JP4844187B2 - Marker for determining renal function or for determining the effect or influence of an anticancer drug and determination method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーおよびそれを用いた判定方法に関する。更に詳細には、カルボニックアンヒドラーゼ II からなる腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーおよびそれを用いた腎機能または制癌剤の効果もしくは影響を判定する方法に関する。 The present invention relates to a marker for determining renal function or determining the effect or influence of an anticancer agent and a determination method using the same. More specifically, the present invention relates to a marker for determining renal function or an effect or influence of an anticancer agent comprising carbonic anhydrase II, and a method for determining the effect or influence of a renal function or an anticancer agent using the marker.
ほとんど全ての薬物は、本来の効能以外に副作用を有している。その副作用は、薬物が、最適な濃度を越えたり、目的としている場所、すなわち臓器以外に分布したり、必要ではない時間に存在したりすることなどにより引き起こされる。特に、制癌剤は、現在臨床使用されているものは、ほとんどが細胞を殺傷する作用を有しており、目的とする場所、すなわち癌細胞以外の場所では、正常な組織をむしばむ毒となる。このことが、癌化学療法の発展の大きな妨げになっている。しかしながら、癌という重大な病であるが故に、副作用をもつ制癌剤でもやむを得ず臨床使用されているという現実がある。制癌剤には副作用はつきものであり、食欲減退や吐気・嘔吐、下痢などが出現したり、制癌剤が血液をつくる骨髄の機能を抑制し白血球が減少したりすることも少なくない。また、肝機能や腎機能障害をきたす場合もある。従って、制癌剤の効果判定が重要であるだけではなく、患者への影響を鋭敏に知ることもまた必要な条件となる。 Almost all drugs have side effects in addition to their original efficacy. The side effects are caused by the fact that the drug exceeds the optimal concentration, is distributed outside the intended location, i.e., other than the organ, or exists at a time when it is not necessary. In particular, most of the anticancer agents currently in clinical use have an action of killing cells, and become poisons that injure normal tissues in the intended place, that is, places other than cancer cells. This has been a major impediment to the development of cancer chemotherapy. However, since it is a serious disease called cancer, there is a reality that even anticancer drugs having side effects are unavoidably used clinically. Anticancer drugs are associated with side effects, such as decreased appetite, nausea / vomiting, and diarrhea, and the anticancer drugs often suppress the function of the bone marrow that produces blood and reduce white blood cells. In addition, liver function and kidney function may be impaired. Therefore, not only is it important to determine the effects of anticancer drugs, but it is also a necessary condition to know the influence on the patient sensitively.
これまでは制癌剤などの強い薬剤を投与した場合、肝機能、腎機能を調べるために、主に血清中 GOT、血清中 GPT、血清中γ-GTP、血清中クレアチニン、BUN などを測定してその影響を検査していた。特に、経過時間ごとの血清中クレアチニン濃度の定性的および定量的な判定は、腎機能検査領域において重要な役割を果たしてきた（非特許文献１および２）。今日では、血清中クレアチニン濃度の血清学的判定は、制癌剤の影響を判定する数少ない現在受け入れられている非侵襲性の方法である。しかし、血清中クレアチニンの測定は有用性において限られたものである。というのは、それは尿細管の激しい破壊を診断するためのものであって、予知するためのものではないからである。事実、メソトレキセート・ロイコボリン救援療法では、約 85％の患者はクレアチニン値上昇を示さない（非特許文献３）。また、腎障害の発現頻度をみると血清中クレアチニンは感度が高くないため腎疾患が軽微な場合では変化がなく情報が十分とはいえなかった。
従って、腎機能への負荷の予知および診断の両方に使用できるアッセイ、あるいは制癌剤の効果または影響を判定できるアッセイを提供することによる、当該技術を強化および進歩させるような方法が必要とされている。
In the past, when strong drugs such as anticancer drugs were administered, in order to investigate liver function and renal function, mainly serum GOT, serum GPT, serum γ-GTP, serum creatinine, BUN, etc. were measured. The effect was being examined. In particular, qualitative and quantitative determination of serum creatinine concentration for each elapsed time has played an important role in the renal function test region (Non-patent Documents 1 and 2). Today, serological determination of serum creatinine concentration is one of the few currently accepted non-invasive methods for determining the effects of anticancer drugs. However, the measurement of serum creatinine is limited in usefulness. Because it is for diagnosing severe destruction of the tubule, not for prediction. In fact, about 85% of patients do not show increased creatinine levels with methotrexate / leucovorin rescue therapy (Non-patent Document 3). In addition, regarding the incidence of renal damage, serum creatinine was not sensitive, so there was no change and information was not sufficient when kidney disease was mild.
Accordingly, there is a need for a method that enhances and advances the art by providing assays that can be used both for predicting and diagnosing the burden on renal function, or for determining the effects or effects of anti-cancer agents. .
従って、本発明の課題は、腎機能を正確に判定するための、または制癌剤の効果もしくは影響を正確に判定するための新たなマーカーを提供することにある。更に、本発明の課題は、該マーカーを用いた腎機能の判定方法または制癌剤の効果もしくは影響の判定方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a new marker for accurately determining renal function or for accurately determining the effect or influence of an anticancer drug. Furthermore, the subject of this invention is providing the determination method of the renal function using this marker, or the determination method of the effect or influence of an anticancer agent.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、二酸化炭素やアルデヒドの水和反応を触媒する酵素として知られているカルボニックアンヒドラーゼ II が、腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of earnest research to solve the above problems, the present inventor has found that carbonic anhydrase II, which is known as an enzyme that catalyzes the hydration reaction of carbon dioxide and aldehyde, is effective for determining renal function or anticancer agent The present invention has been completed by finding out that it can be an influence determination marker.
すなわち、本発明は、カルボニックアンヒドラーゼ II からなる腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーに関する。
更に本発明は、検体中のカルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定し、そのレベルから腎機能または制癌剤の効果もしくは影響を判定する方法に関する。
That is, the present invention relates to a marker for determining renal function or determining the effect or influence of an anticancer agent comprising carbonic anhydrase II.
Furthermore, the present invention relates to a method for measuring the level of carbonic anhydrase II in a specimen and determining the effect or influence of renal function or anticancer agent from the level.
カルボニックアンヒドラーゼ II を腎機能判定用マーカーとして使用することにより、早期にしかも軽微に障害が起こった場合でも、腎機能の良否を判断することができる。その結果、例えば、反復投与が必要な制癌剤であって腎機能を低下させる制癌剤を投与された患者が、再度、投与できる状態まで腎機能が回復しているかどうかを迅速に判断することができ、制癌剤治療を極めて有効に実施することができる。また、カルボニックアンヒドラーゼ II を制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーとして使用することにより、制癌剤の投与コントロールを有効に行うことができる。 By using carbonic anhydrase II as a marker for determining renal function, it is possible to determine whether the renal function is good or not even when a disorder occurs early and slightly. As a result, for example, a patient who has been administered an anticancer drug that requires repeated administration and lowers renal function can quickly determine whether the renal function has been restored to a state where it can be administered again, Anticancer drug treatment can be carried out very effectively. In addition, by using carbonic anhydrase II as a marker for determining the effect or influence of a cancer drug, administration control of the cancer drug can be effectively performed.
本発明において、腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーとして用いるカルボニックアンヒドラーゼ II (Carbonic Anhydrase II ：EC4.2.1.1）は、炭酸脱水酵素であって、炭酸デヒドラターゼ（Carbonate dehydrate）とも呼ばれ、配列表の配列番号１で示すアミノ酸配列を有し、理論分子量 29,213Da の蛋白質であり、赤血球などに多く存在して、下記の反応を行う酵素である。
本発明者の研究により、腎機能を低下させる作用を有することが知られている制癌剤であるメソトレキセートを投与した患者の尿から、カルボニックアンヒドラーゼ II が検出され、他方、メソトレキセート投与前には、カルボニックアンヒドラーゼは検出されないこと、また、メソトレキセート投与を止めるとそれ以降のカルボニックアンヒドラーゼ II の検出レベルが上昇しないか、あるいは低下することなどから、カルボニックアンヒドラーゼ II は、腎機能を判定するためのマーカーとなること、また、制癌剤の効果もしくは影響を判定するためのマーカーとなることが明らかになった。
In the present invention, Carbonic Anhydrase II (Carbonic Anhydrase II: EC4.2.1.1) used as a marker for determining renal function or determining the effect or influence of an anticancer agent is a carbonic anhydrase, which is a carbonic anhydrase (Carbonate dehydrate). It is also called the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, having a theoretical molecular weight of 29,213 Da, and abundantly present in erythrocytes and the like and performing the following reaction.
According to the study of the present inventor, carbonic anhydrase II was detected from the urine of a patient who was administered methotrexate, which is an anticancer drug known to have an action of reducing renal function, while before administration of methotrexate, Because carbonic anhydrase is not detected, and the detection level of carbonic anhydrase II does not increase or decrease after stopping methotrexate, carbonic anhydrase II determines renal function. It became clear that it becomes a marker for determining the effect or influence of an anticancer drug.
従って、患者から採取した検体中のカルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定することにより、患者の腎機能を判定することができ、また、制癌剤を投与している患者の検体中のカルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定することにより、制癌剤の効果もしくは影響を判定することができる。例えば、患者から採取した検体中にカルボニックアンヒドラーゼ II が検出された場合、あるいはカルボニックアンヒドラーゼ II のレベルが高い場合には、患者の腎機能が低下しており、また、制癌剤による腎機能の影響が強いこと、制癌剤による副作用の効果が強いなどの判定を行うことができる。
この判定方法は、特に、制癌剤投与後の腎機能を判定するのに適しており、また、腎機能を低下させる制癌剤の効果または影響を判定するのに適している。従って、例えば、反復投与が必要な制癌剤を投与された患者の検体中のカルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定し、そのレベルから腎機能のレベルを検出し、再度、制癌剤を投与すべきかどうかを判断するのに適している。
Therefore, by measuring the level of carbonic anhydrase II in the sample collected from the patient, the renal function of the patient can be determined, and the carbonic anhydrase in the sample of the patient receiving the anticancer drug. By measuring the level of II, the effect or influence of an anticancer drug can be determined. For example, if carbonic anhydrase II is detected in a sample collected from a patient, or if the level of carbonic anhydrase II is high, the patient's renal function is reduced, and renal function by anticancer drugs is also reduced. It is possible to make a determination that the influence of the drug is strong or that the side effect of the anticancer drug is strong.
This determination method is particularly suitable for determining the renal function after administration of the anticancer drug, and is also suitable for determining the effect or influence of the anticancer drug that lowers the renal function. Thus, for example, by measuring the level of carbonic anhydrase II in a sample of a patient who has been administered an anticancer drug that requires repeated administration, the level of renal function is detected from that level, and whether or not the anticancer drug should be administered again. Suitable for judging.
このような制癌剤としては、例えば、メソトレキセート（methotrexate）、マイトマイシンC（mitomycin)、アドリアマイシン（adriamycin)、ファルモルビシン（epirubicin)、ピノルビン（pirarubicin）、ランダ（cisplatin）、5-FU(FU, 5-FU)、フトラフール（tegafur）、ユーエフティ（UFT)、ミフロール（carmofur)、フルツロン（doxifluridine)、ティーエスワン（TS-1)、トポテシン（irinotecan)、タキソテール（docetaxel)、ロイコボリン（leucovorin)などを挙げることができる。なかでも、本発明の判定方法は、特にメソトレキセート投与後の腎機能の判定、あるメソトレキセートの効果または影響を判定するのに適しており、とりわけ、メソトレキセートとロイコボリンとを併用するメソトレキセート・ロイコボリン救援療法（HakellCM: Cancer treatment, W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 53-123, 1980)における腎機能の判定あるいは制癌剤の効果または影響の判定に適している。 Examples of such anticancer agents include methotrexate, mitomycin C (mitomycin), adriamycin, farmorubicin (epirubicin), pinorbin (pirarubicin), landa (cisplatin), 5-FU (FU, 5-FU) , Fturafur, UFT, Umo, carmofur, doxifluridine, TS-1, topotecin, irinotecan, docetaxel, leucovorin . Among them, the determination method of the present invention is particularly suitable for determination of renal function after administration of methotrexate, and determination of the effect or influence of a certain methotrexate. HakellCM: Cancer treatment, WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 53-123, 1980), which is suitable for the determination of renal function or the effect or influence of anticancer drugs.
本発明の判定方法で用いる検体としては、例えば、患者から採取した尿、血液、血清などが挙げられ、検体としては、特に尿が好ましい。
カルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定する方法としては、例えば、電気泳動法、免疫学的測定法、生化学的方法等がある。
カルボニックアンヒドラーゼ II を電気泳動法で測定するときには、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法はアクリルアミドと呼ばれる化合物で出来たゲル（寒天のような篩い構造のもの）中に蛋白質を通過させる（泳動させる）ことで、一定時間での移動度とタンパク質を構成するアミノ酸の数（別に分子量で表現する）が比例することから、蛋白質を分類する方法である。そのほかにもセルロース・アセテートを支持体としたものなどがある。蛋白質の染色にはクマシー・ブリリアント・ブルー、ポンソーS染色、アミドブラック染色、直接酵素活性を利用する方法などがある。例えば一定量の尿サンプル（20μＬ）と一般的なサンプルバッファーを一定の割合で 1：1 で混合し、加熱処理する。一般的には沸騰水中で５分程度処理される。その後サンプルをゲルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳動は低電流で流すことがよい結果につながる。一般的には５〜１００ｍＡ程度である。電気泳動後に上記試薬にて染色を行い酢酸、メタノール、水混合液よりなる脱色液にて処理するとカルボニックアンヒドラーゼ II のバンドが確認できるが、そのバンドの強弱により、カルボニックアンヒドラーゼ II のレベルを測定できる。
Examples of the specimen used in the determination method of the present invention include urine, blood and serum collected from a patient, and urine is particularly preferable as the specimen.
Examples of methods for measuring the level of carbonic anhydrase II include electrophoresis, immunoassay, biochemical methods, and the like.
When measuring carbonic anhydrase II by electrophoresis, the SDS-PAGE method is generally used. The SDS-PAGE method allows the protein to pass (migrate) through a gel made of a compound called acrylamide (with a sieve structure like agar), so that the mobility in a certain time and the number of amino acids constituting the protein This is a method for classifying proteins because (respectively expressed by molecular weight) is proportional. In addition, there are those using cellulose acetate as a support. Protein staining includes Coomassie brilliant blue, Ponceau S staining, amide black staining, and a method using direct enzyme activity. For example, a certain amount of urine sample (20 μL) and general sample buffer are mixed at a fixed ratio of 1: 1 and heat-treated. Generally, it is treated in boiling water for about 5 minutes. The sample is then applied to the gel. Polyacrylamide electrophoresis leads to good results when it is run at a low current. Generally, it is about 5 to 100 mA. After staining with the above reagent and treatment with a decolorizing solution consisting of acetic acid, methanol, and water, a band of carbonic anhydrase II can be confirmed, but the level of carbonic anhydrase II depends on the strength of the band. Can be measured.
また、ウエスタンブロッティング法による検出も有効である。すなわち、電気泳動をしたゲルをニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜等の膜に転写し、次いで、1次抗体である抗ヒトカルボニックアンヒドラーゼＩＩ 抗体、さらに、２次標識抗体であるＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを反応させ、次いで、ＨＲＰ発色試薬（Wako）で発色させ、ヒトカルボニックアンヒドラーゼ II に相当するバンドの発色度合いにより、カルボニックアンヒドラーゼ II を測定することができる。 Detection by Western blotting is also effective. That is, the electrophoresed gel is transferred to a membrane such as a nitrocellulose membrane or a PVDF membrane, then the primary antibody is anti-human carbonic anhydrase II antibody, and further, the secondary labeled antibody is HRP-labeled anti-rabbit IgG. Then, the color is developed with an HRP coloring reagent (Wako), and carbonic anhydrase II can be measured based on the degree of color development of the band corresponding to human carbonic anhydrase II.
カルボニックアンヒドラーゼ II を免疫学的に測定するときには、ＴＩＡ法、ＬＡＴＥＸ法などの免疫凝集法の他に、汎用的なＥＩＡ法などを用いることができる。また免疫法によって酵素を補足した後に酵素活性を用いて発色させる免疫酵素補足法も利用できる。具体的に免疫酵素補足法としては抗マウスイムノグロブリン抗体をマイクロタイタープレートにまき、ここに融合細胞培養上清を加えて反応させ、更に精製カルボニックアンヒドラーゼＩＩを加えて活性酵素を結合させて免疫複合体を作製し、この結合酵素活性を４−フェニルリン酸のような発色基質を利用して活性測定することもできる。 When measuring carbonic anhydrase II immunologically, a general-purpose EIA method or the like can be used in addition to immunoaggregation methods such as TIA method and LATEX method. Further, an immunoenzyme supplementing method in which an enzyme is supplemented by an immunization method and then colored using an enzyme activity can be used. Specifically, as an immunoenzyme supplementation method, an anti-mouse immunoglobulin antibody is spread on a microtiter plate, a fusion cell culture supernatant is added and reacted therewith, and further purified carbonic anhydrase II is added to bind an active enzyme. It is also possible to prepare an immune complex and measure the activity of this bound enzyme using a chromogenic substrate such as 4-phenyl phosphate.
ポリまたはモノクローナル抗体を一次抗体として使用し、尿検体中のカルボニックアンヒドラーゼ II をサンドイッチ法により蛋白質量として精密測定することでも可能である。具体的に以下に記述する。はじめにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接、または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して本発明によるモノクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であることが好ましい。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したポリまたはモノクローナル抗体にヒトカルボニックアンヒドラーゼ II を測定する検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し酵素標識または発色物質や放射性物質をラベルした二次抗体を加え反応させる。更に洗浄し標識酵素の基質溶液を加え、一定時間反応させる。発色試薬にはＨＲＰ標識の場合、既知のＴＭＢ、ＯＰＤなどを用いることができる。 It is also possible to use a poly or monoclonal antibody as a primary antibody and precisely measure carbonic anhydrase II in a urine sample as a protein amount by the sandwich method. Specifically described below. First, the monoclonal antibody according to the present invention is bound directly or indirectly to a solid phase known per se such as polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, polymethacrylate or the like by using physical bonds, chemical bonds, or affinity. The amount of sensitizing antibody is preferably in the range of 1 ng to 100 mg / ml. A sample for measuring human carbonic anhydrase II is added to and reacted with a poly or monoclonal antibody bound to a solid phase by physical binding, chemical binding, affinity, or the like. After reacting for a certain period of time, the solid phase is washed and a secondary antibody labeled with an enzyme label or a coloring substance or radioactive substance is added and reacted. Further washing, adding a substrate solution of the labeled enzyme, and allowing to react for a certain time. In the case of HRP labeling, known TMB, OPD and the like can be used as the color developing reagent.
カルボニックアンヒドラーゼ II を生化学的方法で測定するには、ｐＨ法、エステラーゼ活性測定法等のようにカルボニックアンヒドラーゼを測定する方法であれば、特に限定されない。ｐＨ法の場合、検体中のカルボニックアンヒドラーゼＩＩを緩衝液で希釈し、飽和二酸化炭素溶液を加え、ｐＨ８．２から６．８までに係る秒数を求め、その秒数からｕｎｉｔを計算する方法である。また、エステラーゼ活性測定法とは、ｐ−ニトロフェニル酢酸溶液を基質として用い、吸光度変化をみる方法である。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例何ら限定されるものではない。
The method for measuring carbonic anhydrase II by a biochemical method is not particularly limited as long as it is a method for measuring carbonic anhydrase, such as a pH method and an esterase activity measurement method. In the case of the pH method, carbonic anhydrase II in the sample is diluted with a buffer solution, a saturated carbon dioxide solution is added, the number of seconds from pH 8.2 to 6.8 is obtained, and the unit is calculated from the number of seconds. Is the method. In addition, the esterase activity measurement method is a method in which a change in absorbance is observed using a p-nitrophenylacetic acid solution as a substrate.
Examples The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１
メソトレキセート投与患者が排出した尿に存在
するカルボニックアンヒドラーゼ II の同定
１）ペプチド・マス・フィンガープリンティング法による同定
大腿骨骨肉腫にメソトレキセート大量療法が施行された際、経時的に採取された尿をサンプルとして、尿タンパクのSDS-PAGE（5/20％）を調べたところ、アルブミンのほかに分子量約 30ｋDa のシャープなバンドが観測された。アルブミンの他に発見された、分子量が約 30ｋDa のシャープなバンドをゲルより切り出して、ペプチド・マス・フィンガープリンティング法（peptide mass finger printing: PMF）により、蛋白質の同定を行った。つまり、切り出したゲルに対してトリプシンによる In gel digestion 操作を行った後、得られたバンド由来の抽出液を、MALDI-TOF 質量分析計に付して切断したペプチドの N-端アミノ酸解析（株式会社アプロサイエンス）を行なった。切断したペプチドと分子量によるＭＳ−Ｆｉｔサーチ（http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm）の結果から、バンド由来の蛋白質は、カルボニックアンヒドラーゼ II （carbonic anhydrase II）であることが確認された。図１に解析結果を示す。なお、図１で、四角に囲っている部分は、トリプシンにより切断されたペプチドでカルボニックアンヒドラーゼ II と一致した部分を表している。
Example 1
Present in urine excreted by methotrexate patients
Identification of carbonic anhydrase II 1) Identification by peptide mass fingerprinting SDS-PAGE of urinary protein using urine collected over time when high-dose methotrexate was administered to femoral osteosarcoma When (5/20%) was examined, a sharp band with a molecular weight of about 30 kDa was observed in addition to albumin. In addition to albumin, a sharp band having a molecular weight of about 30 kDa, which was discovered, was cut out from the gel, and the protein was identified by peptide mass finger printing (PMF). In other words, after performing an in gel digestion operation with trypsin on the excised gel, the obtained extract derived from the band was subjected to N-terminal amino acid analysis of the peptide cleaved by applying it to a MALDI-TOF mass spectrometer (stock) Company Apro Science). From the results of MS-Fit search (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm) based on the cleaved peptide and molecular weight, the protein derived from the band is carbonic anhydrase II (carbonic anhydrase II). It was confirmed that there was. FIG. 1 shows the analysis results. In FIG. 1, the part surrounded by a square represents a part of the peptide cleaved with trypsin that coincides with carbonic anhydrase II.
２）ウエスタンブロッティングによる同定
次に、ウエスタンブロッティングでカルボニックアンヒドラーゼ II であることを確認した。以下、簡単に方法を述べる。
前記した経時的尿サンプルを電気泳動して PVDF 膜に転写した。転写後の膜はブロックエース溶液（大日本製薬）で 4℃、一晩ブロッキングした。0.05％ Tween 20 を含む PBS 洗浄液（以下洗浄液）で膜を 3 回洗浄し、1 次抗体である抗ヒトカルボニックアンヒドラーゼ II（Code：100-401-136 Rockland、USA）を反応させた。室温で 1 時間反応させた後洗浄液で膜を 3 回洗って、2 次標識抗体である HRP 標識抗ウサギ IgG を反応させた。反応終了後、洗浄液で 3 回洗って HRP 発色試薬（Wako）を加え、発色後水道水で洗浄して結果を確認した。するとウエスタンブロッティングで分子量約 30,000 のバンドが特異的に発色し、このバンドがカルボニックアンヒドラーゼ II であることが確認された（図２）。
以上のことより、このバンドは、カルボニックアンヒドラーゼ II であることが確認された。
2) Identification by Western blotting Next, it was confirmed by Western blotting that it was carbonic anhydrase II. The method will be briefly described below.
The chronological urine sample described above was electrophoresed and transferred to a PVDF membrane. The transferred membrane was blocked overnight with Block Ace solution (Dainippon Pharmaceutical) at 4 ° C. The membrane was washed three times with PBS washing solution (hereinafter referred to as washing solution) containing 0.05% Tween 20, and reacted with anti-human carbonic anhydrase II (Code: 100-401-136 Rockland, USA) as the primary antibody. After reacting at room temperature for 1 hour, the membrane was washed three times with a washing solution to react with HRP-labeled anti-rabbit IgG, which is a secondary labeled antibody. After completion of the reaction, the plate was washed 3 times with a washing solution, HRP coloring reagent (Wako) was added, and the color was washed with tap water after color development to confirm the result. Then, Western blotting revealed that a band with a molecular weight of about 30,000 was specifically developed, and this band was confirmed to be carbonic anhydrase II (FIG. 2).
From the above, this band was confirmed to be carbonic anhydrase II.
実施例２
尿中のカルボニックアンヒドラーゼ II の経時変化
メソトレキセート・ロイコボリン救援療法が開始された大腿骨骨肉腫患者２人の尿中カルボニックアンヒドラーゼＩＩのレベルを電気泳動法により、４日間、測定した。また、典型的な腎機能マーカーも同時に測定して比較した。メソトレキセート・ロイコボリン救援療法では、メソトレキセートは 100mg/kg 体重を 5時間点滴投与で行った。ロイコボリンは 10mg/ m2 をメソトレキセート投与終了 24 時間後に静脈投与し、以後 6 時間ごとに経口投与を継続した。
カルボニックアンヒドラーゼ II は、以下のようにして測定した。まず、一定量の尿サンプル（20μＬ）とサンプルバッファーを 1：1 で混合し、沸騰水中で5 分程度加熱処理された。その後、サンプルをポリアクリルアミドゲルにアプライし、SDS-PAGE 法による電気泳動を行った。ついで、そのゲルを PVDF 膜に転写した。転写後の膜はブロックエース溶液（大日本製薬）で 4℃、一晩ブロッキングした。0.05％ Tween 20 を含む PBS 洗浄液（以下洗浄液）で膜を 3 回洗浄し、1 次抗体である抗ヒトカルボニックアンヒドラーゼ II（Code：100-401-136 Rockland、USA）を反応させた。室温で 1 時間反応させた後洗浄液で膜を 3 回洗って、2 次標識抗体である HRP 標識抗ウサギ IgG を反応させた。反応終了後、洗浄液で 3 回洗って HRP 発色試薬（Wako）を加え、発色後水道水で洗浄して結果を確認した。
判定方法としては、分子量３万のバンドの強さを下記の基準で判定した。
− ： 陰性
± ： 弱陽性
＋ ： 陽性
＋＋ ： 強陽性
Example 2
Time course of urinary carbonic anhydrase II The level of urinary carbonic anhydrase II was measured by electrophoresis for 2 days in two femoral osteosarcoma patients who had started methotrexate leucovorin rescue therapy. In addition, typical renal function markers were measured and compared at the same time. For methotrexate and leucovorin rescue therapy, methotrexate was administered at a dose of 100 mg / kg body weight for 5 hours. Leucovorin was intravenously administered at 10 mg / m 2 24 hours after the completion of methotrexate administration, and oral administration was continued every 6 hours thereafter.
Carbonic anhydrase II was measured as follows. First, a certain amount of urine sample (20 μL) and sample buffer were mixed at a ratio of 1: 1, and heat-treated in boiling water for about 5 minutes. Thereafter, the sample was applied to a polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis by SDS-PAGE. The gel was then transferred to a PVDF membrane. The transferred membrane was blocked overnight with Block Ace solution (Dainippon Pharmaceutical) at 4 ° C. The membrane was washed three times with PBS washing solution (hereinafter referred to as washing solution) containing 0.05% Tween 20, and reacted with anti-human carbonic anhydrase II (Code: 100-401-136 Rockland, USA) as the primary antibody. After reacting at room temperature for 1 hour, the membrane was washed three times with a washing solution to react with HRP-labeled anti-rabbit IgG, which is a secondary labeled antibody. After completion of the reaction, the plate was washed 3 times with a washing solution, HRP coloring reagent (Wako) was added, and the color was washed with tap water after color development to confirm the result.
As a determination method, the intensity of a band having a molecular weight of 30,000 was determined according to the following criteria.
-: Negative ±: Weak positive +: Positive ++: Strong positive
結果を表１および表２に示す。表１および表２の結果から、メソトレキセート投与前の患者や健常人の検体では、カルボニックアンヒドラーゼ II は、ほとんど検出されないにもかかわらず、メソトレキセートを投与すると、いずれの患者の検体からもカルボニックアンヒドラーゼ II が検出された。一方、腎機能検査である血清クレアチニン、BUN はほとんど変動がみられなかった。またアルブミンは、メソトレキセート投与後、3〜5時間で強く検出されることもあるが、検体によっては、ほとんど陰性になった。
メソトレキセートを投与すると腎機能が低下することは、知られているにもかかわらず、従来の腎機能マーカーでは、モニターすることができなかった。最も有効と思われるクレアチニンも、メソトレキサート投与で約 85％の患者は、クレアチニン値が上昇しないといわれている。以上のことより、カルボニックアンヒドラーゼ II は、従来にない、鋭敏に腎機能をモニターできることが明らかになった。また、カルボニックアンヒドラーゼ II は、制癌剤の効果または影響をモニターできることも明らかになった。
The results are shown in Tables 1 and 2. From the results shown in Tables 1 and 2, carbonic anhydrase II was hardly detected in the samples of patients and healthy subjects before administration of methotrexate. Hydrase II was detected. On the other hand, serum creatinine and BUN, which are renal function tests, showed almost no change. Albumin may be strongly detected 3 to 5 hours after methotrexate administration, but it was almost negative depending on the sample.
Although it has been known that administration of methotrexate reduces renal function, conventional renal function markers cannot be monitored. Creatinine, which seems to be the most effective, is said to not increase creatinine levels in about 85% of patients treated with methotrexate. From the above, it has been clarified that Carbonic Anhydrase II can monitor renal function with sensitivity, which has never been seen before. Carbonic anhydrase II has also been shown to be able to monitor the effects or effects of anticancer drugs.
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