イメージアナライザー(FM-Bio;日立社)で読み取った後、目的とするマーカーの位置を確認しながらマーカー断片をゲル片ごと回収した。回収したフラグメントは、新たに作成した非蛍光プライマーで再度PCR増幅を行い、精製後、ベクター（pBluescriptSK(+)）、東洋紡）に繋ぎ、大腸菌（JM109、東洋紡）に導入してクローニングを行った。
【００３９】
6) M82及びM84の塩基配列決定
M82及びM84の全領域について、Prism377を用いて塩基配列を決定した。M82及びM84は全く同じ長さでほぼ同一の塩基配列を示していたが、3’末端近傍のMseＩプライマーの選択塩基相当部位(108塩基目)で1塩基が異なっていた。M82の全塩基配列を配列番号1に、M84の全塩基配列を配列番号2にそれぞれ示す。
【００４０】
7) 「W6」及び「みちのく1号」における、M82及びM84が座乗するゲノムの塩基配列
M82とM84は１塩基を除き全く同一の塩基配列を示すマーカーであるが、M82は「みちのく1号」特異的に増幅し、M84は「W6」特異的に増幅を示す。この原因としては、6)で示した3’末端近傍の1塩基の違いに由来するものと予想される。そこで、Invereted PCR法を用いて、それぞれのマーカーが座乗するゲノムの塩基配列を確認した。配列番号1及び2により示された塩基配列に基づき、M82、M84に共通な配列部分から外側向きに増幅するように、表4に示すPCRプライマーを合成した（サワデー・テクノロジー社に委託）。
【００４１】
【表４】

【００４２】
Inverted PCR法は、W6及びみちのく1号のDNAを制限酵素HaeIIIで切断後、ライゲーションキット（Takara Ligation Kit Ver1）でセルフライゲーションしたDNA断片に対して、表4のプライマーを表5のように組み合わせ、2段階のPCR増幅することで行った。得られた増幅産物は同様にクローニング、塩基配列決定を行った。
【００４３】
【表５】

【００４４】
みちのく1号より得られたゲノムの塩基配列を配列番号3に示し、W6より得られたゲノムの塩基配列を配列番号4に示す。その結果、配列番号1及び2で認められた1塩基の違いが、配列番号3及び4でも確認され（38塩基目）、W6、みちのく1号のゲノム塩基配列で1塩基置換が生じていることが明らかになった。
【００４５】
8) AFLPマーカーのCAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)化
１塩基置換が生じている領域は、制限酵素BfaＩの認識配列内に存在していることから、この領域を増幅するPCRプライマーでPCR増幅を行い、さらにBfaＩによる増幅断片の消化の有無を確認することで、マーカータイプの判別が可能である。配列番号3及び4により示される塩基配列に基づき、表6に示すPCRプライマーを合成した。W6、みちのく1号、F1DH（WMH系統）のそれぞれから抽出したDNAを鋳型としてPCRを行った。DNAの抽出は3)と同様にフェノールクロロホルム法に従った。PCRにはPCR9600を用い、95℃（20秒）−57℃（30秒）−72℃（30秒）を35サイクル行った。得られた増幅産物をBfaＩで2時間消化処理した後、2.0％アガロース・ゲルで電気泳動を行った。アガロース・ゲルを、エチジウム・ブロマイドで染色した後、紫外線ランプで発光させて、BfaＩの消化の有無を断片の泳動度の違いで判別した。その結果、F1DH（WMH系統）の各系統から抽出したDNAより増幅されたフラグメントは、BfaＩによって消化される「W6タイプ（106bp）」と、消化されない「みちのくタイプ（133bp）」に選別され、マーカータイプの判別が可能であった（図5、図6）。「W6タイプ（106bp）」はM84マーカーと、「みちのくタイプ（133bp）」はM84マーカーと同一の分離パターンを示していた（表7）。以上から、AFLPマーカーをCAPS化し、さらに利便性の高いマーカーに改良することができた。このマーカーをMWC1マーカーと名付けた。
【００４６】
【表６】

【００４７】
【表７】

【００４８】
[実施例2]
MWC1マーカーが、W6、みちのく１号以外の組み合わせより育成された系統においても適用可能であるかを調べるために、他の立枯病抵抗性分離集団（M2BH系統；101系統）を用いて検証を行った。M2BH系統は、W6由来の立枯抵抗性を有するWWH２と、みちのく１号のF1より作成されたF1DHである。圃場試験は、過去に均一な立枯病の発生が認められた汚染圃場（栃木県小山市）において、101系統のM2BH系統を1系統あたり11本、1反復で栽培した。立枯病抵抗性の判定は、病徴の進展にあわせて複数回行った。罹病度については、[実施例1]と同様に、0:健全株、1:下位葉が萎凋、２:中上位葉が萎凋、３:枯死の4段階とし、各系統の平均を求め、最低0（全て健全株）から100（全て枯死株）までの指数に換算し算出した。また、全系統について、8)の方法に従いMWC1マーカーのマーカータイプの判別を行った。その結果、W6タイプのマーカーが認められた系統の平均罹病度が44.7であるのに対して、みちのくタイプのマーカーが認められた系統の平均罹病度は66.3と異なっていた（図7、図8）。また、便宜的に系統を罹病度順に並べ、罹病度の低い20系統を抵抗性系統群、高い20系統を罹病性系統群とすると、抵抗性系統群におけるW6マーカータイプの出現率は0.7（14/20）であるのに対して、罹病性系統群におけるそれは0.1（2/20）と明らかな違いが認められた。よって、MWC1マーカーのマーカータイプの判別によりM2BH系統の立枯病抵抗性の判別は可能であり、本マーカーの利用が他の抵抗性分離集団においても有効であることが確認された。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】立枯病抵抗性DNAマーカー同定の概略図。
【図２】立枯病汚染圃場におけるF1DHの罹病度分布を示した図。
【図３】タバコG-5群の遺伝子連鎖地図。
【図４】タバコ立枯病抵抗性に連鎖するQTLを示した図。
【図５】表6に示すPCRプライマーによるPCR増幅産物の電気泳動写真。
【図６】表6に示すPCRプライマーによるPCR増幅産物をBfaIで消化した電気泳動写真。
【図７】 M2BH系統の罹病度分布を示す図。
【図８】 101系統のM2BH系統を罹病度順に並べ、MWC1マーカーについてそのマーカータイプを示した図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for breeding tobacco, and more particularly, to a method for selecting tobacco-resistant tobacco.
[0002]
[Prior art]
Ralstonia Solanacearum is a pathogen that infects solanaceous plants such as tomatoes, eggplants, peppers, and tobacco, and the disease caused by this bacteria is called blight in tobacco. Since the disease is progressing rapidly and the symptoms are severe, the damage is severe once infected. In tobacco, varieties resistant to bacterial wilt are being developed, but most of the resistance genes known to date are dominated by multiple genes, making it impossible to select individuals at the seedling stage. Therefore, the current situation is to rely on field verification. Therefore, the resistance test requires a great deal of labor, test field area, and time, and the number of lines that can be used for the test is limited to a very small number. These are considered to contribute to the improvement of breeding efficiency, and the development of an efficient method for selecting resistant individuals is desired.
[0003]
In recent years, a so-called marker breeding technique has been developed that uses a DNA marker linked to a target trait for selection of breeding. As DNA markers, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Williams 1990, Nucleic Acids Res 18: 6531-35), microsatellite markers (Tautz 1989, Nucleic Acids Res 17: 6463-71), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al. 1995, Nucleic Acids Res 23: 4407-14) is known. These DNA markers are extremely effective for selection of varieties focusing on quantitative trait loci (QTL) controlled by multiple genes such as disease resistance and yield, which were difficult with conventional breeding methods. . Since tobacco leaf blight resistance is also QTL, significant improvement in breeding efficiency can be expected by applying DNA markers.
[0004]
The use of such DNA markers is an extremely effective means for cultivating disease-resistant varieties, but since tobacco has a large genome size and little variation between species, no linkage map has been prepared with DNA markers. In addition, examples of QTLs that are currently linked to Ralstonia Solanacearum resistance are tomato (Philippe Thoquet et al. 1996, Mol Plant-Microbe Interac 9: 826-836, Philippe Thoquet et al. 1996, Mol Plant-Microbe Interac. 9: 837-842, Mangin et al. 1999, Genetics Mar; 151 (3): 1165-72., Wang et al. 2000, Mol Plant Microbe Interact Jan; 13 (1): 6-13) It has not been reported and no such example is known for tobacco.
[0005]
As described above, a means for discriminating the resistance of tobacco to blight at the individual selection stage in young seedlings has not yet been established, and this contributes to a decrease in tobacco breeding efficiency. Yes.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In order to solve such problems, an object of the present invention is to provide a means for easily discriminating the resistance of leaf blight to tobacco and to provide a method for selective breeding of tobacco with resistance to blight. And Furthermore, this invention aims at providing the tobacco disease resistant tobacco bred using the said method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors succeeded in identifying a DNA marker that is linked to the resistance to tobacco leaf blight. A selection method was established.
[0008]
That is, the present invention is a method of selecting tobacco-resistant tobacco, which uses polymorphisms of the DNA sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 present in tobacco genomic DNA as an index, and 38 bases thereof are adenine. Provided is a method comprising selecting an individual having a certain DNA as a tobacco resistant to blight.
[0009]
Furthermore, the present invention is a method for selecting tobacco-resistant tobacco.
(1) a step of amplifying a sequence containing the portion 38 of SEQ ID NO: 3 or 4 using DNA extracted from tobacco as a template;
(2) cleaving the obtained amplification product with BfaI,
When the amplification product is cleaved with BfaI, a method is provided, wherein an individual that is a source of the DNA is selected as tobacco resistant to blight.
[0010]
The present invention is also the above method, wherein the primer 123-57.61 STSF3 (CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT) and 123-57.61 STSF5 (GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC) are used as primers for amplifying a sequence containing the region 38 of SEQ ID NO: 3 or 4. I will provide a.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The identification of the bacterial disease resistant DNA marker was performed by the procedure shown in FIG. 1 using the AFLP method.
[0014]
The AFLP method was performed according to the method of Vos et al. (1995). The AFLP method is one of DNA fingerprinting methods, and is a method combining the RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) method and the RAPD (Randam Amplified Polymorphic DNA) method. An outline of the fingerprint method is as follows.
[0015]
DNA is composed of four types of bases (adenine: A, thymine: T, guanine: G, cytosine: C), and A and T, G and C are paired, and the base pairs of genomic DNA are several hundred million Hundreds of billions. Even if you say “examine DNA differences”, it is unrealistic to examine a huge amount of nucleotide sequences. Therefore, it was considered that DNA was cleaved at a specific nucleotide sequence site using a restriction enzyme (for example, EcoRI), subjected to electrophoresis, and DNA fragments were separated according to size. That is, if there is a base sequence difference (polymorphism based on base substitution, deletion, etc.) between DNAs to be compared, it is detected as a difference in length (RFLP) of DNA fragments cleaved with a restriction enzyme. Later, with rapid advances in molecular biology, the RAPD method was developed to detect DNA polymorphisms quickly and easily based on differences in the length of DNA grown by PCR. In the AFLP method, which combines these two fingerprint methods, the difference in length of DNA fragments cleaved with restriction enzymes is selectively amplified and detected by PCR. The excellent advantage of the AFLP method is that the low polymorphism information per reaction and low reproducibility, which were problems of the RFLP method and the RAPD method, have been greatly improved.
[0016]
This time, as shown in Examples described later, by using the AFLP method, a DNA marker linked to the resistance to blight of tobacco was identified. The genomic DNA sequence in the vicinity of the DNA marker linked to the resistance to blight was identical in W6 and Michinoku 1 except for one base. That is, cytosine (C) located at site 38 of the DNA sequence of Michinoku No. 1 shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with adenine (A) as shown in SEQ ID NO: 4 in W6. In addition, varieties having sequences derived from W6 showed resistance to blight, but varieties having sequences derived from Michinoku 1 were diseased. Therefore, it is possible to determine the resistance to withering disease by detecting the difference of one base of this C / A.
[0017]
In the DNA marker sequence used in the present invention, the site where C / A single-base substitution has occurred coincides with the recognition sequence of the restriction enzyme BfaI. Therefore, PCR amplification is performed using a PCR primer (for example, the primer described in Table 6) that can amplify the region containing this site (sequence containing the region 38C / A of SEQ ID NO: 3 or 4), and the PCR product. Is digested with BfaI and the presence or absence of cleavage is confirmed to determine the type of marker DNA. When the PCR product is cleaved, it is judged to be resistant to blight, and when it is not cleaved, it is judged not to have resistance. The PCR amplification may be performed using, for example, extracted DNA as a template. DNA extraction may be performed according to a normal phenol chloroform method or the like. The PCR amplification can be performed by PCR amplification using, for example, PCR9600, primers of the sequences shown in Table 6, 123-57.61 STSF3 (CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT) and 123-57.61 STSF5 (GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC), and 95 ° C. (20 seconds) ) -57 ° C (30 seconds) -72 ° C (30 seconds) can be amplified by 35 cycles. The obtained amplification product is digested with BfaI for 2 hours and then electrophoresed on a 2.0% agarose gel. After agarose gel is stained with ethidium bromide, it is made to emit light with an ultraviolet lamp, and the presence or absence of BfaI digestion can be discriminated by the difference in the migration degree of the fragments.
[0018]
The primer used in the present invention can be synthesized according to the base sequence disclosed in the present invention using an automatic DNA synthesizer or the like. The base length of the primer is not particularly limited as long as it functions as a DNA-specific primer. Usually, the base length can be about 15-30, preferably about 20-30, more preferably about 20-25.
[0019]
The detection of the polymorphism in the present invention can be performed not only by the above method but also by a method capable of detecting other single nucleotide polymorphism.
[0020]
The polymorphism of the above-mentioned DNA marker sequence showing resistance to tobacco blight may be detected by, for example, sequencing. This sequencing may be performed using a normal method, as long as the sequence around the sequence containing C or A located at the site 38 of SEQ ID NO: 3 or 4 is sequenced. For example, the sequencing can be performed by the Sanger method using the primers shown in Table 6.
[0021]
Examples of the method for detecting a polymorphism of the present invention include various methods for analyzing a nucleotide sequence containing the mutation site, such as Southern hybridization method and dot hybridization method (J. Mol. Biol., 98: 503- 517, 1975, etc.), dideoxy base sequencing, or various detection methods combined with DNA amplification techniques [eg PCR-Restriction fragment length polymorphism (RFLP), PCR-single chain] Higher order structure polymorphism analysis (see Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 2766-2770, 1989, etc.), PCR-specific sequence oligonucleotide (SSO), PCR-SSO An allele-specific oligonucleotide method using a dot hybridization method (Nature, 324: 163-166, 1986, etc.)] and the like can be exemplified.
[0022]
It would also be possible to detect using a DNA chip using a sequence containing the above single nucleotide polymorphism.
[0023]
In the present invention, the DNA fragment of the tobacco-derived sequence containing the portion 38 of SEQ ID NO: 3 or 4 is used as a template for preparing DNA using a DNA amplification method such as a PCR method or a DNA synthesis method including a DNA extension method. Is also useful as a probe for detecting the polymorphism according to the present invention. Examples of the sequence include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, but the base length is not limited.
[0024]
The probe used in the above method is not particularly limited as long as it has a functional effective length as a probe for detecting base substitution, and is usually about 10 to 100, preferably 10 to 10 The base length can be 50, more preferably about 10-30.
[0025]
In another aspect of the present invention, a blight resistant tobacco selected using the above method is provided.
[0026]
【Effect of the invention】
By using the method of the present invention, it becomes possible to easily determine resistance to tobacco wilt. As a result, in the individual selection stage of the young seedlings, a means for easily selecting an individual resistant to withering disease is provided, and tobacco breeding can be performed efficiently.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0028]
[Example 1]
Identification of DNA markers linked to resistance to tobacco blight
1) Preparation of a doubling haploid line (F1DH) Burley variety "W6" that shows resistance against blight, and Michinoku No. 1 that shows susceptibility are crossed, and the degree of resistance to blight However, a fixed line (WMH line) was created that was continuously separated from susceptibility to resistance. Spiders were collected from F1 prepared by crossing “W6” and “Michinoku No. 1” and cultured. The regenerated plant was treated with colchicine to double the chromosomes, and 125 genetically fixed haploid lines (F1 doubled haploid; F1DH) were created.
[0029]
2) Field verification
Over two years in 1998 and 1999, 125 F1DH (WMH lines) were cultivated four times repeatedly, with 125 lines of F1DH (WMH line) in a contaminated field (Toyota-cho, Kamata-gun, Shizuoka). The determination of resistance to blight was performed several times according to the progress of disease symptoms. The disease severity was 0: healthy strain, 1: lower leaf was wilt, 2: middle upper leaf was wilt, 3: dead, and the average of each strain was calculated. It was calculated by converting the index up to all dead strains (Fig. 2).
[0030]
3) Marker analysis In order to identify DNA markers specifically present in "W6" or "Michinoku No. 1" and to create a linkage map, DNA extracted from W6 and Michinoku No. 1 was analyzed by AFLP method. DNA was extracted from each individual 30 to 60 days after sowing by the phenol chloroform method.
[0031]
The AFLP method was performed according to the method of Vos et al. (1995). An outline is shown below. PstI and MseI were selected as a combination of restriction enzymes used for genomic DNA cleavage. The extracted DNA was cleaved with PstI and MseI, and then a synthetic adapter corresponding to each enzyme was ligated. The adapter sequence is shown in Table 1.
[0032]
[Table 1]

[0033]
AFLP reaction was performed on the genomic DNA to which the adapter was ligated using the AFLP selection primers shown in Table 2. N in this primer indicates that the N part in the primer is variable. As the PstI primer, 48 types whose first N on the 5 ′ side is A, C, G are used, and as the MseI primer, 64 types of primers whose first N on the 5 ′ side is C are used. It was used. Thereby, the total of the combination of the PstI primer and the MseI primer is 48 × 64 = 3072. AFLP reactions were performed using a total of 3072 primer combinations. The PstI primer was used after being labeled with fluorescent dyes FAM, HEX, and TAMRA so that the presence or absence of a band could be visually discriminated (consigned to J Bios).
[0034]
[Table 2]

[0035]
In AFLP reaction, Gene Amp9600 (Applied Biosystems) is used, and 9 cycles of annealing temperature decrease by 1 degree every cycle from 94 ° C (1 second) -65 ° C (30 seconds) -72 ° C (2 minutes) , 94 ° C. (1 second) -56 ° C. (30 seconds) -72 ° C. (2 minutes) were performed 23 cycles. AFLP reaction products were electrophoresed with a nucleobase sequence analyzer Prism377 (Applied Biosystems) to confirm the presence or absence of bands. In addition, 125 F1DH (WMH strains) were tested for the presence or absence of bands, and each of the F1DH (WMH strains) that were specifically present in each of the “W6” and “Michinoku No. 1” Markers that could be separated from each other were selected. As a result, 84 markers were obtained (Table 3).
[0036]
[Table 3]

[0037]
4) Data analysis
The presence or absence of 84 markers shown in Table 3 was determined using 125 F1DH (WMH strains) as analysis targets. Based on these results, genetic linkage analysis was performed using genetic analysis software Map Mker Ver3.0 to create a genetic linkage map. The analysis was set at Minimum LOD; 3.0, recombination value; 0.4. QTL analysis was performed using QTL (quantitative trait locus) analysis software Q Gene based on the morbidity index of 125 lines obtained by the field test in 1999 and the genetic linkage map described above. As a result, QTL (LOD> 3.0) showing a strong contribution to resistance to blight disease was observed in one genetic linkage group (G-5), and this linkage group had 12 markers (M16, M35). , M30, M84, M82, M83, M93, M94, M74, M108, M91, M107) (Fig. 3). The M82 marker (0.13 kb) specifically observed in Michinoku No. 1 and the M84 marker (0.13 kb) specifically identified in W6 showed the strongest contribution (LOD value; 11.3) (FIG. 4).
[0038]
5) Cloning of M82 and M84 markers The resulting M82 and M84 fragments were recovered from the sequencing gel. After the electrophoresed sequence gel was read with a fluorescence image analyzer (FM-Bio; Hitachi), marker fragments were collected together with the gel pieces while confirming the position of the target marker. The recovered fragment was subjected to PCR amplification again with a newly prepared non-fluorescent primer, purified, connected to a vector (pBluescriptSK (+)), Toyobo), introduced into E. coli (JM109, Toyobo), and cloned.
[0039]
6) Determination of the base sequence of M82 and M84
Base sequences were determined for all regions of M82 and M84 using Prism377. M82 and M84 had the same length and almost the same base sequence, but one base was different at the site corresponding to the selected base (108th base) of the MseI primer near the 3 ′ end. The entire base sequence of M82 is shown in SEQ ID NO: 1, and the whole base sequence of M84 is shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
[0040]
7) The base sequence of the genome on which M82 and M84 sit on “W6” and “Michinoku No. 1”
M82 and M84 are markers showing exactly the same nucleotide sequence except for one base, but M82 is amplified specifically for “Michinoku No. 1”, and M84 is amplified specifically for “W6”. The cause is expected to be derived from the difference of one base near the 3 ′ end shown in 6). Therefore, using the inverted PCR method, the base sequence of the genome on which each marker sits was confirmed. Based on the base sequences shown by SEQ ID NOs: 1 and 2, PCR primers shown in Table 4 were synthesized so as to amplify outward from a sequence part common to M82 and M84 (consigned to Sawasday Technology).
[0041]
[Table 4]

[0042]
The Inverted PCR method is a combination of the primers shown in Table 4 as shown in Table 5 for the DNA fragments obtained by cleaving the DNA of W6 and Michinoku No. 1 with the restriction enzyme HaeIII and then self-ligating with the ligation kit (Takara Ligation Kit Ver1). This was performed by two-stage PCR amplification. The obtained amplification product was similarly cloned and sequenced.
[0043]
[Table 5]

[0044]
The base sequence of the genome obtained from Michinoku No. 1 is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence of the genome obtained from W6 is shown in SEQ ID NO: 4. As a result, the single base difference observed in SEQ ID NOs: 1 and 2 was confirmed in SEQ ID NOs: 3 and 4 (38th base), and a single base substitution occurred in the genomic base sequence of W6 and Michinoku No. 1. Became clear.
[0045]
8) Since the AFPS marker CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) single-substitution region is present in the recognition sequence of the restriction enzyme BfaI, PCR amplification is performed with PCR primers that amplify this region. Furthermore, the marker type can be identified by confirming the presence or absence of digestion of the amplified fragment with BfaI. Based on the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 4, PCR primers shown in Table 6 were synthesized. PCR was performed using DNA extracted from W6, Michinoku No. 1 and F1DH (WMH strain) as templates. The extraction of DNA followed the phenol chloroform method as in 3). PCR 9600 was used for PCR, and 35 cycles of 95 ° C. (20 seconds) -57 ° C. (30 seconds) -72 ° C. (30 seconds) were performed. The obtained amplification product was digested with BfaI for 2 hours and then electrophoresed on a 2.0% agarose gel. After agarose gel was stained with ethidium bromide, it was made to emit light with an ultraviolet lamp, and the presence or absence of BfaI digestion was discriminated by the difference in the migration degree of the fragments. As a result, fragments amplified from DNA extracted from each strain of F1DH (WMH strain) are selected into “W6 type (106 bp)” digested by BfaI and “Michinoku type (133 bp)” which is not digested, and marker The type could be identified (Figs. 5 and 6). “W6 type (106 bp)” showed the same separation pattern as the M84 marker, and “Michinoku type (133 bp)” showed the same separation pattern as the M84 marker (Table 7). From the above, the AFLP marker has been converted to CAPS, which has been improved to a more convenient marker. This marker was named MWC1 marker.
[0046]
[Table 6]

[0047]
[Table 7]

[0048]
[Example 2]
In order to examine whether MWC1 marker can be applied to strains bred from combinations other than W6 and Michinoku No. 1, verification was performed using other isolates resistant to blight (M2BH strain; 101 strains). went. The M2BH line is F1DH prepared from WWH2 that is resistant to mortality derived from W6 and F1 of Michinoku No.1. In the field test, 101 M2BH lines were cultivated 11 times per line in a contaminated field (Oyama City, Tochigi Prefecture), where the occurrence of uniform blight was observed in the past. The determination of resistance to blight was performed several times according to the progress of disease symptoms. As in [Example 1], the disease severity was 0: healthy strain, 1: lower leaf was wilt, 2: middle upper leaf was wilt, 3: dead, and the average of each line was calculated. The index was calculated by converting from 0 (all healthy strains) to 100 (all dead strains). For all lines, the marker type of the MWC1 marker was determined according to the method of 8). As a result, the average morbidity of the strain in which the W6 type marker was observed was 44.7, whereas the average morbidity of the strain in which the Michinoku type marker was observed was different from 66.3 (FIGS. 7 and 8). ). For convenience, if the lines are arranged in order of morbidity, 20 lines with low morbidity are considered as resistant line groups and 20 lines with high susceptibility lines as susceptible line groups, the appearance rate of W6 marker type in the resistant line group is 0.7 (14 / 20), but in the susceptible group, there was a clear difference of 0.1 (2/20). Therefore, it was possible to determine the resistance to blight of M2BH strain by discriminating the marker type of the MWC1 marker, and it was confirmed that the use of this marker is effective in other resistant segregating populations.
[0049]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of identification of a bacterial marker resistant to bacterial wilt.
FIG. 2 is a graph showing the morbidity distribution of F1DH in a field contaminated with blight.
FIG. 3 is a genetic linkage map of tobacco G-5 group.
FIG. 4 is a diagram showing QTL linked to resistance to tobacco blight.
FIG. 5 is an electrophoresis photograph of PCR amplification products using the PCR primers shown in Table 6.
FIG. 6 is an electrophoresis photograph of the PCR amplification products obtained by PCR primers shown in Table 6 digested with BfaI.
FIG. 7 is a graph showing the morbidity distribution of the M2BH strain.
FIG. 8 is a diagram showing 101 M2BH lines arranged in order of morbidity and showing the marker types of MWC1 markers.

Claims

A method of selecting tobacco resistant to bacterial wilt disease, which uses DNA having polymorphisms of SEQ ID NOs: 3 and 4 existing in tobacco genomic DNA as an index, and an individual having DNA whose 38 bases are adenine Is selected as tobacco that is resistant to blight.

A method for selecting tobacco-resistant tobacco,
(1) Amplifying a sequence containing the portion 38 of SEQ ID NO: 3 or 4 using DNA extracted from tobacco as a template;
(2) cleaving the obtained amplification product with BfaI,
When the amplification product is cleaved with BfaI, the individual that is the source of the DNA is selected as a tobacco-resistant tobacco.

The method according to claim 2, wherein the primers 123-57.61 STSF3 (CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT) and 123-57.61 STSF5 (GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC) are used as primers for amplifying a sequence comprising the site 38 of SEQ ID NO: 3 or 4. .