JP4862154B2 - Bacterial blight of bacterial wilt disease - Google Patents
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Description
本発明は、青枯れ病菌(ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum))に対して溶菌性を示すバクテリオファージ(以下、単に「ファージ」とも言う)、及びその利用に関する。 The present invention relates to a bacteriophage (hereinafter also simply referred to as “phage”) exhibiting lytic activity against bacterial wilt ( Ralstonia solanacearum ), and use thereof.
青枯れ病菌は、トマト、ナス、タバコなどに青枯れ病(立ち枯れ病)を引き起こす土壌細菌である。比較的温暖な地域を中心に世界中に分布し、ナス科やマメ科の他、経済的に重要な農作物多種を含む33科200種以上の植物に感染し、甚大な被害をもたらす。一度汚染された土壌から病原菌を除去することはきわめて困難である。本病に対する防除法としては、これまでに間作、輪作、土壌改良、土壌消毒法などが考案されているが、その発生を安定的に抑えることはほとんどできていない。 Bacterial wilt is a soil bacterium that causes bacterial wilt (withering) in tomatoes, eggplants, tobacco, and the like. It is distributed all over the world, mainly in relatively warm regions, and infects more than 200 species of 33 families including eggplants and legumes and various economically important crops, causing tremendous damage. It is very difficult to remove pathogenic bacteria from once contaminated soil. So far, intercropping, crop rotation, soil improvement, soil disinfection methods, etc. have been devised as control methods for this disease, but their occurrence has hardly been stably suppressed.
また、植物細菌病に関しては、病原細菌を溶菌するバクテリオファージを利用した防除方法が、病原細菌を選択的に溶菌して防除できる手段として古くから期待され、青枯れ病についても、P4282ファージ、PK101ファージ等の青枯れ病菌感染性バクテリオファージが報告されている(非特許文献1、非特許文献2)。また、最近、本発明者らは、青枯れ病菌に対して溶菌性を示し、その宿主特異性から3種類に大別される十数種のバクテリオファージを自然界より単離することに成功し、先に特許出願している(特許文献1)。
しかしながら、これまで報告されているバクテリオファージは、溶菌スペクトルが狭く、宿主範囲、地理的分布、病原性、疫学的特徴から多くの系統が存在する青枯れ病菌を有効に防除するには十分なものではない。
However, the bacteriophages reported so far have a narrow lysis spectrum and are sufficient for effective control of bacterial wilt disease with many strains due to host range, geographical distribution, pathogenicity, and epidemiological characteristics. is not.
本発明は、新規な青枯れ病菌感染性バクテリオファージを用いて、青枯れ病を効果的に防除する手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide means for effectively controlling bacterial wilt disease using a novel bacterial wilt infectious bacteriophage.
本発明者は、斯かる実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)より、青枯れ病菌に感染性の広い溶菌スペクトルを示すバクテリオファージを単離することに成功し、これを用いることにより青枯れ病を効果的に防除できることを見出した。 As a result of intensive studies in view of such circumstances, the present inventor succeeded in isolating a bacteriophage exhibiting a broad lytic spectrum infectious against bacterial wilt disease from Ralstonia solanacearum. It was found that the bacterial wilt disease can be effectively controlled by using.
すなわち、本発明は以下の(1)〜(6)に係るものである。
(1)ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)より単離され、ラルストニア ソラナセラムのC−319株、M4S株、Ps29株、Ps65株、Ps72株、Ps74株、MAFF106603株、MAFF106611株、MAFF211270株、MAFF211271株、MAFF211272株、MAFF301556株、MAFF301558株、MAFF730138株及びMAFF730139株のすべてに溶菌性を示すバクテリオファージ。
(2)上記バクテリオファージを有効成分として含有する青枯れ病の防除剤。
(3)上記バクテリオファージを有効成分として含有する土壌改良剤。
(4)上記バクテリオファージを植物又は土壌に散布することを特徴とする青枯れ病の防除方法。
(5)上記バクテリオファージを水耕栽培又は溶液栽培の培養液に添加することを特徴とする青枯れ病の防除方法。
(6)上記バクテリオファージを土壌に添加することを特徴とする土壌の改良方法。
That is, the present invention relates to the following (1) to (6).
(1) Isolated from Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ), C-319, M4S, Ps29, Ps65, Ps72, Ps74, MAFF106603, MAFF106611, MAFF211270, MAFF211272 and MAFF211272 Bacteriophage that is lytic to all of the strains MAFF301556, MAFF301558, MAFF730138 and MAFF730139.
(2) A bacterial blight control agent containing the bacteriophage as an active ingredient.
(3) A soil conditioner containing the bacteriophage as an active ingredient.
(4) A method for controlling bacterial wilt disease comprising spraying the bacteriophage on plants or soil.
(5) A method for controlling bacterial wilt disease comprising adding the bacteriophage to a culture solution of hydroponics or solution cultivation.
(6) A method for improving soil, comprising adding the bacteriophage to soil.
本発明のバクテリオファージは、公知の青枯れ病菌感染性バクテリオファージに比べて、広い作用スペクトルを示す。従って、これを用いることにより、多くの青枯れ病に有効な防除剤を提供することができ、また青枯れ病菌で汚染された土壌の改良に有効な土壌改良剤を提供することができる。 The bacteriophage of the present invention exhibits a broad spectrum of action compared to the known bacterial wilt bacteriophage. Therefore, by using this, it is possible to provide an effective control agent for many bacterial wilt diseases, and it is possible to provide an effective soil conditioner for improving soil contaminated with bacterial wilt disease.
本発明のバクテリオファージは、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)から単離されるものである。
ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)は、トマト、ナス、タバコなど200種以上の農作物に対して、青枯れ病(立ち枯れ病)を引き起こす多犯性の土壌伝染細菌である。本明細書においては、「青枯れ病菌」とも云う。
The bacteriophage of the present invention is isolated from Ralstonia solanacearum .
Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) is a polycidal soil-borne bacterium that causes bacterial wilt (withering disease) on over 200 kinds of crops such as tomato, eggplant and tobacco. In the present specification, it is also referred to as “green blight fungus”.
本発明のバクテリオファージは、少なくともラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)のC−319株、M4S株、Ps29株、Ps65株、Ps72株、Ps74株、MAFF106603株、MAFF106611株、MAFF211270株、MAFF211271株、MAFF211272株、MAFF301556株、MAFF301558株、MAFF730138株及びMAFF730139株のすべてに溶菌性を示すという、宿主特異性を有する。
斯かる宿主特異性は、後記実施例3に示すように、特開2005−278513号公報(特許文献1)に記載のタイプ1、タイプ2及びタイプ3に属するバクテリオファージとは、異なるものである。
The bacteriophage of the present invention contains at least C-319 strain, M4S strain, Ps29 strain, Ps65 strain, Ps72 strain, Ps74 strain, MAFF106603 strain, MAFF106611 strain, MAFF211270 strain, MAFF211271 strain, MAFF211272 strain of Ralstonia solanacearum , MAFF301556, MAFF301558, MAFF730138, and MAFF730139 all have lytic properties and have host specificity.
Such host specificity is different from the bacteriophages belonging to Type 1, Type 2 and Type 3 described in JP-A-2005-278513 (Patent Document 1), as shown in Example 3 below. .
ここで、M4S株は、タバコより分離されたレース1の菌株であり、前記非特許文献1に記載の菌株である。
Ps29株は、タバコより分離されたレース1の菌株であり、Ozawa H,Tanaka H, IchinoseT, Shiraishi T, and Yamada T. Bacterialphage P4282, a parasite of Ralstonia solanacearum, encodes a bacteriolytic protein, important for lytic infection of its host. Molecular Genetics and Genomics (2001) 265:95-101に記載の菌株である。
C−319株、Ps65株、Ps72株及びPs74株は、タバコより分離されたレース1の菌株である。
C−319株、M4S株、Ps29株、Ps65株、Ps72株及びPs74株は、山陰建設工業(島根県出雲市)より分譲された菌株である。
MAFF106603株は、レース1、biovar 3の菌株であり、MAFF106611株は、レース1、biovar 4の菌株であり、MAFF211270株は、レース1、biovar N2の菌株であり、MAFF211271株は、レース3、biovar N2の菌株であり、MAFF211272株は、レース4、biovar 4の菌株であり、MAFF301556株はレース1、biovar 4の菌株であり、MAFF301558株は、レース3、biovar N2の菌株であり、MAFF730138株は、レース1、biovar 3の菌株であり、MAFF730139株は、レース1、biovar 4の菌株である。MAFF106603株、MAFF106611株、MAFF211270株、MAFF211271株、MAFF211272株、MAFF301556株、MAFF301558株、MAFF730138株及びMAFF730139株は、農林水産省生物資源研究所発行の微生物遺伝資源利用マニュアル(12)、堀田光生・土屋健一、平成14年3月に記載の菌株で、農林水産省生物資源研究所農業生物資源ジーンバンクより分譲が可能である。
Here, the M4S strain is a strain of race 1 isolated from tobacco, and is the strain described in Non-Patent Document 1.
Ps29 strain is a strain of race 1 isolated from tobacco, Ozawa H, Tanaka H, IchinoseT, Shiraishi T, and Yamada T. Bacterialphage P4282, a parasite of Ralstonia solanacearum, encodes a bacteriolytic protein, important for lytic infection of Its host. Molecular Genetics and Genomics (2001) 265: 95-101.
C-319 strain, Ps65 strain, Ps72 strain and Ps74 strain are race 1 strains isolated from tobacco.
C-319 strain, M4S strain, Ps29 strain, Ps65 strain, Ps72 strain and Ps74 strain are strains sold by San-in Construction Industry (Izumo City, Shimane Prefecture).
The MAFF106603 strain is a race 1, biovar 3 strain, the MAFF106611 strain is a race 1, biovar 4 strain, the MAFF211270 strain is a race 1, biovar N2 strain, and the MAFF211271 strain is a race 3, biovar strain. Strain N2, MAFF211272 strain is race 4, biovar 4 strain, MAFF301556 strain is race 1, biovar 4 strain, MAFF301558 strain is race 3, biovar N2 strain, MAFF730138 strain is Race 1, biovar 3 strain, and MAFF730139 strain is a strain of race 1, biovar 4. MAFF106603, MAFF106611, MAFF211270, MAFF211271, MAFF211272, MAFF301556, MAFF301558, MAFF730138, MAFF730138, and MAFF730139 are microbial genetic resources utilization manuals published by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Bioresources Research Institute (12), Mitsuko Horita and Tsuchiya Kenichi, a strain described in March 2002, can be sold from the Genebank of Agricultural Bioresources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries.
上記の宿主特異性(溶菌スペクトル)を有するバクテリオファージは本発明のバクテリオファージに包含されるが、このうち、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum) MAFF211272株より単離されるものが好ましい。MAFF211272株は、上記のとおりレース 4、biovar 4の菌株であり、農林水産省生物資源研究所農業生物資源ジーンバンクより分譲が可能である。
そして、このうち、「RSA1」と命名されたバクテリオファージが特に好ましい。
RSA1は、本出願人において分譲可能な状態で保管されている。尚、当該RSA1は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託を申請(NITE AP-210(平成18年2月22日))したが、拒否された。
The bacteriophage having the above host specificity (lysis spectrum) is included in the bacteriophage of the present invention. Among them, those isolated from Ralstonia solanacearum MAFF211272 strain are preferable. The MAFF211272 strain is a strain of race 4 and biovar 4 as described above, and can be sold from the Genebank of Agricultural Bioresources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries.
Of these, the bacteriophage named “RSA1” is particularly preferred.
RSA1 is stored in a state that can be sold by the applicant. The RSA1 applied for a deposit (NITE AP-210 (February 22, 2006)) at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), but was rejected.
以下、バクテリオファージRSA1が有するこの他の特徴について説明する。
1.形態
図1に示すとおり、バクテリオファージRSA1は、正二十面体型の頭部と線上の尾部とから構成されるものである。これは、前記非特許文献1に記載のP4282ファージとは、P4282ファージは頭部の直径が約70nm、尾部が約20nmであるのに対して、RSA1は頭部の直径が約40nm、尾部が約100nmである点で異なる。
Hereinafter, other characteristics of bacteriophage RSA1 will be described.
1. Form As shown in FIG. 1, bacteriophage RSA1 is composed of an icosahedral head and a tail on a line. This is because the P4282 phage described in Non-Patent Document 1 has a head diameter of about 70 nm and a tail of about 20 nm, whereas RSA1 has a head diameter of about 40 nm and a tail of about 20 nm. It differs in that it is about 100 nm.
2.ゲノム解析
バクテリオファージRSA1のゲノムは、2本鎖DNAよりなり、制限酵素(SmaI)処理による断片のパターンは、図2に示すとおりであり、特許文献1に記載のタイプ1〜3のバクテリオファージとは異なる(実施例5)。
電気泳動により決定したRSA1のゲノムサイズは、約39Kbpであり(図2)、非特許文献2のPK101ファージ(約35Kbp)、とは異なる。
また、RSA1の塩基配列を決定したところ、サイズは38,820bpであり、全ゲノムが決定されているラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)GMI1000株のゲノム中に、RSA1の配列と非常に高い相同性を示す領域が存在しており(図3)、RSA1はラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)のゲノム中に溶原化され保持される可能性を示している。
以上より、バクテリオファージRSA1は、文献未記載の新規な青枯れ病菌感染性バクテリオファージであると云える。
2. Genome analysis The genome of bacteriophage RSA1 consists of double-stranded DNA, and the pattern of the fragments by the restriction enzyme ( Sma I) treatment is as shown in FIG. (Example 5).
The genome size of RSA1 determined by electrophoresis is about 39 Kbp (FIG. 2), which is different from PK101 phage (about 35 Kbp) of Non-Patent Document 2.
In addition, when the base sequence of RSA1 was determined, the size was 38,820 bp, and the region of the Ralstonia solanacearum GMI1000 strain, which has been determined for the entire genome, shows a very high homology with the RSA1 sequence. (FIG. 3), indicating that RSA1 may be lysogenized and retained in the genome of Ralstonia solanacearum .
From the above, it can be said that bacteriophage RSA1 is a novel bacterial wilt infectious bacteriophage not described in the literature.
本発明のバクテリオファージは、プラークアッセイ・分離方法を用いることにより、青枯れ病菌より分離することができる。すなわち、例えば、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum) MAFF211272株をCPG(実施例1)培地で旋回培養し、この培養液をtop agarに混合して、CPG寒天培地上に広げる。25〜30℃で12時間〜48時間培養し、検出された単一プラークの中央部分を滅菌爪楊枝等でつつき、例えばラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)M4S株等の培養液に添加してバクテリオファージを増幅させる。増幅後、遠心上清を0.2μm孔のフィルター等で濾過滅菌することにより、バクテリオファージRSA1を分離することができる。 The bacteriophage of the present invention can be isolated from bacterial wilt by using a plaque assay / separation method. That is, for example, Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) MAFF211272 strain is swirled in CPG (Example 1) medium, and this culture is mixed with top agar and spread on a CPG agar medium. Incubate at 25-30 ° C for 12-48 hours, pick up the central part of the detected single plaque with a sterile toothpick, etc., and add to a culture solution such as Ralstonia solanacearum M4S strain to amplify the bacteriophage Let me. After amplification, the bacteriophage RSA1 can be separated by sterilizing the centrifuged supernatant with a 0.2 μm pore filter or the like.
本発明のバクテリオファージは、一般的なバクテリオファージと同様の方法で増殖させることができる。例えば、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)を培養し、十分に増殖させた後、本発明のバクテリオファージを接種し、培養を継続することにより、大量のファージ溶液を得ることができる。ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)の培養は、定法に従って行うことができ、例えば、CPG液体培地などを用い、温度27〜37℃で旋回又は振とう培養すればよい。バクテリオファージを接種する時期は、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)が十分増殖している時期であれば特に限定されないが、菌体濃度が1×104〜1×108cfu/ml程度まで増殖した時期に接種するのが望ましい。ファージ接種から6〜12時間の培養で、ほぼすべての菌が溶菌し、ファージ溶液を得ることができる。 The bacteriophage of the present invention can be grown in the same manner as a general bacteriophage. For example, a large amount of phage solution can be obtained by culturing and fully growing Ralstonia solanacearum , inoculating the bacteriophage of the present invention, and continuing the culture. Cultivation of Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) can be performed according to a conventional method, for example, using a CPG liquid medium or the like, and culturing at a temperature of 27 to 37 ° C. with swirling or shaking. The time to inoculate the bacteriophage is not particularly limited as long as Ralstonia solanacearum is sufficiently proliferating, but the time when the cell concentration has increased to about 1 × 10 4 to 1 × 10 8 cfu / ml It is desirable to inoculate. By culturing for 6 to 12 hours after phage inoculation, almost all bacteria are lysed, and a phage solution can be obtained.
本発明のバクテリオファージは、上述したように、公知の青枯れ病菌感染性バクテリオファージに比べて、広い作用スペクトルを有し(実施例3)、圃場や水耕栽培等に適用した場合に、優れた青枯れ病防除効果を発揮する(実施例8)。従って、このバクテリオファージは、青枯れ病の防除、青枯れ病菌で汚染された土壌の改良及び水耕栽培や溶液栽培の培養液の当該細菌の駆除等に利用できる。なお、ここでいう「防除」とは、感染した青枯れ病菌の「駆除」と感染の「予防」の双方を含む意味である。 As described above, the bacteriophage of the present invention has a broad action spectrum (Example 3) as compared with known bacterial blight infectious bacteriophages, and is excellent when applied to fields, hydroponics and the like. (Example 8). Therefore, this bacteriophage can be used for controlling bacterial wilt disease, improving soil contaminated with bacterial wilt disease, and controlling the bacteria in hydroponics and solution cultures. The term “control” used herein includes both “control” of infected bacterial wilt and “prevention” of infection.
本発明のバクテリオファージを青枯れ病の防除剤又は土壌改良剤として利用する場合、上述した増殖方法によって得られるファージ溶液、あるいはファージ溶液を遠心分離等によって培養残渣と分離したものを使用してもよいが、展着剤を配合した溶液として使用しても、植物体への付着をよくすることができ好ましい。また、微生物製剤において一般的に使用される固体担体又は液体担体を配合して、水和剤、粉剤、カプセル剤等の製剤形態に調製したものを使用してもよい。 When the bacteriophage of the present invention is used as a bacterial wilt control agent or a soil conditioner, a phage solution obtained by the growth method described above, or a phage solution separated from the culture residue by centrifugation or the like may be used. Although it is good, even if it uses as a solution which mix | blended the spreading agent, it can adhere to a plant body and is preferable. In addition, a solid carrier or a liquid carrier generally used in microbial preparations may be blended to prepare a preparation form such as a wettable powder, powder, capsule or the like.
当該バクテリオファージを含有する防除剤又は土壌改良剤においては、溶液中のファージ濃度は、1×105〜1×1011 pfu/mlとするのが好ましく、1×108〜1×1010 pfu/mlとするのが更に好ましい。 In the control agent or soil conditioner containing the bacteriophage, the phage concentration in the solution is preferably 1 × 10 5 to 1 × 10 11 pfu / ml, and 1 × 10 8 to 1 × 10 10 pfu. More preferably / ml.
防除の対象となる植物としては、ジャガイモ、ナス、トマト、トウガラシ、ピーマン、タバコ、シソ、ダイコン、イチゴ、バナナ、マーガレット、キク、ヒマワリ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、防除対象とする病害は、ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)によって引き起こされる病害であれば限定されず、例えば、ナス科植物の青枯れ病、タバコ立枯れ病などを挙げることができる。 Examples of plants to be controlled include, but are not limited to, potato, eggplant, tomato, pepper, pepper, tobacco, perilla, radish, strawberry, banana, margaret, chrysanthemum, sunflower and the like. . The disease to be controlled is not limited as long as it is a disease caused by Ralstonia solanacearum , and examples thereof include bacterial wilt of solanaceous plants and tobacco wilt.
本発明の防除剤を圃場に散布する場合、その散布量は青枯れ病菌を防除できる範囲内であれば特に限定されないが、通常、圃場1平方メートル当り1×108〜1×1012 pfuのファージを散布するのが好適である。水耕栽培又は溶液栽培での防除に用いる場合は、ファージを1×103〜1×1010pfu/mlになるように培養液に添加するのが好ましい。 When the control agent of the present invention is sprayed on the field, the spraying amount is not particularly limited as long as it is within the range where bacterial wilt can be controlled, but usually 1 × 10 8 to 1 × 10 12 pfu phage per square meter of the field It is preferable to spray. When used for control in hydroponics or solution culture, it is preferable to add phages to the culture solution so as to be 1 × 10 3 to 1 × 10 10 pfu / ml.
また、本発明の土壌改良剤を土壌に添加する場合、その添加量は特に限定されないが、通常、土壌1kg当り1×1010〜1×1012pfuのファージを添加するのが好適である。 Further, when the soil improving agent of the present invention is added to the soil, the amount added is not particularly limited, it is preferable usually to add the soil 1kg per 1 × 10 10 ~1 × 10 12 pfu of the phage.
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。尚、特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001);F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. Unless otherwise stated, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) ; FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
実施例1 青枯れ病菌の培養
ポリペプトン10.0g、カザミノ酸1.0g、及びグルコース5.0gを、蒸留水1,000mlに加えて、CPG液体培地を調製した。このCPG液体培地を用いて、青枯れ病菌の各菌株を28℃で旋回培養(200rpm)又は振とう培養(300rpm)した。
Example 1 Culture of bacterial wilt fungus CPG liquid medium was prepared by adding 10.0 g of polypeptone, 1.0 g of casamino acid, and 5.0 g of glucose to 1,000 ml of distilled water. Using this CPG liquid medium, each bacterial strain of bacterial wilt was cultured at 28 ° C. by rotating culture (200 rpm) or shaking culture (300 rpm).
実施例2 バクテリオファージRSA1の分離
プラークアッセイ・分離方法により青枯れ病菌MAFF211272株よりバクテリオファージRSA1を分離した。
ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)MAFF211272株をCPG培地で旋回培養し、この培養液250μLを4mlのtop agarに混合して、CPG寒天培地(上記CPG液体培地に17.0gの寒天を添加した培地)上に広げた。28℃で12時間〜48時間培養後、プラークを検出した。単一プラークの中央部分を滅菌爪楊枝でつつき、青枯れ病菌(M4S株)の培養液(OD600=0.1〜0.5)に添加してバクテリオファージを増幅した。増幅後、遠心上清を0.2μm孔のフィルターで濾過滅菌し、バクテリオファージRSA1を分離した。
このファージRSA1は青枯れ病菌 MAFF211272株に溶原化していた可能性がある。
尚、RSA1は、平成18年2月15日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託申請したが(受領番号NITE AP-210(平成18年2月22日))、平成18年3月28日に受託の拒否がなされた。
Example 2 Separation of Bacteriophage RSA1 Bacteriophage RSA1 was isolated from the bacterial wilt fungus MAFF211272 by a plaque assay / separation method.
Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) MAFF211272 strain was swirled in CPG medium, 250 μL of this culture was mixed with 4 ml of top agar, and then on CPG agar medium (medium with 17.0 g of agar added to the above CPG liquid medium) Spread out. Plaques were detected after culturing at 28 ° C. for 12 to 48 hours. The central part of the single plaque was picked with a sterile toothpick and added to a culture solution (OD600 = 0.1 to 0.5) of bacterial wilt (M4S strain) to amplify the bacteriophage. After amplification, the centrifuged supernatant was sterilized by filtration with a 0.2 μm pore filter to separate bacteriophage RSA1.
This phage RSA1 may have been lysogenized in the bacterial wilt fungus MAFF211272.
RSA1 applied for deposit at the Patent Microorganisms Depositary Center for Product Evaluation and Technology on February 15, 2006 (Receipt Number NITE AP-210 (February 22, 2006)). On March 28, 2018, the acceptance was refused.
実施例3 バクテリオファージRSA1の宿主特異性
バクテリオファージRSA1の青枯れ病菌の各菌株に対する宿主特異性をプラークアッセイ法によって調べた。実施例2で分離したバクテリオファージRSA1を、実施例1で得た青枯れ病菌の各菌株の培養液(OD600=0.1〜0.5)に混合し、28℃で1時間だけ保温後、4mlのtop agarに混合してCPG寒天培地上に広げ、プラークアッセイを行った。青枯れ病菌の検定菌として、病原性、疫学的特徴、生理・生化学的性質が異なるラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)C319株、M4S株、Ps29株、Ps65株、Ps72株、Ps74株、MAFF106603株、MAFF106611株、MAFF211270株、MAFF211271株、MAFF211272株、MAFF301556株、MAFF301558株、MAFF730138株、MAFF730139株を用いた。
本発明者が青枯れ病菌からすでに単離している3種類のバクテリオファージ(特許文献1)との相同性を比較・検討するために、L-type(タイプ1ファージ)、M-type(タイプ3ファージ)、S-type(タイプ2ファージ)のバクテリオファージについても、同様の実験を行った。結果を表1に示す。
Example 3 Host specificity of bacteriophage RSA1 Host specificity of bacteriophage RSA1 against bacterial strains of bacterial wilt was examined by a plaque assay method. The bacteriophage RSA1 isolated in Example 2 was mixed with the culture solution (OD600 = 0.1 to 0.5) of each bacterial wilt of bacteria obtained in Example 1, and incubated at 28 ° C. for 1 hour, and then 4 ml of top agar And spread on a CPG agar medium, and plaque assay was performed. Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) C319 strain, M4S strain, Ps29 strain, Ps65 strain, Ps72 strain, Ps74 strain, MAFF106603 strain, with different pathogenicity, epidemiological characteristics, physiological and biochemical properties MAFF106611 strain, MAFF211270 strain, MAFF211271 strain, MAFF211272 strain, MAFF301556 strain, MAFF301558 strain, MAFF730138 strain, MAFF730139 strain were used.
In order to compare and examine the homology with three types of bacteriophages (Patent Document 1) already isolated from bacterial wilt disease by the present inventor, L-type (type 1 phage), M-type (type 3) The same experiment was performed on bacteriophages of phage) and S-type (type 2 phage). The results are shown in Table 1.
表1に示すように、バクテリオファージRSA1は検定に用いた全ての菌株を宿主とし、すでに単離している3種類のバクテリオファージ(特許文献1)とは宿主特異性が異なっていた。 As shown in Table 1, bacteriophage RSA1 had all the strains used in the assay as hosts, and the host specificity was different from the three types of already isolated bacteriophages (Patent Document 1).
実施例4 バクテリオファージRSA1の形態観察
バクテリオファージRSA1の形態を透過型電子顕微鏡を用いて観察した。実施例2で示すバクテリオファージRSA1の濾過滅菌液10mlを、40,000gで1時間、遠心分離し、バクテリオファージRSA1を沈殿として得た。この沈殿を0.01mol/lのMgSO4を含む100μlのPBSに懸濁した。バクテリオファージの懸濁液をホルムバールの膜を張ったグリッドに滴下し、リンタングステン酸を用いてネガティブ染色後、透過型電子顕微鏡で観察した。この結果を図1に示す。
Example 4 Morphological Observation of Bacteriophage RSA1 The morphology of bacteriophage RSA1 was observed using a transmission electron microscope. 10 ml of bacteriophage RSA1 filter sterilized solution shown in Example 2 was centrifuged at 40,000 g for 1 hour to obtain bacteriophage RSA1 as a precipitate. This precipitate was suspended in 100 μl of PBS containing 0.01 mol / l MgSO 4 . The bacteriophage suspension was dropped onto a grid covered with a formbar film, negatively stained with phosphotungstic acid, and then observed with a transmission electron microscope. The result is shown in FIG.
図1に示すように、バクテリオファージRSA1は正二十面体型の頭部と線状の尾部から構成されていた。尾部の末端は太くなっていた。この形態は、非特許文献1で報告されているものとは異なっていた。ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)に感染する類似ファージの報告は文献等では見あたらない。 As shown in FIG. 1, bacteriophage RSA1 was composed of an icosahedral head and a linear tail. The tail end was thick. This form was different from that reported in Non-Patent Document 1. There are no reports of similar phages that infect Ralstonia solanacearum in the literature.
実施例5 バクテリオファージRSA1のゲノムの解析
バクテリオファージRSA1より核酸を単離し解析した。RSA1のゲノムは2本鎖DNAよりなり、電気泳動でファージRSA1のゲノムサイズを決定したところ、図2に示すように約39kbpであった。RSA1より精製した未処理のDNA(図2A)、SmaI消化処理後のDNA(図2B)の電気泳動パターンより、RSA1のゲノムを解析したところ(図2Aにおいては、低濃度アガロースゲルを用いて電気泳動を行うことで、20Kbp以上のDNAを分離)、断片のパターンは、特許文献1及び非特許文献2のファージとは異なっていた(図2)。
Example 5 Analysis of Genome of Bacteriophage RSA1 Nucleic acid was isolated from bacteriophage RSA1 and analyzed. The genome of RSA1 consists of double-stranded DNA, and the genome size of phage RSA1 was determined by electrophoresis, and it was about 39 kbp as shown in FIG. Analysis of the genome of RSA1 from the electrophoresis pattern of untreated DNA purified from RSA1 (Figure 2A) and DNA after digestion with Sma I (Figure 2B) (In Figure 2A, a low-concentration agarose gel was used. The DNA of 20 Kbp or more was separated by electrophoresis), and the fragment pattern was different from the phages of Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 (FIG. 2).
実施例6 バクテリオファージRSA1のゲノム配列の決定
RSA1の塩基配列を決定したところ、サイズは38,820bpであった。図3に示すようにラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)GMI1000株(全ゲノムが決定されている)のゲノム中に、ファージRSA1の配列と非常に高い相同性を示す領域が存在することが判明した。
ラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)GMI1000株のゲノム中にファージRSA1のゲノムの配列と相同性が高い領域が存在する事は、RSA1はラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)のゲノム中に溶原化され保持される可能性を示している。
Example 6 Determination of the genomic sequence of bacteriophage RSA1
When the base sequence of RSA1 was determined, the size was 38,820 bp. As shown in FIG. 3, it was found that a region having very high homology with the phage RSA1 sequence was present in the genome of Ralstonia solanacearum GMI1000 strain (the entire genome was determined).
The presence of a region highly homologous to the phage RSA1 genome in the genome of Ralstonia solanacearum GMI1000 strain indicates that RSA1 can be lysed and retained in the Ralstonia solanacearum genome. Showing sex.
実施例7 バクテリオファージRSA1の大量生産
CPG寒天培地上で培養したラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)M4S株のシングルコロニーをCPG液体培地50mlに植菌し、28℃にて24〜48時間旋回培養した。この培養液10mlをCPG液体培地2,000mlに添加し、OD600=0.1(約5×107 cfu/ml)程度まで28℃にて4〜6時間旋回培養(120rpm)した。この培養液に、m.o.i.(The multiplicity of infectionの略、細胞一個あたりに対するファージの数)=0.0001〜0.1になるようあらかじめ希釈しておいたファージ液を10〜100ml添加した。ファージの希釈には、実施例1に示すCPG液体培地に、MgSO4が終濃度0.01mol/lになるように加えた溶液を用いた。28℃にて1時間静置後、28℃にて10時間以上旋回培養し(120rpm)、溶菌させることで大量のバクテリオファージ液を調製した。溶菌液は5×107〜5×109 pfu/mlのファージRSA1を含んでいた。
Example 7 Mass production of bacteriophage RSA1
A single colony of Ralstonia solanacearum M4S strain cultured on CPG agar medium was inoculated into 50 ml of CPG liquid medium and swirled at 28 ° C. for 24-48 hours. 10 ml of this culture solution was added to 2,000 ml of CPG liquid medium, and swirling culture (120 rpm) was performed at 28 ° C. for 4 to 6 hours until OD600 = 0.1 (about 5 × 10 7 cfu / ml). To this culture solution, 10 to 100 ml of a phage solution diluted in advance so that moi (abbreviation of The multiplicity of infection, number of phages per cell) = 0.0001 to 0.1 was added. For the dilution of the phage, a solution in which MgSO 4 was added to the CPG liquid medium shown in Example 1 to a final concentration of 0.01 mol / l was used. After standing at 28 ° C. for 1 hour, swirling culture was performed at 28 ° C. for 10 hours or more (120 rpm), and a large amount of bacteriophage solution was prepared by lysis. The lysate contained 5 × 10 7 to 5 × 10 9 pfu / ml of phage RSA1.
実施例8 バクテリオファージRSA1による青枯れ病菌の増殖阻害効果
CPG寒天培地上で培養したラルストニア ソラナセラム(Ralstonia solanacearum)M4S株のシングルコロニーをCPG液体培地50mlに植菌し、28℃にて24時間旋回培養した。この培養液0.5mlをCPG液体培地100mlに添加し、OD600=0.1(約5×107 cfu/ml)程度まで28℃にて4〜6時間旋回培養(200rpm)した。この培養液に、あらかじめCPG液体培地にMgSO4が終濃度0.01mol/lになるように加えた溶液で希釈した、ファージRSA1の溶液を20μl加え、m.o.i.(The multiplicity of infectionの略、細胞一個あたりに対するファージの数)が0.01、0.001、0.0001になるよう感染させた。コントロールの試料にはファージを感染させなかった。28℃にて30分間静置後、28℃にて16時間、旋回培養し(200rpm)、2時間ごとにOD600を測定し、青枯れ病菌の増殖を記録した。結果を図4に示す。
Example 8 Bacteriophage RSA1 inhibits growth of bacterial wilt
A single colony of Ralstonia solanacearum ( Ralstonia solanacearum ) M4S strain cultured on a CPG agar medium was inoculated into 50 ml of a CPG liquid medium, and swirled at 28 ° C. for 24 hours. 0.5 ml of this culture solution was added to 100 ml of CPG liquid medium, and swirl culture (200 rpm) was performed at 28 ° C. for 4 to 6 hours until OD600 = 0.1 (about 5 × 10 7 cfu / ml). To this culture solution, 20 μl of a phage RSA1 solution diluted in advance to a final concentration of 0.01 mol / l MgSO 4 in CPG liquid medium was added, and moi (abbreviation of The multiplicity of infection, per cell) The number of phages against each other was 0.01, 0.001, 0.0001. Control samples were not infected with phage. After standing at 28 ° C. for 30 minutes, culturing was continued at 28 ° C. for 16 hours (200 rpm), OD600 was measured every 2 hours, and growth of bacterial wilt disease was recorded. The results are shown in FIG.
ファージRSA1の添加により青枯れ病菌の増殖が有意に阻害された。増殖阻害の程度は、ファージ感染時のm.o.i.に依存し、m.o.i.が大きいほうが増殖阻害効果は強かった。 Addition of phage RSA1 significantly inhibited the growth of bacterial wilt. The degree of growth inhibition depended on m.o.i. at the time of phage infection, and the larger m.o.i., the stronger the growth inhibition effect.
〔態様の形式1〕圃場における青枯れ病の防除
圃場に散布する場合は圃場1平方メートル当り1×108〜1×1012pfuのファージを散布する。土壌に混合して使用する場合は土壌1Kgあたり1×1010〜1×1012pfuのファージを土壌に混合し使用する。
[Mode 1] Control of bacterial wilt disease in a field When spraying on a field, 1 × 10 8 to 1 × 10 12 pfu of phage per 1 square meter of the field is sprayed. When mixed with soil, 1 × 10 10 to 1 × 10 12 pfu of phage per 1 kg of soil is mixed with the soil and used.
〔態様の形式2〕水耕栽培や溶液栽培における青枯れ病菌の防除
ファージRSA1を用いて、水耕栽培又は溶液栽培での青枯れ病菌の防除を行う。水耕栽培又は溶液栽培で用いる培養液に、ファージRSA1を1×103〜1×1010pfu/mlになるように添加し栽培する。
[Mode 2] Control of bacterial wilt fungus in hydroponics and solution culture Using phage RSA1, bacterial wilt fungus is controlled in hydroponics or solution culture. Phage RSA1 is added to a culture solution used in hydroponics or solution cultivation so that the concentration becomes 1 × 10 3 to 1 × 10 10 pfu / ml.
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