JP4854211B2 - Primer sequence - Google Patents
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Description
本発明は、動物由来DNA検出用のプライマー対に関する。詳細には、ミトコンドリアゲノムATP合成酵素サブユニット8遺伝子配列に由来する動物特異的DNA配列を増幅するために使用されるプライマー対に関する。
The present invention relates to a primer pair for detecting animal-derived DNA. In particular, it relates to primer pairs used to amplify animal specific DNA sequences derived from the mitochondrial genomic
現在、牛海綿状脳症(BSE)の牛に由来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた牛がBSEに罹患し、問題となっている。そして、BSEと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指摘されている。そこで、BSEの発生以来、先端技術を用いた鋭敏な動物種の検出技術の開発が、必要となっており、特に行政上の緊急対応事項となっている。 Currently, meat-and-bone meal derived from bovine spongiform encephalopathy (BSE) cattle is added to feed, and cattle fed with the feed suffer from BSE, which is a problem. And it is pointed out that a disease similar to BSE may exist in various livestock. Therefore, since the occurrence of BSE, development of sensitive animal species detection technology using advanced technology has become necessary, and in particular, it has become an administrative emergency response matter.
動物種識別については、従来、免疫学的手法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子識別手法が用いられてきた。免疫学的手法としては、例えば、ELISA法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる遺伝子識別手法としては、例えば、PCR法が挙げられる。しかし、加熱処理されている肉骨粉などは、タンパク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこと、および肉骨粉混入飼料には植物由来成分が多く、動物由来成分について微量分析が必要であることなど、現在行われている動物種識別方法には、多くの問題点がある。このように加熱処理後サンプルについても実施可能な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務である。さらに、今日では、牛用飼料に魚介類由来のタンパク質および家禽由来のタンパク質を含んではならないとされているため、牛用配合飼料中に混入した魚粉やチキンミールの検出技術の開発も必要である。 Conventionally, for animal species identification, immunological techniques and gene identification techniques using nuclear genes have been used. Examples of the immunological technique include an ELISA method and an immunoblot method. An example of a gene identification method using a nuclear gene is a PCR method. However, meat-and-bone meal that has been heat-treated has a high possibility of protein denaturation and fragmentation of nucleic acids, and meat-and-bone meal-containing feed contains many plant-derived components, and trace analysis of animal-derived components is not possible. There are a number of problems with the animal species identification methods currently in use, such as the necessity. Thus, there is an urgent need to develop a highly sensitive and effective detection method that can be performed on a sample after heat treatment. Furthermore, today, cattle feed must not contain fish and poultry-derived proteins and poultry-derived proteins, so it is also necessary to develop technology for detecting fish meal and chicken meal mixed in cattle feed. .
本発明者らは、これまでに、動物ミトコンドリアゲノムに存在するATP合成酵素サブユニット8遺伝子(atp8遺伝子)に由来する動物特異的DNA配列をプライマー対として用いる動物種識別方法を開発している(特許文献1参照)。これは、atp8遺伝子の相同配列が植物(イネ)ミトコンドリアゲノムに存在しないことを利用し、植物系の飼料中より微量の動物遺伝子を効率的に検出することができる。また、他のグループも、肉種判別や肉骨粉の検出に使用できるプライマーを開発している(非特許文献1および2)。
牛の大量生産国であるカナダおよび米国におけるBSE発生という状況下、家畜あるいはペットに与える飼料中に、どのような動物の肉あるいは肉骨粉が使用されているか、特にウシなどの反芻動物由来の成分あるいはブタ由来の成分を検出するための、さらに感度の高い検出方法が望まれている。また、牛用配合飼料中に混入した種々の魚種の魚粉あるいはチキンミールを幅広く検出する方法も望まれている。 What animal meat or meat-and-bone meal is used in feeds given to livestock or pets in the situation of BSE occurrence in Canada and the United States, which are large producers of cattle, especially ruminant ingredients such as cattle Alternatively, a detection method with higher sensitivity for detecting pig-derived components is desired. In addition, a method for widely detecting fish meal or chicken meal of various fish species mixed in the mixed feed for cattle is also desired.
本発明は、配列表の配列番号1の配列と配列表の配列番号2の配列との組み合わせである、反芻動物特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention provides a ruminant-specific primer pair for detecting DNA, which is a combination of the sequence of SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
好適な実施態様では、上記反芻動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびシカからなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the ruminant is selected from the group consisting of cows, sheep, goats and deer.
本発明はまた、配列表の配列番号3の配列と配列表の配列番号4の配列との組み合わせである、ウシ特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention also provides a primer pair for detecting bovine specific DNA, which is a combination of the sequence of SEQ ID NO: 3 of the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing.
本発明はさらに、配列表の配列番号5の配列と配列表の配列番号6の配列との組み合わせである、ブタ特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention further provides a primer pair for detecting pig-specific DNA, which is a combination of the sequence of SEQ ID NO: 5 of the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 6 of the sequence listing.
本発明はまた、配列表の配列番号7、8、9、10、11、12、13、および14の配列からなる群より選択される配列と、配列表の配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、および31の配列からなる群より選択される配列との組み合わせである、魚類特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention also provides a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14 in the sequence listing; and SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18 in the sequence listing. , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and 31, a primer for detecting fish-specific DNA, which is a combination with a sequence selected from the group consisting of Offer a pair.
好適な実施態様では、上記魚類は、アジ、イワシ、カタクチイワシ、カツオ、サケ、サバ、サンマ、スケソウダラ、ニジマス、およびマグロからなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the fish is selected from the group consisting of horse mackerel, sardine, anchovy, bonito, salmon, mackerel, saury, pollock, rainbow trout, and tuna.
本発明はまた、配列表の配列番号32、33、34、および35の配列からなる群より選択される配列と、配列表の配列番号36、37、および38の配列からなる群より選択される配列との組み合わせである、鶏特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention is also selected from a group selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 33, 34, and 35 in the sequence listing and from a group consisting of sequences SEQ ID NO: 36, 37, and 38 in the sequence listing. A primer pair for detecting chicken-specific DNA, which is a combination with a sequence, is provided.
好適な実施態様では、上記鶏は、ニワトリおよびウズラからなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the chicken is selected from the group consisting of chicken and quail.
本発明はまた、配列表の配列番号39の配列と配列表の配列番号40の配列との組み合わせである、植物特異的DNA検出用プライマー対を提供する。 The present invention also provides a primer pair for detecting plant-specific DNA, which is a combination of the sequence of SEQ ID NO: 39 of the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 40 of the sequence listing.
好適な実施態様では、上記植物は、イネ科植物、およびダイズ、テンサイ、ナタネなどの双子葉植物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the plant is selected from the group consisting of gramineous plants and dicotyledonous plants such as soybean, sugar beet, rapeseed.
本発明はさらに、試料中の反芻動物由来の成分を検出する方法を提供し、該方法は、上記の反芻動物特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む。 The present invention further provides a method for detecting a ruminant-derived component in a sample, the method using the ruminant-specific DNA detection primer pair, and using a DNA in the sample as a template and a DNA fragment as a template. A step of amplifying by PCR, and a step of detecting the amplified DNA fragment.
好適な実施態様では、上記試料は、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the sample is raw meat, processed meat food, processed food containing meat, blood, hair, body fluid, milk, processed milk, meat and bone meal, bone meal, and feed, fertilizer, and feed containing them. Selected from the group consisting of additives.
本発明はまた、試料中のウシ由来の成分を検出する方法を提供し、該方法は、上記のウシ特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む。 The present invention also provides a method for detecting a bovine-derived component in a sample, the method using the above-described primer pair for detecting bovine specific DNA, using DNA in the sample as a template, and PCR using a DNA fragment as a template. And a step of detecting the amplified DNA fragment.
好適な実施態様では、上記試料は、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the sample is raw meat, processed meat food, processed food containing meat, blood, hair, body fluid, milk, processed milk, meat and bone meal, bone meal, and feed, fertilizer, and feed containing them. Selected from the group consisting of additives.
本発明はまた、試料中のブタ由来の成分を検出する方法を提供し、該方法は、上記のブタ特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む。 The present invention also provides a method for detecting a porcine-derived component in a sample. The method uses the above-mentioned primer pair for detecting pig-specific DNA, a DNA fragment as a template, and a PCR method using a DNA fragment as a template. And a step of detecting the amplified DNA fragment.
好適な実施態様では、上記試料は、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the sample is raw meat, processed meat food, processed food containing meat, blood, hair, body fluid, milk, processed milk, meat and bone meal, bone meal, and feed, fertilizer, and feed containing them. Selected from the group consisting of additives.
本発明はまた、試料中の魚類由来の成分を検出する方法を提供し、該方法は、上記の魚類特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む。 The present invention also provides a method for detecting a fish-derived component in a sample. The method uses the above-described primer pair for detecting fish-specific DNA, a DNA fragment as a template, and a PCR method using a DNA fragment as a template. And a step of detecting the amplified DNA fragment.
好適な実施態様では、上記試料は、生魚、魚加工食品、魚加工品含有食品、血液、体液、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the sample is a group consisting of raw fish, fish-processed food, fish-processed food-containing food, blood, body fluid, fish meal, fish soluble, broth, and feed, fertilizer, and feed additive containing them. More selected.
本発明はまた、試料中の鶏由来の成分を検出する方法を提供し、該方法は、上記の鶏特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む。 The present invention also provides a method for detecting a chicken-derived component in a sample, the method using the above-described chicken-specific DNA detection primer pair, a DNA fragment as a template, and a PCR method using a DNA fragment as a template. And a step of detecting the amplified DNA fragment.
好適な実施態様では、上記試料は、生肉、鶏肉加工食品、鶏肉加工品含有食品、血液、体液、羽毛、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される。 In a preferred embodiment, the sample is from the group consisting of raw meat, processed chicken food, processed food containing chicken meat, blood, body fluid, feathers, meat and bone meal, bone meal, and feed, fertilizer, and feed additive containing them. Selected.
本発明はさらに、上記のいずれかのプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法を提供する。 The present invention further includes a step of amplifying a DNA fragment by a PCR method using any one of the above primer pairs and using DNA in a sample as a template, and a step of detecting the amplified DNA fragment. Provide a method.
本発明はさらに、上記の植物特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、植物由来成分の検出方法を提供する。 The present invention further includes a step of amplifying a DNA fragment by a PCR method using the plant-specific DNA detection primer pair as described above and a DNA in a sample as a template, and a step of detecting the amplified DNA fragment. A method for detecting a plant-derived component is provided.
本発明はまた、上記のプライマー対および配列表の配列番号41の配列と配列表の配列番号42の配列との組み合わせである哺乳動物特異的DNA検出用プライマー対を含む、動物由来成分検出用キットを提供する。 The present invention also includes an animal-derived component detection kit comprising the above primer pair and a primer pair for detecting a mammal-specific DNA, which is a combination of the sequence of SEQ ID NO: 41 of the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 42 of the sequence listing I will provide a.
好適な実施態様では、上記キットは、さらに、上記植物特異的DNA検出用プライマー対を含む。 In a preferred embodiment, the kit further includes the plant-specific DNA detection primer pair.
本発明のプライマー対またはキットを用いると、試料中の微量の動物由来DNA配列を、従来よりも高感度で検出することができる。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合も検出可能である。さらに、本発明の魚類特異的DNA検出用プライマーあるいは鶏特異的DNA検出用プライマーを用いると、配合飼料などに混入した種々の魚種由来の魚粉あるいはチキンミールを検出することが可能である。 When the primer pair or kit of the present invention is used, a trace amount of animal-derived DNA sequence in a sample can be detected with higher sensitivity than in the past. Therefore, for example, it is possible to identify the animal species of meat-and-bone meal slightly mixed in the feed. In particular, it is also possible to detect when a small amount of beef bone meal is mixed in livestock blended feed. Furthermore, when the fish-specific DNA detection primer or chicken-specific DNA detection primer of the present invention is used, it is possible to detect fish meal or chicken meal derived from various fish species mixed in the mixed feed.
ミトコンドリアゲノムは、酸化的リン酸化(電子伝達系)に必要な酵素類の生合成に必須であり、ATP合成酵素、シトクロムcオキシダーゼなどがミトコンドリアDNA上にコードされている。ATP合成酵素は、いくつかのサブユニットから構成されており、上述のように、発明者らは、ATP合成酵素サブユニット8遺伝子(atp8遺伝子)が、動物ミトコンドリアゲノムに存在するが、その相同配列は植物(イネ)ミトコンドリアゲノムに存在しないことを見出した。そして、これによって、飼料中に植物由来のDNAが大量に存在するにもかかわらず、動物種を効率的に識別することが可能となった。
The mitochondrial genome is essential for the biosynthesis of enzymes necessary for oxidative phosphorylation (electron transport system), and ATP synthase, cytochrome c oxidase and the like are encoded on mitochondrial DNA. ATP synthase is composed of several subunits. As described above, the inventors have found that the
動物のatp8遺伝子は、いくつか知られている。例えば、ウシのatp8遺伝子配列(ウシ)を基準とし、いくつかの動物種におけるatp8遺伝子配列を、ウシとの相同性が最大となるようにアラインしたものを、図1に示す。図1においては、1:ウシ、2:アルパカ、3:ネコ、4:イヌ、5:ヤギ(1)、6:ヤギ(2)、7:ウマ、8:カモシカ、9:マウス、10:ウサギ、11:ラット、12:ロバ、13:ヒツジ、14:シカ、15:マッコウクジラ、および16:ナガスクジラのatp8遺伝子のDNA配列を示す。なお、図の矢印は、ウシのatp8構造遺伝子の始まりの位置を示す。 Several animal atp8 genes are known. For example, FIG. 1 shows the alignment of the atp8 gene sequences in several animal species so as to maximize the homology with cattle based on the bovine atp8 gene sequence (bovine). In FIG. 1, 1: bovine, 2: alpaca, 3: cat, 4: dog, 5: goat (1), 6: goat (2), 7: horse, 8: antelope, 9: mouse, 10: rabbit 11: rat, 12: donkey, 13: sheep, 14: deer, 15: sperm whale, and 16: fin whale atp8 gene DNA sequences. The arrow in the figure indicates the starting position of the bovine atp8 structural gene.
また、図2は、ウシ、ニワトリ、およびブタのatp8遺伝子をアラインしたものを示す。 FIG. 2 shows an alignment of bovine, chicken, and porcine atp8 genes.
図1および図2に示すように、atp8遺伝子にはDNA配列の多様性がある。この多様性を利用して、各種動物における特異的配列を検出することにより、各動物種の識別が可能である。 As shown in FIGS. 1 and 2, the atp8 gene has a variety of DNA sequences. By using this diversity to detect specific sequences in various animals, each animal species can be identified.
各種動物を識別するために、それぞれの動物種に特異的なDNA配列を検出する方法としては、サザンブロット法、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法などが挙げられるが、微量のDNA試料でも検出が可能な点、および精度を向上させる点で、本発明においてはPCR法が好ましく用いられる。本発明におけるPCRは、目的の動物種に特異的なDNA配列を含む一対のプライマーを用いて行い、増幅されたDNA断片を検出する。 In order to identify various animals, examples of methods for detecting DNA sequences specific to each animal species include Southern blotting and PCR (polymerase chain reaction), but detection is possible even with very small amounts of DNA samples. In the present invention, the PCR method is preferably used in that respect and the point of improving accuracy. The PCR in the present invention is performed using a pair of primers containing a DNA sequence specific to the target animal species, and an amplified DNA fragment is detected.
PCR法は、例えば、以下のように行われる。まず、atp8遺伝子中の目的の動物種に特徴的なDNA配列を有するいくつかの領域から、プライマーとして2箇所を選択し、それぞれのプライマーを合成する。この一対のプライマーを用いて、プライマーに挟まれた領域のDNA断片をPCRによって増幅する。次いで、増幅されたDNA断片を含む試料について電気泳動を行って、該DNA断片の有無を検出する。 The PCR method is performed as follows, for example. First, two primers are selected from several regions having a DNA sequence characteristic of the target animal species in the atp8 gene, and each primer is synthesized. Using this pair of primers, a DNA fragment in the region sandwiched between the primers is amplified by PCR. Next, the sample containing the amplified DNA fragment is electrophoresed to detect the presence or absence of the DNA fragment.
プライマーは、任意の長さのDNA配列であり、公知のデータベースの各種動物のatp8遺伝子の配列アラインメントに基づいて適宜選択される。例えば、哺乳動物に特異的なDNAの検出を目的とする場合、哺乳動物間で相同性が高く、かつ、非哺乳動物とは相同性が低い領域を選択すればよく、特定の動物に特異的なDNAの検出を目的とする場合は、その動物に特異的であり、かつ、他の動物とは相同性の低い領域を選択すればよい。プライマーは、対として使用するため、5’側および3’側の2箇所の領域を選択する。プライマーとして選択可能な領域が2箇所よりも多い場合は、種々の組み合わせのプライマーを用い得る。 The primer is a DNA sequence having an arbitrary length, and is appropriately selected based on the sequence alignment of the atp8 gene of various animals in a known database. For example, when the purpose is to detect DNA specific to mammals, a region having high homology between mammals and low homology to non-mammals may be selected. For the purpose of detection of a simple DNA, a region specific to that animal and having a low homology with other animals may be selected. Since the primer is used as a pair, two regions on the 5 'side and 3' side are selected. When there are more than two selectable regions as primers, various combinations of primers can be used.
例えば、図1および図2に示す四角で囲まれた領域は、それぞれの動物種を特異的に検出できることが確認されている配列を示す(特許文献1参照)。 For example, the region surrounded by a square shown in FIG. 1 and FIG. 2 shows a sequence that has been confirmed to be able to specifically detect each animal species (see Patent Document 1).
本発明においては、配列表の配列番号1と2とに示す配列をプライマーとして用いると、反芻動物特異的なDNAを高感度で検出できる。また、配列表の配列番号3と4とに示す配列をプライマーとして用いると、ウシ特異的なDNAを高感度で検出できる。配列表の配列番号5と6とに示す配列をプライマーとして用いると、ブタ特異的なDNAを高感度で検出できる。あるいは、例えば、配列表の配列番号12および25に示す配列をプライマー対として用いると、魚類特異的なDNAを高感度で検出できる。同様に、例えば、配列表の配列番号32および36に示す配列をプライマー対として用いると、鶏特異的なDNAを高感度で検出できる。 In the present invention, ruminant-specific DNA can be detected with high sensitivity by using the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing as primers. In addition, when the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing are used as primers, bovine specific DNA can be detected with high sensitivity. When the sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 in the sequence listing are used as primers, pig-specific DNA can be detected with high sensitivity. Alternatively, for example, when the sequences shown in SEQ ID NOs: 12 and 25 in the sequence listing are used as primer pairs, fish-specific DNA can be detected with high sensitivity. Similarly, for example, when the sequences shown in SEQ ID NOs: 32 and 36 in the sequence listing are used as primer pairs, chicken-specific DNA can be detected with high sensitivity.
プライマーとして選択された領域のDNA配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般的には、DNA自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法(例えば、カラムクロマトグラフィー)によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。 The DNA sequence of the region selected as the primer is synthesized by a commonly used method. In general, nucleotides are extended on a support using an automated DNA synthesizer, followed by deprotection and cleavage from the support. Subsequently, the target primer can be obtained by purification by a commonly used method (for example, column chromatography).
測定される試料としては、生肉、生魚、肉加工食品、魚加工食品、肉加工品含有食品、魚加工品含有食品、血液、体毛、羽毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、これらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物などが挙げられる。試料からのミトコンドリアDNAの抽出は、例えば、以下のように行う。約50mg〜500mgの試料(例えば、生肉の場合50mg、乾燥粉体試料の場合100〜500mg)を、約10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(例えば、和光純薬工業製)を用いて抽出する。このようなキットは、組織細胞中のゲノムDNAの混入が少なく、より高純度のミトコンドリアDNAを回収するものであり、遠心分離、沈殿採取などによるDNAの抽出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存在する大量のゲノムDNAの混入程度が低くミトコンドリアDNAをより効率的に抽出できる。DNAの抽出法は、ここで記述した方法に限定されず、その他の方法も利用し得ることは、当業者に明らかである。 Samples to be measured include raw meat, raw fish, processed meat foods, processed fish foods, processed food products, processed food products, blood, body hair, feathers, body fluids, milk, processed milk products, meat and bone meal, bone meal, Examples thereof include fish meal, fish solubles, broth, and feeds containing these, fertilizers, and feed additives. Extraction of mitochondrial DNA from a sample is performed as follows, for example. A sample of about 50 mg to 500 mg (for example, 50 mg for raw meat, 100 to 500 mg for a dry powder sample) is suspended in about 10 times the amount of buffer solution, crushed by a bead crushing method, and then commercially available tissue cell mitochondria. Extraction is performed using a DNA extraction kit (for example, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Such a kit recovers higher purity mitochondrial DNA with less contamination of genomic DNA in tissue cells, and performs DNA extraction and concentration operations by centrifugation, precipitation collection, and the like. In this way, mitochondrial DNA can be extracted more efficiently with a low level of contamination of a large amount of genomic DNA present in the sample. It will be apparent to those skilled in the art that DNA extraction methods are not limited to those described herein, and that other methods may be utilized.
プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、約0.4μMで使用することが好ましい。 The amount of the primer used is not particularly limited, but generally it is preferably used at about 0.4 μM.
前処理した試料について、上記の選択したプライマー対を用いてPCRを行い、プライマーに挟まれた領域のDNA断片を増幅する。PCRは、通常行われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞれ適切な条件を設定する。例えば、まず95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒〜1分;アニーリング:40〜65℃、30秒〜2分;伸長:72℃、30秒〜2分の反応を、30〜50サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させてPCRを終了する。DNAポリメラーゼとしては、例えば、AmpliTaq GOLDポリメラーゼなどが用いられる。プライマー対によって増幅されたPCR産物(DNA断片)の大きさは、選択されたプライマー対間の塩基数に応じて変動するが、約80〜約300bpであり得る。このPCR産物は、次いで、上記DNA断片を分離できる条件下で、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを行う。 The pretreated sample is subjected to PCR using the selected primer pair, and the DNA fragment in the region sandwiched between the primers is amplified. PCR is performed under the conditions that are usually performed, and appropriate conditions are set for each primer pair. For example, after heat denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, denaturation: 92 ° C., 30 seconds to 1 minute; annealing: 40 to 65 ° C., 30 seconds to 2 minutes; extension: 72 ° C., 30 seconds to 2 minutes. 30 to 50 cycles are repeated, and finally, the reaction is completed at 72 ° C. for 5 minutes to complete the PCR. For example, AmpliTaq GOLD polymerase is used as the DNA polymerase. The size of the PCR product (DNA fragment) amplified by the primer pair varies depending on the number of bases between the selected primer pairs, but can be about 80 to about 300 bp. The PCR product is then subjected to, for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, etc. under conditions that allow the DNA fragments to be separated.
電気泳動したゲル上のDNA断片は、当業者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって検出され、DNA配列決定により確認し得る。 DNA fragments on the electrophoresed gel can be detected by detection means commonly used by those skilled in the art such as ethidium bromide staining, fluorescence detection, Southern hybridization, and can be confirmed by DNA sequencing.
このようにして、試料中に目的の動物種由来のDNAが存在していれば、増幅されたDNA断片がゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー対の種類および組み合わせ、試料の量、PCR条件、検出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度でDNAの存在を検出することができる。例えば、適切な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配合飼料である場合、特定のウシ特異的なプライマー対を用いて、少なくとも0.001重量%の牛肉骨粉の混入でさえも検出することが可能である。 In this way, if DNA derived from the target animal species is present in the sample, the amplified DNA fragment can be detected on the gel. The detection limit may vary depending on various factors such as the type and combination of primer pairs used, the amount of sample, PCR conditions, detection methods and the like. If appropriate conditions are selected, the presence of DNA can be detected with high sensitivity even in a small amount of sample. For example, if the appropriate conditions are selected, if the sample is a mixed feed containing bovine-derived meat and bone meal, a specific cow-specific primer pair is used to detect even at least 0.001% by weight of beef bone meal Is possible.
なお、試料として配合飼料を用いる場合には、植物由来DNAに特異的なプライマー対(例えば、placon5(配列番号39)とplacon3(配列番号40)との組み合わせ)をコントロール実験として用いれば、試料からDNAが適切に抽出されているかどうかを確認することができる。また、植物由来DNAに特異的なプライマー対を用いれば、試料中の植物由来成分の有無を検出することもできる。 When a mixed feed is used as a sample, a primer pair specific to plant-derived DNA (for example, a combination of placon5 (SEQ ID NO: 39) and placon3 (SEQ ID NO: 40)) is used as a control experiment. It can be confirmed whether or not DNA is appropriately extracted. In addition, if a primer pair specific to plant-derived DNA is used, the presence or absence of plant-derived components in the sample can also be detected.
あるいは、試料として魚粉を用いる場合は、魚類由来DNAに特異的なプライマー対(例えば、FM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)との組み合わせ)をコントロール実験として用いれば、試料からDNAが適切に抽出されているかどうかを確認することができる。また、魚類由来DNAに特異的なプライマー対を用いれば、試料中の魚類由来成分の有無を検出することもできる。 Alternatively, when fish meal is used as a sample, a primer pair specific to fish-derived DNA (for example, a combination of FM5 (SEQ ID NO: 12) and FM3 (SEQ ID NO: 25)) is used as a control experiment. It can be confirmed whether it is properly extracted. In addition, if a primer pair specific to fish-derived DNA is used, the presence or absence of fish-derived components in the sample can also be detected.
本発明のプライマー対は、動物由来成分検出用キットとして提供され得る。このキットには、上記動物特異的DNA検出用プライマー対のうちの少なくとも1つのプライマー対が含まれる。好ましくは、上記の動物特異的DNA検出用プライマー対のうち、それぞれの動物特異的DNAに対して最も高感度で検出し得るプライマー対が含まれる。より好ましくは、コントロールとして、植物特異的DNA検出用プライマー対および魚類特異的DNA検出用プライマー対をさらに含む。 The primer pair of the present invention can be provided as an animal-derived component detection kit. This kit includes at least one primer pair of the above-mentioned primer pairs for animal-specific DNA detection. Preferably, among the above-mentioned primer pairs for detecting an animal-specific DNA, a primer pair that can be detected with the highest sensitivity for each animal-specific DNA is included. More preferably, a plant-specific DNA detection primer pair and a fish-specific DNA detection primer pair are further included as controls.
なお、以下に述べる実施例においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、あるいはその配列において1または2以上の塩基配列の置換、欠失、または挿入、および5’末端側に塩基の追加を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のDNAとハイブリダイズし得、特定の動物種を特異的に検出し得る配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。 In the examples described below, primer sequences are specified and shown, but the present invention is not intended to be limited to these examples. DNA of interest can be obtained by changing the hybridization conditions, including the primer sequence, or including substitution, deletion, or insertion of one or more base sequences in the sequence, and addition of a base at the 5 ′ end. It goes without saying that sequences that can hybridize with and specifically detect a particular animal species are also within the scope of the present invention.
(プライマーの合成)
反芻動物、ウシ、およびブタ由来DNA検出用プライマーについては、図1および図2に示す各種動物のatp8遺伝子のDNA配列のアラインメントに基づいて、以下の各実施例に用いるプライマー領域を選択した。また、魚類由来DNA検出用プライマーについては、図7に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。鶏由来DNA検出用プライマーについては、図8に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。選択した領域のDNA配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。
(Primer synthesis)
For the ruminant, bovine, and swine-derived DNA detection primers, the primer regions used in the following examples were selected based on the alignment of the DNA sequences of the atp8 genes of various animals shown in FIG. 1 and FIG. As for fish-derived DNA detection primers, primer regions were selected based on the alignment of the atp8 gene of various animals shown in FIG. 7 and DNA sequences in the vicinity thereof. For primers for detecting chicken-derived DNA, primer regions were selected based on the alignment of the atp8 gene of various animals shown in FIG. The DNA sequence of the selected region was synthesized using an automatic DNA synthesizer.
(実施例1:反芻動物由来DNA配列の特異的検出)
ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ブタ、ウマ、ウサギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、エビ、およびアサリの15種類の肉試料から、ミトコンドリアDNAを以下のように調製した。各肉試料を10倍量の緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH 7.5)に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットであるmtDNAエキストラクターCTキット(和光純薬工業製)を用いてDNAを抽出した。
(Example 1: Specific detection of ruminant-derived DNA sequence)
Mitochondrial DNA was prepared from 15 different meat samples from cattle, sheep, goats, deer, pigs, horses, rabbits, whales, chickens, cod, salmon, sardines, crabs, shrimps, and clams as follows. Each meat sample is suspended in 10 times the amount of buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM EDTA, pH 7.5), crushed by a bead crushing method, and then a mtDNA extractor which is a commercially available tissue cell mitochondrial DNA extraction kit. DNA was extracted using a CT kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
それぞれのDNA試料を鋳型とし、Fpr-F(配列番号1)とFpr-R(配列番号2)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:反応緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%(W/V)ゼラチン);95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:50℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図3に示す。図中のMは分子量マーカーである。 Each DNA sample was used as a template, and PCR was performed using Fpr-F (SEQ ID NO: 1) and Fpr-R (SEQ ID NO: 2) as 5 ′ and 3 ′ primers, respectively. The PCR conditions were as follows: reaction buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin); after heat denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, Denaturation: 92 ° C., 30 seconds; Annealing: 50 ° C., 30 seconds; Elongation: 72 ° C., 30 seconds reaction was repeated 45 cycles, and finally reacted at 72 ° C. for 5 minutes. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis was performed, and ethidium bromide staining was performed to detect a PCR product (DNA fragment). The results are shown in FIG. M in the figure is a molecular weight marker.
図3から明らかなように、Fpr-F(配列番号1)およびFpr-R(配列番号2)をプライマーとして用いて、それぞれの動物由来のDNAを鋳型とするPCRにより、反芻動物であるウシ、ヒツジ、ヤギ、およびシカにおいてのみ、増幅されたDNA断片の生成が認められた(矢印のバンド位置)。すなわち、Fpr-FおよびFpr-Rをプライマー対とすることにより、種々の動物肉試料の中から、反芻動物由来のDNAのみを特異的に検出できることが示された。したがって、Fpr-FとFpr-Rとの組み合わせは、反芻動物に属する動物種を効率的かつ特異的に検出するプライマー対である。 As is clear from FIG. 3, by using PCR with Fpr-F (SEQ ID NO: 1) and Fpr-R (SEQ ID NO: 2) as primers and DNA derived from each animal as a template, a ruminant bovine, Only sheep, goats and deer produced amplified DNA fragments (arrow band positions). That is, it was shown that by using Fpr-F and Fpr-R as a primer pair, only ruminant-derived DNA can be specifically detected from various animal meat samples. Therefore, the combination of Fpr-F and Fpr-R is a primer pair that efficiently and specifically detects animal species belonging to ruminants.
なお、Fpr-F(配列番号1)およびFpr-R(配列番号2)において、rは、gとaとのミックスであり、kはgとtとのミックスである。すなわち、Fpr-FおよびFpr-R(は混合プライマーであるが、それぞれが単独で使用され得ることは当業者に明白である。 In Fpr-F (SEQ ID NO: 1) and Fpr-R (SEQ ID NO: 2), r is a mix of g and a, and k is a mix of g and t. That is, Fpr-F and Fpr-R (are mixed primers, but it will be apparent to those skilled in the art that each can be used alone.
(実施例2:ウシ由来DNA配列の特異的検出)
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、Fpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:55℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図4に示す。
(Example 2: Specific detection of bovine-derived DNA sequence)
15 types of DNA samples prepared in the same manner as in Example 1 were used as templates, and Fpc-F (SEQ ID NO: 3) and Fpc-R (SEQ ID NO: 4) were used as 5 ′ and 3 ′ primers, respectively. PCR was performed. PCR conditions are as follows: after denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, denaturation: 92 ° C., 30 seconds; annealing: 55 ° C., 30 seconds; extension: 72 ° C., 30 seconds, repeated 45 cycles Finally, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis was performed, and ethidium bromide staining was performed to detect a PCR product (DNA fragment). The results are shown in FIG.
図4は、Fpc-F(配列番号3)およびFpc-R(配列番号4)をプライマーとして用いて、それぞれの動物由来のDNAを鋳型とするPCRにより、ウシに由来するDNA断片からのみPCR産物が生成することが認められた(矢印のバンド位置)。一方、他の動物のDNAからは、PCR産物(DNA断片)は検出できなかった。すなわち、Fpc-FおよびFpc-Rをプライマー対とすることにより、種々の動物肉試料の中から、ウシ由来のDNAのみを特異的に検出できることが示された。したがって、Fpc-FとFpc-Rとの組み合わせは、ウシ由来の動物種を非常に特異的に検出するプライマー対である。 FIG. 4 shows PCR products only from DNA fragments derived from cattle by PCR using Fpc-F (SEQ ID NO: 3) and Fpc-R (SEQ ID NO: 4) as primers and DNA from each animal as a template. Was observed (arrow band position). On the other hand, PCR products (DNA fragments) could not be detected from the DNA of other animals. That is, it was shown that by using Fpc-F and Fpc-R as a primer pair, only bovine-derived DNA can be specifically detected from various animal meat samples. Therefore, the combination of Fpc-F and Fpc-R is a primer pair that very specifically detects bovine-derived animal species.
(実施例3:配合飼料中のウシ由来DNA配列の検出)
家畜用配合飼料(主成分:トウモロコシ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆油かす、なたね油かす)に所定の割合でウシ由来の肉骨粉(オーストラリア産)を混合した。得られた飼料を100mgとり、上記実施例1と同様に10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を用いてミトコンドリアDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、哺乳動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるanicon5(配列番号41)とanicon3(配列番号42)(特許文献1参照)、上記実施例1で用いた反芻動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpr-F(配列番号1)とFpr-R(配列番号2)、ならびに上記実施例2で用いたウシ由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを用いて、実施例1と同じ条件でPCRを行った。結果を図5に示す。0.01質量%の肉骨粉が含まれている場合でも、ウシ由来のDNA配列を検出できることが判明した。
(Example 3: Detection of a bovine-derived DNA sequence in a mixed feed)
Cattle-derived meat-and-bone meal (Australia) was mixed at a predetermined ratio with livestock blended feed (main components: corn, milo, gluten feed, bran, rice bran, soybean oil cake, rapeseed oil cake). 100 mg of the obtained feed was taken, suspended in a 10-fold amount of buffer solution as in Example 1 above, crushed by the bead crushing method, and then used with a commercially available tissue cell mitochondrial DNA extraction kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Mitochondrial DNA was extracted. Using this DNA as a template, anicon 5 (SEQ ID NO: 41) and anicon 3 (SEQ ID NO: 42) (see Patent Document 1), which are primer pairs that specifically detect a mammal-derived DNA sequence, the ruminant used in Example 1 above Primers that specifically detect Fpr-F (SEQ ID NO: 1) and Fpr-R (SEQ ID NO: 2), which are primer pairs that specifically detect derived DNA sequences, and bovine-derived DNA sequences used in Example 2 above PCR was performed under the same conditions as in Example 1 using a pair of Fpc-F (SEQ ID NO: 3) and Fpc-R (SEQ ID NO: 4). The results are shown in FIG. It was found that the bovine-derived DNA sequence can be detected even when 0.01% by mass of meat-and-bone meal is contained.
(実施例4:ブタ由来DNA配列の特異的検出)
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、pig5-3(配列番号5)とpig32-2(配列番号6)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:60℃、1分;伸長:72℃、1分の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図6に示す。
(Example 4: Specific detection of DNA sequence derived from pig)
15 types of DNA samples prepared in the same manner as in Example 1 were used as templates, and pig5-3 (SEQ ID NO: 5) and pig32-2 (SEQ ID NO: 6) were used as 5 ′ and 3 ′ primers, respectively. PCR was performed. PCR conditions are as follows: after denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, denaturation: 92 ° C., 30 seconds; annealing: 60 ° C., 1 minute; extension: 72 ° C., 1 minute reaction, repeated 45 cycles Finally, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis was performed, and ethidium bromide staining was performed to detect a PCR product (DNA fragment). The results are shown in FIG.
図6は、pig5-3(配列番号5)およびpig32-2(配列番号6)をプライマーとして用いて、それぞれの動物由来のDNAを鋳型とするPCRにより、ブタに由来するDNA断片からPCR産物が生成することが認められた(矢印のバンド位置)。一方、他の動物のDNAからは、PCR産物(DNA断片)は検出できなかった。すなわち、pig5-3およびpig32-2をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試料の中から、ブタ由来のDNAのみを特異的に検出できることが示された。したがって、pig5-3とpig32-2との組み合わせは、ブタ由来の動物種を非常に特異的に検出するプライマー対である。 FIG. 6 shows that PCR products were obtained from DNA fragments derived from pigs by PCR using pig5-3 (SEQ ID NO: 5) and pig32-2 (SEQ ID NO: 6) as primers and DNA derived from each animal as a template. It was observed that it was formed (arrow band position). On the other hand, PCR products (DNA fragments) could not be detected from the DNA of other animals. That is, it was shown that only pig-derived DNA can be specifically detected from various animal meat samples by using pig5-3 and pig32-2 as a primer pair. Therefore, the combination of pig5-3 and pig32-2 is a primer pair that very specifically detects animal species derived from pigs.
(実施例5:魚類由来DNA配列の特異的検出)
魚粉に使用される種々の魚類由来の成分を幅広く検出する目的で、図7に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図7には、例として、fish5(配列番号7)とfish3-1(配列番号15)ならびにFM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)の位置を二重下線で示す。
(Example 5: Specific detection of fish-derived DNA sequence)
For the purpose of widely detecting various fish-derived components used in fish meal, several primer regions were selected based on the alignment of the atp8 gene shown in FIG. 7 and the DNA sequence in the vicinity thereof. In FIG. 7, the positions of fish5 (SEQ ID NO: 7) and fish3-1 (SEQ ID NO: 15) and FM5 (SEQ ID NO: 12) and FM3 (SEQ ID NO: 25) are indicated by double underlines.
以下の表2に示す23種の動植物から、実施例1と同様に市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を用いて、ミトコンドリアDNAを調製した。このDNA溶液を鋳型とし、図7の配列アラインメントに基づいて選択した種々の5’側プライマーおよび3’側プライマーの組み合わせを用いて、PCRを行った。使用したプライマーは、以下の表1に示すとおりであった。 Mitochondrial DNA was prepared from 23 kinds of animals and plants shown in Table 2 below using a commercially available tissue cell mitochondrial DNA extraction kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in the same manner as in Example 1. Using this DNA solution as a template, PCR was performed using various combinations of 5'-side primers and 3'-side primers selected based on the sequence alignment of FIG. The primers used were as shown in Table 1 below.
PCRの条件は以下の通りである:反応緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%(W/V)ゼラチン);95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:50℃〜60℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。陽性コントロールでは、微粉砕したイワシの肉から上記実施例1と同様にして得たイワシ由来DNA溶液を鋳型として用いてPCR反応を行い、そして陰性コントロールでは、PCR反応液に鋳型DNAを加えないブランクでPCRを行った。 The PCR conditions were as follows: reaction buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin); after heat denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, Denaturation: 92 ° C., 30 seconds; Annealing: 50 ° C. to 60 ° C., 30 seconds; Elongation: 72 ° C., 30 seconds reaction was repeated 45 cycles, and finally the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis was performed, and ethidium bromide staining was performed to detect a PCR product (DNA fragment). In the positive control, a PCR reaction was performed using a sardine-derived DNA solution obtained from pulverized sardine meat in the same manner as in Example 1 above as a template, and in the negative control, a blank in which no template DNA was added to the PCR reaction solution. PCR was performed.
種々のプライマーの組み合わせにおいて最も良好なバンドを示したFM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)との組み合わせによる結果を、表2に示す。なお、表2の判定において、陰性コントロールでバンドが検出されず、陽性コントロールで目的のサイズのバンドが検出され、かつ試料において陽性コントロールで検出されたと同じサイズのバンドが検出された場合を、陽性とした。 Table 2 shows the results of the combination of FM5 (SEQ ID NO: 12) and FM3 (SEQ ID NO: 25) that showed the best band among various primer combinations. In addition, in the determination of Table 2, when no band was detected by the negative control, a band of the desired size was detected by the positive control, and a band of the same size as that detected by the positive control was detected in the sample, It was.
表2の判定の欄に示すように、アジ、イワシ、カタクチイワシ、カツオ、サケ、サバ、サンマ、スケソウダラ、ニジマス、およびマグロのDNA試料で、78bpの位置にバンドが検出された。一方、哺乳動物、ニワトリ、および植物のDNAでは、バンドは検出されなかった。したがって、FM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)とのプライマー対は、魚粉の製造に用いられることが多い主な魚種を共通に検出できることがわかった。 As shown in the judgment column of Table 2, a band was detected at a position of 78 bp in DNA samples of horse mackerel, sardine, anchovy, bonito, salmon, mackerel, saury, pollock, rainbow trout, and tuna. On the other hand, no band was detected in mammalian, chicken, and plant DNA. Therefore, it was found that the primer pair of FM5 (SEQ ID NO: 12) and FM3 (SEQ ID NO: 25) can commonly detect main fish species often used for fish meal production.
これとは別に、国内で流通している魚粉約100種について、上記と同様にミトコンドリアDNAを抽出して検査した結果、9割以上の魚粉で目的の位置にバンドを検出することができた。このことからも、種々の魚類由来DNAについて幅広く検出可能なことがわかる。 Separately, as a result of extracting and examining mitochondrial DNA in the same manner as described above for about 100 kinds of fish meal distributed in Japan, it was possible to detect a band at a target position with 90% or more of fish meal. This also indicates that various fish-derived DNAs can be detected widely.
(実施例6:魚類由来DNA配列の添加実験および検出限界)
市販の牛飼育用の配合飼料およびチキンミールに混入した魚粉を検出できるかどうかについて検討した。使用した魚粉の原料は(1)サバおよびサンマ、(2)マグロおよびカツオ、ならびに(3)イワシであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。配合飼料としては、市販の牛用配合飼料を粉砕器および乳鉢で粉砕し、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。なお、配合飼料の配合割合は、以下の表3に示すとおりである。チキンミールは、市販のチキンミールであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。
(Example 6: Addition experiment and detection limit of fish-derived DNA sequence)
We investigated whether fish meal mixed in commercially available mixed feed for cattle breeding and chicken meal could be detected. The raw materials for the fish meal used were (1) mackerel and saury, (2) tuna and bonito, and (3) sardines, which passed through a 0.5 mm mesh screen. As the mixed feed, a commercially available mixed feed for cattle was pulverized with a pulverizer and a mortar and passed through a 0.5 mm mesh screen. The blending ratio of the blended feed is as shown in Table 3 below. The chicken meal was a commercially available chicken meal that passed through a 0.5 mm mesh screen.
上記の配合飼料またはチキンミール中に10、1、0.1、0.01、または0.001質量%の(1)〜(3)の魚粉を含む試料を調製した。これらの試料および無添加試料について、上記実施例5と同様にDNAを抽出し、FM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)とのプライマー対を用いてPCRを行った。 Samples containing 10, 1, 0.1, 0.01, or 0.001% by mass of (1) to (3) fish meal in the above-described mixed feed or chicken meal were prepared. For these samples and the additive-free sample, DNA was extracted in the same manner as in Example 5, and PCR was performed using a primer pair of FM5 (SEQ ID NO: 12) and FM3 (SEQ ID NO: 25).
魚粉を0.01〜0.001質量%含む配合飼料およびチキンミールにおいて、魚類由来のDNAが検出された。一方、無添加試料においては、DNAは検出されなかった。したがって、本実施例に使用した魚粉については、0.01〜0.001質量%の混入でも検出可能であることがわかった。 Fish-derived DNA was detected in the mixed feed and chicken meal containing 0.01 to 0.001% by mass of fish meal. On the other hand, no DNA was detected in the additive-free sample. Therefore, it was found that the fish meal used in this example can be detected even with a mixing of 0.01 to 0.001% by mass.
(実施例7:鶏由来DNA配列の特異的検出)
鶏由来の成分を幅広く検出する目的で、図8に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図8には、例として、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)の位置を二重下線で示す。
(Example 7: Specific detection of chicken-derived DNA sequence)
For the purpose of widely detecting chicken-derived components, several primer regions were selected based on the alignment of the atp8 gene shown in FIG. 8 and the DNA sequence in the vicinity thereof. In FIG. 8, as an example, the positions of chick5-1 (SEQ ID NO: 32) and chick3-1 (SEQ ID NO: 36) are indicated by double underlines.
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、種々の5’側および3’側プライマーの組み合わせを用いてPCRを行った。使用したプライマーは、5’側プライマーとしては、chick5-1(配列番号32)、chick5-2(配列番号33)、chick5-3(配列番号34)、およびchick51-3(配列番号35)を用い、3’側プライマーとしては、chick3-1(配列番号36)、chick3-2(配列番号37)、およびchick3-3(配列番号38)であった。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:55℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。 PCR was performed using 15 kinds of DNA samples prepared in the same manner as in Example 1 as templates and using various combinations of 5 'and 3' primers. As the 5 'primer, chick5-1 (SEQ ID NO: 32), chick5-2 (SEQ ID NO: 33), chick5-3 (SEQ ID NO: 34), and chick51-3 (SEQ ID NO: 35) were used as the 5' primer. The 3 ′ primers were chick3-1 (SEQ ID NO: 36), chick3-2 (SEQ ID NO: 37), and chick3-3 (SEQ ID NO: 38). PCR conditions are as follows: after denaturation at 95 ° C. for 9 minutes, denaturation: 92 ° C., 30 seconds; annealing: 55 ° C., 30 seconds; extension: 72 ° C., 30 seconds, repeated 45 cycles Finally, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis was performed, and ethidium bromide staining was performed to detect a PCR product (DNA fragment).
種々のプライマーの組み合わせにおいて、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)との組み合わせが最も良好なバンドを示した(図9)。 Among various primer combinations, the combination of chick5-1 (SEQ ID NO: 32) and chick3-1 (SEQ ID NO: 36) showed the best band (FIG. 9).
(実施例8:鶏由来DNA配列の添加実験および検出限界)
上記実施例6で用いた市販の牛飼育用の配合飼料中に、市販のチキンミールを10、1、0.1、0.01、または0.001質量%含む試料を調製した。これらの試料および無添加の試料について、上記実施例5と同様にDNAを抽出し、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)とのプライマー対を用いてPCRを行った。
(Example 8: Addition experiment and detection limit of chicken-derived DNA sequence)
A sample containing 10, 1, 0.1, 0.01, or 0.001% by mass of a commercially available chicken meal in the commercially available mixed feed for cattle breeding used in Example 6 was prepared. For these samples and the additive-free sample, DNA was extracted in the same manner as in Example 5, and PCR was performed using a primer pair of chick5-1 (SEQ ID NO: 32) and chick3-1 (SEQ ID NO: 36). .
チキンミールを0.01質量%含む配合飼料において、鶏由来のDNAが検出された。一方、無添加試料においては、DNAは検出されなかった。したがって、本実施例に使用したチキンミールについては、0.01質量%の混入でも検出可能であることがわかった。 Chicken-derived DNA was detected in a mixed feed containing 0.01% by weight of chicken meal. On the other hand, no DNA was detected in the additive-free sample. Therefore, it was found that the chicken meal used in this example can be detected even with a mixture of 0.01% by mass.
本発明の方法は、試料中に含まれる微量反芻動物由来DNA配列の高感度検出を可能にする。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合は、高感度で検出可能である。また、本発明の魚類特異的DNA検出用プライマーは、配合飼料などに混入した種々の魚種に由来する魚粉を幅広く検出するために有用である。さらに、本発明の鶏特異的DNA検出用プライマーは、配合飼料などに混入したチキンミールを検出するために有用である。 The method of the present invention allows highly sensitive detection of trace ruminant-derived DNA sequences contained in a sample. Therefore, for example, it is possible to identify the animal species of meat-and-bone meal slightly mixed in the feed. In particular, when a small amount of beef and bone meal is mixed in the livestock blended feed, it can be detected with high sensitivity. In addition, the fish-specific primer for detecting DNA of the present invention is useful for widely detecting fish meal derived from various fish species mixed in a mixed feed or the like. Furthermore, the primer for detecting chicken-specific DNA of the present invention is useful for detecting chicken meal mixed in a mixed feed or the like.
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