JP4833430B2

JP4833430B2 - Nitrogen oxide production inhibitor

Info

Publication number: JP4833430B2
Application number: JP2001126160A
Authority: JP
Inventors: 誠佐熊; 聡宮内; 教尚藤井
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: JP2002322089A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンドロイチナーゼの新規な用途に関する。より詳細には、コンドロイチナーゼを含有する窒素酸化物産生抑制剤、細胞・組織障害の防止又は抑制剤、および抗炎症剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」ともいう）の分解を触媒する酵素である。コンドロイチナーゼには種々の種類が知られており、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」ともいう）の分解を弱く触媒する酵素である。
【０００３】
一方、椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して突出した髄核を融解して椎間板ヘルニアを治療する方法が試みられている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕。
【０００４】
Ｓｐｉｎｅ（１９９７年）第２２巻、第１０６５−１０７３頁には、椎間板の変性やヘルニアに一酸化窒素（ＮＯ）が関与している旨が記載されている。ＮＯは炎症のメディエーターの一種であり、細胞・組織の障害に関与することが知られている。
【０００５】
しかしコンドロイチナーゼが窒素酸化物の産生を抑制すること等については知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コンドロイチナーゼ、特にコンドロイチナーゼＡＢＣの新規な用途、具体的には、窒素酸化物に起因する細胞・組織障害を防止ないし抑制する作用、又は抗炎症作用を利用した医薬を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コンドロイチナーゼを含有する窒素酸化物産生抑制剤（以下、「本発明抑制剤」ともいう）、本発明抑制剤からなる医薬（以下、「本発明医薬」ともいう）、コンドロイチナーゼを含有する細胞・組織障害の防止又は抑制剤（以下、「本発明防止剤」ともいう）およびコンドロイチナーゼを含有する抗炎症剤（以下、「本発明抗炎症剤」ともいう）を提供するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）コンドロイチナーゼを含有する、窒素酸化物産生抑制剤。
（２）コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＡＢＣである、（１）に記載の抑制剤。
（３）（１）又は（２）に記載の抑制剤からなる医薬。
（４）椎間板または脊髄硬膜外腔投与用の（３）に記載の医薬。
（５）コンドロイチナーゼを含有する、細胞・組織障害の防止又は抑制剤。
（６）コンドロイチナーゼを含有する、抗炎症剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
＜1＞本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼ
本発明抑制剤に用いることができるコンドロイチナーゼは、ＣＳを分解する酵素である限りにおいて特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki,J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol.Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P.Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997))等のコンドロイチナーゼも、本発明抑制剤に用いることができる。
【００１０】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明抑制剤で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明抑制剤において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの組み合わせであってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１１】
本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００１２】
ここでコンドロイチナーゼの由来とは、当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝子を元来保有する生物を起源とすることをいう。従って、例えばProteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣとは、Proteus vulgarisが元来保有する遺伝子によって産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣを意味する。よって、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣには、Proteus vulgaris自体により産生されるものはもちろん、Proteus vulgarisから取得されたコンドロイチナーゼＡＢＣ遺伝子を利用して他の細胞で産生させたもの等も含まれる。
【００１３】
本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼの純度は特に限定されず、使用の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明抑制剤を後述の「本発明医薬」とする場合や、「本発明防止剤」または「本発明抗炎症剤」とする場合には、用いるコンドロイチナーゼは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。
【００１４】
例えば本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼは、300U/mg蛋白以上の比活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の比活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００１５】
なお、本明細書においてコンドロイチナーゼの１Ｕ(単位)は、至適ｐＨおよび至適温度付近の条件において、ＣＳから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種コンドロイチナーゼの１Ｕの定義を示す。
【００１６】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１７】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来)の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１８】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００１９】
例えば、比活性が300U/mg蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、本発明抑制剤を本発明医薬（後述）として生体内に投与した際にも目的部位のプロテオグリカン（ＣＳやＨＡを含む）を効率的に分解することができ、かつ、窒素酸化物産生を効果的に抑制することができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００２０】
＜２＞本発明抑制剤の形態等
本発明抑制剤は、上記のようなコンドロイチナーゼを、窒素酸化物の産生を抑制するために有効な量含有する。ここで「窒素酸化物の産生を抑制するために有効な量」とは、窒素酸化物の産生の抑制を検知可能な程度とすることができる量を意味する。この量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、窒素酸化物産生の抑制を企図する細胞や組織等（以下、単に「組織等」という）の種類や状態、組織等が由来する哺乳動物の種類や症状等によっても異なるものであり、当業者が適宜決定することができるが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、健常なウサギから摘出した椎間板組織において窒素酸化物の産生を抑制せしめる場合には、当該組織を０．０１〜１０００Ｕ/ｍｌ程度の酵素溶液に接触させることによって、窒素酸化物の産生を抑制することができる。
【００２１】
例えば、１回の投与に用いられる本発明抑制剤中のコンドロイチナーゼＡＢＣの具体的含量としては５Ｕ以上が例示され、５〜４００Ｕ程度がより好ましく、５〜２００Ｕ程度がさらに好ましい。
【００２２】
本発明抑制剤は、コンドロイチナーゼ以外に、さらに医薬的あるいは試薬的に許容される担体を含有していてもよい。
このような担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬あるいは試薬に用いられる成分が例示され、使用の目的や、本発明抑制剤の形態（剤型等）に応じて適宜選択することができる。例えば本発明抑制剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥形態のいずれの形態であってもよいが、保存安定性等の面では乾燥形態、特に凍結乾燥形態が好ましい。
【００２３】
本発明抑制剤中に含有させることができる担体としては、特開平１１−２３６３３６号公報に記載されているものを採用することが好ましい。本発明抑制剤の調製は、コンドロイチナーゼと所望の担体を用い、製剤学的に公知の方法により行なうことができる。
【００２４】
＜３＞本発明抑制剤の使用方法等
本発明抑制剤は、組織等の窒素酸化物の産生抑制を目的として使用することができる。かかる使用目的が意図される限りにおいて、本発明抑制剤の具体的な用途は限定されず、試薬用途・医薬用途のいずれにも使用することができる。また具体的な用途に応じて、使用方法等を適宜決定することができる。
【００２５】
本発明抑制剤による産生抑制の対象となる窒素酸化物も特に限定されないが、一酸化窒素（ＮＯ）、これが酸素と反応して生成するＮＯ₂等が挙げられる。また本明細書における「窒素酸化物」という用語は、窒素酸化物の酸化物、還元物、イオン化物等も包含する。例えば、ＮＯ₂から生成するＮＯ₂ ^-やＮＯ₃ ^-、ＮＯがスーパーオキシドと反応して生成するＯＮＯＯ^-、ＮＯが還元されて生成するＮＯ^-や、酸化されて生成するＮＯ⁺等も、本明細書における「窒素酸化物」に包含される。窒素酸化物の中でも、ＮＯが抑制の対象として好ましい。
【００２６】
試薬用途として使用する場合には、例えば、生体から分離された組織等に本発明抑制剤を接触させ、窒素酸化物の産生を抑制せしめることができる。また医薬用途として使用する場合については、後述の「本発明医薬」、「本発明防止剤および本発明抗炎症剤」において詳細に説明する。
【００２７】
＜４＞本発明医薬
本発明医薬は本発明抑制剤からなる医薬であり、本発明抑制剤を医薬用途に応用したものである。本発明医薬は、本発明抑制剤の医薬用途への使用が意図される限りにおいて、その具体的な使用方法等も限定されず、具体的な目的に応じて適宜決定することができる。
【００２８】
本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう「医薬」に包含される。
【００２９】
本発明医薬は、窒素酸化物の産生の抑制が望まれる組織等に投与することにより、本発明医薬に含有されるコンドロイチナーゼの作用が発揮され、当該組織及び周辺組織における窒素酸化物の産生を抑制することができる。
【００３０】
本発明医薬は、ヒトを含む哺乳類全般に投与することができるが、ヒトに投与されるものであることが特に好ましい。
本発明医薬が投与される組織等は、窒素酸化物の産生抑制を所望する組織である限りにおいて特に限定されないが、細胞・組織障害の防止や抗炎症作用が望まれる組織であることが好ましく、窒素酸化物の産生抑制による細胞・組織障害防止・抑制作用や抗炎症作用に加えて、コンドロイチナーゼ本来の作用によるＣＳ及び/又はＨＡの分解が望まれる組織であることが好ましい。
【００３１】
このような組織等として好ましいのは、椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の椎間板組織、あるいは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の脊髄硬膜外腔である。従って本発明医薬は、椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用とすることが好ましい。
【００３２】
すなわち、本発明医薬をこのような椎間板組織等に投与することにより、コンドロイチナーゼ本来の作用によって髄核中のＣＳやＨＡが分解され、髄核中のＣＳ量、ＨＡ量およびこれらによって保持されていた水分量が減少し、その結果として髄核自体の体積を減ずることができる。のみならず、コンドロイチナーゼによる窒素酸化物の産生抑制作用により、細胞・組織の障害を防止又は抑制でき、また炎症を抑制することができる。この結果、突出した髄核による神経への刺激を速やかに除去できるとともに、細胞・組織のダメージを抑制することができ、腰痛等の椎間板ヘルニアの諸症状を効果的に改善することができる。
【００３３】
従って本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置（症状の改善、悪化防止、治療等）のために用いられるものであることが好ましい。
このような本発明医薬は、コンドロイチナーゼを含有する注射用製剤として主に使用される。本発明医薬を溶液状態の注射用製剤として提供する場合には、溶液状態の本発明医薬を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。また凍結状態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に凍結状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。また、本発明医薬を乾燥形態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に乾燥状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液またはソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥形態の本発明医薬は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。このような種々の形態の注射用製剤の中でも、乾燥形態、特に凍結乾燥形態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬は注射用凍結乾燥製剤の形態であることが特に好ましい。
【００３４】
本発明医薬の投与量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、投与される哺乳動物の種類や症状等、投与対象となる組織等の種類やその状態等によって個別に設定されるべきものであり、特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、成人の椎間板ヘルニア症患者の椎間板１箇所に投与する場合、１回あたりコンドロイチナーゼＡＢＣの量として概ね０．１〜２００Ｕ程度、好ましくは０．５〜１００Ｕ程度、特に好ましくは０．５〜５０Ｕ程度を投与することができる。
【００３５】
＜５＞本発明防止剤および本発明抗炎症剤
本発明防止剤は、コンドロイチナーゼを含有する細胞・組織障害の防止又は抑制剤である。また本発明抗炎症剤は、コンドロイチナーゼを含有する抗炎症剤である。
【００３６】
これらの剤は、コンドロイチナーゼの窒素酸化物産生抑制作用を、細胞・組織障害の防止又は抑制剤および抗炎症剤に応用したものである。すなわち、ＮＯ等の窒素酸化物が細胞・組織の障害に関与していること、およびＮＯが炎症のメディエーターの一種であることが知られていることから、コンドロイチナーゼによる窒素酸化物の産生抑制作用を通じて、細胞・組織障害を防止又は抑制でき、炎症を抑制することができる。
【００３７】
本発明防止剤および抗炎症剤についての形態、投与量等の他の説明は、前記「本発明医薬」と同じである。
【００３８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００３９】
以下の実施例では、炎症メディエーターの一種であるＮＯの産生に対するコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）の効果をインビトロで検討した。
【００４０】
Ｃ−ＡＢＣがインビボで椎間板内注射されると、椎間板細胞は、周囲のマトリックス内でのＣＳの分解という変化によって活性化されることが知られている（Clin Orthop, 253, 301-308(1990)）。以下の実施例では、培養組織中の細胞を活性化してよりインビボに近い細胞状態を再現するための刺激剤として、ＩＬ−１を用いた。
【００４１】
＜１＞椎間板組織の培養
（１）組織の調製
新鮮な線維輪を、６匹の雌の日本白ウサギ（３．８〜４．４Ｋｇ）の腰椎椎間板（Ｌ１−Ｌ２およびＬ５−Ｌ６間）から切開して得た。各ウサギから得た椎間板組織は、異なる群に割り当てた。各群それぞれ６つの線維輪を用いた。２５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬、東京、日本）を、完全培地として用いた。各組織を生理的食塩水で洗浄し、完全培地（２ｍｌ）で満たされた12ウェルのカルチャープレートの各ウェルに入れた。
【００４２】
（２）培養手順
用意された組織は、３７℃で５％ＣＯ₂ガス中で、培地を毎日交換する４日間の予備培養、および３日間の連続培養からなる７日間の培養を行った。高純度精製医薬品グレードのＣ−ＡＢＣ（生化学工業株式会社製；比活性３８０Ｕ／ｍｇ蛋白、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下）、および市販の組み換えヒトインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を、培地への添加物として使用した。各組織は、１日目は完全培地のみで培養した。以下に示すＣ−ＡＢＣ群およびＩＬ−１＋ＡＢＣ群においては、２〜４日目に２０Ｕ／ｍｌの濃度でＣ−ＡＢＣを添加した。
【００４３】
続いて、各組織をリン酸緩衝生理食塩水および上記血清フリー培地ですすいだ。培地を、何も含まない（コントロール群）、２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（Ｃ−ＡＢＣ群）、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１を含む（ＩＬ−１群）、または１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１および２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）無血清培地に交換した。さらに、各組織を７２時間培養した後、培地および組織を採収した。
【００４４】
＜２＞採収した組織の乾燥重量の統計学的分析
採収した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。ダンネットの多重比較検定（Dunnett's multiple comparison test）を用いて、コントロール群および他の群との間の統計学的分析を行った。
【００４５】
結果を表１に示す。各群間で統計学的な有意差はなかった。したがって、一酸化窒素（ＮＯ）の値を乾燥重量によって標準化して差し支えない。
【００４６】
【表１】

【００４７】
＜３＞炎症メディエーター（ＮＯ）の産生抑制
ＮＯ産生は、市販のキット（（株）同仁化学研究所、熊本、日本）を用いて検定した。ＮＯ産生は、その安定な酸化産物である亜硝酸（ＮＯ₂ ^-）の濃度として決定した。すなわち、培地を限外濾過し、これを２，３−ジアミノナフタレンおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２０分、室温でインキュベートした。反応をＮａＯＨで停止し、亜硝酸と２，３−ジアミノナフタレンとの反応により得られた蛍光産物を、マイクロプレートフルオロメーター（Fluoroskan II、ラボシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて、９６−ブラックウェルマイクロプレートで測定した。培地中の亜硝酸濃度は、標準曲線から検量した。
【００４８】
各群の平均値および標準誤差を図１に示す。なお、図１中の＊＊は、ＩＬ−１群に対してｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）で有意差があることを示す。ＮＯ産生はＩＬ−１によって強く誘導された。Ｃ−ＡＢＣ処理（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）により、ＮＯ産生は減少し、ＮＯの産生量はＩＬ−１群よりも有意に低かった。
【００４９】
（３）結果
以上のように、Ｃ−ＡＢＣが炎症メディエーターの一種であるＮＯの産生を抑制することが明らかにされた。このようなＣ−ＡＢＣによるＮＯの減少は、椎間板細胞の障害を抑制すると考えられる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、窒素酸化物産生抑制剤が提供される。本発明の窒素酸化物産生抑制剤は、試薬として、又は椎間板若しくは脊髄硬膜外腔投与用の医薬、具体的には例えば椎間板ヘルニアの処置用の医薬として有用である。
また、本発明により、細胞・組織障害の防止又は抑制剤、及び抗炎症剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】線維輪組織による一酸化窒素（ＮＯ）産生を示す図である。ＮＯ産生量を培地中の亜硝酸量として検出した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel use of chondroitinase. More specifically, the present invention relates to a nitrogen oxide production inhibitor containing chondroitinase, a preventive or inhibitor of cell / tissue damage, and an anti-inflammatory agent.
[0002]
[Prior art]
Chondroitinase is an enzyme that catalyzes the degradation of chondroitin sulfate (hereinafter also referred to as “CS”). Various types of chondroitinase are known. For example, chondroitinase ABC (EC 4.2.2.4) is chondroitin sulfate A derived from mammalian cartilage, chondroitin sulfate C derived from cartilage, and mammals. It is an enzyme that strongly catalyzes the degradation of skin-derived chondroitin sulfate B (dermatan sulfate) and weakly catalyzes the degradation of hyaluronic acid (hereinafter also referred to as “HA”).
[0003]
On the other hand, intervertebral hernia is a disease caused by protrusion of the nucleus pulposus in the intervertebral disk, and the protruding nucleus pulposus stimulates nearby nerves, and symptoms such as low back pain appear.
In recent years, an attempt has been made to treat intervertebral hernia by administering chondroitinase to the intervertebral disc to melt the protruding nucleus pulposus [US Pat. No. 4696816, Clinical Orthopedics, 253, 301-308 (1990)].
[0004]
Spine (1997) Vol. 22, pages 1065-1073 describes that nitric oxide (NO) is involved in disc degeneration and hernia. NO is a type of mediator of inflammation and is known to be involved in cell / tissue damage.
[0005]
However, it is not known that chondroitinase suppresses the production of nitrogen oxides.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel use of chondroitinase, particularly chondroitinase ABC, specifically, a drug utilizing the action to prevent or suppress cell / tissue damage caused by nitrogen oxides, or an anti-inflammatory action. The task is to do.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention are composed of a chondroitinase-containing nitrogen oxide production inhibitor (hereinafter also referred to as “the present invention inhibitor”) and the present invention inhibitor. Drug (hereinafter also referred to as “the drug of the present invention”), preventive or inhibitor of cell / tissue damage containing chondroitinase (hereinafter also referred to as “the inhibitor of the present invention”), and anti-inflammatory agent containing chondroitinase (Hereinafter also referred to as “the anti-inflammatory agent of the present invention”).
[0008]
That is, the present invention is as follows.
(1) A nitrogen oxide production inhibitor containing chondroitinase.
(2) The inhibitor according to (1), wherein the chondroitinase is chondroitinase ABC.
(3) A medicament comprising the inhibitor according to (1) or (2).
(4) The medicament according to (3) for administration to an intervertebral disc or spinal epidural space.
(5) An agent for preventing or suppressing cell / tissue damage, comprising chondroitinase.
(6) An anti-inflammatory agent containing chondroitinase.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<1> Chondroitinase used in the inhibitor of the present invention The chondroitinase that can be used in the inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that degrades CS. Specific examples of chondroitinase include chondroitinase ABC (derived from Proteus vulgaris; JP-A-6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), Chondroitinase AC (from Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), chondroitinase ACII (from Arthrobacter aurescens; K Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201 (1976)), chondroitinase ACIII ( From Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Junichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 61, 1023 (1989)), Chondroitinase B (derived from Flavobacterium heparinum; YM Michelacci, CPDietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), YM Mi chelacci, CP Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Keiko Ueno, Junichi Yoshida, Biochemistry, 57, 1189 (1985)), chondroitinase C (derived from Flavobacterium sp. Hp102) Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Junichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 61, 1023 (1989)) are known, and any of these chondroitinases can be used. In addition, chondroitin sulfate ABC exolyase (A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y), chondroitin sulfate ABC exolyase described in JP-A-9-168384 Chondroitinases such as Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 272, 9123-9130 (1997)) can also be used as the inhibitor of the present invention.
[0010]
These various chondroitinases are merely examples, and chondroitinases that can be used in the inhibitor of the present invention are not limited to these. The chondroitinase used in the inhibitor of the present invention may be a single type of chondroitinase or a combination of multiple types of chondroitinases. In such cases, both meanings are included.
[0011]
It is extremely preferable to use chondroitinase ABC as the chondroitinase used in the inhibitor of the present invention. Of chondroitinase ABC, it is particularly preferable to use chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris.
[0012]
Here, the origin of chondroitinase means that it originates from an organism that originally possesses the gene encoding the chondroitinase. Therefore, for example, chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris means chondroitinase ABC produced by a gene originally possessed by Proteus vulgaris. Accordingly, chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris includes not only those produced by Proteus vulgaris itself, but also those produced in other cells using the chondroitinase ABC gene obtained from Proteus vulgaris. It is.
[0013]
The purity of the chondroitinase used in the inhibitor of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of use. For example, when the inhibitor of the present invention is the “medicine of the present invention” described later, or when the “inhibitor of the present invention” or “the anti-inflammatory agent of the present invention” is used, the chondroitinase to be used can be used as a medicament. It is preferable that the enzyme is substantially free from substances that are purified and are not allowed to be mixed as pharmaceuticals.
[0014]
For example, the chondroitinase used in the inhibitor of the present invention is preferably a purified chondroitinase having a specific activity of 300 U / mg protein or more, has a specific activity of 300 U / mg protein or more, and substantially contains endotoxin. And purified chondroitinase having a nucleic acid and protease content below the detection limit is more preferred, and purified chondroitinase ABC having such characteristics is particularly preferred.
[0015]
In the present specification, 1 U (unit) of chondroitinase is the amount of enzyme that liberates 1 micromole of reaction product per minute from CS under conditions near the optimum pH and temperature. As a precaution, the definition of 1U of various chondroitinases is shown below.
[0016]
1 U of chondroitinase ABC is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 8.0 and 37 ° C. Further, 1U of chondroitinase AC (derived from Flavobacterium heparinum) is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 7.3 and 37 ° C.
[0017]
Moreover, 1U of chondroitinase ACII (derived from Arthrobacter aurescens) is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 6.0 and 37 ° C.
[0018]
In addition, 1U of chondroitinase B (derived from Flavobacterium heparinum) is defined as the amount of enzyme that releases a UV-absorbing substance corresponding to 1 micromole of hexuronic acid residue from dermatan sulfate for 1 minute at pH 8.0 and 30 ° C. Is done.
[0019]
For example, by using chondroitinase ABC having a specific activity of 300 U / mg protein or more, the proteoglycan (CS or HA) of the target site can be obtained even when the inhibitor of the present invention is administered in vivo as the pharmaceutical of the present invention (described later). Can be efficiently decomposed, and nitrogen oxide production can be effectively suppressed. Such chondroitinase ABC can be obtained, for example, by the method described in JP-A-6-153947.
[0020]
<2> Form of the inhibitor of the present invention The inhibitor of the present invention contains the above chondroitinase in an amount effective for suppressing the production of nitrogen oxides. Here, “an amount effective for suppressing the production of nitrogen oxides” means an amount capable of detecting the inhibition of the production of nitrogen oxides. This amount depends on the type of chondroitinase used, the type and state of cells and tissues etc. (hereinafter simply referred to as “tissue etc.”) intended to suppress the production of nitrogen oxides, and the type and symptoms of mammals from which the tissues are derived. However, for example, when chondroitinase ABC is used as chondroitinase to suppress the production of nitrogen oxides in intervertebral disc tissue excised from healthy rabbits. Can suppress the production of nitrogen oxides by bringing the tissue into contact with an enzyme solution of about 0.01 to 1000 U / ml.
[0021]
For example, the specific content of chondroitinase ABC in the inhibitor of the present invention used for one administration is exemplified by 5 U or more, more preferably about 5 to 400 U, further preferably about 5 to 200 U.
[0022]
In addition to chondroitinase, the inhibitor of the present invention may further contain a pharmaceutically or reagent acceptable carrier.
Such carriers include conventional excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, buffers, isotonic agents, preservatives, soothing agents, and the like, which are usually used in pharmaceuticals or reagents. And can be appropriately selected according to the purpose of use and the form (form etc.) of the inhibitor of the present invention. For example, the inhibitor of the present invention may be in the form of a solution, a frozen state, or a dried form, but is preferably a dried form, particularly a lyophilized form in terms of storage stability.
[0023]
As the carrier that can be contained in the inhibitor of the present invention, those described in JP-A-11-236336 are preferably employed. The inhibitor of the present invention can be prepared by a known pharmacological method using chondroitinase and a desired carrier.
[0024]
<3> Method of using the inhibitor of the present invention The inhibitor of the present invention can be used for the purpose of suppressing the production of nitrogen oxides such as tissues. As long as the intended purpose is intended, the specific use of the inhibitor of the present invention is not limited and can be used for both reagent use and pharmaceutical use. Moreover, according to a specific use, a usage method etc. can be determined suitably.
[0025]
Nitrogen oxides that are subject to production inhibition by the inhibitor of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include nitric oxide (NO), NO ₂ produced by reaction with oxygen, and the like. In addition, the term “nitrogen oxide” in this specification includes oxides, reduced products, ionized products, and the like of nitrogen oxides. For example, NO ₂ produced from NO ₂ ^- and NO ₃ ^-, ONOO which NO is produced by the reaction with superoxide ^-, NO which NO is generated is reduced ^- or even NO ⁺ such as that generated by oxidation, the It is included in “nitrogen oxide” in the specification. Among nitrogen oxides, NO is preferable as an object of suppression.
[0026]
When used as a reagent application, for example, the inhibitor of the present invention can be brought into contact with a tissue separated from a living body to suppress the production of nitrogen oxides. Moreover, the case where it is used as a pharmaceutical use will be described in detail in the “present invention medicament” and “present invention inhibitor and present invention anti-inflammatory agent” described later.
[0027]
<4> Invention Drug The drug of the present invention is a drug composed of the inhibitor of the present invention, and is an application of the inhibitor of the present invention for pharmaceutical use. As long as the inhibitor of the present invention is intended for use in medicine, the pharmaceutical of the present invention is not limited in its specific method of use and can be appropriately determined according to the specific purpose.
[0028]
In the present specification, the “medicine” means a drug used for medical treatment. Therefore, as long as it is a medicine used for medical treatment, it is included in the “medicine” here regardless of the name.
[0029]
When the medicament of the present invention is administered to a tissue or the like where the suppression of nitrogen oxide production is desired, the action of chondroitinase contained in the medicament of the present invention is exhibited, and the production of nitrogen oxide in the tissue and surrounding tissues Can be suppressed.
[0030]
The medicament of the present invention can be administered to all mammals including humans, but is particularly preferably administered to humans.
The tissue or the like to which the pharmaceutical of the present invention is administered is not particularly limited as long as it is a tissue desired to suppress the production of nitrogen oxides, but is preferably a tissue in which prevention of cell / tissue damage or anti-inflammatory action is desired, It is preferably a tissue in which CS and / or HA degradation by chondroitinase original action is desired in addition to cell / tissue damage prevention / suppression action and anti-inflammatory action by inhibiting production of nitrogen oxides.
[0031]
As such a tissue, the nucleus pulposus is preferably caused by protrusion or release such as a disc tissue of a mammal affected by a herniated disc, or an epidural migrating disc herniation or a transligament prolapse disc herniation. It is the spinal epidural space of a mammal afflicted with an extramembrane type of herniated disc. Accordingly, the medicament of the present invention is preferably used for intervertebral disc or spinal epidural space administration.
[0032]
That is, by administering the medicament of the present invention to such an intervertebral disc tissue or the like, CS and HA in the nucleus pulposus are degraded by the original action of chondroitinase, and the CS amount and HA amount in the nucleus pulposus are retained by these. The amount of water that has been reduced is reduced, and as a result, the volume of the nucleus pulposus itself can be reduced. In addition, cell / tissue damage can be prevented or suppressed, and inflammation can be suppressed by the action of chondroitinase to suppress the production of nitrogen oxides. As a result, nerve stimulation caused by the protruding nucleus pulposus can be quickly removed, cell / tissue damage can be suppressed, and various symptoms of disc herniation such as low back pain can be effectively improved.
[0033]
Therefore, the medicament of the present invention is preferably used for the treatment of disc herniation (improvement of symptoms, prevention of deterioration, treatment, etc.).
Such a medicament of the present invention is mainly used as an injectable preparation containing chondroitinase. When providing the pharmaceutical preparation of the present invention as a solution injectable preparation, the pharmaceutical preparation of the solution is filled and sealed in an appropriate container such as an ampoule, vial, syringe for injection, and distributed or stored as it is. It can be used for administration as an injection. In the case of providing a frozen preparation for injection, the frozen medicament of the present invention is held in a sealed state in an appropriate container such as an ampoule, vial, or syringe for injection, distributed or stored, and before administration. It can be melted and then administered as an injection. In the case where the pharmaceutical of the present invention is provided as an injectable preparation in a dry form, the dried pharmaceutical of the present invention is held in a sealed state in an appropriate container such as an ampoule, a vial, or a syringe for injection, or distributed. It can be stored and dissolved in distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, aqueous sorbitol solution or the like before administration and used as an injection. The medicament of the present invention in a dry form may be provided as a set with a solvent for dissolution. Among these various forms of injectable preparations, those in dry form, particularly freeze-dried form are preferred. That is, the medicament of the present invention is particularly preferably in the form of a freeze-dried preparation for injection.
[0034]
The dosage of the medicament of the present invention should be set individually depending on the type of chondroitinase used, the type and condition of the mammal to be administered, the type of tissue to be administered, its state, etc. Although it is not limited, for example, when chondroitinase ABC is used as chondroitinase and administered to one disc of an adult herniated disc patient, the amount of chondroitinase ABC is about 0.1 to 200 U per dose, preferably Can be administered at about 0.5 to 100 U, particularly preferably at about 0.5 to 50 U.
[0035]
<5> Inhibitor of the present invention and anti-inflammatory agent of the present invention The inhibitor of the present invention is a preventive or inhibitor of cell / tissue damage containing chondroitinase. The anti-inflammatory agent of the present invention is an anti-inflammatory agent containing chondroitinase.
[0036]
These agents are obtained by applying chondroitinase's inhibitory effect on nitrogen oxide production to the prevention or suppression of cell / tissue damage and anti-inflammatory agents. That is, it is known that nitrogen oxides such as NO are involved in cell / tissue damage, and that NO is a kind of mediator of inflammation, so that production of nitrogen oxides by chondroitinase is suppressed. Through the action, cell / tissue damage can be prevented or suppressed, and inflammation can be suppressed.
[0037]
Other explanations of the inhibitor and anti-inflammatory agent of the present invention, such as the form and dosage, are the same as those of the “medicament of the present invention”.
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention should not be limited by these.
[0039]
In the following examples, the effect of chondroitinase ABC (C-ABC) on the production of NO, which is a kind of inflammatory mediator, was examined in vitro.
[0040]
It is known that when C-ABC is injected in vivo, intervertebral disc cells are activated by changes in CS degradation within the surrounding matrix (Clin Orthop, 253, 301-308 (1990). )). In the following examples, IL-1 was used as a stimulator for activating cells in a cultured tissue and reproducing a cell state closer to in vivo.
[0041]
<1> Culture of Intervertebral Disc Tissue (1) Preparation of Tissue Fresh annulus was obtained from lumbar intervertebral disc (between L1-L2 and L5-L6) of 6 female Japanese white rabbits (3.8-4.4 Kg). An incision was obtained. Intervertebral disc tissue obtained from each rabbit was assigned to different groups. Six annulus fibres were used for each group. Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) supplemented with 25 mg / ml ascorbic acid and 10% fetal bovine serum was used as the complete medium. Each tissue was washed with saline and placed in each well of a 12 well culture plate filled with complete medium (2 ml).
[0042]
(2) Culture procedure The prepared tissue was cultured in 5% CO ₂ gas at 37 ° C. for 7 days consisting of 4 days of preliminary culture in which the medium was changed daily and 3 days of continuous culture. High-purity purified pharmaceutical grade C-ABC (manufactured by Seikagaku Corporation; specific activity 380 U / mg protein, substantially free of endotoxin, nucleic acid, protease content below detection limit), and commercially available recombinant human interleukin- 1b (IL-1b) (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) was used as an additive to the medium. Each tissue was cultured in complete medium only on the first day. In the following C-ABC group and IL-1 + ABC group, C-ABC was added at a concentration of 20 U / ml on the 2nd to 4th days.
[0043]
Subsequently, each tissue was rinsed with phosphate buffered saline and the serum-free medium. Medium contains nothing (control group), contains 20 U / ml concentration of C-ABC (C-ABC group), contains 10 ng / ml concentration of IL-1 (IL-1 group), or 10 ng / ml The serum-free medium containing IL-1 at a concentration and C-ABC at a concentration of 20 U / ml (IL-1 + C-ABC group) was replaced. Furthermore, after culturing each tissue for 72 hours, the medium and the tissue were collected.
[0044]
<2> Statistical analysis of dry weight of collected tissue The collected tissue was freeze-dried and the dry weight was measured. Statistical analysis between the control group and other groups was performed using Dunnett's multiple comparison test.
[0045]
The results are shown in Table 1. There were no statistically significant differences between groups. Therefore, the value of nitric oxide (NO) can be normalized by the dry weight.
[0046]
[Table 1]

[0047]
<3> Inhibition of Production of Inflammatory Mediator (NO) NO production was assayed using a commercially available kit (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). NO production was determined as the concentration of its stable oxidation product, nitrous acid (NO ₂ ⁻ ). That is, the medium was ultrafiltered and incubated with 2,3-diaminonaphthalene and Tris-HCl buffer (pH 7.5) for 20 minutes at room temperature. The reaction was stopped with NaOH, and the fluorescent product obtained by the reaction of nitrous acid with 2,3-diaminonaphthalene was added to a 96-black well using a microplate fluorometer (Fluoroskan II, Labsystems, Helsinki, Finland). Measured with a microplate. The concentration of nitrite in the medium was calibrated from a standard curve.
[0048]
The average value and standard error of each group are shown in FIG. In addition, ** in FIG. 1 indicates that there is a significant difference in p <0.01 (Student's t-test) with respect to the IL-1 group. NO production was strongly induced by IL-1. C-ABC treatment (IL-1 + C-ABC group) decreased NO production, and NO production was significantly lower than IL-1 group.
[0049]
(3) Results As described above, it has been clarified that C-ABC suppresses production of NO which is a kind of inflammatory mediator. Such reduction of NO by C-ABC is considered to suppress the damage of intervertebral disc cells.
[0050]
【The invention's effect】
The present invention provides a nitrogen oxide production inhibitor. The nitrogen oxide production inhibitor of the present invention is useful as a reagent or a pharmaceutical agent for administering an intervertebral disc or spinal epidural space, specifically, for example, a pharmaceutical agent for treating disc herniation.
In addition, the present invention provides an agent for preventing or suppressing cell / tissue damage and an anti-inflammatory agent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows nitric oxide (NO) production by annulus fibrosus tissue. The amount of NO production was detected as the amount of nitrous acid in the medium.

Claims

A nitric oxide production inhibitor containing chondroitinase ABC .