JP4808841B2 - LO-CD2a antibodies that inhibit T cell activation and proliferation and methods of use thereof - Google Patents

Description

【００７８】
２個の正常供与体でのＮＫ検定での５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、および０．５ｕｇ／ｍｌでのＬＯ−ＣＤ２ａの細胞含有物（図１０ａおよび１０ｂ）が抗体のすべての試験された濃度およびすべての試験されたＥ／Ｔ比率にわたり約５０％の細胞毒性の阻害に導いた。これは０．２５ｕｇ／ｍｌの用量であるいはそれ以上の用量のＭＬＲでの増殖の基本的に完全な阻害と比較したものである。
【００７９】
〔実施例４〕
非ヒト霊長類での生体内研究
材料と方法
モノクローナル抗体
ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣはＦＩＴＣで接合されたラットＩｇカッパ１ｂアロタイプに対して指向されたマウスｍＡｂである。ＭＡＲＧ２ｂ−ビオチンはビオチンで接合されたマウス抗ラットＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンｍＡｂである。これら２個のｍＡｂｓが我々の研究室で産生され標識された。免疫蛍光試験のために、これらのｍＡｂｓは２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ（ベクトン−ディキンソン）およびＴ１１ローダミン（コールター）は２個のマウス抗ヒトＣＤ２ｍＡｂｓである。Ｔ４−およびＴ８−ローダミン標識（コールター）はそれぞれマウス抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８ｍＡｂｓである。
【００８０】
表現型分析
抗ヒトＴ細胞ｍＡｂｓ（抗−ＣＤ２、−ＣＤ４、−ＣＤ８、前記参照）が全血の１００μｌサンプルに加えられ、４℃で４５分保温された。赤血球はトリス緩衝塩化アンモニウム溶解緩衝液（塩化アンモニウム１４４ｍＭ／トリス１７ｍＭ、ｐＨ７．２）で溶解され、リンパ球はＰＢＳ／ＦＣＳ２％／ＮａＮ３、０．２％で洗浄された。非標識ｍＡｂｓの検出のために、第二ｍＡｂ（ＦＩＴＣ−あるいはビオチン−接合体）が２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えられた。４℃で４５分保温の後、細胞はＰＢＳ／ＦＣＳ／ＮａＮ３で洗浄された。ビオチン化ｍＡｂｓのために、ストレプトアビジン−フィコエリスリン接合体での保温（１５分）が行われた。標識ヒトあるいはサルリンパ球が２％ホルマリン溶液に再懸濁され、サイズ対粒度の関数としてリンパ球をゲート化するための溶解IIプログラムを備えたファクソン・サイトフルオロメーター（ベクトン・ディキンソン）で分析された。非特異的染色のための対照として、細胞のアリコートがＦＩＴＣ−あるいはフィコエリスリン接合マウスＩｇｓ（コールター）で保温された。
【００８１】
循環Ａｂｓのレベル
血清のＬＯ−ＣＤ２ａが、マウス抗ラット１ｇＧ２ｂ ｍＡｂ（我々の研究所で産生されたＭＡＲＧ２ｂ−８）を第一層（被覆物）としまた検出のためにホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたマウス抗ラットカッパ鎖（ＭＡＲＫ−３）ｍＡｂを用いてエリザで定量された。要約すると、マイクロタイタ平板（ファルコン）がＭＡＲＧ２ｂ−８（５μｇ／ｍｌ）の１００μＬ／ウエルで一晩保温され、プラスチックの未占有部位が粉ミルク（ウシ）５％を含むＰＢＳで飽和された。室温で１時間保温の後、平板はトウィーン−２０、０．１％を持つＰＢＳで洗浄され、また希釈サルあるいはヒト血清の１００μｌ／ウエルで保温された。未結合材料を洗い出した後、平板は１時間１００μｌ／ウエルのＭＡＲＫ３−ペルオキシダーゼ（ＰＢＳ内で２μｇ／ｍｌ）で保温された。再度洗浄の後、平板は過酸化水素０．０３％を含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液でＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン−ジヒドロクロライド、０．４ｍｇ／ｍｌ、シグマ・ケミカルズ）で保温された。染色反応産物は４９２ｎｍで検出された。標準曲線は対照サルあるいはヒト血清のプールで連続希釈された精製ＬＯ−ＣＤ２ａの既知の濃度と平行して作られた。
【００８２】
サルあるいはヒト抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の検出は、ＬＯ−ＣＤ２ａ（５μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエルマイクロタイタ平板を用いるエリザにより実行された。平板に結合する抗ＬＯ−ＣＤ２ａヒトあるいはサル抗体は、ラット抗ヒトＩｇＭ（ＬＯ−ＨＭ−７）あるいはＩｇＧ（ＬＯ−ＨＧ−２２）ｍＡｂｓで標識されたホースラディッシュペルオキシダーゼにより明らかにされた。
【００８３】
Ａ．シノモルグスサル
一匹のシノモルグスサルが３連続日にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日受けた。モノクローナル抗体は充分に耐性であった。
【００８４】
リンパ球喪失が最初の注射後に観察されたが、２回および３回目の注射後には非常に僅かの追加喪失があったに過ぎなかった。
【００８５】
第二のサルは１０日にわたり２０ｍｇ／日を受けた。ｍＡｂは同じく充分に耐性であった。用量投与後副作用は観察されず、そこで動物は活性があり、用心深く、よく餌を食べ同時に嘔気あるいは胃腸障害の証拠はなかった。
【００８６】
第二のサルのリンパ球の総数および細胞集団は図１５および１６で要約される。ＮＫ活性は１０回注射後に僅かではあるが減少した（図１７）。ＭＡｂの循環レベルは非常に高く（図１８）、また免疫化は処置の終りに生じた（図１９）。
【００８７】
Ｂ．ヒヒ
ＬＯ−ＣＤ２ａに対するヒヒの耐性を決定し、またこのｍＡｂのヒヒリンパ球の膜マーカーのいくつかに対する作用を分析しかつ血清におけるＬＯ−ＣＤ２ａの半減期を決定するためにここで記載された実験が始められた。
【００８８】
ＬＯ−ＣＤ２ａでのヒヒ細胞の染色は染色ヒト細胞のそれよりも著しく低い平均蛍光強度で正の細胞が２０％以下に帰着する。この染色パターンはヒヒ細胞とのＦｃ相互作用を経由する弱い交差感受性あるいは結合を反映する。
【００８９】
この研究は８．８Ｋｇの体重の雄ヒヒ（パピオ・モルモン）について行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａの各注射の前に、サルは麻酔された。麻酔は第１回目はケテーラー（２ｍｌ）およびプラジン（０．５ｍｌ）、第２回目はケテーラーのみで続く回にはケテーラーおよびプラジン（０．３ｍｌ）であった。ＬＯ−ＣＤ２ａは生理食塩水１００ｍｌで希釈されて、静脈内（ｉ．ｖ．１０分）で注射された。リンパ球の表現型分析および循環抗体（注射されたＬＯ−ＣＤ２ａ、新しく形成された抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、および前から存在していた交差反応性ヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体）の測定のために、血液サンプル（１０ｍｌ）が、２個の管に取られた。リンパ球型別のための管はＥＤＴＡを含んでいた。サンプルは基準線レベルを決定するために最初の処置の前に採取された。
【００９０】
ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量（１０ｍｇ）が研究の０日に投与された。続く４個の用量（１０ｍｇ／用量）は７、８、９、および１０の日に投与された。血液サンプルは各ＬＯ−ＣＤ２ａ用量後２−３分で採取された。７日および９日に（ＥＤＴＡ含有管で）補足血液サンプルが同じくＬＯ−ＣＤ２ａ注射の前に採取された。血液サンプルは１、２、１１、１２、１３、１６および２４日に採取された。
【００９１】
ＬＯ−ＣＤ２ａ注射の期間あるいはこの研究の期間を通じて異常な活性の反応あるいは食餌習慣は観察されなかった。動物の体重は０日に測定された約８．８Ｋｇに留まった（下記の表を参照されたい）。
【００９２】
０日から２４日までのヒヒの体重（Ｋｇ）
日 ０ ７ ８ ９ 10 12 13 16 24
体重 8.8 8.9 9.1 9.1 8.8 9.0 9.1 8.9 8.9
表現型および循環ｍＡｂの分析
このヒヒの末梢血リンパ球の蛍光染色はいくつかの興味深い特性を明らかにした：
ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａの作用の下で、リンパ球のＣＤ２−正サブセットは、ＬＯ−ＣＤ２ａの第５回投与の終結の際に、つまり血液中でｍＡｂの最大の累積の時点で（２個の異なった抗ＣＤ２ｍＡｂｓにより明らかにされたように）著しく減少した（図２０ａおよび２０ｂを参照されたい）。リンパ球のＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットがこの期間に減少しないという仮定で（図２２）、またＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が大抵のＣＤ２保持リンパ球を含むために、ＣＤ２⁺ 細胞における減少は立体配座において減少しているかあるいは変化するものはリンパ球よりも膜マーカー発現であることを示している。
【００９３】
（図２０ａ）で見ることができるように、ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量後にＣＤ２＋（Ｌｅｕ−５ｂ⁺ あるいはＴ１１⁺ ）正リンパ球の僅かな減少が観察される。この最初の用量の２日後に、ＣＤ２正細胞（Ｔ１１⁺ のＬｅｕ５ｂ⁺ ）のレベルは出発時の値に上昇した。
【００９４】
ＬＯ−ＣＤ２ａの４回２４時間間隔をあけた用量の終結時点（７日−１０日）で、ＣＤ２正細胞（Ｌｅｕ５ｂ⁺ あるいはＴ１１⁺ ）の割合は急激に減少し、またＬＯ−ＣＤ２ａ投与の終結３日後にゆっくり上昇を開始した。
【００９５】
ｂ）同時に、ＬＯ−ＣＤ２ａ正細胞の割合、すなわち、循環ｍＡｂにより結合された細胞の割合はＬＯ−ＣＤ２ａの第２回用量（７日）の後２２％に上昇し、次いで、抗ＣＤ２ｍＡｂｓ Ｌｅｕ５ｂおよびＴ１１により明らかにされたＣＤ２⁺ 細胞がそうであったように減少した（図２０）。ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少はＭＡＲＫ−３ＦＩＴＣ ｍＡｂにより明らかにされた（図２１）。
【００９６】
ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少は、ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣにより、あるいはＭＡＲＧ２ｂ−８−ビオチン接合ｍＡｂｓにより検出された細胞に存在するＬＯ−ＣＤ２ａの検出により決定された（図２１ａ）。同じ現象は、もしも細胞が循環ｍＡｂにより占められていないすべての部位を飽和するために２．５μｇ／ｍｌでＬＯ−ＣＤ２ａでまず保温されたかどうかが観察された。ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＡＲＫ−３−ＦＩＴＣあるいはＭＡＲＧ２ｂ−８−ビオチンにより検出された（図２１）。
【００９７】
ｃ）（図２２）で見ることができるように、ヒヒリンパ球のＴ４正サブセットは９日から１２日までの間に適度の上昇を示し、その後Ｔ４⁺ リンパ球の割合は当初の値に戻った。Ｔ４⁺ 細胞の上昇に附随して、Ｔ８正リンパ球の割合は９日から１１日までに上昇した。その日以後、この割合は当初の値に戻った。
【００９８】
ｄ）循環ｍＡｂ ＬＯ−ＣＤ２ａのレベルは最初の注射３日後に目立たない値にまで減少した（図２０ｂ参照）。ＬＯ−ＣＤ２ａが４回の短時間間隔の用量を適用される時（７日から１０日）、血清ＬＯ−ＣＤ２ａのレベル（約３．７ｍｇ／ｍｌ、この期間での最大値）は最後の用量（１０日から１６日）後にゆっくり減少し、これはこの動物モデルでＡｂの半減期が相対的に長いことを示している。１１日，１２日，１３日，１６日および２４日に採取された血液サンプルではヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は検出されなかった。
【００９９】
〔結論〕
ＬＯ−ＣＤ２ａはシノモルグスサルヒヒで明らかな反応の不在により示されるように、非ヒト霊長類により十分寛容であるように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａはヒヒにおいて相対的に長い半減期を持つように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量の２４時間後（図２７の１日目）、ＭＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ血清に存在していた。ＬＯ−ＣＤ２ａの最後の用量の３日後（図２７の１３日目）、ｍＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ血清に存在していた。
【０１００】
非ヒト霊長類での染色パターンがヒト細胞に対するＣＤ２で観察されたものと一致しないけれども、ＣＤ２正リンパ球の割合の減少に続き細胞のこの割合のゆるやかな上昇は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養されたヒトＰＢＭＣ単核細胞で観察されたものと類似している。
【０１０１】
〔実施例５〕
ＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者
思いやりのある基礎に基づくＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者
患者＃１（Ｍｂ．Ｅ．）
これは末期腎不全のために腎同種異系移植を処置された慢性腎盂腎炎を持つ女性の患者であった。拒絶発症が起こり、１０日間ＯＫＴ３で処置された。クレアチニンレベルは２乃至１．４ｍｇ／ｄｌまで低下した。約４ケ月後、拒絶発症は２ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルおよび適度の拒絶を示す生検により診断された。患者はソルメドロール１．５ｇおよび続く８日間ＡＴＧのコースで処置され、その時点でクレアチニンレベルは１．６５ｍｇ／ｄｌであった。処置７日後、生検が行われ、それは細胞拒絶および適度な血管拒絶を示した。生検（０日）の２日後、患者は２．４ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルで無尿症となった。同日患者はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、コルチコステロイド・ソルメドロール１．５ｇ、プラス、ポラリミン１ｇ（抗ヒスタミン）およびダファルガン１ｇ（アセトアミノフェン）を受けた。コルチコステロイド、デキスクロロフェニルアミンおよびアセトアミノフェンでの処置は移植社会により「適用範囲」（ｃｏｖｅｒａｇｅ）として引用される。副作用は認められなかった。２３時間の終りまでに、患者は７００ｍｌの尿を出し、クレアチンは２．７２ｍｇ／ｄｌであった。次の９日間に、彼女はＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日受けた。患者は１１日の時点で追跡生検を受けることなく病院を離れた。
【０１０２】
ＡＴＧ処置の間および続くＬＯ−ＣＤ２ａ処置の間での血清クレアチニンレベルの測定は、クレアチニンレベルがＡＴＧ処置にも拘らず上昇し、次いで下降してＬＯ−ＣＤ２ａで安定化されたことを示した（図３１，３２）。
【０１０３】
白血球総数はＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の期間に、１０，０００個の最高水準から２０００個まで低下し２１日目の最終の測定まで低下を続けた（図２３）。リンパ球総数は低く観察の期間中に変化していた。
【０１０４】
ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置に続き直ちに２．０−３．０μｇ／ｍｌの最大値に上昇し、各処置の間で約１．０μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２４）。９日目の最後の処置で、このレベルは２４時間に５０％低下し、１４日目には０になった。この患者は４０日に外来に戻った。
【０１０５】
患者のクレアチニンレベルは４０日で２．２７、５０日で２．４８であり、６６日では３．１１まで上昇し、この時点で生検が激しい細胞拒絶および間隙出血と一致する最初の報告と共に得られた（以下を参照のこと）。患者は腎に１５０Ｒの照射、３×１２５ｍｇのソルメドロールで処置され、一方シクロスポリンおよび１２．５ｍｇ／日のステロイドでの薬物維持療法が続けられた。クレアチニンレベルは続く期間中は上昇を続けた。７０日にクレアチニンレベルは３．３、８０日に５．６３、８４日には８．３５であった。８６日にはクレアチニンレベルは１０．８となり、移植腎摘出が８８日に行われた。この患者の１０日の排泄と６６日生検の間の期間の維持免疫抑制を伴う患者のコンプライアンスは疑問であり、また明らかに成功した救助であるにも拘らず腎の喪失が不確かなコンプライアンスの要因となるに違いない。
【０１０６】
（ii）患者＃２
この患者はＣ型肝炎を患った３８歳の男性であった。彼は慢性間隙性腎症（ネフロパシー）に帰因する末期腎不全の処置のために腎同種異系移植を受けた。１年３ケ月後、彼は一連のＯＫＴ３に耐性の急性細胞および血管拒絶のため移植腎摘出を受けた。
【０１０７】
移植腎摘出から１年１０ケ月に、彼は２回目の腎同種異系移植を受けた。３日後、彼のクレアチニンレベルは１．４ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。その日の後患者のクレアチニンは１．８ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロールの５００ｍｇを受けた。クレアチニンは３．２５ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。彼のクレアチニンは２．９５ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼のクレアチニンレベルは２．３ｍｇ／ｄｌであり、彼は生検を受けそれは３プラスの細胞性拒絶を示した。３日後彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、およびソルメドロール２００ｍｇポララミンおよびダルファガンを受けた。観察された副作用は眠気さに限定された。高熱あるいは高血圧は認められなかった。次の９日間彼は毎日ＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの処置を受けた。このような処置の終りの次の日生検は拒絶反応を示さなかった。
【０１０８】
患者はＬＯ−ＣＤ２ａのコースで十分な耐性を示し、どのような用量でも熱あるいは高血圧もなく臨床副作用の何らの徴候も示さなかった。処置のコースの間に得られたいつもの血液学および臨床化学実験室検査（ＬＦＴｓを含む）は、リンパ球総数が２９０／立方mmから１００／立方mmの最低値に減少し、また拒絶発症の消炎と関連するクレアチニンレベルの減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置の開始で２．７ｍｇ／ｄｌからコース終期での１．１０への減少）したことを除き、抗体の投与に帰属する何らの変化も示さなかった。
【０１０９】
図２５はＬＯ−ＣＤ２ａの処置に続く日々に２．５から約１．０まで低下したこの患者の血清クレアチニンレベルを示す。患者は処置の前および処置の間リンパ球減少症であり、白血球数は処置によって何ら劇的な変化を示さなかった（図２６）。この患者では、ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置後２．０μｇ／ｍｌ以上に上昇せずまた１．０から０．２５μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２７）。ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の８ケ月後、患者は正常な腎機能で身体が丈夫であり、再発性拒絶の徴候はなかった。
【０１１０】
患者２−生検＃１−診断：不確定
生検は目立たない約２０個の糸球を含んでいた。散在する単核性浸潤および少ない度合いの間隙性水腫があった。少ない度合いの管状浸入のみが見出されたが血管外傷はなかった。これらの発見は急性細胞性拒絶の診断には不十分である。小動脈にはまれに単核細胞が存在したがこれは疑わしく、しかし拒絶の診断の判定基準には合致しなかった。
【０１１１】
患者２−生検＃２、最初の生検の約２週間後のもの−診断上異常は認められなかった。
【０１１２】
この生検は前の生検に類似しているように見え、約１０個の糸球を含んでいた。浸潤は非常にまばらであり血管外傷は確認されなかった。
【０１１３】
（iii ）患者＃３
この患者はフォン・ヴィレブランド病にかかった１９歳の男性であり、慢性腎盂腎炎に起因する末期腎不全の処置のため腎同種異系移植を受けた。６日コースのＯＫＴ３が失敗した後で二次高血圧での急性血管拒絶のため移植片は１７日後に除去された。
【０１１４】
５ケ月半後に彼は第二回目の腎同種異系移植を受けた。１０日後彼のクレアチニンレベルは６ｍｇ／ｄｌであった。その翌日クレアチニンレベルは７ｍｇ／ｄｌであり生検は３プラス細胞性拒絶および血管拒絶（壊死あるいは血栓症のない増殖性動脈内膜炎）を示した。その同日、彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、ソルメドロールおよびポララミンならびにダファルガン４０ｍｇを受けた。副作用は観察されなかった。次の９日間、彼は毎日、他の薬剤あるいは副作用なしでＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの処置を受けた。処置の完了の２日後、彼のクレアチニンレベルは１．７５ｍｇ／ｄｌであり、生検は間隙性壊死および１個所慢性拒絶の病巣はあったが、急性拒絶の徴候は示さなかった。
【０１１５】
臨床的副作用（ＢＰあるいは温度の変化）は観察されなかった。日常の血液学および臨床化学実験室試験（ＬＦＴｓを含む）は、拒絶発症の消炎に伴うクレアチニンレベルの減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置開始時の７．１０ｍｇ／ｄｌから１０日間コースの終期での１．７５ｍｇ／ｄｌ）を除き、抗体の投与に帰属する変化を示さなかった。リンパ球数は処置前３４０／立方mmであり、処置中に２２０／立方mmの最低値に低下し、ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の中止９日後に６９０／立方mmに上昇しまた処置終期の２３日後に１０００／立方mmにまで上昇した。
【０１１６】
この患者の白血球数は処置により著しく変化しなかった（図２８）。血清クレアチニンレベルは処置で劇的に低下した（図２８）。ＬＯ−ＣＤ２ａでの最初の処置７ケ月後に、患者は正常な腎機能で身体は丈夫になり、再発性拒絶の徴候は存在しなかった。
【０１１７】
患者３−生検＃１−診断：小動脈およびそれより低い度合いで間隙ならびに糸球に影響する危険な細胞拒絶
弓状型動脈は弾性線維の破壊を伴う内膜への著しい単核浸潤を示した。時々細管に侵入した間隙にまばらな浸潤巣が存在した。間隙は拡散した軽い間隙水腫を示した。約７個の糸球が存在した。これらは単核細胞での細胞過剰症および内皮腫脹を示した。全体に、このパターンは重い急性細胞拒絶の症状を示した。
【０１１８】
患者３−生検＃２、最初の生検約２週後−診断：処置された拒絶と一致
生検は時々ムコイド物質を持ちしかしごく少量の細胞浸潤巣を持つ内膜線維症を示す２、３の小動脈を示した。間隙は微細な拡散線維症および最少の単核浸潤巣を示した。細管は局部的に萎縮性であったがそれ以外は目立たなかった。活性細胞拒絶の徴候は存在しなかった。
【０１１９】
患者の免疫抑制療法でコンプライアンスに留まった第２および第３の患者の追跡治療での２８ケ月間にはその後拒絶症状の出現は報告されなかった。
【０１２０】
（iv）患者＃４
同種異系骨髄移植の後、重い対宿主性移植片病（高用量のプレドニゾン投与に対し耐性である重い皮膚、消化管、腎および中枢神経系毒性）を患う患者が１２日間ＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日を受けた。彼の症状は改善した。腎機能は正常に戻り、下痢は止まり、皮膚は改善されまた錯乱状態は消散した。４日後抗体は停止され、症状は再発し、患者は抗体の第２回コースの開始にも拘らず死亡した。
【０１２１】
ＬＯ−ＣＤ２ａは、かくして外部組織（同種異系および異種、というのはそれが同種異系ＭＬＲと同じように異種ＭＬＲを阻害するためである）に対する進行中の免疫応答を逆転するために使用することができた。抗体は１０日から１４日にわたり、１日１回乃至２回静脈内注入により与えられるであろう。それはまた器官移植に続いて直ちに誘導実験記録の一部としてＴ細胞の活性化を阻害するために予防的に使用することができるかもしれない。
【０１２２】
２回目の実験、フェーズＩ安全性、において、薬物動態および用量決定臨床試験が、急性拒絶症状の出現を証明された最初の生検を受けた腎同種異系移植片受容体で開始された。この試験で使用された抗体調製物は細胞培養で生産されたＬＯ−ＣＤ２ａである。
【０１２３】
抗体の思いやりのある使用は副作用を示さず、また１０日間１０ｍｇ／日の用量で急性移植片拒絶を逆転するのに有効であることを示唆した。チンパンジーを用いる予備臨床研究は、類似の生体内効果が明らかな副作用なしで０．１−１００ｍｇ／日にわたるヒト用量に等しい用量で観察されたことを示唆した。従ってこのフェーズＩ試験の目的は、最小有効量の目安を得るために、１０日間（選択肢の延長として追加の５日間）１０ｍｇ／日で開始するＬＯ−ＣＤ２ａの用量レベルを減少することを調査することであった。前に記載した思いやり使用患者において副作用がステロイドの「適用範囲」で観察されなかったため、ステロイドの適用範囲なしで鎮痛薬および抗ヒスタミン薬の最小予備処置のみの投与が決定された。これはＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導される副作用を予言的に特徴付けるために行われた。
【０１２４】
１１名の患者がこれまでのこのプロトコルの下で登録された。４名の患者は１０ｍｇ／日で処置され、５名の患者は５ｍｇ／日で処置され、また２名の患者は２．５ｍｇ／日で処置された。
【０１２５】
登録された１１名の患者の間で、９名の患者は生検で確認された急性拒絶の逆転あるいは部分的逆転を経験した。その９名は、１０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａで処置された４名すべての患者、５ｍｇ／日で処置された３名の患者、および２．５ｍｇ／日で処置された２名の患者であった。５ｍｇ／日で処置された患者の１人（下記参照、患者８）は最初の処置の後自発的に研究から退き、また第２の患者（患者９）は劣った応答を示した。
【０１２６】
表１はこのプロトコルの下でＬＯ−ＣＤ２ａで処置された腎拒絶患者で得られた結果を要約したものである。
【０１２７】
【表１】

【０１２８】
多分サイトカインの一過性放出の結果として、悪心、嘔吐、発熱、悪寒、および高血圧を含むステロイドの適用範囲なしでのＬＯ−ＣＤ２ａで処置の間副作用が観察された。これらの事象の大多数（７０％以上）は最初の用量の投与の間に観察され、それの事象は制限された範囲および継続期間のものであった。例えば、４０℃以上の発熱は観察されず、事象の殆どは発症の時間内に消散した。高血圧あるいは重い下痢症状は観察されなかった。これらの事象の強さおよび出現率ならびに抗体用量との間には明らかな関係がなかった。これらの症状が明らかに不快であったにも拘らず緊急蘇生手段を必要とする事象は存在しなかった。
【０１２９】
第３の実験において、急性腎同種異系移植拒絶の１０名の患者は以下の通りＬＯ−ＣＤ２ａでのステロイドの適用範囲なしで思いやりのある基礎に基づいて処置された。
【０１３０】
２名は１０ｍｇ／日、４名は５ｍｇ／日、また４名は２．５ｍｇ／日で処置された。すべての思いやり使用患者は１０ｍｇ／日および５ｍｇ／日で処置され、２．５ｍｇ／日で処置された患者１人を除いてすべては生検および他の臨床徴候により完全なあるいは部分的拒絶消散の証拠を示した。これらの思いやり使用患者の有害事象プロフィールは、制限された持続時間および範囲の第１用量症状でここで支配的に見られるものと類似していた。
【０１３１】
第４の実験において、ステロイド耐性対宿主性移植片病を持つ６名の患者および１名の肝移植受容者が思いやりのある基礎に基づいてＬＯ−ＣＤ２ａを受けた。これらの患者に対して副作用は報告されなかった。これらの患者に関する短い物語は以下の通りである。
【０１３２】
ＧｖＨＤ（対宿主性移植片病）患者６名のすべてが、１０日連続でＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの用量を毎日処置され、１時間にわたり静脈内投与された。これに付随して、シクロスポリンおよびステロイドの投与が続けられた。１人を除きすべての人がＧｖＨＤ症状の改善を示した。ＧｖＨＤ症状の消散はｍＡｂ療法の開始３−６日後に始まった。ｍＡｂ療法の下で肝臓ＧｖＨＤの徴候の向上が２名の患者で観察された。ＧｖＨＤの徴候の再発は評価される３名の患者の内２名で見られた。
【０１３３】
７番目の患者は供与体の肝臓を受け入れたが、不幸にもシクロスポリン毒性のため腎不全に伴う手術合併症の結果として敗血症を起こし、骨髄機能を著しく低下させた。彼女の疾患状態のため、外科医は誘導のための現在利用できる免疫抑制剤（ＯＫＴ３、モフェティル、ＦＫ５０６、シクロスポリンおよびＡＴＧ）を用いることにより、割当てられた第２の肝臓で患者にリスクをとらせることを望まなかった。患者は肝移植を受け、移植器官の鉗子利用に先立ち手術開始の間注入される最初の用量として５ｍｇ／日で７日間ＬＯ−ＣＤ２ａの処置を受けた。これに続く用量は低用量のステロイドが与えられた。処置期間の間患者の腎機能は開始されるべき従来の免疫抑制処方に対し十分な改善をみた。患者は移植８週後に何らの拒絶徴候も見せなかった。
【０１３４】
この発明は望ましい実施例において移植片拒絶反応の阻害に向けられるけれども、この発明の範囲はそれに限定されるべきでなく、また目的の何れかおよびすべてでＴ細胞活性化の阻害に一般に有用であることは理解されるべきである。
【０１３５】
〔実施例６〕
キメラ抗体の構築および発現
Ａ．ＬＯ−ＣＤ２ａのＶ_H およびＶ_L のクローニングおよび配列化
全ＲＮＡがチャーグウィンの方法（バイオケミストリー、１８巻、５２９４ページ、１９７９年）に従って細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４２３）から分離された。ｍＲＮＡが次いでオリゴテックス−ｄＴ ｍＲＮＡキット（カリフォルニア、チャッツワース、キアジェン）を用いて調製された。約２００−３００ｎｇのｍＲＮＡがパーキン−エルマー・シータス（コネチカット、ノーフォーク）のＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いて逆転写された。反応は４２℃で１時間行われた。Ｖ_H およびＶ_L 遺伝子の増幅に必要なオリゴヌクレオチド・プライマーは下記の引用例を用いて選択された：１）免疫関連タンパク質の配列、キャバット、他、第５版、１９９１年、２）オーランディ、他、全米科学アカデミー紀要（アメリカ合衆国）、８６巻：３８３３−３８３７（１９８９年）。
【０１３６】
【数２】

【０１３７】
番号はキャバット、他、１９９１年で示されたアミノ酸残基を引用する。
【０１３８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が下記の条件を用いてパーキン−エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー４８０で行われた：９４℃で５分。９４℃で１分、６０℃で２分、および７２℃で２分よりなる３０サイクル、これに７２℃で５分が続いた。ＤＮＡ断片はキエックス・ゲル抽出キット（カリフォルニア、チャッツワース、キアジェン）を用いてアガロース１％からゲル精製された。断片は次いでカナンゴおよびパンディ、バイオテクニクス、１４巻：９１２−９１３ページ（１９９３年）の方法に従って平滑末端化され、ブルースクリプトＫＳＩＩ^- （カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）のＳｍａＩ部位に連結された。多重クローンはシーケナーゼ^TMＴ７ポリメラーゼ・キット（オハイオ、クリーブランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いるジデオキシ鎖終結法により配列された。
【０１３９】
ＰＣＲに固有の潜在的誤り率の故で、少くとも３回異なった反応が行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L およびＶ_H 遺伝子でもっとも普通に観察される配列は図３４、３５、３６および図３７、３８で示され、ここで図３４、３５、３６は天然リーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。図３７、３８は天然リーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０１４０】
図３４、３５、３６で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１である。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基２４乃至３９である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基は６２乃至９３である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０３乃至１１２である。
【０１４１】
図３７、３８で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残基３６乃至４９である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレームワーク３はアミノ酸残基６７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至１０７である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。
【０１４２】
Ｂ．一過性発現のためのベクターへの挿入
２個のベクターがＬＯ−ＣＤ２ａのキメラ軽鎖および重鎖それぞれの発現のため、ロンドンのメディカル・リサーチ・カウンシル（ＭＲＣ）からライセンスされた。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖ１１ｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片としてヒトカッパ定常部および抗リゾチームのヒト化Ｖ_L 領域のゲノムクローンを含む。８．６キロベース重鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片としてヒトγ１定常部および抗リゾチームのヒト化Ｖ_H 領域のゲノムクローンを含む。これらのベクターは前田、他、ヒト抗体ハイブリドーマ、２巻：１２４−１３４ページ（１９９１年）により詳細に記述されている。
【０１４３】
天然シグナルペプチドを含むＤＮＡ断片は利用不可能であるため、ＬＯ−ＣＤ２ａのＶ領域はＭＲＣベクターに既に存在するシグナルの背後にクローンされた。シグナル断片を持つ軽鎖Ｖ領域は下記の通り個別のＰＣＲ反応からそれぞれ誘導された２個の断片から構築された：
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ軽鎖ベクターであった。増幅された断片はシグナルペプチドに加えてフレームワーク（ＦＲ）１の一部を含んでいた。使用された２個のペプチドは以下の通りであった。
【０１４４】
【数３】

【０１４５】
アンチセンスプライマーは抗リゾチームのＭＲＣベクターでは見出されなかったＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１配列を含んでいた。ＰＣＲ反応は０．１５キロベースのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｔｔｈ ＩＩＩ断片を産生した。
【０１４６】
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L クローンであった。増幅された断片は（Ｔｔｈ ＩＩＩ部位から）ＦＲ４の末端までにＬＯ−ＣＤ２ａ ＦＲ１を含んでいた。ＭＲＣ軽鎖ベクターで見出される３′未翻訳領域はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてＬＯ−ＣＤ２ａの３′末端に付加された。使用された２個のオリゴヌクレオチドは以下のものであった。
【０１４７】
【数４】

【０１４８】
この反応は０．３５キロベースのＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片を産生した。双方のＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲル精製され、適切な酵素を用いて制限された。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｔｔｈ ＩＩＩ断片プラスＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いで３方向連結でブルースクリプトのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩ部位の間で連結された。ＬＯ−ＣＤ２ａの全Ｖ_L 領域プラスＭＲＣシグナルペプチドを含むこの構築物は次いで配列された。
【０１４９】
重鎖ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ領域構築物はその５′末端でＭＲＣシグナル配列、および同じくＭＲＣ重鎖ベクターから誘導された長３′未翻訳領域を含んでいる。最終構築物は以下に述べる３種の異なったＰＣＲ反応から作られた：
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ重鎖ベクターであった。抗リゾチームのＶ_L およびＶ_H 遺伝子が同じシグナルを使うために、センスプライマーはＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 構築物に使用されたもの、すなわち５′Ｖ _L ｌｙｓｓｉｇと同じであった。アンチセンスプライマーは３′Ｖ _H ｌｙｓｓｉｇ：以下のものであった。
【０１５０】
【数５】

【０１５１】
この反応はＭＲＣシグナルに加えＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１の一部を含む０．１６キロベースのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片を産生した。断片はゲル精製され、制限され、配列化のためＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。
【０１５２】
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプトのＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 領域であった。この反応はＶ_H 領域の殆どを含む０．３キロベースのＰｓｔ Ｉ−Ｓｔｙ Ｉ断片を産生した。ＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ３に内部Ｐｓｔ Ｉ部位があったために、Ｐｓｔ Ｉ−Ｓｙｔ Ｉ断片は以下に示す２種のＰＣＲ反応から構築されねばならなかった。
【０１５３】
【数６】

【０１５４】
上で示された鋳型ＤＮＡはブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 、クローン８２−８である。
【０１５５】
反応Ａ：プライマーとしてオリゴ１および２として引用されるオリゴヌクレオチドを用いて、０．２キロベース断片を産生する。
【０１５６】
【数７】

【０１５７】
反応Ｂ：プライマーとしてオリゴ３およびオリゴ４を用いて０．１キロベースの断片を産出する。
【０１５８】
【数８】

【０１５９】
前記のオリゴ２および３はＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸配列を変化させることなく、内部Ｐｓｔ Ｉ部位を除去するヌクレオチド配列での変化を含む。前記の反応ＡおよびＢのオーバーラップ産物のアリコート（２−５μｌ）は組合され、第３ＰＣＲ反応のための鋳型として役立った。この反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは前記ダイアグラムの番号１および４であった。０．３キロベースの産物はキアックスによりゲル精製され、Ｐｓｔ ＩおよびＳｔｙ Ｉで制限された。断片は無傷のままに留まったため、内部Ｐｓｔ Ｉ部位は成功裡に突然変異された。
【０１６０】
反応３：最終Ｖ_H 断片はＭＲＣ重鎖ベクターを鋳型として用いて産生された。この０．２３キロベースＳｔｙ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片はＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ４の一部、およびＭＲＣベクターからの全３′未翻訳領域を含んでいた。使用されたプライマーは以下のものであった：
【０１６１】
【数９】

【０１６２】
生成断片はゲル精製され、Ｓｔｙ ＩおよびＢａｍ ＨＩで制限された。Ｐｓｔ Ｉ−Ｓｔｙ ＩおよびＳｔｙ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いで配列化のためにＰｓｔ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ切断ブルースクリプトに連結された。
【０１６３】
すべてのオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ合成機で合成された。すべての配列反応はシーケナーゼ^TMＴ７ポリメラーゼキット（オハイオ、クリーブランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いて実行された。すべてのＰＣＲ_S は下記のプロトコルを使用して実行された：９５℃で５分。９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分よりなる３５サイクル、７２℃で５分の最終延長。
【０１６４】
正しい配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａＶ_L およびＶ_H 断片はブルースクリプトから除去され、ＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩ部位の間にクローンされた。重鎖に対しては、５′Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片はまずブルースクリプト内での構築物（Ｐｓｔ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ）の残部に結合された。全Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いでＭＲＣベクターにクローンされた。
【０１６５】
Ｃ．Ｖ_H およびＶ_L のＮ−末端アミノ酸配列化
Ｎ末端アミノ酸配列分析は、ＲＮＡ−ＰＣＲを用いて得られた配列を確認するために、ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖および軽鎖のサンプルについて、マサチューセッツ、ケンブリッジにあるハーバード・マイクロケミストリー・ラボラトリーにより実行された。サンプルは以下のように調製された：
ＬＯ−ＣＤ２ａの２００μｇがＢ−メルカプトエタノールの存在下で１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル走行全体にわたり適用された。電気泳動に続き、タンパク質はウエスタン移転機器を用いてＰＶＤＦ膜に移された。膜は短時間でポンソーＳで染色され、１％酢酸内で脱色され、また軽鎖および重鎖帯は真空下で乾燥されアミノ酸分析およびＮ末端配列化に送られた。
【０１６６】
ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H の最初の２０残基のアミノ酸配列はクローン配列と完全に一致した。しかしＦＲ１の２、３、７残基が、クローン遺伝子によりコード化されたものと異なっていることをＶ_L の配列が示した。これらの差異すべては、これまでに引用した文献から得られた最良の推定配列にもとづき、クローニング目的のために使用されるＰＣＲプライマーに存在する。
【０１６７】
Ｄ．Ｎ末端アミノ酸配列のＤＮＡ配列確認およびその補正
この配列を補正しまた同時にＬＯ−ＣＤ２ａのＶ_L およびＶ_H 双方の天然シグナルペプチドをクローンするために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ、Ｅｎｄｓ末端のＲａｐｉｄ急速Ａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ増幅−ＰＣＲ）が採用された。ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのｍＲＮＡは逆転写され、生成ｃＤＮＡはｄＧＴＰの存在下でターミナルトランスフェラーゼを用いてその３′末端でＧ尾部につなげられた。ｃＤＮＡは次いでＧ尾部に相補的な特異的３′オリゴヌクレオチドおよび５′オリゴヌクレオチドを用いて増幅された。サブクローニングを単純化するために、適切な制限部位が各オリゴヌクレオチドの５′末端に加えられた。
【０１６８】
ｃＤＮＡの調製のために使用されたオリゴヌクレオチドは下記のものであった。
【０１６９】
【数１０】

【０１７０】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲのオリゴヌクレオチドは下記の通りであった：
【０１７１】
【数１１】

【０１７２】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応は下記のプロトコルを用いて行われた：９４℃で５分。９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で５０秒の４０サイクル、続いて７２℃で５分の延長。
【０１７３】
ＬＯ−ＣＤ２ａ、Ｖ_L およびＶ_H で得られたＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲル抽出された。Ｖ_H 断片はＸｈｏ ＩおよびＳｔｕ Ｉで制限され、Ｘｈｏ Ｉ−Ｓｍａ Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。Ｖ_L 断片は平滑末端化されＳｍａ Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。数多くのクローンが軽鎖および重鎖Ｖ両領域に配列され、シグナル配列が確認された。
【０１７４】
免疫グロブリン遺伝子で見出されるシグナル配列が一般にイントロンを持っているために、これらは発現に重要となるであろう。Ｖ_L およびＶ_H リーダー配列を含むゲノムクローンは同様に確認された。ゲノムＤＮＡは以下の通り調製された：４×１０⁷ ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞が回転され、冷却ＰＢＳで洗浄され、回転され、ＰＢＳで再度洗浄された。細胞は（新鮮追加プロテイナーゼＫを持つ）消化緩衝液０．４ｍｌに再懸濁された。この混合物は振動させながら５０℃で１２−１５時間保温され、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出され、１７００ｘｇで回転された。水相は清浄な管に移され、１／２量の酢酸アンモニウム７．５Ｍおよび２量の９５％エタノールが加えられた。ＤＮＡは２分間、１７００ｘｇの回転でペレット化された。ペレットは７０％エタノールで洗浄され、空気乾燥された。ペレットは８０ｍｌのＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁された。
【０１７５】
鋳型として細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａから得られたゲノムＤＮＡを用いて、下記のオリゴヌクレオチドがＶ_L およびＶ_H 両方のゲノムリーダー配列、同じくユニーク制限部位（Ｖ_L ではＳｐｈ Ｉ、Ｖ_H ではＰｓｔ Ｉ）で終結するフレーワーク領域の部分を増幅するために指定された。
【０１７６】
【数１２】

【０１７７】
ＰＣＲ反応は以下の通り行われた：ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、オリゴＬＶＬおよびＢＫＡ（Ｖ_L 断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌあるいはＬＶＨおよびＰＶＨＡ（Ｖ_H 断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌ、１mm、ｄＮＴＰｓ１０μｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液１０μｌ。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）１μｌ（２．５単位）、１００μｌまでの脱イオン水。Ｐｆｕが使用された理由は、それがＴａｑポリメラーゼよりも精度が高いためであった。
【０１７８】
反応条件は以下の通りであった：９４℃５分、５０℃５分。９４℃１分、５０℃で１分、７２℃１分の３５サイクル、次いで７２℃で５分。ＰＣＲ産物はゲル精製され、制限され、配列化のためブルースクリプトに連結された。正しい配列を含むクローンが一度確認されると、これらのクローンを含むブルースクリプトベクターはＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｐｈ Ｉ（Ｖ_L ）あるいはＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＰｓｔ Ｉ（Ｖ_H ）で切断され、断片はゲル分離された。０．７５キロベースのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓｐｈ Ｉ断片は次いでもとのＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 構築物を含むブルースクリプトに連結され、それからＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓｐｈ Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然ＬＯ−ＣＤ２ａシグナルプラスイントロンおよび補正ＦＲ１配列（Ｎ末端配列と合致するもの）を含んでいた。０．１６キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片はもとのＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 構築物を含むブルースクリプトに連結され、それからＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然シグナル＋イントロンを含んでいた。新しく構築されたＶ_L およびＶ_H 断片は次いでＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去され、ＣＯＳ細胞での発現のためにＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれにクローンされた。
【０１７９】
Ｅ．ＣＯＳ細胞での一過性発現
ＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣ（アクセス番号ＣＲＬ−１６５１）から得られ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％を持つダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長した。最適形質移入は付着細胞の約５０％密集で達成された。形質移入の調製において、プラスミドＤＮＡがニューセラムおよびＤＥＡＥ−デキストラン／二リン酸クロロキンを含むＤＭＥＭに加えられた。ＣＯＳ細胞培地は除去され、ＤＮＡ混合物が加えられ、細胞は３時間３７℃で保温された。この培地が次いで除去され、ＰＢＳ内１０％のＤＭＳＯが細胞に２分間加えられ次いで除去された。ＦＢＳ１０％を持つＤＭＥＭが細胞に加えられた。一晩保温の後、培地は取り替えられ細胞は２日間３７℃で保温された。上澄みがキメラ抗体の分泌のためのエリザによる検定のために採取された。
【０１８０】
Ｆ．エリザによる分泌キメラ抗体の検出
キメラ抗体の分泌は、ヒト抗体（あるいはその部分）の存在を検出するために設計されたエリザでの形質移入ＣＯＳ細胞からの上澄みの検定により確認された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５μｇ／ｍｌの濃度に希釈され、エリザマイクロタイタ平板のウエルに１晩４℃での保温で付着された。平板は３回エリザ平板洗浄器を用いて洗浄された。
【０１８１】
残った遊離部位はウシ胎仔血清アルブミン１％を含むＰＢＳ２００μｌ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を１／２時間室温で加えることにより遮断された。上澄みおよび正の対照引用標準（精製ヒトＩｇＧ１Ｋ）のＰＢＳ−ＢＳＡでの２倍希釈液が用意された。培地のみおよびもしくはＰＢＳ−ＢＳＡのみが負の対照を構成した。抗体希釈液および対照はウエルに加えられ、室温で１．５時間保温された。平板は次いでトウィーン２０の０．０５％を含むＰＢＳ内で平板洗浄器で３回洗浄された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗体あるいはヤギ抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰ接合抗体の適切な希釈液が各ウエルに加えられ室温で１時間保温された。平板は前に記載の通りＰＢＳ−トウィーン２０で洗浄され、その後過酸化水素を含む成長基質（ＡＢＴＳ）が加えられた。結合抗体は４０５ｎｍの波長での吸光度を読み取ることで検出された。
【０１８２】
Ｇ．分泌キメラ抗体の結合特異性
キメラ抗体の結合特異性がＣＤ２発現突然変異体ジャーカット細胞系ＪＲＴ３−Ｔ３−５に結合する抗体のフローサイトメトリー分析により評価された。キメラ抗体（ヒトＩｇＧ１）の結合プロフィルは天然ラット抗体（ＩｇＧ２ｂ）および無関係の（非−ＣＤ−２）結合特異性を示すアイソタイプ付合対照ＭＡＢ_S （ヒトＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂ）の結合プロフィルと比較された。
【０１８３】
ＪＲＴ３−Ｔ３−５（ジャーカット）細胞系の調製
ジャーカット細胞系はＡＴＣＣ（アクセス番号ＴＩＢ−１５３）から得られ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％、アミノ酸補足物（ＮＣＴＣ）１０％、およびＬ−グルタミン６ｍＭを含むＤ−ＭＥＭ（完全培地）で増殖された。細胞は３７℃、炭酸ガス１０％で維持され、１：４の比率（継代での細胞濃度が約３×１０⁶ ／ｍｌになるように）で週当り３回継代された。ジャーカット細胞は収穫され、消費培地を除去するために遠心分離され、ＤＭＥＭで洗浄された。細胞は次いでアジ化ナトリウム（ＮａＡｚ）０．１％を持つ食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁され、細胞計量のためにアリコートが取りわけられた。生菌数はトリパンブルー排除により決定された。
【０１８４】
ジャーカット細胞の間接染色
細胞面染色が９６ウエルＵ型底部マイクロタイタ平板で行われた。９０μｌの量の約６×１０⁵ 細胞がマイクロタイタ平板の各ウエルに分配された。試験される抗体の希釈液はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳで調製され、１０μｌの量で適切なウエルに分配された。細胞は抗体と共に１５分室温で保温され、その後細胞はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳを各ウエルに加え２分間１９００ｒｐｍ（ソーバルＲＴ６０００Ｄ）で遠心分離して３回洗浄された。細胞の再懸濁は平板を緩やかにたたいて達成された。適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合二次抗体（抗ヒトＩｇあるいは抗ラットＩｇ）のアリコート１０ｕｌが適切なウエルに加えられ、室温で暗闇で１５分保温された。平板は前に記載の通りＮａＡｚ０．１％を持つＰＢＳで３回洗浄された。染色細胞はＰＢＳ内でパラホルムアルデヒド０．５％の２００μｌを追加することで固定され４℃で（１週間まで）貯蔵された。
【０１８５】
染色ジャーカット細胞のフローサイトメトリー分析
染色細胞はベクトン−ディキンソン・ファクスキャンを用いるデータ取得のために１２×１７mmポリスチレン管に移された。データ取得および分析はリシス−ＩＩソフトウエアを用いて行われた。ＣＤ２発現ジャーカット細胞はＬＯ−ＣＤ２ａ（ラットＩｇＧ２ｂ）ＭＡＢ、ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒトＩｇＧ１）のキメラ版、および対応するアイソタイプ付合対照と共に保温された。結合抗体は前に記載したプロトコルに従って適切なＦＩＴＣ接合二次抗体を用いて検出された。分析は天然ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびキメラヒト−ラットＬＯ−ＣＤ２ａの類似の結合パターンを示している。
【０１８６】
Ｈ．ＮＳＯ細胞における安定発現
安定した形質移入体にキメラ抗体を発現するために、グルタミン合成酵素遺伝子増幅システムがセルテック・リミテッド（英国、バークシャー）から得られた。このシステムはベビントン、他、バイオテクノロジー、１０巻、１６９−１７５ページ（１９９２年）に記載されている。使用された発現ベクターはｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２であった。このようなベクターは公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＷＯ８９／１０４０４に記載されている。これらベクターのいずれもがＣカッパあるいはＣガンマ１を含まないために、これら遺伝子のゲノムクローンはそれぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターから得られた。両定常部クローンは制限地図を得るため配列された。２個の構築物はｐＥＥ１２内で作られた。第１のものは軽鎖（Ｖ＋Ｃ）５′から重鎖（Ｖ＋Ｃ）までを含んでいた。第２の構築物は重鎖５′から軽鎖までを含んでいた。
【０１８７】
軽鎖を伴う戦略は以下の通りであった。
【０１８８】
１．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２それぞれはＸｍａ ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化された。
【０１８９】
２．キメラ軽鎖の５′、１．９３キロベース部分はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏ ＲＩを用いてＭＲＣベクターから除去された。この断片は以下に述べるようにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。
【０１９０】
【数１３】

【０１９１】
制限部位はアンダーラインされている。
【０１９２】
ＰＣＲは５′制限部位をＨｉｎｄ ＩＩＩからＸｍａ Ｉに変更し、コザックコンセンサス配列を構築物の５′末端に加えるために行われた。これは効果的な翻訳にとっては必須である（コザック、Ｍ．細胞生物学ジャーナル、１０８巻：２２９ページ、１９８９年）。３′ＰＣＲオリゴは続くクローニング段階に干渉する内部Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩ部位を除去するために使用される。ＰＣＲ突然変異誘発の最終産物は０．８５キロベースＸｍａ Ｉ−Ｍｓｃ Ｉ断片である。ＰＣＲ_S はＴＡクローニングキット（カリフォルニア、サンジェゴ、インバイトロジェン）で提供された指示に従って行われた。下記の条件がＰＣＲに使用された：９４℃で２分。続いて９４℃で１分、５５℃で２分、および７２℃で２分の３０サイクル。これは７２℃で５分の延長に続けられた。連結反応および形質転換がキット指示事項に従って行われた。数多くのクローンが前に記載の通り、ジデオキシ鎖終結法により配列された。補正クローンはＸｍａ ＩおよびＭｓｃ Ｉでの消化によりＴＡクローニングベクターから除去された。この断片はキアックスを使ってゲル精製された。
【０１９３】
３．２．７キロベースＣカッパ断片がＭｓｃ ＩおよびＥｃｏ ＲＩでの消化によりＭＲＣベクターから除去された。この断片はキアックスを使ってゲル精製された。
【０１９４】
２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ軽鎖、すなわち０．８５キロベースＸｍａ Ｉ／Ｍｓｃ Ｉ断片＋２．７キロベースＭｓｃ Ｉ／Ｅｃｏ ＲＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、そのそれぞれがＸｍａ Ｉ／Ｅｃｏ ＲＩで切断された。
【０１９５】
重鎖を伴う戦略は以下の通りであった。
【０１９６】
１．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２の両方が大腸菌菌株ＤＭ１に形質移入された。両ベクターはＥｃｏ ＲＩおよびＢｃ１Ｉで消化された（Ｂｃ１Ｉはもしもプラスミドがメチラーゼマイナス菌内で増殖するならば切断するだけであろう）。
【０１９７】
２．キメラ重鎖はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏ ＲＩでの消化によりＭＲＣベクターから除去された。生成２．７キロベース断片はキアックスを用いてゲル精製された。この断片はＮｈｅ ＩおよびＢｇ１ ＩＩで消化された。これは０．７キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｈｅ Ｉ断片および２キロベースＮｈｅ Ｉ／Ｂｇ１ ＩＩ断片を産生する。両断片はゲル精製された。０．７キロベース断片は次いでＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。
【０１９８】
【数１４】

【０１９９】
制限部位はアンダーラインされている。
【０２００】
このＰＣＲは５′制限部位をＨｉｎｄ ＩＩＩからＥｃｏ ＲＩに変更し更にコザックコンセンサス配列を加えるために行われた。３′オリゴは続くクローニング段階に干渉すると思われる内部Ｂａｍ ＨＩ部位を除去するために使用される。ＰＣＲｓ、連結反応および形質転換は前に記載された通りに行われた。
【０２０１】
２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ重鎖、すなわち０．７キロベースＥｃｏ ＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ断片＋２．０キロベースＮｈｅ Ｉ／Ｂｇ１ ＩＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、それぞれはＥｃｏ ＲＩ／Ｂｃ１ Ｉで切断された。
【０２０２】
（Ｂｃ１ ＩおよびＢｇ１ ＩＩは両立できる制限部位である）。
【０２０３】
キメラ軽鎖および重鎖両方を含むｐＥＥ１２での最終構築物は下記の通り作られた。
【０２０４】
軽鎖５′から重鎖まで：キメラ重鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇ１ ＩＩ／Ｂａｍ ＨＩで消化された。重鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．１キロベース断片はゲル精製され、キメラ軽鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ ＨＩ部位に連結された。正しい配向はＳａｌ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩでの消化により照合された。０．２８キロベース断片の存在は正しい配向を示している。
【０２０５】
重鎖５′から軽鎖まで：キメラ軽鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇｌ ＩＩ／Ｂａｍ ＨＩで消化された。軽鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．９キロベース断片はゲル精製され、キメラ重鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ ＨＩ部位に連結された。配向は前に記載の通りＳａｌ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩでの消化により照合された。
【０２０６】
ＮＳ／Ｏ細胞（ガルファー、他、酵素学での方法論、７３巻（Ｂ）、３−４６ページ（１９８１年）、ヨーロッパ動物細胞培養収集所に寄託されたＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３）が電気穿孔法により形質移入された。形質移入細胞はグルタミン無し培地での成長により選別された。ＣＤ２−発現ジャーカット細胞に対する抗体産生および結合活性は下記に記載されたように確認された。
【０２０７】
ヒト−ラットキメラ抗体の機能分析は、その機能性がラットＬＯ−ＣＤ２ａ抗体のそれと類似していることを示している。両抗体は抗体の１２０ｎｇ／ｍｌまでのナノグラム量が培養に加えられた時一次混合白血球反応（ＭＬＲ）を阻害する。更にキメラ抗体の一次ＭＬＲへの追加は、もとの同種異系抗原あるいは第三者同種異系抗原に攻撃するために応答個体集団に低応答性の状態を誘導する。低応答性はミトゲンあるいは破傷風トキソイドへの攻撃が増殖応答を誘導することで同種異系抗原に特異的である。
【０２０８】
〔実施例７〕
ヒト化抗体の構築および発現
Ａ．ヒト化軽鎖の構築
ＬＯ−ＣＤ２ａと相同性を分ち合いＨＵＭ５４００（ＥＭＢＬアクセスＸ５５４００）として名付けられたヒトＶカッパ遺伝子からのフレームワーク領域が軽鎖Ｖ領域のヒト化のために選ばれた。以下はＬＯ−ＣＤ２ａとＨＵＭ５４００のフレームワークの間の比較である：
【０２０９】
【数１５】

【０２１０】
ラットＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域配列、相同性ヒト可変領域、ＨＵＭ５４００、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの比較が図３９で示される。完全アミノ酸配列がＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のために与えられ、残基はラット配列に従って数が付けられている。ヒト化配列とＨＵＭ５４００配列で対応する位置にあるラットのそれと同一の残基は水平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コードで与えられる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域はＨＵＭ５４００フレームワーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ ＣＤＲ′ｓ（アンダーライン付き）、および７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラット配列の上に＊で指定されたもの）よりなり、これらはそのような残基がＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持することに関連するため選ばれた。
【０２１１】
図３９で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３までである。ＣＤＲ１はアミノ酸残基２４乃至３９である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基６２乃至９３である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０３乃至１１２である。リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１である（図４０、４１、４２）。フレームワーク領域内に保持されるラットアミノ酸残基はフレームワーク１のアミノ酸残基９および１２、フレームワーク２のアミノ酸残基は４１、４２、５０および５１、またフレームワーク３のアミノ酸残基は８２である。
【０２１２】
ヒト化軽鎖は、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＨＵＭ５４００の可変領域フレームワークを含むように構築されたが、ただ７個の異常残基（＊）はＬＯ−ＣＤ２ａのフレームワークから保持された。５′領域はキメラ軽鎖構築物から得られた。この０．４３キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｐｈ Ｉ断片は、天然シグナルプラスイントロンおよびラットとヒトフレームワークで同一であるフレームワーク１の最初の３個のアミノ酸残基をコード化する配列を含む。可変領域の最初の３個のアミノ酸を除くすべてのアミノ酸をコード化するヌクレオチドを含む構築物（０．３７キロベース）の残部（すなわち３′末端）は、６３−８１ヌクレオチドの大きさにわたる７個のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからＰＣＲにより合成された。これらの長いオリゴヌクレオチドは、それより短い５′および３′外部ＰＣＲオリゴヌクレオチド（長さ２１−２６のヌクレオチド）の鋳型として役立った。すべての場合で、鋳型５ｐｍｏｌがそれぞれの外部ＰＣＲオリゴヌクレオチド１００ｐｍｏｌと共に使用された。すべてのＰＣＲｓはより大きな適合度を達成するために、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて行われた。その手順は以下の通りであった：９５℃で５分。続いて９４℃で２分、５５℃で２分および７２℃で２分を含んだ２５サイクル。これはその後７２℃で５分の追加延長が続けられた。すべての合成は４段階で達成された。第１段階では、最初の長いオリゴヌクレオチドが０．４３キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｈｐｈ Ｈ断片に加えられた。次の３組のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドは、次いでＰＣＲを用いて連続的に加えられた。全０．８キロベース構築物の合成が完成された後、それはキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩで制限され、再びキアックスでゲル精製され、更にＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩ切断ブルースクリプト ＫＳ ＩＩに連結された。数多くのクローンが正しい版のものが得られるまで配列された。クローンは次いでＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去された。生成断片はキアックスでゲル精製され、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩで切断されたＭＲＣ軽鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図４０、４１、４２で示される。
【０２１３】
ヒト化軽鎖の合成で使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびその用途についての説明は以下の通りである。
【０２１４】
【数１６】

【０２１５】
オリゴヌクレオチド１、３、５、および７は逆補体配列である。
【０２１６】
オリゴヌクレオチド２、４、および６はセンス鎖配列である。
【０２１７】
オリゴヌクレオチド＃１はキメラ軽鎖構築物から誘導された０．４３キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｐｈ Ｉ断片をオーバーラップする。このオリゴヌクレオチドは、下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより０．４３キロベース断片に加えられた：
【０２１８】
【数１７】

【０２１９】
同じようなやり方で、オリゴヌクレオチド＃２および＃３が下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲによりお互いに縫い込まれた：
【０２２０】
【数１８】

【０２２１】
ＰＣＲの後、両産物はキアックスを用いてゲル精製され、次いで第３回のＰＣＲを用いて一緒に接合された。第３回のＰＣＲは下記のオリゴを必要とした：
【０２２２】
【数１９】

【０２２３】
生成断片はキアックスによりゲル精製された。オリゴヌクレオチド＃４および＃５は次いで下記のオリゴを用いるＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２２４】
【数２０】

【０２２５】
断片はゲル精製され、ＰＣＲオリゴを用いてこれまでの構築物に加えられた：
【０２２６】
【数２１】

【０２２７】
最終断片はオリゴヌクレオチド＃６および＃７ならびにＰＣＲオリゴを用いて構築された：
【０２２８】
【数２２】

【０２２９】
ゲル精製後、この断片はオリゴを用いるＰＣＲによりヒト化軽鎖構築物の残部に加えられた。
【０２３０】
【数２３】

【０２３１】
Ｂ．ヒト化重鎖の構築
ヒト抗体クローンＡｍｕ５−３（ジェンバンク・アクセス番号Ｕ００５６２）のフレームワーク領域がヒト化重鎖の生成のために使用された。下記はＬＯ−ＣＤ２ａのフレームワークおよびＡｍｕ５−３のそれとの比較である：
【０２３２】
【数２４】

【０２３３】
図４３はラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域配列、相同性ヒト可変領域Ａｍｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒト化Ｖｈ）を示す。完全アミノ酸配列がＬＯ−ＣＤ２ａに与えられ、残基はラット配列に従って番号を付される。ヒト化配列およびＡｍｕ５−３配列内の対応する位置にあるラットのそれと同一の残基は水平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コードで与えられる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ ＶｈはＡｍｕ５−３フレームワーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ ＣＤＲｓ、および７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラット残基上の＊により指定されたもの）よりなり、それらはＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持するために関係があるということで選択された。ラットおよびヒト化配列のＣＤＲ３での垂直線は３個の配列を整列するために必要であった空間を表しており、何故ならＡｍｕ５−３はラットおよびヒト化領域より長いＣＤＲ３を有していたからである。
【０２３４】
図４３で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残基３６乃至４９である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレームワーク３はアミノ酸残基６７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至１０７である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。リーダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である（図４４、４５、４６）。
【０２３５】
フレームワーク領域に保持されるラットＬＯ−ＣＤ２ａアミノ酸残基はフレームワーク２のアミノ酸残基４７であり、またフレームワーク３のアミノ酸残基６７、７０、７２、７６、８５および８７である。
【０２３６】
単一のヒト化重鎖構築物が作られた。この構築物は、ＬＯ−ＣＤ２ａから保持される７個の残基（＊）という例外はあるが、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＡｍｕ５−３のフレームワークを含む。この構築物はヒト軽鎖のそれと同じやり方で産生された。この場合、６９−８８のヌクレオチドのサイズにわたる１２個のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオチドがあった。１２個の外部ＰＣＲオリゴヌクレオチドは２１−２６のサイズにわたっていた。合成は各段階で１対のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオチドを加えて６段階で達成された。最終構築物（０．７キロベース）は前に記載した通りキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩで消化され、再びゲル精製され、前に記載した通りに配列化のためにブルースクリプトに連結された。正しいクローンが確認されると、それはＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩでの制限によりブルースクリプトから除去され、次いで同じ酵素で消化されたＭＲＣ重鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が図４４、４５、４６で示される。
【０２３７】
ヒト化重鎖の合成に使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびその用途の説明が以下に続く。
【０２３８】
【数２５】

【０２３９】
オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃１および＃２は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４０】
【数２６】

【０２４１】
生成断片はゲル精製された。
【０２４２】
オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃３および＃４は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４３】
【数２７】

【０２４４】
断片はゲル精製された。
【０２４５】
オリゴヌクレオチド＃５および＃６は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４６】
【数２８】

【０２４７】
ゲル精製後、この断片は下記のオリゴでＰＣＲによりオリゴヌクレオチド＃３および＃４で産生された断片に接合された：
【０２４８】
【数２９】

【０２４９】
生成断片はゲル精製された。
【０２５０】
オリゴヌクレオチド＃７および＃８は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２５１】
【数３０】

【０２５２】
生成断片はゲルに精製され、オリゴヌクレオチド＃３から＃６までを接合して作られた構築物に加えられた。これはＰＣＲオリゴを用いて実現された。
【０２５３】
【数３１】

【０２５４】
オリゴヌクレオチド＃３から＃８までを接合することにより作られた生成断片はゲル精製された。構築物（オリゴヌクレオチド＃１＋＃２）の５′末端が次いでＰＣＲオリゴを用いて加えられた。
【０２５５】
【数３２】

【０２５６】
この断片はゲル精製され、次の断片（３′）がオリゴヌクレオチド＃９および＃１０を用いて加えられた。
【０２５７】
オリゴヌクレオチド＃９および＃１０は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより接合された：
【０２５８】
【数３３】

【０２５９】
ゲル精製後、この３′断片はＰＣＲオリゴを用いて構築物の残部に加えられた。
【０２６０】
【数３４】

【０２６１】
生成断片はゲル精製され、構築物の残部に加えられた。
【０２６２】
オリゴヌクレオチド＃１１および＃１２は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより接合された：
【０２６３】
【数３５】

【０２６４】
ゲル精製後、この最終３′断片はオリゴ（５′）ＰＣＲ４Ｈ（センス）および（３′）ＰＣＲ６Ｊ′（アンチセンス）を用いて構築物の残部に加えられた。生成０．７キロベース最終構築物は前に指示された通り、ゲル生成され、配列化され、ＭＲＣ重鎖ベクターにクローンされた。
【０２６５】
ＣＯＳ細胞の一過性発現および分泌抗体の検出はキメラ抗体に対して前に記載された通り行われた。ヒト化抗体はアフィニティークロマトグラフィーにより精製された（タンパク質Ａ）。ジャーカット細胞に関する結合研究はＬＯ−ＣＤ２ａのヒト化形態とラット形態の間で類似の結合パターンを示している（図４７）。ＣＤ２を発現するジャーカット細胞系は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ）あるいはラットＩｇＧ２ｂもしくはヒトＩｇＧ対照と共に染色された。抗体濃度は０乃至４μｇ／ｍｌであった。ＬＯ−ＣＤ２ａのラットおよびヒト化形態はジャーカット細胞と類似の結合パターンで結合するが、一方ラットおよびヒトアイソタイプ対照抗体はそうではない。結合抗体はアイソタイプ特異的ＦＩＴＣ接合抗血清で検出された。図４７で示される結果は、前に述べられた濃度の範囲にわたり抗体で正に染色された細胞の割合として表現される。ヒト化抗体は更に一次ＭＬＲを阻害できることを機能研究が示している。ＬＯ−ＣＤ２ａ、ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ、ラットＩｇＧ２ｂ対照、あるいはヒトＩｇＧ１対照のナノグラム量が、指定された応答体および刺激体（照射細胞）からのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の等数を含む培養ウエルに加えられた。対照ウエルは抗体を全然含んでいなかった。培養は５日間保温され、次いで一晩トリチウム化されたチミジン（ ³ＨＴ）でパルスされた。増殖は ³ＨＴの取り込みで検出される。以下の表２で与えられるように、結果はベータ平板リーダーで記録された平均ＣＰＭ（１分間当り放射能カウント数）で表現される。
【０２６６】
【表２】

【０２６７】
ヒト化抗体はまた、（無関係の特異性を持つ）アイソタイプ対照がヒト抗体と置換される時ではなく、これらのＴ細胞が同種異系抗原およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で一次ＭＬＲで培養される時に（平均ＣＰＭで ³ＨＴの取り込みで測定されるように）Ｔ細胞にある同種異系抗原を攻撃するための低応答状態を誘導する（図４８）。ヒト化抗体の機能特性はラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれと類似する。
【０２６８】
〔実施例８〕
ＬＯ−ＣＤ２ａは同種異系抗原特異的低応答性を引き出す
一次培養のみへのＬＯ−ＣＤ２ａの追加に続き二次ＭＬＲにおける同種異系抗原を認識するＴ細胞の能力が試験された。一次ＭＬＲ培養がＬＯ−ＣＤ２ａ、対照抗体（ＬＯ−ＤＮＰ１１、マサチューセッツ、チャールズタウン、バイオトランスプラント，インコーポレイテッド）の存在下で、あるいは無抗体の下で応答個体細胞および照射刺激細胞を含み、７日間保温された。細胞は次いで洗浄され、追加の３日間培地のみで休止された。休止期間の後、培養細胞はもとの刺激細胞あるいは異なった供与体から得られた細胞（「第三者」細胞）で再攻撃された。
【０２６９】
これらの研究からの代表的な実験結果が図４９で図示される。パネルＡでは、応答個体細胞が２００ｎｇ／ｍｌで対照抗体の存在下で培養された時に一次応答が観察されたが、ＬＯ−ＣＤ２ａが２００ｎｇ／ｍｌでの存在下で培養された場合には応答は監視されず、これはこれまでに報告されたデータと合致した。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。データは個別ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提供された。
【０２７０】
図４９ｂで描かれているように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに何らの抗体も存在せずに１：１の割合で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原に再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された細胞の応答は対照として含まれる。データは個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図４９ａで描かれた同じ実験からのものである。
【０２７１】
図５０Ｃで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体の存在下で特異的同種異系抗原で一次ＭＬＲ内で刺激された細胞は、次いで二次培養に存在する何らの抗体の存在なしで１：１の比率で第三者供与体からの細胞を運ぶ同種異系抗原で攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。対照抗体あるいはＬＯ−ＣＤ２ａで一次ＭＬＲ内で培養された自己由来刺激細胞に対する細胞の応答は対照として含まれる。データは個々のウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図４９ａおよびｂで描かれた同じ実験からのものである。
【０２７２】
一次培養で対照抗体の存在下で培養された細胞は、一次培養でのそれと同じ同種異系刺激細胞による再攻撃に応答性であり（パネルｂ）、また第三者細胞による刺激に対しても応答性であった（パネルｃ）。それに反して、一次ＭＬＲの間でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養された細胞は、一次同種異系刺激細胞での再攻撃（パネルＢ）あるいは第三者細胞による刺激（パネルｃ）のいずれに対しても応答性でなかった。ＬＯ−ＣＤ２ａを含む培養での細胞は生存でき、同種異系抗原以外の刺激に応答性であった。例えばＰＨＡあるいは可溶ＯＫＴ３のいずれかによる刺激は、ＬＯ−ＣＤ２ａ対照抗体、あるいは新鮮自己由来ＰＢＭＣで培養された細胞で同等の増殖応答を引き起こした（データは示されていない）。休止後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析は細胞表面でのＬＯ−ＣＤ２の検出を果せなかった（データは示されていない）。かくしてこれらのデータは、ＬＯ−ＣＤ２ａおよび同種異系抗原への露出が続く同種異系抗原低応答性、すなわち耐性の状態を誘導することができることを示している。
【０２７３】
同種異系抗原刺激の間に、ＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導された低応答性の明らかな同種異系抗原特異性にアドレスするために、同種異系抗原刺激の後に培養から得られた細胞は、可溶タンパク質抗原、すなわち破傷風トキソイドに応答するために攻撃された。可溶抗原応答は７日後に同種異系抗原刺激培養で喪失した生存可能な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在を必要とする。従ってこれらの研究では、ＡＰＣの新鮮源が照射自己由来ＰＢＭＣを二次検定培養に加えることにより培養細胞に提供された。図３８Ａで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに存在するいずれの抗体の存在もなしで１：１の比率で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原で再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日での収穫培養で測定された。ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された自己由来刺激細胞に対する細胞の応答はまた対照として含まれる。データは個別のウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データの時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。
【０２７４】
図５１ｂで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次培養に存在するいずれの抗体もなしで７．５μｇ／ｍｌの破傷風トキソイドで再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日での収穫培養により測定された。抗体および自己由来刺激細胞なしの一次培養で培養された細胞の応答は、破傷風トキソイドに対する応答の対照として役立った。
【０２７５】
図５１ａおよびｂで示される結果は、一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａプラス同種異系抗原で培養された細胞が二次ＭＬＲ内での同種異系抗原に対し低応答性であったけれども、この細胞は新鮮ＡＰＣにより提示された時には破傷風トキソイドに対し応答性であったことを示している。
【０２７６】
〔実施例９〕
ＬＯ−ＣＤ２ａのＦｃ部分の役割にアドレスするために、Ｆ（ａｂ′）₂ 断片の機能作用を全抗体と比較する研究が行われた。
【０２７７】
図５２で示されるように、ＰＢＭＣが照射エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞系と共に応答個体細胞対刺激細胞２：１の割合でまたＬＯ−ＣＤ２ａあるいはそのＦ（ａｂ′）₂ 断片の用量を増加させながら６日間培養された。このグラフは４人の異なった供与体の応答に対するＦ（ａｂ′）₂ 断片の作用を描き、また各時点は各データ時点での三つ組ウエル運動の平均値である。結果は対照応答の割合として報告される。グラフを明確にするために、全ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体を追加したものからのデータは示されていない。全ＬＯ−ＣＤ２ａの３０ｎｇ／ｍｌの用量で、供与体の応答は：対照に対し供与体１−１８％、供与体２−６．６％、供与体３−３．７％、および供与体４−１２％であった。試験された個体からの存在する抗体なしの細胞応答は、平均値が５６，６９０ｃｐｍから４０４，８４３ｃｐｍにわたり、また個体ウエルからのｃｐｍは平均値の１０％以内であった。
【０２７８】
Ｆ（ａｂ′）₂ 断片の潜在阻害性を更に評価するために、Ｆ（ａｂ′）₂ 断片の用量滴定が、可溶ＯＫＴ３（ＡＰＣ依存性応答）で刺激された未分画ＰＢＭＣに加えられた。図５３で示されるように、ＰＢＭＣは可溶ＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激された。ＬＯ−ＣＤ２ａの無傷抗体あるいはＦ（ａｂ′）₂ 断片のいずれかが用量を増加して０日に加えられた。結果はアイソタイプ付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割合で表現される。各データ時点は個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった三つ組ウエルの平均値である。抗体なしでの刺激されたＰＢＭＣに対する平均ｃｐｍは６０，１１７であった。
【０２７９】
図５３の結果はＯＫＴ３に対するＴ細胞の増殖が、Ｆ（ａｂ′）₂ 断片が使用された時には阻害されなかったことを示している。
【０２８０】
〔実施例１０〕
ＡＰＣは試験管内培養におけるＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性を必要とする
ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性でＡＰＣの役割の問題をアドレスするために、ＰＢＭＣのＴ細胞集団は免疫磁性選別によりＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ正細胞を喪失された。精製細胞のフローサイトメトリー技術による分析は、ＡＰＣ集団が９５％以上喪失したことを示した（データは示されていない）。可溶ＯＫＴ３に対するこれら精製Ｔ細胞の増殖（ＡＰＣ依存性応答）はこの喪失により未分画ＰＢＭＣの増殖の１％以下に減少した（データは示されていない）。精製Ｔ細胞あるいは未分画ＰＢＭＣは、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で平板結合ＯＫＴ３（Ｔ細胞刺激のＡＰＣ非依存性方法）により刺激された。Ｔ細胞活性化を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａの能力はＡＰＣが除去された時に取り除かれた（図５４）。図５４で示されるように、ＰＢＭＣあるいは免疫磁性技術によりＡＰＣを喪失させたＰＢＭＣは、ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエル平板で平板培養され、３日間培養された。ＬＯ−ＣＤ２ａは培養の開始時に加えられた。結果はアイソタイプ付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割合として表現される。プロットされたデータは３種の実験を表わしており、ここで各データ時点は個別ウエルからのｃｐｍが平均値１０％以内にあった三つ組のウエルの平均値である。
【０２８１】
〔実施例１１〕
第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭＥＤＩ−５０７）の構築と分析
ベクターの構築
ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（実施例７Ｂ）重鎖の第一世代の追加突然変異誘発が抗体の結合性質を改良するために実施された。４個の追加ラットフレームワーク残基が実施例７に記載された分子に保持された７個に加えて保持された。これら４個のアミノ酸変化は３個のＰＣＲ突然変異誘発実験を用いて行われた（ＰＣＲｓの１個は２個のアミノ酸が変化されるよう導いた）。
【０２８２】
すべてのＰＣＲはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア，ラホーラ，ストラーダジーン）および下記のプログラムを用いて行われた：９５℃で５分。７２℃で５分。９４℃で１分、５５℃で１分、更に７２℃で１分の２５サイクル。次いで７２℃で５分の延長。鋳型ＤＮＡは第一世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａＶ_H 領域から分離された７０１塩基対（確認されたい）ｈｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片であった。使用されたオリゴヌクレオチドは下記の表３でリストされている。
【０２８３】
【表３】

【０２８４】
反応＃１はオリゴヌクレオチド８７７と１００７を含み１８５塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これは２個の追加ラットＬＯ−ＣＤ２ａ抗体残基をアミノ酸（ＡＡ）１２と１３（Ｇｌｎ１２とＡｒｇ１３）でフレームワークＦＲ１に保持した。（残基はキャバット他、免疫学関連タンパク質の配列、第４版、１９８７年、保健社会福祉省、公衆衛生総局、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスに従って番号を付された）。
【０２８５】
反応＃２はオリゴヌクレオチド１００６と８７５を含み５１５塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これはまたＡＡｓＧｌｎ１２とＡｒｇ１３で２個のラット残基を保持した。
【０２８６】
反応＃３はオリゴヌクレオチド８７７と１０１２を含み２９０塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これは位置４８でラットＬＯ−ＣＤ２ａ残基を保持した。
【０２８７】
反応＃４はオリゴヌクレオチド１０１１と８７５を含み同じ位置４８でラット残基を保持する断片を生成した。
【０２８８】
すべての反応産物はキアックス（カルフォルニア，チャッツワース，キアージェン）を用いて精製された。反応産物は次いで以下の通り７０１塩基対Ｖ_H 断片を生成するために追加のＰＣＲを受けた。反応＃５は反応＃１と＃２の反応産物、およびオリゴヌクレオチド８７７と８７５を含んでいた。反応＃６は反応＃３と＃４の反応産物、およびオリゴヌクレオチド８７７と８７５を含んでいた。
【０２８９】
位置２８で突然変異を得るために、（イソロイシン）ＰＣＲが反応＃５（すなわちＧｌｎ１２，Ａｒｇ１３を含む）から鋳型を使用して設定された。反応＃７はオリゴヌクレオチド８７７と１０２０を含み、２３０塩基対ＤＮＡ断片を生成し、それは位置２８でラット残基を保持した。反応＃８はオリゴヌクレオチド１００８と８７５を含み同じく位置２８でラット残基を保持する４７０塩基対ＤＮＡ断片お生成した。キアックス（カリフォルニア，チャッツワース，キアージェン）を用いる反応産物の精製に続き、反応産物は次いで７０１塩基対Ｖ_H 断片を生成するために追加のＰＣＲを受け、続くＤＮＡ配列化のためにピーブルースクリプト／Ｓｍａ（カリフォルニア，ラホーラ，ストラータジーン）にクローンされた。
【０２９０】
配列分析に続き、２個の断片はキアックス（カリフォルニア，チャッツロース，キアージェン）を用いてゲル分離された：（１）４個の新しいアミノ酸変化の内３個を含む２７０塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＮＩ（Ｈｕ Ｖｈ ｍｕｔ １＋２Ａ）、および（２）第４のアミノ酸変化を含む４３０塩基対ＥｃｏＮＩ／ＢａｍＨＩ（Ｈｕ Ｖｈ ｍｕｔ ３Ｄ）、である。断片は次いで実施例６Ｂで説明されたＭＲＣ重鎖ベクターに連結され、これは最終クローンであるクローン＃２５７−２０を産生するためにＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の間にヒト重鎖定常部を含んでいた。軽鎖発現ベグダは第一世代発現ベクター（２０２−２）で使用されたものと同じであった。
【０２９１】
図５７はモデル化過程で使用されたラット抗体とヒト重鎖可変配列と平行に整列された第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａＶＨ断片（ＭＥＤＩ−５０７）のアミノ酸配列を示す。
【０２９２】
ＭＲＣベクターを用いるＣＯＳ細胞での一過性発現
２個のベクターがそれぞれヒト化軽鎖・重鎖の発現のためにメディカル・リサーチ・カウンシル（英国，ロンドン，ＭＲＣ）からライセンスされた（図５７）。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖｌｌｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として抗リゾチームのヒトカッパ定常部をヒト化Ｖ_L 領域のゲノムクローンを含む。８．６キロベース重鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として抗リゾチームのヒトγ１定常部とヒト化Ｖ_H 領域のゲノムクローンを含む（前田、他、１９９１年、ヒト抗体ハイブリドーマ、２巻、１２４−１３４ページ）。抗リゾチームＶ_L およびＶ_H 領域は制限消化により除去され、ヒト化Ｖ_L 及びＶ_H 構築物はその適所に挿入された。２個のプラスミドは次いでＣＯＳ−７細胞に同時形質移入された。
【０２９３】
ＣＯＳ−７細胞はＡＴＣＣ（アクセス番号ＣＲＬ−１６５１）から得られ、２個の表面積１７００cm² 波形プラスチックローラーボトル（ニューヨーク，コーニング，コーニング）で４０−６０％密集になるまでＦＢＳ／ＤＭＥ培地で成長した。すべての培地は除去され、３７℃で形質移入培地で置換された〔ヌーセラム１０％（マサチューセッツ，ウォルサム，コラボレイティブ・リサーチ，インコーポレイテッド）、ＤＥＡＥ−デキストラン・クロロキン２リン酸、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖ＤＮＡ、０．２５ｍｇ，軽鎖ＤＮＡ、０．２５ｍｇを持つＤＭＥＭ〕。ローラーボトルは保温器およびローラーボトル設備１２３時間戻され、その後すべての培地で除去され３７℃でＰＢＳ内ＤＭＳＯ１０％で置換された。接触の２乃至５分後、ＤＭＳＯ溶液は除去されＦＢＳ／ＤＭＥＭで置換された。ローラーボトルは保温器およびローラーボトル設備に１日３７℃戻され、その後培地は除去され処分され（タンパク質の集積はこの時点では収穫にはあまりにも低すぎると考えられ）、次いで新鮮な同じ培地で置換された。３７℃で２、３日間保温された後、各ローラーボトルの培地の半分が除去され新鮮同一培地で置換された。この過程は約３回の収穫が得られるまで繰り返された（その時点以後は収穫量は減少した）。収穫された上澄みはエリザでヒト化ＩｇＧの存在を検定された。
【０２９４】
生成する抗体はアフィニティークロマトグラフィーで形質移入ＣＯＳ細胞から精製された（タンパク質Ａ）。このヒト化抗体の試験管内活性が３個の実験方式：ジャーカット細胞との結合、一次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害、および二次ＭＬＲのアロ抗原（同種異系抗原）への低応答性の誘導、を用いてラットＬＯ−ＣＤ２ａの活性と比較された。一過性発現で産生されたヒト化抗体の機能性はラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれと類似しており、後にＮＳＯ細胞での安定抗体発現で確認された。
【０２９５】
セルテックベクターを用いるＮＳＯ細胞での安定発現
臨床用途のための組換え哺乳類遺伝子産物の生物産生は、タンパク質の適切な処理と安全な生物学的活性を達成するためにより高次の真核細胞の使用を一般に必要とする。不死化げっ菌類細胞は、費用のかからない培地で高密度で成長する能力、高い生産性、および移植後処理の適合度に起因してこの目的のための現在選択のシステムである。２個の望ましいシステムは、１）マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞でのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、選択（ベビントン、他、１９９２年、バイオ／テクノロジー、１０巻、１６９−１７５ページ）、および２）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ マイナス）細胞でのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）増幅（カウフマンおよびシャープ、１９８２年、分子生物学ジャーナル、１５９巻、６０１−６２１ページ）である。
【０２９６】
ＮＳＯ細胞でのグルタミンシンテターゼシステムは第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭＥＤＩ−５０７）の安定発現と結果として生じる産生に利用された。ＮＳＯ細胞は生存のために付加グルタミンに、あるいは外因性ＧＳ遺伝子の導入に絶対必要なグルタミン栄養要求体である（ベビントン、他、１９９２年）。発現システムはグルタミン欠損培地でＧＳ遺伝子と免疫グロブリン遺伝子を運ぶ細胞を選択するためにこの性質を利用する（コケット、他、１９９０年、バイオテクノロジー（ニューヨーク）、８巻、６６２−６６７ページ）。細胞がグルタミンシンテターゼのレベルを増加できる一つの方法は、隣接遺伝子のコピー数の付随増幅を用いてＤＮＡ増幅の遺伝子コピー数を増加させることである。増加遺伝子用量に潜在するものは、遺伝子産物、この場合グルタミンシンテターゼと免疫グロブリン両方の産生の増加である。
【０２９７】
使用されたセルテック発現ベクター（図４４）はｐＥＥ６ＣＭＶ−ＢとｐＥＥ１２であった（公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ８６／０５８０７，ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＷＯ８９／１０４０４に記載されている）。これらのベクターいずれもＣカッパあるいはＣガンマ１を含んでいなかったため、これらの遺伝子のためのゲノムクローンはそれぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターから得られた。両方の定常部クローンは制限地回を得るため配列化された。
【０２９８】
ＭＲＣベクターとセルテックベクターの間の差（軽鎖と重鎖のＭＲＣベクターは別個であり、セルテックベクターでは重鎖が軽鎖の後につきｈＣＭＶプロモーター領域で分離されている）の故で、軽鎖と重鎖の構築物に以下の変更を行うことが必要であった。
【０２９９】
一過性発現ヒト化ＢＴＩ−３２２軽鎖構築物をセルテックベクターにクローンするために、以下の変更が行われた。軽鎖クローン、クローン＃２０２−２はＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＨＩで消化され、１．９３キロベース断片がゲル精製された。この断片は５′制限部位をＸｍａＩに変更し翻訳開始コンセンサス配列を加えるためにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として役立った（コザック，１９９８年，点突然変異は真核リボソームによる翻訳を調節するＡＵＧ開始コドンに隣接する配列を定義する。細胞４４巻、２８３−２９２ページ）。このＰＣＲ反応はまた後でのクローニング段階を可能とするために内部ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位を除去するために使用された。生成０．８５キロベースＰＣＲ産物は配列化され、次いでＸｍａＩ／ＭｓｃＩで消化された。クローン＃２０２−２は次いでＭｓｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化され、２．７キロベース断片はゲル分離された。０．８５キロベース断片と、２．７キロベース断片の３方向連続はそれらをポリリンカーのＸｍａＩとＥｃｏＲＩ部位の間でｐＥＥ１２に挿入することで実行された。生成クローンはクローン＃２３７−４と名付けられた。
【０３００】
重鎖構築物のセルテックベクターへの挿入は下記の変更を必要とした：クローン＃２５７−２０はＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化され、全２．７キロベース重鎖はゲル分離された。この断片は次いで更に０．７キロベースＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片と、２．０キロベースＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩ断片を産生するためにＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩで消化された（Ｂｇ１ＩＩ部位はもとのクローンの３′末端に非常に近く、つまりＥｃｏＲＩ部位から２０塩基対離れている）。０．７キロベースＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片は次いで５′制限部位をＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩに変更し、また翻訳開始コンセンサス配列を加えるためにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された（コザック、１９８６年、細胞、４４巻、２８３−２９２ページ）。３′末端もまた内部ＢａｍＨＩ部位を除去することで変更された。生成断片は配列化された。正しいクローンが発見された時、３方向連続は以下の通り行なわれた：０．７キロベースＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ断片と、２．０キロベースＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩ断片はポリリンカーのＥｃｏＲＩとＢｃ１Ｉ部位の間でｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂに連続された（Ｂｃ１ＩとＢｇ１ＩＩは適合部位である）。成功裡に細菌形質転換がＰＣＲにより確認された後、これらのクローンの一つ、クローン＃６と指定されたものが最終発現ベクターを構築するために使用された。
【０３０１】
これを行うために、ヒト化重鎖プラスそのｈＣＭＶプロモーターを含むクローン＃６から誘導された６キロベースＢｇ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片がｐＥＥ１２／ヒト化軽鎖ベクター２３７−４のＢａｍＨＩ部位に挿入された。大腸菌への形質転換の後、正しい配向に軽鎖と重鎖の両方を含むクローンを確認するために、５分間煮沸された細菌コロニー（コロニーＰＣＲ）から得られた鋳型ＤＮＡを使用してＰＣＲで行われた。２個のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーが軽鎖の３′末端から重鎖の５′末端にわたる領域を増幅するよう設計された。クローン＃１２は正しいと確認された。このクローンが軽鎖と重鎖の挿入片を適切な配向で含んでいることを更に確認するために、プラスミドＤＮＡはこのクローンから分離されＤＮＡはＢａｍＨＩ／ＳａＩＩで消化された。小さな０．２５キロベース断片のクローン＃１２からの放出は、重鎖およびｈＣＭＶプロモーターを含む６キロベースＢｇ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片で正しい５′から３′への配向にあることを指示していた（もし配向が逆転していたなら、ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉ消化は６．３キロベース断片を産生していた筈であったであろう。
【０３０２】
ＮＳＯ細胞系での安定発現
Ｓａ１Ｉで線型化されたクローン＃１２ＤＮＡは、セルテックのグルタミンシンテターゼ遺伝子増幅システム−操作手順マニュアルに従ってＮＳＯ細胞の形質転換のために使用された（第２版：骨髄腫細胞での使用のために、改訂版５、６−１４ページ、１９９２年１１月５日）。細胞は３μＦ、１５００ボルト、２パルスで電気穿孔された（１０⁷ ＮＳＯ細胞当り４０μｇが形質移入された）。電気穿孔の後、細胞はＦＢＳ／ＤＭＥ１０％の５０μＬ／ウエルでウエル当りそれぞれ１６，０００、４，０００、および１０００個の細胞の４−６平板上で平板培養された。次の日、１０％透析ＦＢＳを持つグルタミン無しＩＭＤＭの１５０μＬ／ウエルが平板に加えられた。コロニーがグルタミン無し培地で９６個のウエル平板上で成長していることが確認されるとコロニーは標識された（ＭＥＤＩ−５０７抗体遺伝子の遺伝子に結合されたグルタミンシンテターゼの遺伝子をそれらが取り込んだことを示唆している）。形質移入が前に記載のＤＮＡで実行されたことから、全体で２０４コロニーがエリザでスクリーンされ、最高の力価で選択された。約１／３のコロニーは４８個のウエル平板での抗張のために選択され、５日保温され、次いでＴ−２５フラスコで抗張された。著しい細胞成長がどれか特定のＴ−２５フラスコで（更に通常３−６日の内に）生じた時、そのフラスコは更に２，３個のＴ−２５フラスコそれぞれに５×１０⁴ 生存可能細胞／ｍｌに分割された。これらフラスコの一つはフラスコが妨げられることなく２−３週間成長できるようにして抗体産生を調べるために使用された。他のフラスコは細胞成長率を測定し、どの細胞系が抗体産生、細胞成長、および無血清培地成長への適応性に基づいて更に検査しクローニングする価値があるかどうかを決定できるまで各種細胞系を増殖させるために使用された。この時点で約５週間にわたり、細胞は各継代の前に必ずしも細胞計数を行わないで、細胞系がフラスコからフラスコに単に継代するよう増殖のために使用された。この期間の終りに、サブクローニングが前に説明された基準により決定されて、もっとも有望な細胞系のいくつかで開始された。ＭＥＤＩ−５０７ｈｕ２．２．４０４は１６Ｋ細胞／ウエル平板で藩主された平板からのものであった。サブクローニングは０．５および５細胞／ウエルでそれぞれ２個の平板上でクローンＭＥＤＩ−５０７ｈｕ２．２．２０４．Ｘについて行われ、約３週保温するようにされた。
【０３０３】
クローン＃２０４．１１と標識されたサブクローンは５細胞／ウエル平板上で生成された（もともと開始生存細胞密度を計算していた）。この特定平板は９６ウエルの３３個で成長した。（全平板からの）２９個のクローンは標識されエリザでスクリーンされた。２９個の内５個のクローンは４８個のウエル平板に、次いで保温のため続く５−７日Ｔ−２５フラスコに抗張のために選別された。全部で５個のクローンが更に５−７日保温され、次いでＴ−７５フラスコで抗張された。５−７日後、これらのフラスコからの細胞は各クローンの凍結ガラスビンを準備するために使用され、細胞の残りは抗体産生率、成長率、および無血清培地への適応性を検査するために使用された。スクリーニング過程が終了した後、最良細胞系の最良クローンの凍結ガラスビンのものが解凍され、それぞれのいくつかのガラスビンを定住のために拡張され、更に培養で評価された。
【０３０４】
ヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａの試験管内機能性と生物学的性質の比較
相対的結合親和性、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害、二次ＭＬＲでアロ抗原に低応答性を誘導する能力、およびＨｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウスにおけるＣＤ２細胞喪失によるラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれに対するヒト化ＭＥＤＩ−５０７の機能活性および生物学的活性を比較する研究が行われた。その結果は２個の抗体が類似に行動することを示す。
【０３０５】
ジャーカット細胞への相対的結合
ジャーカット細胞ベースの結合検定がヒトＭＥＤＩ−５０７（ロット、ＰＡ１１２８９５）の研究ロットの競合結合をラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）のそれと比較するために実施された。１．３×１０⁶ 細胞／ｍｌの細胞密度でジャーカット細胞３００μＬが４℃で ¹²⁵Ｉ−標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａの４ｍＭ溶液２０μＬおよび冷却（未標識）ラットＬＯ−ＣＤ２ａあるいはヒト化ＭＥＤＩ−５０７の８０μＬと共に保温された。標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａの有効濃度は０．２ｎＭであった。未標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびヒト化ＭＥＤＩ−５０７は２ｎＭから０ｎＭまで変化した。冷却ＬＯ−ＣＤ２ａの有効濃度は２０ｎＭを含む管が非特異的結合のための対照として役立った。
【０３０６】
４℃で３０分保温の後、この反応混合物２４０μＬは細いポイプロピレン管でシリコン油混合物５０μＬ（ＡＲ−２００の２：１（ｖ／ｖ）：トーマス・シリコン・オイル）の最上部に層状に置かれ、微小遠心分離機で１４，０００×ｇ、５分遠心分離された。標識抗体の結合抗体からの分離は細胞をオイルプラグを通して沈澱させることで達成された。油層は切断され計数された。分離前の反応混合物１００μＬが全投入ｃｐｍを決定するために直接計数された。検定の分析はラットＬＯ−ＣＤ２ａとヒト化ＭＥＤＩ−５０７の間で類似の結合パターンを示している。
【０３０７】
ＭＬＲの阻害
混合リンパ球反応を阻害するラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）と２個の異なった研究ロットのヒト化ＭＥＤＩ−５０７（ロットＱＡＳとＡＳＱ）の能力が試験された。照射ヒト刺激体ＰＢＭＣがラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７、および適切なアイソタイプ対照の１０乃至６０ｎｇ／ｍＬにわたる濃度での存在下で異なった供与体からのヒト応答個体ＰＢＭＣと共に保温された。５日間３７℃の保温で、培養は ³Ｈ−チミジンでパルスされ、チミジン取り込みが決定された。この結果（図４６）は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａとヒト化ＭＥＤＩ−５０７の両方が用量依存の方式で同じようにＭＬＲを阻害することを示している。
【０３０８】
低応答性の誘導
ラットＬＯ−ＣＤ２ａの重要な生物学的性質は試験管内アロ抗原特異的低応答性を誘導する能力である。低応答性を誘導するヒト化ＭＥＤＩ−５０７（ロットＱＡＳとＡＳＱ）の能力でラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）のそれと比較された。
【０３０９】
一次ＭＬＲｓがヒト化ＭＥＤＩ−５０７、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ，あるいは適切なアイソタイプ対照、および無抗体の対照培養で１０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの存在下で実行された。７−８日保温後、細胞は培養から分離され、フィコール液に入れられ、洗浄され、培養培地で再懸濁されまた３７℃で３−４日「休止」を許された。これらの培養からの細胞はもとの供与体からの照射刺激体細胞を含む二次ＭＬＲ培養で応答固体細胞として使用された。培養は次いで追加で４８時間保温され、 ³Ｈ−チミジンでパルスされ、またチミジン取り込みが決定された。結果の分析（図６１）はヒト化ＭＥＤＩ−５０７もアロ抗原の攻撃に対し低応答性の状態を誘導することを示している。
【０３１０】
ＣＤ２細胞喪失
マウス（Ｈｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウス）に移植されたヒトＣＤ２受容体に対するヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａの作用が比較された。２５匹のＨｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウスが５グループの一つに割当てられ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７（０．１２ｍｇ／ｋｇあるいは０．００６ｍｇ／ｋｇ）、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．１２ｍｇ／ｋｇあるいは０．０６ｍｇ／ｋｇ）、もしくは緩衝液対照（５匹のマウス／グループ）を受けた。マウスは０日（用量を受ける前）、１、３、７、１４、２１、２８、３６および４４の各日に採血され、血液はＣＤ２リンパ球を分析された。
【０３１１】
全血液はヘパリンを含む管に収集された。２０μＬアリコート４個が９６ウエル、円底組織培養平板に分配され、適切な抗体で染色され、赤血球を溶解し染色細胞を固定するためにＦＡＣＳライスで処置された。非結合抗体と細胞破片を除去するための洗浄の後、残存リンパ球集団がフローサイトメトリーで分析された。
【０３１２】
図６２は、低用量のヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．００６ｍｇ／ｋｇ、これらのマウスでそれは０．１５μｇ用量になる）がＣＤ２細胞総数に何ら検出可能な作用を与えなかったことを示した。これらのマウスは１４日の時点以後は検査されなかった。高用量のヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．１２ｍｇ／ｋｇ、これらのマウスでそれは３．０μｇ用量になる）はＣＤ２細胞総数に大きな喪失作用を与えた。ヒト化およびラット抗体を高用量で処置した遺伝子導入マウスにおけるＣＤ２保持細胞の補充も比較できた。
【０３１３】
（産業上の利用可能性）
以上のように、この発明はヒトあるいは非ヒト霊長類におけるＴ細胞の活性化および増殖を阻害して移植片拒絶反応を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａからのヒト化抗体を産生し、合せて、免疫応答を阻害しまた移植片拒絶を阻害する方法も開示される。
【０３１４】
この発明の数多くの修飾および変更が前記教訓を考慮して可能であり、また従って、前に記載した請求の範囲内でこの発明は特に記載されたもの以外にも実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ビオチン化ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂＰＥを用いる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２色染色
この染色のために下記のパラメータが続いた。
【図２】 ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次いでａ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコールター抗体）、あるいはｂ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ−５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いずれの場合もＬＯ−ＣＤ２ａでの前処理により変更された二次抗体による染色はなかった。
【図３】 ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次いでａ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコールター抗体）、あるいはｂ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ−５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いずれの場合もＬＯ−ＣＤ２ａでの前処理により変更された二次抗体による染色はなかった。
【図４】 膜マーカーに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２×１０⁶ 細胞／ｍｌでのＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破線）で培養された。図面で示された時間で、細胞は採取されサイトフルオロメーター分析のために処理された。ａ）およびｂ）；ＰＢＭＣは抗ＣＤ３（Ｌｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ）ｍＡｂｓ、抗クラスＩＩ抗原（ＬＯ−ＤＲａ−ＦＩＴＣ）あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）で標識された。商業用マウスｍＡｂｓのための負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラットｍＡｂｓの負の対照は標準ラット血清、続いてＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）により保温された細胞であった。結果は正の細胞の割合として示される。
【図５】 ＬＯ−ＣＤ２ａの追加ありおよび追加なしでのＬＯ−ＣＤ２ａの膜マーカーおよびヒト血液リンパ球培養に対する作用。１×１０⁶ 細胞／ｍｌでのリンパ球培養が、ａ）抗ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ₄ −ＲＤ１）ｍＡｂ、あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）ｍＡｂで指示された時点で標識された。商業用マウスｍＡｂのための負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラットｍＡｂｓのための負の対照は標準ラット血清で、次いでＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）で保温された細胞であった。結果は正細胞の割合として示される。
【図６】 ＣＤ２発現に対するＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂの作用。ヒトＰＢＭＣが、ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）あるいはｂ）Ｌｅｕ−５ｂ（ＰＢＳに対して透析され、１：２に希釈されたもの）で指示された時点で保温され、ａ）ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１）の発現、およびＬＯ−ＣＤ２ａ（Ｍａｒｋ−３−ＦＩＴＣ）の結合、あるいはｂ）ＣＤ２（ＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ、Ｔ１１−ＲＤ１）およびＬｅｕ−５ｂヤギ抗マウス（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ）の発現のために染色された。
【図７】 ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ａ）０時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａの増加する濃度の存在下で６日保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は６日で採取された。ｂ）０時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａの異なった濃度で保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は２４時間間隔で採取された。ｃ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破線）で混合リンパ球培養による ³Ｈ−チミジン（Ｈ−Ｔ）取り込み（ｃｐｍ）。ｄ）保温開始後異なった時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）によるＭＬＲの阻害。培養は６日に採取された。すべての培養は最終量２００μｇ／ウエルで三つ組み（各供与体／ｍｌの１×１０⁶ 細胞）が作られた。培養採取の８時間前に ³Ｈ−チミジンが加えられた。ｃ）の結果は指示された時点で採取されたウエル当り取り込まれたｃｐｍ×１０³ として示される。ａ），ｂ）およびｄ）の結果は対照培養（ＬＯ−ＣＤ２ａなしのもの）と比較した三つ組み培養（平均値±標準偏差）のＭＬＲの阻害割合として示される。
【図８】 ＭＬＣの間の芽細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。末梢血単核細胞がＬＯ−ＣＤ２ａの２００ｎｇ／ｍｌの付加もしくは付加なしでの混合リンパ球培養で培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ２（Ｌｅｕ５ｂ−ＦＩＴＣ）に対する抗体で染色された後フローサイトメトリーにより分析された。芽細胞は前方および側面散乱でゲート化され、指示マーカーの発現は芽細胞で計量された。
【図９】 ＭＬＣの間の休止細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ヒトリンパ球がＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加ありあるいは付加なしで培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ３（Ｌｅｕ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。休止リンパ球はサイズおよび粒度に対する差動ゲート化により確認され、結果は指示された抗体での全休止リンパ球染色の割合で示される（図９）。ＬＯ−ＣＤ２ａありおよび無しの培養でＬｅｕ−５ｂにより正に染色された休止細胞の割合は図１０で示される。
【図１０】 ＭＬＣの間の休止細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ヒトリンパ球がＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加ありあるいは付加なしで培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ３（Ｌｅｕ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。休止リンパ球はサイズおよび粒度に対する差動ゲート化により確認され、結果は指示された抗体での全休止リンパ球染色の割合で示される（図９）。ＬＯ−ＣＤ２ａありおよび無しの培養でＬｅｕ−５ｂにより正に染色された休止細胞の割合は図１０で示される。
【図１１】 ミトゲン刺激リンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ＰＢＭＣがＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の不在下あるいは存在下で９６時間培養された。平行培養において、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）がミトゲンの１時間後（グレー棒）あるいはミトゲンの１時間前（白地棒）に加えられた。格子模様棒はＬＯ−ＣＤ２ａのみの存在下で行われた培養を表す。（三つ組みの）培養は保温の最後の８時間に ³Ｈチミジンでパルス標識された。
【図１２】 ＰＭＢＣのミトゲン駆動活性化に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２個の供与体からのＰＭＢＣ_S がＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＯＮ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で９６時間培養された。平行培養において、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）が培養開始０日（０時間）、１日（２４時間）、あるいは２日（４８時間）で付加された。グラフは各供与体におけるミトゲン誘導増殖のＬＯ−ＣＤ２ａによる阻害の割合を示す。
【図１３】 ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクター細胞および標的細胞（⁵¹ＣＲ標識Ｋ５６２細胞）の保温によるＮＫ活性の阻害。ＬＯ−ＣＤ２ａの３種の濃度：５μｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌが試験された。ＮＫ活性の末梢血リンパ球であったエフェクター細胞は標識標的細胞の溶解度パーセントで示される。２個の標準被験材料が３種のＥ／Ｔ比率：２００／１，１００／１，５０／１で試験された。
【図１４】 ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクター細胞および標的細胞（⁵¹ＣＲ標識Ｋ５６２細胞）の保温によるＮＫ活性の阻害。ＬＯ−ＣＤ２ａの３種の濃度：５μｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌが試験された。ＮＫ活性の末梢血リンパ球であったエフェクター細胞は標識標的細胞の溶解度パーセントで示される。２個の標準被験材料が３種のＥ／Ｔ比率：２００／１，１００／１，５０／１で試験された。
【図１５】 １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモルグスサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の末梢血のμｌ当り全リンパ球。
【図１６】 １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノモルグスサルのＰＢＭＣがＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ８およびＣＤ１１ｂ）、およびＢ細胞（抗−ＩｇＭ）に対するモノクローナル抗体で指示された日に染色され、フローサイトメトリーにより分析された。結果は血液のマイクロリットル当り染色細胞全数の割合で示される。
【図１７】 １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノモルグスサルのＮＫ活性。ＮＫ活性は１１日および２２日で検定され、２５／１、５０／１および１００／１のＥ／Ｔでの溶解度％で示された。
【図１８】 １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日で抗体を受けたシノモルグスサルのＬＯ−ＣＤ２ａの血清濃度。モノクローナル抗体が本文に記載された通りエリザにより測定されまたμｇ／ｍｌで表現された。
【図１９】 １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモルグスサルにおけるＬＯ−ＣＤ２ａに対するＩｇＧ抗体の推移。モノクローナル抗体に対する抗体が本文に記載されたサンドイッチエリザにより指定された日に引き出された血清の連続希釈で測定され、４９２ｎｍの光学密度（吸光度）で示される。
【図２０】 ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
ａ）指示された日に血液がヒヒから得られ、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するために、細胞が抗ＣＤ２抗体Ｔ１１−ＲＤ１およびＬｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ、ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ラットカッパ１ｂ抗体で染色された。
ｂ）指示された日に採取された血清サンプルがエリザによりＬＯ−ＣＤ２ａのレベルを評価された。
【図２１】 ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
指示された日に血液が採取され、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するために細胞がＰＥ−接合ストレプトアビジンで検出されるＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣおよびＭＡＲＫ２ｂ−８−ビオチン（ビオチンに接合されたマウスモノクローナル抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体）で染色された。
ａ）細胞の前処理なし。
ｂ）循環抗体で占有されていないいずれかの部位を検出するために染色に先立つＬＯ−ＣＤ２ａ、２．５μｇ／ｍｌでの保温。
【図２２】 ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
指示された日に血液サンプルが採取されＴ４−ＲＤ１（ＣＤ４）、Ｔ８−ＲＤ１（ＣＤ８）あるいはＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ（ＬＯ−ＣＤ２ａに結合）で染色された。
【図２３】 同種移植片拒絶反応のためＡＴＧ次いでＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者＃１の白血球、リンパ球およびクレアチニン。
【図２４】 患者＃１における処置中および処置後のＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベル。
【図２５】 ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置前、処置中および処置後の患者＃２におけるクレアチニン。
【図２６】 ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置前、処置中および処置後の患者＃２における白血球数およびリンパ球数。
【図２７】 各注射の直前および２．５時間後に取り出された患者＃２におけるＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベル。
【図２８】 腎同種移植片拒絶反応に関しＬＯ−ＣＤ２ａを受けた患者＃３における白血球数、リンパ球数および血清クレアチニンレベル。
【図２９】 ＬＯ−ＣＤ２ａおよび（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４）Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）および（６）Ｌｅｕ１１（抗ＣＤ１６）ＮＫ細胞のマーカーでの二色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合はヤギ抗ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２色ヒストグラムの上部セット（１−６）は二色染色を示す。下部セット（７−１２）は各抗体での単一染色を示す。
【図３０】 ＬＯ−ＣＤ２ａおよび（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４）Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）および（６）Ｌｅｕ１１（抗ＣＤ１６）ＮＫ細胞のマーカーでの二色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合はヤギ抗ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２色ヒストグラムの上部セット（１−６）は二色染色を示す。下部セット（７−１２）は各抗体での単一染色を示す。
【図３１】 ＬＯ−ＣＤ２ａに対するラットアイソタイプ対照（ファーミンゲン、精製ラットＩｇＧ２ｂ、カッパ）、あるいはＬＯ−ＣＤ２ａとＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するフィコエリスリン接合抗体でのヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａおよびアイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ′）２抗ラット免疫グロブリン（サザン・バイオテクノロジー）で検出された。ＣＤ抗原に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソンから得たフィコエリスリン接合抗体であった〔ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（ＬｅｕＳｂ）〕。それぞれの場合アイソタイプ対照での染色は第一ヒストグラムでまたＬＯ−ＣＤ２ａは第二ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはアイソタイプ対照でのパターンをまたｂはＬＯ−ＣＤ２ａでのパターンを示す。
【図３２】 ＬＯ−ＣＤ２ａに対するラットアイソタイプ対照（ファーミンゲン、精製ラットＩｇＧ２ｂ、カッパ）、あるいはＬＯＣＤ２ａとＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するフィコエリスリン接合抗体でのヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａおよびアイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ′）２抗ラット免疫グロブリン（サザン・バイオテクノロジー）で検出された。ＣＤ抗原に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソンから得たフィコエリスリン接合抗体であった〔ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（ＬｅｕＳｂ）〕。それぞれの場合アイソタイプ対照での染色は第一ヒストグラムでまたＬＯ−ＣＤ２ａは第二ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはアイソタイプ対照でのパターンをまたｂはＬＯ−ＣＤ２ａでのパターンを示す。
【図３３】 野生型ＣＤ２で形質移入されたＣＯＳ細胞の染色の細胞蛍光間接撮影分析。左側パネルはＣＤ２を含まない対照ベクターで形質移入されたＣＯＳ細胞の染色のヒストグラム、右側のセットのパネルは完全ＣＤ２分子を含むベクターで一過性形質移入されたＣＯＳ細胞の染色のヒストグラムを示す。各セットにおいて、上部ヒストグラムはネズミＷ６３２（ＣＯＳ細胞により発現されるものとして知られるクラスＩに対する抗体）、および７６−２−１１（ネズミＷ６３２のためのアイソタイプ対照）での染色を示す。中位パネルはＬｅｕ５ｂ（ベクトン・ディキンソンからの抗ＣＤ２）および７６−２−１１、Ｌｅｕ５ｂ染色のためのアイソタイプ付合対照での染色を示し、下部パネルはＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬＯ−ＣＤ２ａのためのラットアイソタイプ付合対照での染色を示す。
【図３４】 キメラＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３５】 キメラＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３６】 キメラＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３７】 キメラＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３８】 キメラＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３９】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＨＵＭ５４００およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図４０】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４１】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４２】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４３】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＡｍｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図４４】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４５】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４６】 ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４７】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａのジャーカット細胞への結合。
【図４８】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ、および対照ラットならびにヒト免疫グロブリンによる試験管内低応答性の誘導。
【図４９】 ＬＯ−ＣＤ２ａによる一次ＭＬＲの阻害および一次ＭＬＲ内でのＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいはＭＬＲ内での第三者刺激体に対する応答。
【図５０】 ＬＯ−ＣＤ２ａによる一次ＭＬＲの阻害および一次ＭＬＲ内でのＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいはＭＬＲ内での第三者刺激体に対する応答。
【図５１】 一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいは二次培養内での破傷風トキソイドに対する応答。
【図５２】 ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ′）₂ 断片の作用。
【図５３】 無傷ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体とＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ′）₂ 断片の可溶ＯＫＴ３によるＰＢＭＣの増殖に対する阻害性の比較。
【図５４】 ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性についてのＡＰＣ_S の平板結合ＯＫＴ３により誘導される増殖に対する作用。
【図５５】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化抗体ＭＥＤＩ−５０７、およびヒトＡｍｕ５−３の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図５６】 ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化抗体ＭＥＤＩ−５０７、およびヒトＡｍｕ５−３の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図５７】 ｈｃｍｖ−Ｖ１１ｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏおよびｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏのプラスミド地図。
【図５８】 ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２のプラスミド地図。
【図５９】 結合測定法に基づくラットＬＯ−ＣＤ２ａとジャーカット細胞のヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体との比較。
【図６０】 リンパ球混合反応を阻害するためのＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体、およびヒトＩｇＧの能力の比較。１個の応答体／刺激体対のＭＬＲ応答がラットＬＯ−ＣＤ２ａあるいはＭＥＤＩ−５０７による応答の相対的阻害の例として示される。ラットＩｇＧ２ｂあるいはヒトＩｇＧはアイソタイプ対照である。
【図６１】 低応答性検定でのラットＬＯ−ＣＤ２ａ及びヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体の比較。要約すると、全部で７日のＭＬＲがラットＬＯ−ＣＯ２ａ、ＭＥＤＩ−５０７あるいは対照ラットもしくはヒトＩｇＧの存在下で６ウエル平板で実行された。培養は死亡細胞を除去するためにフィコールにされ、３乃至４日培地に置かれた。細胞は次いでもとの異形刺激体を持つ二次攻撃に対し増殖する能力を評価された。外因性抗体を受けなかった一次ＭＬＲの再攻撃された培養に関連する増殖の対照％が示される。この「培地」処置培養は１００％応答と測定される。
【図６２】 ＣＤ２細胞総数に対するラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体の作用の比較。[0001]
(Technical field)
This invention relates to antibodies (or fragments or derivatives thereof), and preferably to antibodies (or fragments or derivatives thereof) that bind to human lymphocytes. More particularly, this invention relates to preventing and / or inhibiting an ongoing immune response in a patient through administration of such an antibody (or fragment or derivative thereof) to the patient. Desirably, the invention relates to preventing or inhibiting T cell activation and proliferation through administration of such antibodies or fragments or derivatives thereof to a patient.
[0002]
(Background technology)
The prior art disclosed the possibility of using antibodies against CD2 antigen that inhibit graft rejection. In general, the prior art discloses the use of antibodies that bind to the CD2 antigen as perhaps useful in inhibiting graft rejection. See Ortho Pharmaceutical Corporation, U.S. Pat. Nos. 4,364,973, 4,614,720, 4,515,893, 4,743,681, and 4,798,806. .
[0003]
Even in the cited references, it was not known that such antibodies were useful for inhibiting graft rejection in human patients or non-human primates. The following citation example, J.A. V. Giorgi, etc.Immunosuppressive activity and immunogenicity of OKT11A monoclonal antibody in monkey allograft receptor, Transplantation Bulletin, Vol. 15, No. 1, March 1983, and p. J. et al. Sirlo, etc.Monoclonal anti-chimpanzee T cell antibody, Transplantation, Vol. 36, No. 3, pp. 293-298.
[0004]
Thus, an antibody against CD2 antigen that inhibits graft rejection inhibits T cell activation and proliferation in humans or non-human primates, or prior to administration of an agent that stimulates T cell activation and proliferation or There is no disclosure regarding inhibiting graft rejection even when antibodies are added later.
[0005]
In view of the above circumstances, the present invention provides a humanized antibody from the monoclonal antibody LO-CD2a produced from the cell line of ATCC Deposit No. HB11423, thereby inhibiting the immune response and graft rejection. It is also an object to provide a method of inhibiting.
[0006]
(Disclosure of the Invention)
The present invention can solve the above-described problems by having the following configuration.
[0007]
(1) One humanized antibody consisting of CDRs from LO-CD2a, said humanized antibody being rat LO-CD2a as shown in FIGS. 55 and 56 in the framework of the heavy chain variable region of the humanized antibody. A human characterized by consisting of amino acids 47, 67, 70, 72, 76, 85 and 87 of the heavy chain variable region and one, two, three or four of amino acids 12, 13, 28 and 48 Antibody.
[0008]
(2) The humanized antibody of (1) above, wherein the humanized antibody is a rat LO-CD2a heavy chain as shown in FIGS. 55 and 56 in the framework of the heavy chain variable region of the humanized antibody. A humanized antibody comprising variable region amino acids 12, 13, 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85 and 87.
[0009]
(3) The humanized antibody according to (1) above, wherein the humanized antibody is a rat LO-CD2a light chain variable region as shown in FIG. 39 in the framework of the light chain variable region of the humanized antibody. A humanized antibody further comprising one or more of the following amino acids 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82:
[0010]
(4) The humanized antibody according to (3) above, wherein the humanized antibody is a rat LO-CD2a light chain variable region as shown in FIG. 39 in the framework of the light chain variable region of the humanized antibody. A humanized antibody comprising the amino acids 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82.
[0011]
(5) A humanized antibody according to (1) above, wherein the heavy chain variable region of the humanized antibody has the amino acid sequences of FIGS.
[0012]
(6) The humanized antibody according to (3) above, wherein the light chain variable region of the humanized antibody has the amino acid sequence of FIG.
[0013]
(7) A method for inhibiting an immune response in a patient, the method comprising treating the patient with the antibody described in (1) above.
[0014]
(8) A method for inhibiting rejection of a graft in a patient, the method comprising treating the patient with the antibody described in (1) above.
[0015]
(Best Mode for Carrying Out the Invention)
In order to describe the present invention in more detail, the embodiments will be described with reference to the accompanying drawings.
[0016]
In accordance with one aspect of this invention, a molecule (preferably a monoclonal antibody or fragment thereof) that binds to the same human lymphocyte epitope (or portion thereof) as the monoclonal antibody produced by the cell line deposited under ATCC Deposit No. HB11423 Provided. The antibody produced in the deposited cell line is sometimes referred to below as LO-CD2a. The term “molecule” or “antibody that binds to the same epitope as LO-CD2a” includes LO-CD2a. The term “LO-CD2a” includes antibodies produced by the deposited cell line ATCC HB11423 and those identical to those produced, for example, by recombinant techniques.
[0017]
The molecules or antibodies of this invention inhibit the activation and proliferation of human T cells, and applicants do so when adding molecules or antibodies either before or after agents that stimulate T cell activation. Has been found to be able to achieve significant inhibition.
[0018]
The molecules or antibodies of this invention are characterized by binding to epitopes of CD2 antigen (CD2 positive human T cells), but the ability of such molecules or antibodies to inhibit T cell activation or proliferation is CD2 positive. Applicants currently believe that the mechanism of action may or may not be through binding to cells and that the mechanism of action involves the binding of a molecule or antibody to CD2 positive cells.
[0019]
In accordance with one aspect of this invention, through administering to a human patient an antibody referred to below as LO-CD2a (or fragment or derivative thereof) or any molecule that mimics such antibody or derivative or fragment thereof. One method of preventing and / or inhibiting an ongoing immune response in a human patient is provided.
[0020]
The cell line producing LO-CD2a was deposited with the American Type Culture Collection, July 28, 1993, at 20852, Maryland, Rockville, Perclone Drive 12301, and was assigned ATCC accession number ATCC HB11423. This antibody is a rat monoclonal antibody.
[0021]
Although applicants do not intend to limit the invention to any theoretical analogy, the monoclonal antibodies of the invention can be used to prevent or reduce the severity of the immune response and to activate and proliferate T cells. The mechanism that makes it possible to inhibit the decrease in the density of CD2 expressed by the LO-CD2a antibody on the surface of T cells and thus the number of CD2-T lymphocytes and / or prominent traits This is considered to be a fact that affects the introduction. These mechanisms of action are thought to be responsible not only for preventing immune responses but also for reducing ongoing immune responses. In addition, LO-CD2a antibodies, as exemplified herein, are natural killer (NK) cells.In a test tubeInhibits activity. This is appropriate for the present invention. This is because non-MHC-restricted cytotoxic mechanisms such as NK cell activity are thought to have influenced graft-versus-host disease.
[0022]
In accordance with an aspect of this invention, a patient is administered an effective amount of a molecule (preferably an antibody) that binds to the same epitope on human lymphocytes (or any portion thereof), such as an LO-CD2a antibody. One method of inhibiting the initial or further activation and proliferation of certain T cells is provided. Desirable molecules are LO-CD2a or chimeric and / or humanized forms thereof. Such molecules will contain the same complementarity determining region (CDR) as for example the LO-CD2a antibody.
[0023]
The term “inhibit” as used herein throughout this application is intended to mean prevention or inhibition of graft rejection, or reduction of disease severity, or induction or reversal of resistance. As used herein for the purposes of this application, the term “transplant” is not necessarily limited thereto, but shall mean any or all transplants, including allogeneic and xenograft transplants. Such transplantation includes, but is not necessarily limited to, the transplantation of cells, bone marrow, tissue, solid organs, bones, and the like.
[0024]
The term “immune response” as used herein is intended to mean an immune response that depends on T cell activation and proliferation, including both cellular action and T cell dependent antibodies, (I) graft, (ii) versus host graft disease, and (iii) rheumatoid arthritis, systemic lupus, multiple sclerosis, but not necessarily limited thereto It is derived in response to autoantigens resulting in autoimmune diseases such as diabetes mellitus.
[0025]
The molecule used in this invention binds to the same epitope (or part of this epitope) as the LO-CD2a monoclonal antibody. The term “binds to the same epitope as the LO-CD2a monoclonal antibody” not only describes the LO-CD2a monoclonal antibody, but also other antibodies, fragments or the like that bind the same epitope as the LO-CD2a monoclonal antibody. It is intended to describe the derivative or molecule.
[0026]
Such other antibodies include, but are not limited to, rat, murine, porcine, bovine, human, chimeric, humanized antibodies, or fragments or derivatives thereof.
[0027]
As used herein, the term “derivative” is intended to bind to the same epitope (or portion thereof) recognized by a chimeric or humanized antibody, single chain antibody, bispecific antibody or LO-CD2a monoclonal antibody. Meaning other antibodies.
[0028]
As used herein, the term “fragment” refers to a portion of an antibody and, by way of example, such portion of an antibody is not necessarily limited thereto, but is the same epitope recognized by CDR, Fab, or LO-CD2a. Alternatively, it includes such other parts that are bonded to any part thereof.
[0029]
As used herein, the term “antibody” refers to polyclonal, monoclonal antibodies, also antibody fragments, derivatives as well as antibodies prepared by recombinant techniques such as chimeric or humanized antibodies, and the same epitope recognized by the monoclonal antibody LO-CD2a. Alternatively, a single chain or bispecific antibody that binds to that portion is included. The term “molecule” is not necessarily limited by example, but mimics a peptide, oligonucleotide, or antibody or other its derivative derived from any source that binds to the same epitope or portion thereof as an antibody fragment or derivative thereof. Such compounds.
[0030]
Another embodiment of the invention is an LO-CD2a antibody, or antibody or derivative, or a fragment thereof, or at least one selected from the group consisting of molecules that bind to the same epitope (or part thereof) as the LO-CD2a antibody. One method of treating a patient who is to receive or has received a graft transplant with an effective amount of an individual member is provided. This treatment is desirably performed with whole LO-CD2a antibody or intact LO-CD2a antibody.
[0031]
As described above, the monoclonal antibody of the present invention can be produced by a conventionally known technique as described in Kohler and Milstein (Nature 256, 495-497, 1975) in the same manner as the technique disclosed herein. can do. The preparation of monoclonal LO-CD2a antibody is described in more detail in Example 1 of this application. As previously indicated, LO-CD2a antibodies can also be produced recombinantly using conventionally known procedures. The recombinant antibody may further take the form of a chimeric antibody, wherein the variable region of the LO-CD2a rat antibody is also combined with the constant region of one species of antibody. Thus, for example, a monoclonal antibody is humanized by combining the CDR regions of a rat LO-CD2a monoclonal antibody with the V region, framework region and constant region of a human antibody to provide a chimeric human-rat monoclonal antibody.
[0032]
In one example, the antibody is a humanized form of a LO-CD2a antibody constructed from the constant region of a human antibody and the light and heavy chain variable region framework and CDR regions, wherein the light and heavy The framework region of the chain variable region is derived from the framework region of the light chain and heavy chain variable region of the human antibody, and CDR's are rat LO-CD2a, CDR's. In one example, one or more amino acid residues of the light chain and heavy chain variable region framework regions are amino acid residues from the rat LO-CD2a framework region. Residues from such rat framework regions are retained in the humanized antibody because such residues maintain the binding specificity of LO-CD2a. Thus, in producing humanized antibodies, in accordance with a desirable aspect of the present invention, CDR's of human antibodies include certain amino acids of the light chain variable portion of LO-CD2a, especially from FR1, FR2 and FR3, and particularly FR- Certain amino acids of the heavy chain variable portion of LO-CD2a from 2 and FR-3 are replaced with the CDR's of LO-CD2a with additional factors retained in constructing the humanized antibody. That is, the corresponding amino acid of the human framework is replaced with the indicated amino acid from the rat LO-CD2a framework. As pointed out in connection with FIG. 39, amino acids 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82 in the framework of the light chain variable region of rat LO-CD2a are retained and pointed out in FIG. As such, amino acids 47, 67, 70, 72, 76, 85 and 87 in the framework of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a are retained in the humanized antibody. A specific example of the construction of such a humanized antibody is given in Example 7 below.
[0033]
In another embodiment, in the heavy chain variable region of the humanized antibody, certain amino acids of the FR1, FR2, and FR3 regions are retained when constructing the humanized antibody. As pointed out specifically in FIGS. 55 and 56, amino acids 47, 67, 70, 72, 76, 85 and 87, and amino acids 12, 13, 28 and 48 in the framework of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a. 1, 2, 3 or 4 of these are retained in the humanized antibody. In a preferred embodiment, amino acids 12, 13, 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85 and 87 in the framework of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a are retained in the humanized antibody. In another preferred embodiment, in addition to retaining the amino acids in the framework of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a in the humanized antibody, the humanized antibody further comprises a light chain variable region frame of the humanized antibody. Within the work is one or more amino acids 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82 of the rat LO-CD2a light chain variable region as shown in FIG. Desirably, each amino acid 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82 in the light chain variable region of rat LO-CD2a is retained in the humanized antibody.
[0034]
In the most preferred embodiment, the humanized antibody is within the framework of the heavy chain variable region of the humanized antibody, as shown in FIGS. 55 and 56, amino acids 12, 13, 28, of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a. 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85 and 87. The humanized antibody also contains amino acids 9, 12, 41, 42, 50, 51 and 82 of the rat LO-CD2a light chain variable region as shown in FIG. 39 within the framework of the light chain variable region of the humanized antibody. Contains. Such an antibody is sometimes referred to below as MEDI-507, the structure of which is described in Example 11 below.
[0035]
In another embodiment, the invention relates to a chimeric antibody consisting of a human constant region and a variable region from rat LO-CD2a and to its use.
[0036]
The antibody or molecule of this invention desirably binds to all T lymphocytes and null cells, but not B lymphocytes, as shown by (i) two-color staining of lymphocytes analyzed by flow cytometry. (Ii) All CD4 as defined by all T cells, Leu3a and Leu2b antibodies respectively (as determined by staining with anti-CD3 antibody Leu4) And CD8 positive cells, and CD_Three Binds to some lymphocytes that are negative (null cells); (iv) binds to null cells as confirmed by staining of CD16 positive cells detected with Leu11, a marker for NK cells. (FIGS. 29, 30); B cell staining was not seen with LO-CD2a, as defined by anti-CD19 binding. (FIGS. 31, 32). The LO-CD2a antibody also desirably has the property that the antibody binds to human null cells and further stains to human cells that are both CD2 + and CD4 + rather than to human cells that are both CD2 + and CD16 + by two-color staining. With higher intensity of staining of human cells that are both CD2 + and CD8 + than to human cells that are both CD2 + and CD16 +.
[0037]
LO-CD2a binding to CD2 was confirmed by transiently expressing CD2 in COS cells.
[0038]
COS cells are And seed B. , Nature 329, October 29, 1987, pages 842-846, and transiently transfected with a πH3MCD2 plasmid containing the gene encoding the entire CD2 molecule.
[0039]
Transfection was achieved with the DEAE-dextran method. Cells were harvested and stained with anti-CD2 monoclonal antibodies Leu5b (Becton-Dickinson) and LO-CD2a with murine W632, an antibody to MHC class I, and corresponding isotype-matched controls as positive controls for staining. The specificity of reactivity was verified by assessing the binding of the same panel of monoclonal antibodies to COS cells transfected with an irrelevant plasmid.
[0040]
The staining pattern of these monoclonal antibodies against transiently expressed native CD2 (FIG. 33) shows that transfection with CD2 led to binding of both antibodies and supported the ability of LO-CD2a to bind to CD2. ing.
[0041]
The preparation of a LO-CD2a monoclonal antibody suitable for the purposes of this invention should be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
[0042]
An antibody or fragment or derivative or molecule of the type previously described inhibits T cell activation and proliferation according to the present invention and reduces the density of CD2 expression on the cell surface, thereby causing CD2⁺ To reduce the number of T lymphocytesIn vivoCan be administered.
[0043]
Thus, for example,In vivoIn procedures, such LO-CD2a antibodies are administered to prevent and / or inhibit the immune response, thereby inhibiting T cell activation and proliferation.
[0044]
An antibody or fragment or derivative or molecule thereof of the type previously described is a CD2 on the cell surface according to the present invention.⁺ Reduce the density of expression and thus CD2 of the donor cell⁺ To reduce the number of cellsEx vivoCan be administered. By example and without limitation,Ex vivoIn the procedure, such antibodies or fragments or derivatives or molecules thereof will be injected into the donor bone marrow prior to transplantation in order to prevent the development of graft versus host disease upon transplantation.
[0045]
like thisIn vivoOrEx vivoIn the art, the antibody or fragment or derivative or molecule thereof will be administered in a pharmacologically acceptable carrier. Representative examples of such carriers include isotonic saline solution, buffer solution and the like. Such pharmacologically acceptable carriers are known in the prior art, and the selection of an appropriate carrier is deemed to be within the scope of those skilled in the art from the lessons contained herein.
[0046]
The LO-CD2a antibody or other molecule of this invention isIn vivoIt is administered by intravenous or intramuscular administration.
[0047]
As previously indicated, the LO-CD2a antibody or other molecule of this invention is in an amount effective to inhibit graft rejection.In vivoBe administered. The term “effective amount” for the purposes of this application shall mean the amount of monoclonal antibody that is capable of producing the desired effect, ie inhibition of graft rejection or inhibition of T cell activation. . In general, such antibodies are administered in an amount of at least 1 mg. In addition, after the first treatment, the amount described previously is reduced during the subsequent treatment if none. Thus, the scope of the invention is not limited by such amounts.
[0048]
In accordance with this example, such antibodies are administered to maintain T cell activation and inhibition of graft rejection. Thus, without limitation by the examples, and without limitation, the antibody may be used in physiologically acceptable carrier suspensions for 1-2 hours in an amount of about 1 mg / dose to about 50 mg / dose once or twice daily. It is administered by intravenous infusion over a period of about 8 days or longer. Such treatment for graft rejection is desirably at the start of transplantation, or just before or after transplantation, or when graft rejection occurs. The treatment could be given once or twice daily for as little as 1 day or 2 days when initiated at the time of implantation to introduce a selective hyporesponsive state in the graft. In accordance with this invention, such treatment for autoimmune diseases associated with administration of antibodies or fragments or derivatives or molecules thereof is initiated when the treating physician determines that it is desirable to inhibit the pathological immune response.
[0049]
Thus, according to one aspect of the invention, administration of antibodies according to the invention at the time of transplantation and in most cases for a short period thereafter can introduce hyporesponsiveness into the transplanted tissue or organ, thereby further Appearance of repeated symptoms of rejection can be prevented or inhibited.
[0050]
The technique of the present invention for inhibiting T cell activation may be used alone or other techniques, agents for inhibiting T cell activation or graft rejection or anti-host graft disease Or it can use together with a compound.
[0051]
The invention will be further described in connection with the following examples, which are illustrative but not intended to limit the scope of the invention.
[0052]
The cells, cultures, mAbs and mitogens used in the examples are prepared and used by methods and procedures known and practiced by those of ordinary skill in the art. The following are used in the preparation and use of cells, cultures, mAbs and mitogens used in subsequent examples.
[0053]
Cells and culture
PBMC were obtained by Ficoll-Hypaque (Sweden, Pharmacia) sedimentation of heparinized blood obtained from a local blood donation center. The isolated PBMCs were enriched in medium: RPMI 1640 medium (Belgium, Resuspended in Jibco). PBMC is 1 × 10 in 96 U-well microplate (Falcon) to a final volume of 200 μl culture medium / well.^Five Cultured in cells / well. Bidirectional MLC is 1 × 10 × in each donor / well with the same volume of culture medium as previously described.^Five Performed with cells. All cultures were made in triplicate. The culture was 3 hours 8 hours before the indicated time point._H Liquid scintillation of a radioisotope pulse labeled with 2.0 μCi / well of −T (Belgium, Amersham; 247.9 GBq / mmol; 6.7 Ci / mmol) and incorporated into the culture with a beta counter (Beckman L5 6000SE) Weighed by The percentage of inhibition was calculated as follows:% inhibition = [1− (average cpm of test culture / average cpm of control culture)] × 100. All results are expressed as the average of 3 individual cultures. The standard deviation was always less than 15% of the average value, except when those values were shown graphically.
[0054]
Cytofluorometric analysis was performed on a Hewlett Packard hardware with Consort 30 program using a Faxscan cytofluorograph (Becton Dickinson). Separate analysis for staining of lymphocytes and blasts was made possible using differential gating defined by size and granularity. 25,000 events were analyzed in each sample. In these experiments, the LO-CD2a final concentration was 200 ng / ml except where indicated.
[0055]
Mabs and mitogens
LO-DRA and LO-Tact-1 (both FITC-labeled) are rat mAbs produced in our laboratory (open citation, H. Bazan (edit) 1990, p. 287). LO-Tact-1 is directed against the p55 chain of the IL-2 receptor (public reference, H. Bazan, Immunology, 1984, and Janssen, M., Buck, D. and Mayno, VC , Leukocyte type IV, leukocyte differentiation antigen, W. Knap (eds.), Oxford University Press, 1989, p. 403). Mouse anti-human-CD2 and anti-CD3 mAbs (Leu-5b and Leu-4a-FITC labeled) were obtained from Becton Dickinson (Belgium). Mouse anti-human CD4 or anti-human CD8 mAbs (phycoerythrin labeled) and mouse IgG FITC- or phycoerythrin label (negative control) were obtained from Coulter. OKT3 (Ortho-Sirague, Belgium) was used at a final concentration of 100 ng / ml. Phytohemagglutinin A (plant hemagglutinin) (PHA: Welcome Labs, UK) and Concanavalin A (ConA; Calbiochem Company, USA) were used at final concentrations of 1 and 10 μg / ml, respectively.
[0056]
Biotinylation of LO-CD2a. The concentration of purified LO-CD2a was adjusted to 1 mg / ml with 0.1 M sodium bicarbonate buffer, pH 8.4. NHS-biotin (Boehringer Mannheim 1008 960) was dissolved in DMSO at a concentration of 1.5 mg / ml. To each MAB, 0.1 ml NHS biotin solution was added. The mixture was rotated at ambient temperature for 2 hours. In the reaction, 0.1 ml of 2M Tris-HCl, pH 8.0 was added to each ml of antibody (at ambient temperature for 10 minutes), and then 1 ml of BSA in saline phosphate buffer (PBS) was added to each ml of antibody. Was completed by adding 1 ml of. To remove free biotin, the solution was dialyzed overnight at 4 ° C. with 1000 volumes of PBS. Both the biotinylation reaction and the conjugated mAb were covered with aluminum foil and hidden from light.
[0057]
Lysis of red blood cells (RBC). RBC was removed from whole blood by lysis with ammonium chloride. 10X stock solution is NH_Four C1, 90g, KHCO_Three Prepared to consist of 10 g, EDTA 370 mg, and 100 mls of water. 40 mls of 1X ammonium chloride was added to each 10 mls of blood and incubated for 10 minutes at room temperature. The mixture was then centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes and the pellet was resuspended in 10 ml PBS with 0.1% azide.
[0058]
Peripheral blood staining
Staining was performed at 4 ° C. in round bottom 96-well cluster plates (Costar # 3790). For single color staining, 10 μl of mAb was diluted appropriately in PBS containing 0.2 mg human immunoglobulin and added to each well. Erythrocyte-depleted blood was dispensed on plates in an amount of 90 μl per well. Cells and mAb were mixed gently and incubated for 30 minutes. 50 μl of chilled PBS was added to each well and the plate was centrifuged at 1900 rpm for 2 minutes. The supernatant was removed by transposition and gentle flapping of the plate. Cells were dispersed by tapping the plate with a counter. The washing procedure was repeated twice with the addition of 200 μl of cold PBS. Goat F (ab ')₂ 10 μl of a 1/20 dilution of anti-rat 1 g-FITC was added to the dispersed cells in each well and incubated for 30 minutes in the dark. The cells were washed with the addition of 180 μl of cold PBS to each well and then centrifuged at 1900 rpm for 2 minutes. The supernatant was removed, the cells were dispersed, and 200 μl of 0.5% chilled paraformaldehyde was added to each well. Cells were transferred to tubes (Falcon # 2054) and diluted to about 0.5 mls with 0.5% paraformaldehyde. Samples were evaluated on a Becton-Dickinson Faxscan machine using Lysis II software.
[0059]
Two-color staining was performed with similar experimental records. Cells were incubated with primary mAb and FITC-conjugated anti-rat reagent and 1/5 dilution of standard mouse serum was added to block any remaining sites of anti-rat reagent. Following a 15 minute incubation (no wash), 20 μl of PE-labeled mAb specific for a known CD determinant was added and incubated for 30 minutes. Cells were washed and fixed as described for single staining.
[0060]
[Example 1]
LO-CD2a is a rat (IgG2b-kappa) anti-CD2 monoclonal antibody produced and characterized in our laboratory as shown in any of the literature (see citation below: Seea, H , Lavette, AM, Latanne, D., Ninanne, J., De Bruyère, M., Socal, G. and Bazan, H., -H. Bazan (ed.),Rat hybridoma and rat monoclonal antibodyCRC Press, Inc., Boca Raton, 1990 Florida, p. 309, and Rabbet, A. M.M. Latanne, D.C. Segers, J .; Manu Breeze, P.A. Ninannu, J .; De Bruyère, M. Bazan, H .; , And Socal, G.M. , -H. Bazan (hen),Rat hybridoma and rat monoclonal antibodyCRC Press, Inc., Boca Raton, 1990 Florida, p. 287). LO-CD2a was purified from ascites fluid by immunoaffinity chromatography that takes advantage of the allotypic differences present between rat immunoglobulins that receive the hybridoma produced and the mAbs secreted by the latter (Bazan, H. et al. Cormont, F. and Declaak, L., Immunology Methodology Journal, 1984, 71: 9). This recognizes about 90% of the total population stained with mouse mAb Leu-5b (FITC label), FIG. 1 and the population labeled with mouse T11 (rhodamine labeled) mAb (data not shown). The epitope recognized by LO-CD2a on the CD2 molecule is different from the epitope recognized by anti-CD2 mouse mAbs Leu-5b and T11 (FIGS. 2 and 3).
[0061]
[Example 2]
LO-CD2a exhibits regulatory effects on PBMC but not mitogenic activity
To determine the effect of rat mAb LO-CD2a on resting lymphocytes, PBMC were incubated in the presence of increasing concentrations of this mAb. As can be seen in Appendix 1, PBMCs incubated for 6 days in the presence of LO-CD2a were compared to control cultures.^ThreeThere is no significant change in the rate of HT uptake. Cell viability at the end of this period varied but averaged about 80% as assessed by trypan blue exclusion. When resting PBMC were incubated in the presence of LO-CD2a, there was no significant change in the phenotypic expression of some membrane markers, as assessed by flow cytometry. Cell markers of resting mature T cells (eg CD3, CD4 and CD8 etc.) show the same pattern of change in the presence or absence of LO-CD2a in 6 days of culture, CD25 (IL-2R / p55) etc. Is not expressed under these experimental conditions or modified by LO-CD2a as in the case of DR antigenic determinants (FIG. 4).
[0062]
When PBMC were incubated for 6 days in the presence of LO-CD2a, a significant reduction in the proportion of Leu-5b + gated lymphocytes was observed (FIG. 5). The percentage of CD4- and CD8- lymphocytes is not affected by the presence of LO-CD2a in 6 days of culture, because the observed decrease in CD2 retaining lymphocytes cannot be attributed to the elimination of these cells, instead CD2 This is due to the conformational change in this glycoprotein produced by the disappearance of the molecule or the binding of LO-CD2a.
[0063]
To confirm whether the observed decrease in Leu-5b-lymphocytes was due to a conformational change in CD2 after binding of LO-CD2a or due to the disappearance (internalization or release) of this molecule PBMC were cultured in the presence of 500 ng / ml of LO-CD2a and flow cytometry was performed using Leu-5b (FITC labeled), T11-RD1 (rhodamine labeled) and MARK-3 (FITC labeled) for 6 days. Was analyzed. As shown in FIG. 6, Leu-5b or T11 mAbs cannot bind to PBMC after 2 to 4 days of culture in the presence of LO-CD2a. Under these conditions, the mouse anti-rat kappa chain mAb MARK-3 labels 50% of the cells on day 6 of culture, which means that only 35% of the original CD2 retaining cells have LO-CD2a on their surface. Not shown at all, but indicates that Leu-5b-FITC and T11-RD1 staining was significantly reduced on day 2. This suggests that a conformational change in CD2 that supplies an epitope of Leu5B and T11 that is not available for binding occurs in response to LO-CD2a.
[0064]
Analysis of the mean fluorescence of CD2 + cells showed that the expression density of this marker decreased with time in the presence of LO-CD2a. A similar phenomenon was observed whether either Leu-5b FITC labeling or LO-CD2a (as revealed by MARK-1 FITC labeling) was used to detect CD2 + lymphocytes. An aliquot of the same PBMC was cultured in the presence of Leu-5b (commercially available mAb dialyzed against PBS at a final concentration of 1: 2 in culture medium). As shown in FIG. 5b, under these experimental conditions, all CD2 retaining cells are coated with Leu-5b mAb (as revealed by goat anti-mouse-FITC). Staining with T11-RD1 was significantly reduced, while a smaller and slower decrease was observed in the proportion of cells submitting epitopes recognized by LO-CD2a-FITC mAb. Taken together, these results indicate that the CD2 molecule partially changes its conformation in response to LO-CD2a and that gradual regulation of CD2 / LO-CD2a occurs.
[0065]
LO-CD2a inhibits MLR
When MLC was performed (for a period of 6 days or more) in the presence of increasing concentrations of rat mAb (3H-thymidine (^ThreeSignificant inhibition of MLR was observed at mAb concentrations as low as 125 ng / ml, as measured by HT) uptake). In FIG. 6a we show a typical example of a dose-response curve for MLR inhibition by LO-CD2a. As can be seen in this FIG. 6a, LO-CD2a induced 80% inhibition of MLR (6 days in culture) at 250 ng / ml, and this percentage of inhibition ranged from a wide range of concentrations (0.25 to 5). It remains almost constant over 80 μg / ml mAb) or remains above 80%. FIG. 7 shows the time course of the inhibitory effect of different concentrations of LO-CD2a on MLR from day 0 to day 6 of culture. Against MLC (in the presence or absence of LO-CD2a)^ThreeA typical example of HT uptake is shown in FIG. 6c, where LO-CD2a was added at a final concentration of 200 ng / ml.
[0066]
In FIG. 7, the effect of LO-CD2a on MLR when this mAb (at 200 ng / ml) is added at different times after the start of MLC is shown. (^ThreeOver 90% inhibition of MLR was obtained when this mAb was added at day 0, as measured by HT uptake, and this inhibitory effect was LO-CD2a 4 days after the start of MLC. Is still present (45% in this example) when is added. Similar results (not shown) were obtained at higher concentrations of LO-CD2a (0.20 to 5.0 μg / ml).
[0067]
LO-CD2a blocks the pathway of IL-2R expression
When cytofluorescence analysis was performed on lymphoblast subsets of MLC (FIGS. 8a and 8b), the following observations were made: a) Number of blasts already present at the start of MLC (25 analyzed About 300-500 blasts of 5,000 events) rose sharply from 4 to 6 days in control culture (more than 1200 blasts analyzed 25,000 events); b) in the presence of LO-CD2a No significant change in blast numbers during the entire culture with MLC carried out in, and on day 6 the blast count is constantly lower or almost the same as the initial blast count on day 0 ( FIG. 8a); c) The proportion of CD25 blasts rose rapidly in cells incubated without LO-CD2a (FIG. 8b); d) This fraction was a fraction from MLC incubated in the presence of mAb. Less than 20% of blast cells Retention (Figure 8b), and mean fluorescence (as a measure of CD25 expression) was reduced by 75% compared to blasts present in control cultures (results not shown); e) In the absence of mAb , The percentage of CD3-blasts remains constant during the first 4 days of culture (FIG. 8b), and on day 6 the percentage of CD3 cells increases to 90%, while in the presence of LO-CD2a, C3- The rate rose slowly and finally reached about 45% on the sixth day. These results indicate that the presence of LO-CD2a inhibits the entry of these cells through an activation pathway characterized by IL-2 receptor (CD25) expression. The number of CD2 + blasts remains constant or decreases in the presence of LO-CD2a, and the expression density of this membrane marker is strongly reduced under these conditions (data not shown).
[0068]
Phenotypic analysis is MLCPause(Non-blast) When performed over 6 days for lymphocyte subsets, results similar to those shown in FIG. 4 were obtained: CD3 +, CD4 + or CD8 + lymphocytes in the presence of LO-CD2a compared to control cultures No significant change was detected in the proportion of CD25; no CD25 expression (activation marker) could be detected in the presence or absence of LO-CD2a in 6 days of culture (FIG. 9). These results suggest that LO-CD2a, if any, has a very weak effect on the resting subset of T lymphocytes in MLC; that is, T cells are not restricted during the activation process. At the same time, as shown in FIG. 8b, LO-CD2a induces a significant decrease in the proportion of CD2 + lymphocytes during MLC. These results are that in both unstimulated culture (FIG. 6) and MLC, the action of LO-CD2a decreases CD2 expression and / or induces conformational changes in its structure.
[0069]
LO-CD2a can block T cell activation pathways that depend on the TcR / CD3 complex or mitogen receptor.
[0070]
When LO-CD2a is added to mitogen activated PBMC,^ThreeSignificant inhibition of HT uptake was observed. One of three experiments on PBMC incubated with mitogen (OKT3, ConA and PHA) in the presence or absence of LO-CD2a added either at 0 hours or 1 hour after the start of culture . In the first case, mitogen was added after 1 hour. Mitogen was added at 0 hours when LO-CD2a was added 1 hour after the start of culture. This was done to see if pre-incubation of PBMC with mitogen or LO-CD2a could trigger events that could be affected by the addition of secondary reagents. Culture^ThreeCollected at 96 hours after HT pulse labeling (6 hours).^ThreeOver 50% inhibition of HT uptake was observed in the presence of LO-CD2a, whether it was added first or after mitogen (FIG. 11). The same effect was observed when cells were collected 4 days after the start of MLC and exposed to mitogen (data not shown). In cultures that received both mitogen and LO-CD2a compared to the same culture that received only mitogens^ThreeA dramatic decrease in HT uptake was observed 2 days after the start of MLC (results not shown). Pre-incubation of MLC with LO-CD2a before mitogen addition is comparable to MLC without OKT3^Three HT-uptake was lowered.
[0071]
LO-CD2a was also able to inhibit mitogen-induced proliferation if added 1 day after the start of mitogen-induced proliferation. The result of the experiment performed with two donors is shown in FIG. PBMC were incubated with mitogens (OKT3, ConA and PHA). In these experiments, LO-CD2a was added at time 0 (0 day), 24 hours (1 day) or 48 hours (2 days) before the start of culture. Inhibition of proliferation in response to OKT3 and ConA by LO-CD2a was significant if added 24 hours after the addition of mitogen at time zero.
[0072]
Example 3
Inhibition of natural killer cell (NK) activity
PBMCs were separated from heparinized blood by Ficoll-Hypaque sedimentation method. After washing, the effector cells suspended in the enriched medium are placed on a Falcon plate to remove mononuclear cells (by attachment) to 1 × 10 ×.⁶ Incubated overnight at a concentration of / ml.
[0073]
Target cells (K562 cell line) are⁵¹chromium⁵¹Cr (3 × 10⁶ 0.9 ml of cell suspension at 5 ml / ml + 5 mCi / ml⁵¹Labeled by incubating overnight with 0.02 ml from a solution of Cr, Amersham).
[0074]
After incubation for 16 hours, the effector cells and target cells were washed 4 times, counted, and different E / T ratios (effector cell / target cell ratio): 200/1 (4 × 10 4⁶ 2 x 10 in 100 ul of / ml effector cell suspension^Four / Ml target cells (100 ul), 100/1, 50/1 and 25/1 were incubated on 96V bottom microplates.
[0075]
After keeping warm for 4 hours,⁵¹Cr release was measured by counting 100 μl of supernatant from each well with a gamma counter.
[0076]
Maximum (target cell + HCLIN) and spontaneous release (target cell + enriched medium) were used to calculate specific solubility:
[0077]
[Expression 1]

[0078]
The cell content of LO-CD2a at 5 ug / ml, 1 ug / ml, and 0.5 ug / ml in two normal donors (FIGS. 10a and 10b) is all tested concentrations of antibody And led to an inhibition of cytotoxicity of about 50% over all tested E / T ratios. This is in comparison to essentially complete inhibition of growth at doses of 0.25 ug / ml or higher MLR.
[0079]
Example 4
In non-human primatesIn vivothe study
Materials and methods
Monoclonal antibody
MARK3-FITC is a mouse mAb directed against the rat Ig kappa 1b allotype conjugated with FITC. MARG2b-biotin is a mouse anti-rat IgG2b immunoglobulin mAb conjugated with biotin. These two mAbs were produced and labeled in our laboratory. For the immunofluorescence test, these mAbs were used at a final concentration of 2.5 μg / ml. Leu-5b-FITC (Becton-Dickinson) and T11 rhodamine (Coulter) are two mouse anti-human CD2 mAbs. T4- and T8-rhodamine labels (Coulter) are mouse anti-human CD4 and CD8 mAbs, respectively.
[0080]
Phenotypic analysis
Anti-human T cell mAbs (anti-CD2, -CD4, -CD8, see above) were added to a 100 μl sample of whole blood and incubated at 4 ° C. for 45 minutes. Red blood cells were lysed with Tris-buffered ammonium chloride lysis buffer (Ammonium chloride 144 mM / Tris 17 mM, pH 7.2), and lymphocytes were washed with PBS / FCS 2% / NaN3, 0.2%. For detection of unlabeled mAbs, a second mAb (FITC- or biotin-conjugate) was added to a final concentration of 2.5 μg / ml. After incubation at 4 ° C for 45 minutes, the cells were washed with PBS / FCS / NaN3. Incubation with a streptavidin-phycoerythrin conjugate (15 minutes) was performed for biotinylated mAbs. Labeled human or monkey lymphocytes were resuspended in 2% formalin solution and analyzed on a Faxon cytofluorometer (Becton Dickinson) equipped with a Lysis II program to gate lymphocytes as a function of size versus particle size . As a control for non-specific staining, aliquots of cells were incubated with FITC- or phycoerythrin-conjugated mouse Igs (Coulter).
[0081]
Level of circulating Abs
Serum LO-CD2a is a mouse anti-rat kappa with mouse anti-rat 1gG2b mAb (MARG2b-8 produced in our laboratory) as the first layer (coating) and conjugated to horseradish peroxidase for detection. Quantified with an ELISA using a chain (MARK-3) mAb. In summary, microtiter plates (Falcon) were incubated overnight at 100 μL / well of MARG2b-8 (5 μg / ml) and the unoccupied area of plastic was saturated with PBS containing 5% powdered milk (bovine). After incubation at room temperature for 1 hour, the plates were washed with PBS with Tween-20, 0.1% and incubated with 100 μl / well of diluted monkey or human serum. After washing away unbound material, the plates were incubated with 100 μl / well MARK3-peroxidase (2 μg / ml in PBS) for 1 hour. After washing again, the plate was incubated with OPD (O-phenylenediamine-dihydrochloride, 0.4 mg / ml, Sigma Chemicals) in citrate-phosphate buffer containing 0.03% hydrogen peroxide. . The staining reaction product was detected at 492 nm. Standard curves were generated in parallel with known concentrations of purified LO-CD2a serially diluted in control monkey or human serum pools.
[0082]
Detection of monkey or human anti-LO-CD2a antibody was performed by an ELISA using 96-well microtiter plates coated with LO-CD2a (5 μg / ml). Anti-LO-CD2a human or monkey antibody binding to the plate was revealed by horseradish peroxidase labeled with rat anti-human IgM (LO-HM-7) or IgG (LO-HG-22) mAbs.
[0083]
A. Cynomolgus monkey
One cynomolgus monkey received 10 mg / day of LO-CD2a for 3 consecutive days. The monoclonal antibody was sufficiently resistant.
[0084]
Lymphocyte loss was observed after the first injection, but there was very little additional loss after the second and third injections.
[0085]
The second monkey received 20 mg / day over 10 days. The mAb was also well tolerated. No side effects were observed after dose administration, where the animals were active, cautious, well fed and at the same time there was no evidence of nausea or gastrointestinal disturbances.
[0086]
The total number and cell population of the second monkey lymphocyte is summarized in FIGS. 15 and 16. NK activity decreased slightly after 10 injections (Figure 17). Circulating levels of MAb were very high (Figure 18) and immunization occurred at the end of treatment (Figure 19).
[0087]
B. Baboon
The experiments described here were started to determine baboon resistance to LO-CD2a and to analyze the effects of this mAb on several baboon lymphocyte membrane markers and to determine the half-life of LO-CD2a in serum. It was.
[0088]
Staining of baboon cells with LO-CD2a results in less than 20% positive cells with an average fluorescence intensity significantly lower than that of stained human cells. This staining pattern reflects weak cross-sensitivity or binding via Fc interaction with baboon cells.
[0089]
This study was conducted on a male baboon (Papio mormon) weighing 8.8 kg. Prior to each injection of LO-CD2a, monkeys were anesthetized. Anesthesia was keteller (2 ml) and prazine (0.5 ml) for the first time, and ketaire and prazine (0.3 ml) for the second time with ketaire alone. LO-CD2a was diluted with 100 ml saline and injected intravenously (iv 10 minutes). For phenotypic analysis of lymphocytes and measurement of circulating antibodies (injected LO-CD2a, newly formed anti-LO-CD2a antibody, and pre-existing cross-reactive baboon anti-LO-CD2a antibody) A blood sample (10 ml) was taken in two tubes. The tube for lymphocyte typing contained EDTA. Samples were taken before the first treatment to determine baseline levels.
[0090]
The first dose of LO-CD2a (10 mg) was administered on day 0 of the study. Subsequent four doses (10 mg / dose) were administered on days 7, 8, 9, and 10. Blood samples were taken 2-3 minutes after each LO-CD2a dose. Supplemental blood samples were also taken on days 7 and 9 (with EDTA containing tubes) prior to LO-CD2a injection. Blood samples were taken on days 1, 2, 11, 12, 13, 16 and 24.
[0091]
No abnormal activity response or dietary habits were observed during the LO-CD2a injection period or the duration of the study. The animal's body weight remained at about 8.8 Kg measured on day 0 (see table below).
[0092]
Baboon weight (Kg) from day 0 to day 24
Day 0 7 8 9 10 12 13 16 24
Weight 8.8 8.9 9.1 9.1 8.8 9.0 9.1 8.9 8.9
Analysis of phenotype and circulating mAb
Fluorescent staining of baboon peripheral blood lymphocytes revealed several interesting properties:
a) Under the action of LO-CD2a, the CD2-positive subset of lymphocytes is expressed at the end of the fifth dose of LO-CD2a, ie at the point of maximum accumulation of mAbs in the blood (2 There was a significant reduction (as revealed by the different anti-CD2 mAbs) (see FIGS. 20a and 20b). With the assumption that CD4 + and CD8 + subsets of lymphocytes do not decrease during this period (FIG. 22), and because CD4 + and CD8 + cells contain most CD2 bearing lymphocytes, CD2⁺ A decrease in cells indicates that the decrease or change in conformation is more membrane marker expression than lymphocytes.
[0093]
(FIG. 20a), CD2 + (Leu-5b) after the first dose of LO-CD2a.⁺ Or T11⁺ ) A slight decrease in normal lymphocytes is observed. Two days after this initial dose, CD2 positive cells (T11⁺ Leu5b⁺ ) Level increased to the starting value.
[0094]
CD2 positive cells (Leu5b) at the end of the dose of LO-CD2a 4 times 24 hours apart (7-10 days)⁺ Or T11⁺ ) Ratio rapidly decreased, and slowly started to increase 3 days after the end of LO-CD2a administration.
[0095]
b) At the same time, the percentage of LO-CD2a positive cells, ie the percentage of cells bound by circulating mAb, rose to 22% after the second dose of LO-CD2a (7 days) and then anti-CD2 mAbs Leu5b and CD2 revealed by T11⁺ Cells were reduced as they were (FIG. 20). The decrease in LO-CD2a + cells was revealed by the MARK-3 FITC mAb (FIG. 21).
[0096]
The decrease in LO-CD2a + cells was determined by detection of LO-CD2a present in cells detected by MARK3-FITC or by MARG2b-8-biotin-conjugated mAbs (FIG. 21a). The same phenomenon was observed if cells were first incubated with LO-CD2a at 2.5 μg / ml to saturate all sites not occupied by circulating mAb. LO-CD2a was detected by MARK-3-FITC or MARG2b-8-biotin (FIG. 21).
[0097]
c) As can be seen in (FIG. 22), the T4 positive subset of baboon lymphocytes shows a modest increase between days 9 and 12, after which T4⁺ The percentage of lymphocytes returned to the original value. T4⁺ Accompanying the rise in cells, the proportion of T8 normal lymphocytes increased from day 9 to day 11. After that date, this percentage returned to its original value.
[0098]
d) Levels of circulating mAb LO-CD2a decreased to inconspicuous values 3 days after the first injection (see FIG. 20b). When LO-CD2a is applied at 4 short-interval doses (7 to 10 days), serum LO-CD2a levels (approximately 3.7 mg / ml, maximum during this period) are the last dose It decreases slowly after (10 to 16 days), indicating that the Ab half-life is relatively long in this animal model. No baboon anti-LO-CD2a antibody was detected in blood samples taken on days 11, 12, 13, 16, and 24.
[0099]
[Conclusion]
LO-CD2a appears to be well tolerated by non-human primates as shown by the absence of a clear response in cynomolgus baboons. LO-CD2a appears to have a relatively long half-life in baboons. After 24 hours of the first dose of LO-CD2a (Day 1 in FIG. 27), 50% of the maximum detectable level of MAb was still present in the serum. Three days after the last dose of LO-CD2a (day 13 of FIG. 27), 50% of the maximum detectable level of mAb was still present in the serum.
[0100]
Although the staining pattern in non-human primates does not match that observed with CD2 for human cells, a gradual increase in this proportion of cells following a decrease in the proportion of CD2 normal lymphocytes was observed in the presence of LO-CD2a. Similar to that observed in cultured human PBMC mononuclear cells.
[0101]
Example 5
Patients treated with LO-CD2a
Patients treated with LO-CD2a based on a caring foundation
Patient # 1 (Mb.E.)
This was a female patient with chronic pyelonephritis treated with renal allograft for end-stage renal failure. A rejection episode occurred and was treated with OKT3 for 10 days. Creatinine levels dropped from 2 to 1.4 mg / dl. About 4 months later, the onset of rejection was diagnosed by biopsy showing a creatinine level of 2 mg / dl and moderate rejection. The patient was treated with 1.5 g of Solmedrol and the following 8-day ATG course, at which time the creatinine level was 1.65 mg / dl. Seven days after treatment, a biopsy was performed, which showed cell rejection and moderate vascular rejection. Two days after the biopsy (day 0), the patient became anuria at a creatinine level of 2.4 mg / dl. The same day the patient received LO-CD2a, 10 mg, corticosteroid solmedrol 1.5 g, plus, polarimine 1 g (antihistamine) and dafargan 1 g (acetaminophen). Treatment with corticosteroids, dexchlorophenylamine and acetaminophen is referred to as “coverage” by the transplant society. No side effects were observed. By the end of 23 hours, the patient had 700 ml of urine and creatine was 2.72 mg / dl. During the next 9 days she received 10 mg / day of LO-CD2a. The patient left the hospital at 11 days without undergoing a follow-up biopsy.
[0102]
Measurement of serum creatinine levels during ATG treatment and subsequent LO-CD2a treatment showed that creatinine levels increased despite ATG treatment and then decreased and stabilized with LO-CD2a ( (FIGS. 31, 32).
[0103]
The total white blood cell count decreased from the highest level of 10,000 to 2000 during the treatment with LO-CD2a and continued to decrease until the final measurement on day 21 (FIG. 23). The total number of lymphocytes was low and changed during the observation period.
[0104]
Serum levels of LO-CD2a immediately increased to a maximum of 2.0-3.0 μg / ml following each treatment and decreased to a minimum of about 1.0 μg / ml between each treatment (FIG. 24). At the last treatment on day 9, this level dropped by 50% at 24 hours and reached zero on day 14. The patient returned to the outpatient on the 40th.
[0105]
The patient's creatinine level was 2.27 at 40 days, 2.48 at 50 days, and increased to 3.11 at 66 days, at which point the biopsy was consistent with severe cell rejection and interstitial bleeding, with the first report Was obtained (see below). The patient was treated with 150R irradiation, 3 × 125 mg solmedrol in the kidney, while drug maintenance therapy with cyclosporine and 12.5 mg / day steroids was continued. Creatinine levels continued to rise during the following period. The creatinine level on day 70 was 3.3, on day 80 it was 5.63 and on day 84 it was 8.35. On day 86, the creatinine level was 10.8, and transplanted nephrectomy was performed on day 88. The patient's compliance with maintenance immunosuppression for the period between this patient's 10-day excretion and 66-day biopsy is questionable and is a factor of compliance where kidney loss is uncertain despite apparently successful rescue It must be.
[0106]
(Ii) Patient # 2
This patient was a 38 year old man with hepatitis C. He received a renal allograft for the treatment of end stage renal failure attributed to chronic interstitial nephropathy (nephropathy). One year and three months later, he received a transplant nephrectomy for a series of OKT3-resistant acute cells and vascular rejection.
[0107]
One year and 10 months after the transplant nephrectomy, he received a second renal allograft. After 3 days his creatinine level was 1.4 mg / dl. Three days later he received 500 mg of Solmedrol. After that day, the patient's creatinine was 1.8 mg / dl. The next day he received 500 mg of Solmedrol. Creatinine was 3.25 mg / dl. The next day he received 500 mg of Solmedrol. His creatinine was 2.95 mg / dl. Three days later his creatinine level was 2.3 mg / dl and he underwent a biopsy that showed 3 plus cellular rejection. Three days later he received LO-CD2a, 10 mg, and solmedrol 200 mg polaramine and darfagan. The observed side effects were limited to sleepiness. There was no high fever or high blood pressure. The next 9 days he received LO-CD2a, 10 mg treatment daily. The next day biopsy after the end of such treatment showed no rejection.
[0108]
The patient was well tolerated on the course of LO-CD2a, no fever or hypertension at any dose and no signs of clinical side effects. Routine hematology and clinical chemistry laboratory tests (including LFTs) obtained during the course of treatment have reduced the total number of lymphocytes from a minimum of 290 / cubic mm to 100 / cubic mm and Shows any change attributed to administration of the antibody except for a decrease in creatinine levels associated with anti-inflammatory (from 2.7 mg / dl at the beginning of LO-CD2a treatment to 1.10 at the end of the course) There wasn't.
[0109]
FIG. 25 shows the serum creatinine level of this patient that decreased from 2.5 to about 1.0 on the days following LO-CD2a treatment. The patient was lymphopenic before and during treatment and the white blood cell count did not show any dramatic changes with treatment (FIG. 26). In this patient, serum levels of LO-CD2a did not rise above 2.0 μg / ml after each treatment and dropped to a minimum of 1.0 to 0.25 μg / ml (FIG. 27). After 8 months of treatment with LO-CD2a, the patient was healthy with normal renal function and no signs of relapse rejection.
[0110]
Patient 2-Biopsy # 1-Diagnosis: Uncertain
The biopsy contained about 20 inconspicuous glomeruli. There were scattered mononuclear infiltrates and a small degree of interstitial edema. Only a small degree of tubular infiltration was found but no vascular trauma. These findings are insufficient for the diagnosis of acute cellular rejection. Rarely, there were mononuclear cells in the small arteries, which were suspicious but did not meet the criteria for diagnosis of rejection.
[0111]
Patient 2-Biopsy # 2, about 2 weeks after the first biopsy-No diagnostic abnormality was observed.
[0112]
This biopsy appeared to be similar to the previous biopsy and contained about 10 glomeruli. Infiltration was very sparse and no vascular trauma was observed.
[0113]
(Iii) Patient # 3
This patient was a 19-year-old man with von Willebrand disease who underwent renal allograft treatment for end-stage renal failure due to chronic pyelonephritis. The graft was removed after 17 days due to acute vascular rejection in secondary hypertension after the failure of the 6-day course of OKT3.
[0114]
Five and a half months later he received a second kidney allograft. Ten days later his creatinine level was 6 mg / dl. The next day the creatinine level was 7 mg / dl and the biopsy showed 3 plus cellular rejection and vascular rejection (proliferative endarteritis without necrosis or thrombosis). On the same day, he received LO-CD2a, 10 mg, solmedrol and polaramine and 40 mg dafargan. No side effects were observed. For the next 9 days, he received LO-CD2a, 10 mg treatment daily without other drugs or side effects. Two days after the completion of treatment, his creatinine level was 1.75 mg / dl and the biopsy showed foci of necrotic necrosis and single-point chronic rejection but showed no signs of acute rejection.
[0115]
No clinical side effects (BP or temperature changes) were observed. Routine hematology and clinical chemistry laboratory studies (including LFTs) showed a decrease in creatinine levels associated with the onset of rejection (from 7.10 mg / dl at the start of LO-CD2a treatment to 1 at the end of the 10 day course). Except for .75 mg / dl) showed no change attributable to antibody administration. The lymphocyte count was 340 / cubic mm before treatment, dropped to a minimum of 220 / cubic mm during treatment, increased to 690 / cubic mm 9 days after discontinuation of treatment with LO-CD2a, and 23 at the end of treatment. After a day, it rose to 1000 / cubic mm.
[0116]
The patient's white blood cell count did not change significantly with treatment (FIG. 28). Serum creatinine levels were dramatically reduced with treatment (Figure 28). Seven months after the first treatment with LO-CD2a, the patient became normal with normal renal function and no signs of recurrent rejection.
[0117]
Patient 3-Biopsy # 1-Diagnosis: Dangerous cell rejection affecting small arteries and to a lesser extent gaps and glomeruli
The arcuate artery showed significant mononuclear infiltration into the intima with elastic fiber destruction. Occasionally there were sparse infiltrates in the gaps that entered the tubules. The gap showed diffuse light pore edema. There were about 7 yarn balls. They showed cell hyperplasia and endothelial swelling in mononuclear cells. Overall, this pattern showed severe acute cell rejection symptoms.
[0118]
Patient 3-Biopsy # 2, about 2 weeks after first biopsy-Diagnosis: consistent with treated rejection
The biopsy showed a few arteries showing intimal fibrosis with mucoid material but occasionally with a small amount of cellular infiltrate. The gap showed fine diffuse fibrosis and minimal mononuclear infiltrate. The tubules were locally atrophic but otherwise inconspicuous. There were no signs of active cell rejection.
[0119]
No episodes of rejection were subsequently reported during 28 months of follow-up treatment for second and third patients who remained in compliance with the patient's immunosuppressive therapy.
[0120]
(Iv) Patient # 4
After allogeneic bone marrow transplantation, patients suffering from severe host-related graft disease (heavy skin, gastrointestinal tract, kidney and central nervous system toxicity resistant to high doses of prednisone) will receive 10 mg LO-CD2a for 12 days / I received a day. His symptoms improved. Renal function returned to normal, diarrhea ceased, skin improved, and confusion was resolved. After 4 days the antibody was stopped, the symptoms recurred and the patient died despite the start of the second course of antibody.
[0121]
LO-CD2a is thus used to reverse the ongoing immune response against external tissues (allogeneic and xenogeneic because it inhibits the heterologous MLR in the same way as the allogeneic MLR). I was able to. The antibody will be given by intravenous infusion once or twice daily for 10 to 14 days. It may also be used prophylactically to inhibit T cell activation as part of an induction experiment record immediately following organ transplantation.
[0122]
In a second experiment, Phase I safety, a pharmacokinetic and dose determining clinical trial was initiated with a renal allograft receptor that underwent the first biopsy that demonstrated the appearance of acute rejection symptoms. The antibody preparation used in this study is LO-CD2a produced in cell culture.
[0123]
Caring use of the antibody showed no side effects and suggested that it was effective in reversing acute graft rejection at a dose of 10 mg / day for 10 days. Preliminary clinical studies with chimpanzees suggested that similar in vivo effects were observed at doses equivalent to human doses over 0.1-100 mg / day without obvious side effects. The purpose of this Phase I study is therefore to investigate reducing the dose level of LO-CD2a starting at 10 mg / day for 10 days (additional 5 days as an extension of the option) in order to obtain a minimum effective dose measure. Was that. Since no side effects were observed in the “scope” of steroids in the caring patients described previously, it was decided to administer only minimal pretreatment of analgesics and antihistamines without steroid coverage. This was done to predictively characterize the side effects induced by LO-CD2a.
[0124]
Eleven patients were enrolled under this protocol so far. Four patients were treated with 10 mg / day, 5 patients were treated with 5 mg / day, and 2 patients were treated with 2.5 mg / day.
[0125]
Among the 11 patients enrolled, 9 patients experienced a reversal or partial reversal of acute rejection confirmed by biopsy. The 9 were all 4 patients treated with LO-CD2a at 10 mg / day, 3 patients treated with 5 mg / day, and 2 patients treated with 2.5 mg / day It was. One of the patients treated at 5 mg / day (see below, patient 8) voluntarily dropped out of the study after the first treatment and the second patient (patient 9) showed an inferior response.
[0126]
Table 1 summarizes the results obtained with renal rejection patients treated with LO-CD2a under this protocol.
[0127]
[Table 1]

[0128]
Side effects were observed during treatment with LO-CD2a without steroid coverage, possibly as a result of transient release of cytokines, including nausea, vomiting, fever, chills, and hypertension. The majority of these events (greater than 70%) were observed during the first dose administration, with events of limited range and duration. For example, no fever above 40 ° C. was observed and most of the events resolved within the onset time. No hypertension or severe diarrhea was observed. There was no clear relationship between the intensity and appearance rate of these events and the antibody dose. Despite the apparent discomfort of these symptoms, there were no events requiring emergency resuscitation.
[0129]
In a third experiment, 10 patients with acute renal allograft rejection were treated on a caring basis without steroid coverage with LO-CD2a as follows.
[0130]
Two were treated with 10 mg / day, 4 with 5 mg / day, and 4 with 2.5 mg / day. All compassionate patients were treated with 10 mg / day and 5 mg / day, with the exception of one patient treated with 2.5 mg / day, all with complete or partial rejection due to biopsy and other clinical signs Showed evidence. The adverse event profile of these compassionate patients was similar to that predominantly seen here with limited duration and range of first dose symptoms.
[0131]
In a fourth experiment, 6 patients with steroid resistant versus host graft disease and 1 liver transplant recipient received LO-CD2a on a caring basis. No side effects were reported for these patients. A short story about these patients follows.
[0132]
All 6 GvHD (versus-host graft disease) patients were treated daily with LO-CD2a, 10 mg dose for 10 consecutive days and administered intravenously over 1 hour. Accompanying this, administration of cyclosporine and steroids was continued. All but one showed improvement in GvHD symptoms. Resolution of GvHD symptoms began 3-6 days after the start of mAb therapy. Improved signs of liver GvHD under mAb therapy were observed in 2 patients. Recurrence of signs of GvHD was seen in 2 of the 3 patients evaluated.
[0133]
A seventh patient received the donor liver, but unfortunately cyclosporine toxicity caused sepsis as a result of surgical complications associated with renal failure and significantly reduced bone marrow function. Because of her disease state, the surgeon is taking the patient at risk in the second assigned liver by using currently available immunosuppressants for induction (OKT3, Mofetil, FK506, Cyclosporine and ATG) Did not want. The patient underwent liver transplantation and was treated with LO-CD2a for 7 days at 5 mg / day as the first dose injected during the start of surgery prior to the use of forceps on the transplanted organ. Subsequent doses were given low doses of steroids. During the treatment period, the patient's renal function improved sufficiently over conventional immunosuppressive regimens to be initiated. The patient did not show any signs of rejection 8 weeks after transplantation.
[0134]
Although the invention is directed to inhibiting graft rejection in the preferred embodiment, the scope of the invention should not be limited thereto and is generally useful for inhibiting T cell activation for any and all purposes. That should be understood.
[0135]
Example 6
Construction and expression of chimeric antibodies
A. LO-CD2a V_H And V_L Cloning and sequencing
The total RNA is the Churgwin method (Biochemistry18: 5294 (1979) and was isolated from the cell line LO-CD2a (ATCC HB11423). The mRNA was then prepared using the Oligotex-dT mRNA kit (Chatsworth, CA). Approximately 200-300 ng of mRNA was reverse transcribed using a Perkin-Elmer Citas (Connecticut, Norfolk) RNA-PCR kit. The reaction was carried out at 42 ° C. for 1 hour. V_H And V_L The oligonucleotide primers required for gene amplification were selected using the following reference: 1)Immune related protein sequences, Cabat, et al., 5th edition, 1991, 2) Aurandi, et al.,Bulletin of National Academy of Sciences (United States)86: 3833-3837 (1989).
[0136]
[Expression 2]

[0137]
The numbers refer to the amino acid residues indicated in Kabat, et al., 1991.
[0138]
Polymerase chain reaction (PCR) was performed on a Perkin-Elmer DNA thermal cycler 480 using the following conditions: 5 minutes at 94 ° C. 30 cycles of 1 minute at 94 ° C, 2 minutes at 60 ° C, and 2 minutes at 72 ° C followed by 5 minutes at 72 ° C. The DNA fragment was gel purified from 1% agarose using a Kiex gel extraction kit (California, Chatsworth, Qiagen). The pieces are then Canango and Pandy,Biotechnics14: 912-913 (1993), blunt-ended, and Bluescript KSII^- Ligated to the SmaI site of (California, La Jolla, Stratagene). Multiple clones are Sequenase^TMSequenced by dideoxy chain termination method using T7 polymerase kit (Ohio, Cleveland, US Biochemical).
[0139]
Due to the potential error rate inherent in PCR, at least three different reactions were performed. LO-CD2a V_L And V_H The most commonly observed sequences in the gene are shown in FIGS. 34, 35, 36 and FIGS. 37, 38, where FIGS. 34, 35, 36 contain LO-CD2a V containing the natural leader sequence._L The nucleotide and amino acid sequences of the chains are shown. Figures 37 and 38 show LO-CD2a V containing the native leader sequence._H The nucleotide and amino acid sequences of the chains are shown.
[0140]
As shown in FIGS. 34, 35, and 36, the leader sequence is amino acid residues −20 to −1. Framework 1 is amino acid residues 1-23. CDR1 is amino acid residues 24-39. Framework 2 is amino acid residues 40-54. CDR2 is amino acid residues 55 to 61. Framework 3 has 62 to 93 amino acid residues. CDR3 is amino acid residues 94-102. Framework 4 is amino acid residues 103-112.
[0141]
As shown in FIGS. 37 and 38, the leader sequence is amino acid residues −19 to −1. Framework 1 is amino acid residues 1-30. CDR1 is amino acid residues 31 to 35. Framework 2 is amino acid residues 36-49. CDR2 is amino acid residues 50-66. Framework 3 is amino acid residues 67-98. CDR3 is amino acid residues 99-107. Framework 4 is amino acid residues 108-118.
[0142]
B. Insertion into a vector for transient expression
Two vectors were licensed from the London Medical Research Council (MRC) for the expression of each of the chimeric light and heavy chains of LO-CD2a. The 9.2 kilobase light chain vector (hcmv-v11ys-kr-neo) is a human kappa constant region and humanized V of anti-lysozyme as a HindIII-BamHI fragment._L Includes genomic clones of the region. The 8.6 kilobase heavy chain vector (hcmv-VhLys-gammal-neo) is a human γ1 constant region and humanized V of anti-lysozyme as a Hind III-Bam HI fragment._H Includes genomic clones of the region. These vectors are Maeda, et al.Human antibody hybridoma2: pp. 124-134 (1991).
[0143]
Since the DNA fragment containing the natural signal peptide is not available, the V region of LO-CD2a was cloned behind the signal already present in the MRC vector. The light chain V region with a signal fragment was constructed from two fragments, each derived from a separate PCR reaction as follows:
Reaction 1: DNA template was MRC light chain vector. The amplified fragment contained part of framework (FR) 1 in addition to the signal peptide. The two peptides used were as follows:
[0144]
[Equation 3]

[0145]
The antisense primer contained the FR1 sequence of LO-CD2a that was not found in the anti-lysozyme MRC vector. The PCR reaction produced a 0.15 kilobase Hind III-Tth III fragment.
[0146]
Reaction 2: DNA template is LO-CD2a V in Bluescript_L It was a clone. The amplified fragment contained LO-CD2a FR1 (from the Tth III site) to the end of FR4. The 3 'untranslated region found in the MRC light chain vector was added to the 3' end of LO-CD2a using an antisense oligonucleotide. The two oligonucleotides used were:
[0147]
[Expression 4]

[0148]
This reaction produced a 0.35 kilobase TthIII-BamHI fragment. Both PCR products were gel purified using Kiax and restricted using the appropriate enzyme. The HindIII-TthIII fragment plus the TthIII-BamHI fragment was then ligated between the Bluescript HindIII and BamHI sites in a three-way ligation. All V of LO-CD2a_L This construct containing the region plus the MRC signal peptide was then sequenced.
[0149]
The heavy chain LO-CD2a V region construct contains an MRC signal sequence at its 5 'end and a long 3' untranslated region also derived from the MRC heavy chain vector. The final construct was made from three different PCR reactions described below:
Reaction 1: DNA template was MRC heavy chain vector. Anti-lysozyme V_L And V_H Because the gene uses the same signal, the sense primer is LO-CD2a V_L The one used in the construct, ie5'V _L lyssigWas the same. Antisense primer3'V _H lyssig: It was as follows.
[0150]
[Equation 5]

[0151]
This reaction produced a 0.16 kilobase Hind III-Pst I fragment containing a portion of the FR1 of LO-CD2a in addition to the MRC signal. Fragments were gel purified, restricted and ligated to Hind III-Pst I cut bluescript for sequencing.
[0152]
Reaction 2: DNA template is Bluescript LO-CD2a V_H It was an area. This reaction is V_H A 0.3 kilobase Pst I-Sty I fragment containing most of the region was produced. Due to the internal Pst I site in FR3 of LO-CD2a, the Pst I-Syt I fragment had to be constructed from the two PCR reactions shown below.
[0153]
[Formula 6]

[0154]
The template DNA shown above is LO-CD2a V in Bluescript._H Clone 82-8.
[0155]
Reaction AUse the oligonucleotides cited as oligo 1 and 2 as primers to produce a 0.2 kilobase fragment.
[0156]
[Expression 7]

[0157]
Reaction B: Produce a 0.1 kilobase fragment using oligo 3 and oligo 4 as primers.
[0158]
[Equation 8]

[0159]
Oligo 2 and 3 described above contain changes in the nucleotide sequence that remove the internal Pst I site without changing the amino acid sequence of LO-CD2a. Aliquots (2-5 μl) of the overlap products from reactions A and B above were combined and served as a template for the third PCR reaction. The oligonucleotide primers for this reaction were numbers 1 and 4 in the diagram. The 0.3 kilobase product was gel purified by Kiax and restricted with Pst I and Sty I. The internal Pst I site was successfully mutated because the fragment remained intact.
[0160]
Reaction 3: Final V_H Fragments were produced using the MRC heavy chain vector as a template. This 0.23 kilobase Sty I-Bam HI fragment contained part of the FR4 of LO-CD2a and the entire 3 'untranslated region from the MRC vector. The primers used were:
[0161]
[Equation 9]

[0162]
The product fragment was gel purified and restricted with Sty I and Bam HI. The Pst I-Sty I and Sty I-Bam HI fragments were then ligated into a Pst I-Bam HI cleavage bluescript for sequencing.
[0163]
All oligonucleotides were synthesized on an Applied Biosystems synthesizer. All sequence reactions are Sequenase^TMThis was performed using a T7 polymerase kit (Ohio, Cleveland, US Biochemical). All PCR_S Was performed using the following protocol: 5 minutes at 95 ° C. 35 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 50 ° C, 2 minutes at 72 ° C, final extension at 72 ° C for 5 minutes.
[0164]
LO-CD2aV containing the correct sequence_L And V_H The fragment was removed from the Bluescript and cloned between the Hind III and Bam HI sites of the MRC light and heavy chain vectors, respectively. For the heavy chain, the 5 'Hind III-Pst I fragment was first ligated to the remainder of the construct (Pst I-Bam HI) in Bluescript. The entire Hind III-Bam HI fragment was then cloned into the MRC vector.
[0165]
C. V_H And V_L N-terminal amino acid sequencing of
N-terminal amino acid sequence analysis was performed by Harvard Microchemistry Laboratory, Massachusetts, on samples of LO-CD2a heavy and light chains to confirm the sequences obtained using RNA-PCR. . Samples were prepared as follows:
200 μg of LO-CD2a was applied throughout the 12% SDS polyacrylamide gel run in the presence of B-mercaptoethanol. Following electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane using a Western transfer instrument. The membrane was briefly stained with Ponceau S, decolorized in 1% acetic acid, and the light and heavy chain bands were dried under vacuum and sent for amino acid analysis and N-terminal sequencing.
[0166]
LO-CD2a V_H The amino acid sequence of the first 20 residues completely matched the clone sequence. However, it can be seen that FR1, 2, 3 and 7 residues are different from those encoded by the cloned gene._L Sequence shown. All of these differences are present in the PCR primers used for cloning purposes, based on the best deduced sequences obtained from the literature cited so far.
[0167]
D. Confirmation and correction of DNA sequence of N-terminal amino acid sequence
This arrangement is corrected and the V of LO-CD2a_L And V_H To clone both natural signal peptides, RACE-PCR (cDNA,Ends terminalRrapid rapidAnmplification amplification-PCR) was employed. The mRNA from LO-CD2a cells was reverse transcribed and the resulting cDNA was ligated to the G tail at its 3 'end using terminal transferase in the presence of dGTP. The cDNA was then amplified using specific 3 'and 5' oligonucleotides complementary to the G tail. Appropriate restriction sites were added to the 5 'end of each oligonucleotide to simplify subcloning.
[0168]
The oligonucleotides used for the preparation of the cDNA were:
[0169]
[Expression 10]

[0170]
The RACE-PCR oligonucleotides were as follows:
[0171]
[Expression 11]

[0172]
The RACE-PCR reaction was performed using the following protocol: 5 minutes at 94 ° C. 40 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 50 seconds, followed by 5 minutes extension at 72 ° C.
[0173]
LO-CD2a, V_L And V_H The PCR product obtained in (1) was gel extracted using KIAX. V_H The fragment was restricted with Xho I and Stu I and ligated into the Xho I-Sma I cut blue script. V_L The fragment was blunt-ended and ligated into Sma I cut bluescript. A number of clones were sequenced in both the light chain and heavy chain V regions, confirming the signal sequence.
[0174]
Since signal sequences found in immunoglobulin genes generally have introns, these will be important for expression. V_L And V_H A genomic clone containing the leader sequence was similarly identified. Genomic DNA was prepared as follows: 4 × 10⁷ LO-CD2a cells were spun, washed with cold PBS, spun, and washed again with PBS. The cells were resuspended in 0.4 ml digestion buffer (with fresh additional proteinase K). The mixture was incubated for 12-15 hours at 50 ° C. with shaking, extracted with an equal volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol and spun at 1700 × g. The aqueous phase was transferred to a clean tube and 1/2 volume of ammonium acetate 7.5M and 2 volumes of 95% ethanol were added. The DNA was pelleted for 2 minutes at 1700 × g rotation. The pellet was washed with 70% ethanol and air dried. The pellet was resuspended in 80 ml TE, pH 8.0.
[0175]
Using genomic DNA obtained from the cell line LO-CD2a as a template,_L And V_H Both genome leader sequences, also unique restriction sites (V_L Then Sph I, V_H Was designated to amplify the part of the framework region that ends with Pst I).
[0176]
[Expression 12]

[0177]
The PCR reaction was performed as follows: 100 ng genomic DNA from LO-CD2a cells, oligo LVL and BKA (V_L For fragments) 200 pmol or LVH and PVHA (V_H For fragments) 200 pmol, 1 mm each, dNTPs 10 μl, 10 × Pfu buffer 10 μl. 1 μl (2.5 units) of Pfu DNA polymerase (California, La Jolla, Stratagene), deionized water up to 100 μl. Pfu was used because it is more accurate than Taq polymerase.
[0178]
The reaction conditions were as follows: 94 ° C for 5 minutes, 50 ° C for 5 minutes. 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute 35 cycles, then 72 ° C for 5 minutes. PCR products were gel purified, restricted and ligated to Bluescript for sequencing. Once clones containing the correct sequence are identified, Bluescript vectors containing these clones are Hind III and Sph I (V_L ) Or Hind III and Pst I (V_H ) And the fragments were gel separated. The 0.75 kilobase Hind III-Sph I fragment is then the original LO-CD2a V_L Ligated into the bluescript containing the construct, from which the Hind III-Sph I fragment was removed. The new construct contained the native LO-CD2a signal plus intron and a corrected FR1 sequence (matching the N-terminal sequence). The 0.16 kilobase Hind III-Pst I fragment is the original LO-CD2a V_H Ligated into the bluescript containing the construct, from which the Hind III-Pst I fragment was removed. The new construct contained a natural signal + intron. Newly built V_L And V_H The fragment was then removed from the bluescript by digestion with Hind III and Bam HI and cloned into MRC light and heavy chain vectors, respectively, for expression in COS cells.
[0179]
E. Transient expression in COS cells
COS7 cells were obtained from ATCC (access number CRL-1651) and grown in Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum (FBS). Optimal transfection was achieved with approximately 50% confluence of adherent cells. In preparation for transfection, plasmid DNA was added to DMEM containing Neuselam and DEAE-dextran / chloroquine diphosphate. The COS cell medium was removed, the DNA mixture was added and the cells were incubated for 3 hours at 37 ° C. This medium was then removed and 10% DMSO in PBS was added to the cells for 2 minutes and then removed. DMEM with 10% FBS was added to the cells. After overnight incubation, the medium was changed and the cells were incubated for 2 days at 37 ° C. The supernatant was collected for assay by Elisa for secretion of the chimeric antibody.
[0180]
F. Detection of secreted chimeric antibody by Elisa
The secretion of the chimeric antibody was confirmed by assaying the supernatant from transfected COS cells with an ELISA designed to detect the presence of the human antibody (or part thereof). Goat anti-human IgG (H + L) was diluted in saline phosphate buffer (PBS) to a concentration of 5 μg / ml and attached to the wells of the Eliza microtiter plate overnight at 4 ° C. incubation. The plate was washed 3 times using an Eliza plate washer.
[0181]
The remaining free sites were blocked by adding 200 μl of PBS containing 1% fetal bovine serum albumin (PBS-BSA) for 1/2 hour at room temperature. A 2-fold dilution of the supernatant and positive control reference standard (purified human IgG1K) in PBS-BSA was prepared. Media alone and / or PBS-BSA alone constituted a negative control. Antibody dilutions and controls were added to the wells and incubated at room temperature for 1.5 hours. The plate was then washed 3 times with a plate washer in PBS containing 0.05% of Tween 20. Appropriate dilutions of goat anti-human IgG (gamma chain specific) -horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody or goat anti-human kappa light chain-HRP conjugated antibody were added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. The plate was washed with PBS-Tween 20 as previously described, after which growth substrate (ABTS) containing hydrogen peroxide was added. Bound antibody was detected by reading the absorbance at a wavelength of 405 nm.
[0182]
G. Binding specificity of secreted chimeric antibodies
The binding specificity of the chimeric antibody was assessed by flow cytometric analysis of antibodies that bind to the CD2 expressing mutant Jurkat cell line JRT3-T3-5. The binding profile of the chimeric antibody (human IgG1) is a natural rat antibody (IgG2b) and an isotype-matched control MAB showing irrelevant (non-CD-2) binding specificity._S The binding profiles of (human IgG1 and rat IgG2b) were compared.
[0183]
Preparation of JRT3-T3-5 (Jurkat) cell line
The Jurkat cell line was obtained from ATCC (Accession Number TIB-153) and in D-MEM (complete medium) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 10% amino acid supplement (NCTC), and 6 mM L-glutamine. Proliferated. Cells are maintained at 37 ° C. and 10% carbon dioxide, with a ratio of 1: 4 (cell concentration at passage of about 3 × 10 6⁶ 3 times per week). Jurkat cells were harvested, centrifuged to remove spent medium, and washed with DMEM. The cells were then resuspended in saline phosphate buffer (PBS) with 0.1% sodium azide (NaAz) and aliquots were removed for cell quantification. Viable counts were determined by trypan blue exclusion.
[0184]
Indirect staining of Jurkat cells
Cell surface staining was performed on 96-well U-type bottom microtiter plates. Approximately 6 x 10 in a volume of 90 μl^Five Cells were distributed into each well of the microtiter plate. Antibody dilutions to be tested were prepared in PBS with NaAz, 0.1% and dispensed into appropriate wells in a volume of 10 μl. The cells were incubated with the antibody for 15 minutes at room temperature, and then the cells were washed 3 times by adding PBS with NaAz, 0.1% to each well and centrifuging for 2 minutes at 1900 rpm (Soval RT6000D). Cell resuspension was achieved by gently tapping the plate. A 10 ul aliquot of the appropriate fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated secondary antibody (anti-human or anti-rat Ig) was added to the appropriate wells and incubated for 15 minutes in the dark at room temperature. The plates were washed 3 times with PBS with NaAz 0.1% as previously described. Stained cells were fixed by adding 200 μl of paraformaldehyde 0.5% in PBS and stored at 4 ° C. (up to 1 week).
[0185]
Flow cytometric analysis of stained Jurkat cells
Stained cells were transferred to 12 x 17 mm polystyrene tubes for data acquisition using Becton-Dickinson Facscan. Data acquisition and analysis was performed using Lysis-II software. CD2-expressing Jurkat cells were incubated with LO-CD2a (rat IgG2b) MAB, a chimeric version of LO-CD2a (human IgG1), and the corresponding isotype-matched controls. Bound antibody was detected using the appropriate FITC-conjugated secondary antibody according to the protocol described previously. The analysis shows a similar binding pattern of native rat LO-CD2a and chimeric human-rat LO-CD2a.
[0186]
H.Stable expression in NSO cells
In order to express chimeric antibodies in stable transfectants, a glutamine synthase gene amplification system was obtained from Celltech Limited (Berkshire, UK). This system is described in Bebington, et al., Biotechnology, 10, 169-175 (1992). The expression vectors used were pEE6hCMV-B and pEE12. Such vectors are described in published PCT application numbers WO86 / 05807, WO87 / 04462, WO89 / 01036, and WO89 / 10404. Since none of these vectors contained C kappa or C gamma 1, genomic clones of these genes were obtained from the MRC light chain and heavy chain vectors, respectively. Both constant region clones were sequenced to obtain a restriction map. Two constructs were made in pEE12. The first included from light chain (V + C) 5 'to heavy chain (V + C). The second construct contained heavy chain 5 'to light chain.
[0187]
The strategy involving the light chain was as follows.
[0188]
1. pEE6hCMV-B and pEE12 were digested with Xma I and Eco RI, respectively.
[0189]
2. The 5 ′, 1.93 kilobase portion of the chimeric light chain was removed from the MRC vector using Hind III and Eco RI. This fragment was used as a template for PCR mutagenesis as described below.
[0190]
[Formula 13]

[0191]
Restriction sites are underlined.
[0192]
PCR was performed to change the 5 'restriction site from Hind III to Xma I and add a Kozak consensus sequence to the 5' end of the construct. This is essential for effective translation (Kozak, M. et al.Journal of cell biology108: 229, 1989). The 3 'PCR oligo is used to remove internal Bam HI and Eco RI sites that interfere with subsequent cloning steps. The final product of PCR mutagenesis is a 0.85 kilobase Xma I-Msc I fragment. PCR_S Was performed according to the instructions provided with the TA cloning kit (California, San Diego, Invitrogen). The following conditions were used for PCR: 2 minutes at 94 ° C. This is followed by 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes. This was continued for 5 minutes at 72 ° C. Ligation and transformation were performed according to kit instructions. A number of clones were sequenced by the dideoxy chain termination method as previously described. Corrected clones were removed from the TA cloning vector by digestion with Xma I and Msc I. This fragment was gel purified using Kiax.
[0193]
The 3.2.7 kilobase C kappa fragment was removed from the MRC vector by digestion with Msc I and Eco RI. This fragment was gel purified using Kiax.
[0194]
Using two different three-way ligation reactions, the complete chimeric light chain, ie 0.85 kilobase Xma I / Msc I fragment + 2.7 kilobase Msc I / Eco RI fragment, was ligated to both pEE6hCMV-B and pEE12 Each was cut with Xma I / Eco RI.
[0195]
The strategy involving heavy chains was as follows.
[0196]
1. Both pEE6hCMV-B and pEE12 were transfected into E. coli strain DM1. Both vectors were digested with EcoRI and Bc1I (Bc1I would only cut if the plasmid grew in methylase minus bacteria).
[0197]
2. The chimeric heavy chain was removed from the MRC vector by digestion with Hind III and Eco RI. The resulting 2.7 kilobase fragment was gel purified using Kiax. This fragment was digested with Nhe I and Bg1 II. This produces a 0.7 kilobase Hind III / Nhe I fragment and a 2 kilobase Nhe I / Bg1 II fragment. Both fragments were gel purified. The 0.7 kilobase fragment was then used as a template for PCR mutagenesis.
[0198]
[Expression 14]

[0199]
Restriction sites are underlined.
[0200]
This PCR was performed to change the 5 'restriction site from Hind III to Eco RI and to add Kozak consensus sequences. The 3 'oligo is used to remove an internal Bam HI site that appears to interfere with subsequent cloning steps. PCRs, ligation reactions and transformations were performed as previously described.
[0201]
Using two different three-way ligation reactions, the complete chimeric heavy chain, ie 0.7 kilobase Eco RI / Nhe I fragment + 2.0 kilobase Nhe I / Bg1 II fragment was ligated to both pEE6hCMV-B and pEE12 Each was cut with Eco RI / Bc1 I.
[0202]
(Bc1 I and Bg1 II are compatible restriction sites).
[0203]
The final construct with pEE12 containing both chimeric light and heavy chains was made as follows.
[0204]
From light chain 5 'to heavy chain: PEE6hCMV-B carrying the chimeric heavy chain was digested with BgII / BamHI. The 5.1 kilobase fragment containing the heavy chain plus hCMV promoter was gel purified and ligated to the BamHI site of pEE12 containing the chimeric light chain. The correct orientation was verified by digestion with Sal I / Bam HI. The presence of a 0.28 kilobase fragment indicates the correct orientation.
[0205]
From heavy chain 5 'to light chain: PEE6hCMV-B carrying the chimeric light chain was digested with Bgl II / Bam HI. The 5.9 kilobase fragment containing the light chain plus hCMV promoter was gel purified and ligated to the BamHI site of pEE12 containing the chimeric heavy chain. Orientation was verified by digestion with Sal I / Bam HI as previously described.
[0206]
NS / O cells (Gulfer, et al., Enzymology methodology, 73 (B), 3-46 (1981), ECACC catalog number 85110503 deposited at the European Animal Cell Culture Collection) were electroporated. Transfected. Transfected cells were selected by growth on medium without glutamine. Antibody production and binding activity against CD2-expressing Jurkat cells was confirmed as described below.
[0207]
Functional analysis of the human-rat chimeric antibody shows that its functionality is similar to that of the rat LO-CD2a antibody. Both antibodies inhibit the primary mixed leukocyte reaction (MLR) when nanogram amounts of antibodies up to 120 ng / ml are added to the culture. Furthermore, the addition of a chimeric antibody to the primary MLR induces a hyporesponsive state in the responding population to attack the original allogeneic antigen or a third party allogeneic antigen. Low responsiveness is specific for allogeneic antigens by attacking mitogens or tetanus toxoids to induce proliferative responses.
[0208]
Example 7
Construction and expression of humanized antibodies
A. Construction of humanized light chain
A framework region from the human V kappa gene that shares homology with LO-CD2a and was named HUM5400 (EMBL access X55400) was chosen for humanization of the light chain V region. The following is a comparison between the LO-CD2a and HUM5400 frameworks:
[0209]
[Expression 15]

[0210]
A comparison of rat LO-CD2a light chain variable region sequence, homologous human variable region, HUM5400, and humanized LO-CD2a is shown in FIG. The complete amino acid sequence is given for the LO-CD2a variable region, and the residues are numbered according to the rat sequence. Residues that are identical to those in rat at corresponding positions in the humanized and HUM5400 sequences are indicated by a horizontal dash line, while non-identical residues are given in letter code. The humanized LO-CD2a light chain variable region is designated with a HUM5400 framework region, rat LO-CD2a CDR's (underlined), and 7 rat LO-CD2a framework residues (* above the rat sequence). These were chosen because such residues are related to maintaining the binding specificity of LO-CD2a.
[0211]
As shown in FIG. 39, framework 1 is amino acid residues 1 to 23. CDR1 is amino acid residues 24-39. Framework 2 is amino acid residues 40-54. CDR2 is amino acid residues 55 to 61. Framework 3 is amino acid residues 62-93. CDR3 is amino acid residues 94-102. Framework 4 is amino acid residues 103-112. The leader sequence is amino acid residues −20 to −1 (FIGS. 40, 41 and 42). Rat amino acid residues retained in the framework region are amino acid residues 9 and 12 of framework 1, amino acid residues of framework 2 are 41, 42, 50 and 51, and amino acid residues of framework 3 are 82 It is.
[0212]
The humanized light chain was constructed to contain the CDRs of LO-CD2a and the variable region framework of HUM5400, but only 7 unusual residues (*) were retained from the framework of LO-CD2a. The 5 'region was obtained from a chimeric light chain construct. This 0.43 kilobase Hind III / Hph I fragment contains the sequence encoding the natural signal plus intron and the first three amino acid residues of framework 1 that are identical in the rat and human frameworks. The remainder (ie, the 3 ′ end) of the construct (0.37 kilobase) containing nucleotides encoding all amino acids except the first three amino acids of the variable region is 7 nucleotides ranging in size from 63-81 nucleotides. Synthesized by PCR from overlapping oligonucleotides. These long oligonucleotides served as templates for shorter 5 'and 3' external PCR oligonucleotides (21-26 nucleotides in length). In all cases, 5 pmol of template was used with 100 pmol of each external PCR oligonucleotide. All PCRs were performed using Pfu polymerase to achieve greater fitness. The procedure was as follows: 5 minutes at 95 ° C. 25 cycles, followed by 94 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 2 minutes. This was followed by an additional 5 minutes extension at 72 ° C. All syntheses were accomplished in 4 stages. In the first stage, the first long oligonucleotide was added to the 0.43 kilobase Hind III-Hph H fragment. The next three sets of overlapping oligonucleotides were then added sequentially using PCR. After the synthesis of the entire 0.8 kilobase construct was completed, it was gel purified using Kiax, restricted with Hind III and Bam HI, gel purified again with Kiax, and further Hind III / Bam HI cleaved bluescript KS Linked to II. Many clones were sequenced until the correct version was obtained. The clone was then removed from the bluescript by digestion with Hind III and Bam HI. The resulting fragment was gel purified with Kiax and ligated into the MRC light chain vector cut with Hind III / Bam HI. The nucleotide and amino acid sequences of the humanized LO-CD2a light chain V region are shown in FIGS.
[0213]
A description of the overlapping oligonucleotides used in the synthesis of the humanized light chain and their uses is as follows.
[0214]
[Expression 16]

[0215]
Oligonucleotides 1, 3, 5, and 7 are reverse complement sequences.
[0216]
Oligonucleotides 2, 4, and 6 are sense strand sequences.
[0217]
Oligonucleotide # 1 overlaps a 0.43 kilobase Hind III / Hph I fragment derived from the chimeric light chain construct. This oligonucleotide was added to the 0.43 kilobase fragment by PCR using the following PCR oligo:
[0218]
[Expression 17]

[0219]
In a similar manner, oligonucleotides # 2 and # 3 were sewn together by PCR using the following PCR oligos:
[0220]
[Formula 18]

[0221]
After PCR, both products were gel purified using Kiax and then joined together using a third round of PCR. The third round of PCR required the following oligos:
[0222]
[Equation 19]

[0223]
The resulting fragment was gel purified by Kiax. Oligonucleotides # 4 and # 5 were then conjugated together by PCR using the following oligos:
[0224]
[Expression 20]

[0225]
Fragments were gel purified and added to previous constructs using PCR oligos:
[0226]
[Expression 21]

[0227]
The final fragment was constructed using oligonucleotides # 6 and # 7 and PCR oligos:
[0228]
[Expression 22]

[0229]
After gel purification, this fragment was added to the remainder of the humanized light chain construct by PCR using oligos.
[0230]
[Expression 23]

[0231]
B. Construction of humanized heavy chain
The framework region of human antibody clone Amu5-3 (Genbank accession number U00562) was used for the generation of humanized heavy chains. The following is a comparison with the framework of LO-CD2a and that of Amu5-3:
[0232]
[Expression 24]

[0233]
FIG. 43 shows rat LO-CD2a heavy chain variable region sequence, homologous human variable region Amu5-3, and humanized LO-CD2a (humanized Vh). The complete amino acid sequence is given in LO-CD2a and the residues are numbered according to the rat sequence. Residues identical to those of the rat in the corresponding positions in the humanized and Amu5-3 sequences are indicated by horizontal dashes, while non-identical residues are given in letter code. Humanized LO-CD2a Vh consists of an Amu5-3 framework region, rat LO-CD2a CDRs, and 7 rat LO-CD2a framework residues (designated by * on rat residues), which are Selected to be relevant to maintain the binding specificity of LO-CD2a. The vertical line in the CDR3 of the rat and humanized sequence represents the space required to align the three sequences because Amu5-3 had a longer CDR3 than the rat and humanized region. is there.
[0234]
As shown in FIG. 43, framework 1 is amino acid residues 1-30. CDR1 is amino acid residues 31 to 35. Framework 2 is amino acid residues 36-49. CDR2 is amino acid residues 50-66. Framework 3 is amino acid residues 67-98. CDR3 is amino acid residues 99-107. Framework 4 is amino acid residues 108-118. The leader sequence is amino acid residues -19 to -1 (FIGS. 44, 45, 46).
[0235]
The rat LO-CD2a amino acid residue retained in the framework region is framework 2 amino acid residue 47 and framework 3 amino acid residues 67, 70, 72, 76, 85 and 87.
[0236]
A single humanized heavy chain construct was made. This construct contains the CDRs of LO-CD2a and the framework of Amu5-3, with the exception of 7 residues (*) retained from LO-CD2a. This construct was produced in the same way as that of the human light chain. In this case, there were 12 overlapping template oligonucleotides ranging in size from 69-88 nucleotides. Twelve external PCR oligonucleotides ranged in size from 21-26. Synthesis was accomplished in 6 steps with the addition of a pair of overlapping template oligonucleotides at each step. The final construct (0.7 kilobase) was gel purified using KIAX as previously described, digested with Hind III and Bam HI, gel purified again, and Bluescript for sequencing as previously described. Connected to Once the correct clone was identified, it was removed from the Bluescript by restriction with Hind III / Bam HI and then ligated into the MRC heavy chain vector digested with the same enzymes. The nucleotide and amino acid sequences of the humanized LO-CD2a heavy chain V region are shown in FIGS.
[0237]
A description of the overlapping oligonucleotides used for the synthesis of humanized heavy chains and their uses follows.
[0238]
[Expression 25]

[0239]
Overlapping oligonucleotides # 1 and # 2 were joined together by PCR using the following PCR oligos:
[0240]
[Equation 26]

[0241]
The product fragment was gel purified.
[0242]
Overlapping oligonucleotides # 3 and # 4 were joined together by PCR using the following PCR oligos:
[0243]
[Expression 27]

[0244]
The fragment was gel purified.
[0245]
Oligonucleotides # 5 and # 6 were joined together by PCR using the following PCR oligos:
[0246]
[Expression 28]

[0247]
After gel purification, this fragment was joined to the fragments produced by oligonucleotides # 3 and # 4 by PCR with the following oligos:
[0248]
[Expression 29]

[0249]
The product fragment was gel purified.
[0250]
Oligonucleotides # 7 and # 8 were joined together by PCR using the following PCR oligos:
[0251]
[30]

[0252]
The product fragment was purified into a gel and added to a construct made by conjugating oligonucleotides # 3 to # 6. This was achieved using PCR oligos.
[0253]
[31]

[0254]
The product fragment made by conjugating oligonucleotides # 3 to # 8 was gel purified. The 5 'end of the construct (oligonucleotide # 1 + # 2) was then added using a PCR oligo.
[0255]
[Expression 32]

[0256]
This fragment was gel purified and the next fragment (3 ') was added using oligonucleotides # 9 and # 10.
[0257]
Oligonucleotides # 9 and # 10 were conjugated by PCR using the following PCR oligos:
[0258]
[Expression 33]

[0259]
After gel purification, this 3 'fragment was added to the rest of the construct using PCR oligos.
[0260]
[Expression 34]

[0261]
The product fragment was gel purified and added to the rest of the construct.
[0262]
Oligonucleotides # 11 and # 12 were conjugated by PCR using the following PCR oligos:
[0263]
[Expression 35]

[0264]
After gel purification, this final 3 'fragment was added to the rest of the construct using oligo (5') PCR4H (sense) and (3 ') PCR6J' (antisense). The generated 0.7 kilobase final construct was gel generated, sequenced and cloned into the MRC heavy chain vector as previously indicated.
[0265]
Transient expression of COS cells and detection of secreted antibodies was performed as previously described for chimeric antibodies. The humanized antibody was purified by affinity chromatography (Protein A). Binding studies on Jurkat cells show a similar binding pattern between the humanized and rat forms of LO-CD2a (FIG. 47). Jurkat cell lines expressing CD2 were stained with rat LO-CD2a, humanized LO-CD2a (LO-CD2aHu) or rat IgG2b or human IgG control. The antibody concentration was 0-4 μg / ml. Rat and humanized forms of LO-CD2a bind with a similar binding pattern to Jurkat cells, whereas rat and human isotype control antibodies do not. Bound antibody was detected with an isotype specific FITC-conjugated antiserum. The results shown in FIG. 47 are expressed as the percentage of cells that stained positive with antibody over the range of concentrations stated previously. Functional studies have shown that humanized antibodies can further inhibit primary MLR. Cultures in which nanogram amounts of LO-CD2a, LO-CD2aHu, rat IgG2b control, or human IgG1 control contain an equal number of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from designated responders and stimulators (irradiated cells) Added to the well. Control wells contained no antibody. The culture was incubated for 5 days and then tritiated thymidine (^ThreeHT). Proliferation^ThreeDetected by HT uptake. As given in Table 2 below, the results are expressed in average CPM (radioactivity counts per minute) recorded with a beta plate reader.
[0266]
[Table 2]

[0267]
Humanized antibodies are also cultured in primary MLR in the presence of allogeneic antigen and humanized LO-CD2a, not when isotype controls (with irrelevant specificity) are replaced with human antibodies. (When the average CPM^ThreeInduces a hyporesponsive state to attack allogeneic antigens on T cells (as measured by HT uptake) (FIG. 48). The functional properties of the humanized antibody are similar to those of rat LO-CD2a.
[0268]
Example 8
LO-CD2a elicits allogeneic antigen-specific hyporesponsiveness
Following the addition of LO-CD2a to primary culture only, the ability of T cells to recognize allogeneic antigens in the secondary MLR was tested. Primary MLR cultures contain responding individual cells and irradiation-stimulated cells in the presence of LO-CD2a, control antibody (LO-DNP11, Massachusetts, Charlestown, Biotransplant, Incorporated) or in the absence of antibody for 7 days It was kept warm. The cells were then washed and rested with medium alone for an additional 3 days. After a rest period, the cultured cells were re-attacked with the original stimulator cells or cells obtained from different donors (“third party” cells).
[0269]
Representative experimental results from these studies are illustrated in FIG. In panel A, a primary response was observed when responding individual cells were cultured at 200 ng / ml in the presence of a control antibody, but when LO-CD2a was cultured in the presence of 200 ng / ml, the response was Not monitored, this was consistent with previously reported data. Response kinetics were measured by harvesting cultures on days 3, 5 and 7. Data was provided as the average of triplicate well runs at each data point where cpm from individual wells was within 10% of the average.
[0270]
As depicted in FIG. 49b, responding individual cells from cultures treated with either LO-CD2a or a control antibody were stimulated at a 1: 1 ratio in the absence of any antibody in the secondary MLR. Re-attacked by allogeneic antigens carrying cells. Response kinetics were measured by harvesting cultures on days 3, 5 and 7. Responses of cells cultured in primary MLR with either LO-CD2a or control antibody are included as controls. Data are presented as the mean of triplicate well runs at each data point where cpm from individual wells was within 10% of the mean. Data are from the same experiment depicted in FIG. 49a.
[0271]
As shown in FIG. 50C, cells stimulated in the primary MLR with a specific allogeneic antigen in the presence of LO-CD2a or a control antibody, then 1 in the absence of any antibody present in the secondary culture. Attacked with allogeneic antigen carrying cells from a third-party donor in a ratio of 1: 1. Response kinetics were measured by harvesting cultures on days 3, 5 and 7. Cell responses to autologous stimulator cells cultured in primary MLR with control antibody or LO-CD2a are included as controls. Data are presented as the average of triplicate well runs at each data point where cpm from individual wells was within 10% of the average. Data are from the same experiment depicted in FIGS. 49a and b.
[0272]
Cells cultured in the presence of a control antibody in primary culture are responsive to re-attack by the same allogeneic stimulator cells as in primary culture (panel b) and are also resistant to stimulation by third party cells. Responsive (Panel c). In contrast, cells cultured in the presence of LO-CD2a between primary MLRs were either re-attacked with primary allogeneic stimulator cells (panel B) or stimulated with third party cells (panel c). It was not responsive. Cells in culture containing LO-CD2a were viable and responsive to stimuli other than allogeneic antigens. For example, stimulation with either PHA or soluble OKT3 caused an equivalent proliferative response in cells cultured with LO-CD2a control antibody or fresh autologous PBMC (data not shown). Flow cytometric analysis of these cells after resting failed to detect LO-CD2 on the cell surface (data not shown). Thus, these data indicate that allogeneic antigen hyporesponsiveness, ie, a state of resistance, can be induced followed by exposure to LO-CD2a and allogeneic antigens.
[0273]
To address the hypoallergenic apparent allogeneic antigen specificity induced by LO-CD2a during allogeneic antigen stimulation, cells obtained from culture after allogeneic antigen stimulation are acceptable. Attacked to respond to a lytic protein antigen, tetanus toxoid. The soluble antigen response requires the presence of viable antigen presenting cells (APCs) lost after 7 days in allogeneic antigen-stimulated cultures. Thus, in these studies, a fresh source of APC was provided to cultured cells by adding irradiated autologous PBMC to the secondary assay culture. As depicted in FIG. 38A, responding individual cells from cultures treated with either LO-CD2a or a control antibody were stimulated at a 1: 1 ratio without the presence of any antibody present in the secondary MLR. Re-attacked with allogeneic antigen carrying cells. Response kinetics were measured in harvest cultures at 3, 5, and 7 days. Cell responses to autologous stimulator cells cultured in primary MLR with either LO-CD2a or a control antibody are also included as controls. Data are presented as the average of triplicate well runs at each data point where cpm from individual wells was within 10% of the average.
[0274]
As depicted in FIG. 51b, responding individual cells from cultures treated with either LO-CD2a or a control antibody were treated with 7.5 μg / ml tetanus toxoid without any antibody present in the secondary culture. Re-attacked. Response kinetics were measured by harvest cultures at 3, 5, and 7 days. The response of cells cultured in primary culture without antibody and autologous stimulator cells served as a control for response to tetanus toxoid.
[0275]
The results shown in FIGS. 51a and b show that cells cultured with LO-CD2a plus allogeneic antigen in the primary MLR were poorly responsive to allogeneic antigen in the secondary MLR. Indicates responsiveness to tetanus toxoid when presented by fresh APC.
[0276]
Example 9
To address the role of the Fc portion of LO-CD2a, F (ab ′)₂ Studies were performed comparing the functional effects of the fragments with the whole antibody.
[0277]
As shown in FIG. 52, PBMC responded with irradiated Epstein-Barr virus (EBV) transformed B cell line at a ratio of responding individual cells to stimulator cells of 2: 1 and also LO-CD2a or its F (ab ′)₂ Incubated for 6 days with increasing fragment dose. This graph shows F (ab ') for the response of four different donors.₂ The effect of the fragment is depicted, and each time point is the average of triplicate well motion at each data time point. Results are reported as a percentage of the control response. To clarify the graph, data from the addition of the whole LO-CD2a antibody is not shown. At a dose of 30 ng / ml of total LO-CD2a, the donor response is: donor 1-18%, donor 2-6.6%, donor 3-3.7%, and donor 4 relative to the control -12%. The antibody-free cellular response from the tested individuals ranged from 56,690 cpm to 404,843 cpm, and cpm from individual wells was within 10% of the average value.
[0278]
F (ab ')₂ To further evaluate the potential inhibitory properties of the fragments, F (ab ′)₂ Fragment titration of fragments was added to unfractionated PBMC stimulated with soluble OKT3 (APC dependent response). As shown in FIG. 53, PBMC were stimulated with soluble OKT3 (100 ng / ml) for 3 days. LO-CD2a intact antibody or F (ab ')₂ Any of the fragments were added on day 0 in increasing doses. Results are expressed as a percentage of the proliferative response of the cells to OKT3 in the presence of isotype-matched control monoclonal antibody. Each data time point is the average of triplicate wells where cpm from individual wells was within 10% of the average. The average cpm for stimulated PBMC without antibody was 60,117.
[0279]
The result of FIG. 53 shows that the proliferation of T cells against OKT3 is F (ab ′)₂ This indicates that the fragment was not inhibited when used.
[0280]
Example 10
APC requires LO-CD2a inhibition in vitro culture
To address the issue of the role of APC in the inhibition of LO-CD2a, the PBMC T cell population was depleted of CD14, CD56, CD19 and HLA-DR positive cells by immunomagnetic sorting. Analysis of purified cells by flow cytometry techniques showed that the APC population was lost by more than 95% (data not shown). Proliferation of these purified T cells to soluble OKT3 (APC-dependent response) was reduced to 1% or less of unfractionated PBMC proliferation due to this loss (data not shown). Purified T cells or unfractionated PBMC were stimulated by plate-bound OKT3 (APC-independent method of T cell stimulation) in the presence or absence of LO-CD2a. The ability of LO-CD2a to inhibit T cell activation was removed when APC was removed (FIG. 54). As shown in FIG. 54, PBMC or PBMC in which APC was lost by immunomagnetic technique were plated on 96-well plates coated with OKT3 (10 μg / ml) and cultured for 3 days. LO-CD2a was added at the beginning of the culture. Results are expressed as a percentage of the proliferative response of the cells to OKT3 in the presence of isotype-matched control monoclonal antibody. The plotted data represents three experiments, where each data point is the average of triplicate wells with cpm from individual wells within an average of 10%.
[0281]
Example 11
Construction and analysis of second generation humanized LO-CD2a (MED-507)
Vector construction
Humanized LO-CD2a (Example 7B) heavy chain first generation additional mutagenesis was performed to improve the binding properties of the antibody. Four additional rat framework residues were retained in addition to the seven retained in the molecule described in Example 7. These four amino acid changes were made using three PCR mutagenesis experiments (one of the PCRs led to two amino acids being changed).
[0282]
All PCRs were performed using Pfu DNA polymerase (California, La Jolla, Strada Gene) and the following program: 5 minutes at 95 ° C. 5 minutes at 72 ° C. 25 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C. Then extend at 72 ° C for 5 minutes. Template DNA is first generation humanized LO-CD2aV_H A 701 base pair (please confirm) HindIII / BamHI DNA fragment isolated from the region. The oligonucleotides used are listed in Table 3 below.
[0283]
[Table 3]

[0284]
Reaction # 1 contains oligonucleotides 877 and 1007 to generate a 185 base pair DNA fragment, which consists of two additional rat LO-CD2a antibody residues at amino acids (AA) 12 and 13 (Gln12 and Arg13) and framework FR1. Held on. (Residues are numbered according to Cabat et al., Immunology-related protein sequence, 4th edition, 1987, Ministry of Health and Human Services, Directorate General of Public Health, National Institute of Health).
[0285]
Reaction # 2 contained oligonucleotides 1006 and 875 to generate a 515 base pair DNA fragment that also retained two rat residues at AAsGln12 and Arg13.
[0286]
Reaction # 3 contained oligonucleotides 877 and 1012 to generate a 290 base pair DNA fragment that retained the rat LO-CD2a residue at position 48.
[0287]
Reaction # 4 produced a fragment containing oligonucleotides 1011 and 875, retaining the rat residue at the same position 48.
[0288]
All reaction products were purified using Kiax (California, Chatsworth, Kiagen). The reaction product is then 701 base pairs V as follows:_H Additional PCR was performed to generate fragments. Reaction # 5 contained the reaction products of reactions # 1 and # 2, and oligonucleotides 877 and 875. Reaction # 6 contained the reaction products of reactions # 3 and # 4 and oligonucleotides 877 and 875.
[0289]
To obtain a mutation at position 28, (isoleucine) PCR was set up using the template from reaction # 5 (ie containing Gln12, Arg13). Reaction # 7 contained oligonucleotides 877 and 1020, producing a 230 base pair DNA fragment that retained a rat residue at position 28. Reaction # 8 produced a 470 base pair DNA fragment containing oligonucleotides 1008 and 875, also retaining a rat residue at position 28. Following purification of the reaction product using Kiax (California, Chatsworth, Chiagen), the reaction product is then 701 base pair V_H Additional PCR was performed to generate the fragment and was cloned into Pea Blue Script / Sma (California, La Jolla, Stratagene) for subsequent DNA sequencing.
[0290]
Following sequence analysis, the two fragments were gel separated using Kiax (California, Chatsulose, Chiagen): (1) 270 base pairs HindIII / EcoNI (Hu) containing 3 of the 4 new amino acid changes Vh mut 1 + 2A), and (2) 430 base pairs EcoNI / BamHI (Hu Vh mut 3D), including the fourth amino acid change. The fragment was then ligated to the MRC heavy chain vector described in Example 6B, which contained a human heavy chain constant region between the HindIII and BamHI sites to produce the final clone, clone # 257-20. . The light chain expression begda was the same as that used in the first generation expression vector (202-2).
[0291]
FIG. 57 shows the amino acid sequence of the rat antibody used in the modeling process and the second generation humanized LO-CD2aVH fragment (MED-507) aligned in parallel with the human heavy chain variable sequence.
[0292]
Transient expression in COS cells using MRC vectors
Two vectors were licensed from the Medical Research Council (MRC, London, UK) for expression of humanized light and heavy chains, respectively (Figure 57). A 9.2 kilobase light chain vector (hcmv-vlys-kr-neo) humanizes the human kappa constant region of anti-lysozyme as a HindIII-BamHI fragment._L Includes genomic clones of the region. The 8.6 kilobase heavy chain vector (hcmv-VhLys-gammal-neo) is a HindIII-BamHI fragment of anti-lysozyme human γ1 constant region and humanized V_H Including genomic clones of the region (Maeda, et al., 1991,Human antibody hybridoma2, vol. 124-134). Anti-lysozyme V_L And V_H The region was removed by restriction digestion and humanized V_L And V_H The construct was inserted in its place. The two plasmids were then cotransfected into COS-7 cells.
[0293]
COS-7 cells are obtained from ATCC (access number CRL-1651) and have two surface areas of 1700 cm² Grown in corrugated plastic roller bottles (New York, Corning, Corning) in FBS / DME medium until 40-60% confluent. All media was removed and replaced with transfection media at 37 ° C. [Noseram 10% (Massachusetts, Waltham, Collaborative Research, Incorporated), DEAE-dextran chloroquine diphosphate, humanized LO-CD2a heavy chain DNA, 0.25 mg, light chain DNA, DMEM with 0.25 mg]. The roller bottle was returned to the incubator and roller bottle equipment 123 hours, then removed with all media and replaced with 10% DMSO in PBS at 37 ° C. After 2-5 minutes of contact, the DMSO solution was removed and replaced with FBS / DMEM. The roller bottles are returned to the incubator and roller bottle equipment at 37 ° C. per day, after which the medium is removed and disposed of (protein accumulation is considered too low for harvesting at this point) and then with the same fresh medium. Replaced. After incubation at 37 ° C. for a few days, half of the media in each roller bottle was removed and replaced with fresh identical media. This process was repeated until about 3 harvests were obtained (the yield decreased after that point). The harvested supernatant was assayed for the presence of humanized IgG with an ELISA.
[0294]
The resulting antibody was purified from transfected COS cells by affinity chromatography (Protein A). This in vitro activity of this humanized antibody has three experimental modes: binding to Jurkat cells, inhibition of primary mixed lymphocyte reaction (MLR), and low response of secondary MLR to alloantigen (allogeneic antigen) Sex induction was used to compare with the activity of rat LO-CD2a. The functionality of the humanized antibody produced by transient expression was similar to that of rat LO-CD2a and was later confirmed by stable antibody expression in NSO cells.
[0295]
Stable expression in NSO cells using Celltech vector
Biological production of recombinant mammalian gene products for clinical use generally requires the use of higher order eukaryotic cells to achieve proper processing of proteins and safe biological activity. Immortalized fungal cells are the currently selected system for this purpose due to their ability to grow at high density in inexpensive media, high productivity, and suitability of post-transplant treatment. Two desirable systems are: 1) glutamine synthetase (GS) in mouse myeloma NSO cells, selection (Bebington, et al., 1992, Bio / Technology, 10, 169-175), and 2) Chinese hamster ovary (CHO-DHFR minus) dihydrofolate reductase (dhfr) amplification in cells (Kaufman and Sharp, 1982,Journal of molecular biology159, 601-621).
[0296]
The glutamine synthetase system in NSO cells was utilized for the stable expression and resulting production of second generation humanized LO-CD2a (MED-507). NSO cells are glutamine auxotrophs that are absolutely necessary for the addition of glutamine for survival or for the introduction of exogenous GS genes (Bevinton et al., 1992). The expression system takes advantage of this property to select cells carrying GS and immunoglobulin genes in glutamine deficient media (Coket et al., 1990, Biotechnology (New York), Vol. 8, pages 662-667). One way in which cells can increase the level of glutamine synthetase is to increase gene copy number of DNA amplification using concomitant amplification of copy number of adjacent genes. The potential for increased gene dosage is an increase in the production of gene products, in this case both glutamine synthetase and immunoglobulin.
[0297]
The Celltech expression vectors used (FIG. 44) were pEE6CMV-B and pEE12 (described in published PCT application numbers WO86 / 05807, WO87 / 04462, WO89 / 01036, and WO89 / 10404). Since none of these vectors contained C kappa or C gamma 1, genomic clones for these genes were obtained from the MRC light and heavy chain vectors, respectively. Both constant region clones were sequenced to obtain restriction sites.
[0298]
Because of the difference between the MRC vector and the Celtec vector (the light chain and heavy chain MRC vectors are separate and the heavy chain is separated by a hCMV promoter region after the light chain) It was necessary to make the following changes to the heavy chain construct.
[0299]
The following changes were made to clone the transiently expressed humanized BTI-322 light chain construct into a Celtec vector. The light chain clone, clone # 202-2, was digested with HindIII / EcoHI and the 1.93 kilobase fragment was gel purified. This fragment served as a template for PCR mutagenesis to change the 5 'restriction site to XmaI and add a translation initiation consensus sequence (Kozak, 1998, point mutations are AUG initiation codons that regulate translation by eukaryotic ribosomes. The sequence adjacent to is defined as cell 44, pages 283-292). This PCR reaction was also used to remove internal BamHI and EcoRI sites to allow later cloning steps. The resulting 0.85 kilobase PCR product was sequenced and then digested with XmaI / MscI. Clone # 202-2 was then digested with MscI / EcoRI and the 2.7 kilobase fragment was gel separated. A three-way continuation of the 0.85 kilobase fragment and the 2.7 kilobase fragment was performed by inserting them into pEE12 between the XmaI and EcoRI sites of the polylinker. The producing clone was named clone # 237-4.
[0300]
Insertion of the heavy chain construct into the Celltech vector required the following changes: Clone # 257-20 was digested with HindIII / EcoRI and the entire 2.7 kilobase heavy chain was gel separated. This fragment was then further digested with NheI / Bg1II to produce a 0.7 kilobase HindIII / NheI fragment and a 2.0 kilobase NheI / BglII fragment (the BglII site was at the 3 'end of the original clone). Very close, ie 20 base pairs away from the EcoRI site). The 0.7 kilobase HindIII / NheI fragment was then used as a PCR mutagenesis template to change the 5 'restriction site from HindIII to EcoRI and to add a translation initiation consensus sequence (Kozak, 1986,cell44, 283-292). The 3 'end was also altered by removing the internal BamHI site. The generated fragment was sequenced. When the correct clone was found, a three-way sequence was performed as follows: a 0.7 kilobase EcoRI / NheI fragment and a 2.0 kilobase NheI / Bg1II fragment between the EcoRI and Bc1I sites of the polylinker. Continued to pEE6hCMV-B (Bc1I and Bg1II are compatible sites). After successful bacterial transformation was confirmed by PCR, one of these clones, designated clone # 6, was used to construct the final expression vector.
[0301]
To do this, a 6 kilobase BglII / BamHI fragment derived from clone # 6 containing the humanized heavy chain plus its hCMV promoter was inserted into the BamHI site of pEE12 / humanized light chain vector 237-4. After transformation into E. coli, PCR was performed using template DNA obtained from a bacterial colony boiled for 5 minutes (colony PCR) to confirm clones containing both light and heavy chains in the correct orientation. It was conducted. Two oligonucleotide PCR primers were designed to amplify the region from the 3 'end of the light chain to the 5' end of the heavy chain. Clone # 12 was confirmed to be correct. To further confirm that this clone contained light and heavy chain inserts in the proper orientation, plasmid DNA was isolated from this clone and the DNA was digested with BamHI / SaII. Release of the small 0.25 kilobase fragment from clone # 12 indicated that it was in the correct 5 'to 3' orientation with the 6 kilobase BglII / BamHI fragment containing the heavy chain and hCMV promoter (if If the orientation was reversed, the BamHI / Sa1I digestion would have produced a 6.3 kilobase fragment.
[0302]
Stable expression in NSO cell line
Clone # 12 DNA linearized with Sa1I was used for transformation of NSO cells according to Celltech's glutamine synthetase gene amplification system-procedure manual (2nd edition: revised for use in myeloma cells) Edition 5, pages 6-14, November 5, 1992). Cells were electroporated with 3 μF, 1500 volts, 2 pulses (10⁷ 40 μg were transfected per NSO cell). After electroporation, cells were plated on 4-6 plates of 16,000, 4,000, and 1000 cells per well at 50 μL / well of 10% FBS / DME, respectively. The next day, 150 μL / well of glutamine-free IMDM with 10% dialyzed FBS was added to the plate. Colonies were marked when colonies were confirmed to grow on 96-well plates in medium without glutamine (they incorporated the glutamine synthetase gene linked to the gene for MEDI-507 antibody) It suggests). Since transfection was performed with the previously described DNA, a total of 204 colonies were screened with Eliza and selected with the highest titer. Approximately 1/3 colonies were selected for tensile in 48 well plates, incubated for 5 days, and then tensile in T-25 flasks. When significant cell growth occurs in any particular T-25 flask (and usually within 3-6 days), the flask is further 5 × 10 5 in each of a few T-25 flasks.^Four Divided into viable cells / ml. One of these flasks was used to examine antibody production, allowing the flask to grow for 2-3 weeks without interruption. Other flasks measure cell growth rates and determine which cell lines are worth examining further based on antibody production, cell growth, and adaptability to serum-free medium growth Was used to grow. At this point, for about 5 weeks, the cells were used for growth so that the cell line simply passed from flask to flask without necessarily performing a cell count prior to each passage. At the end of this period, subcloning was determined by the criteria previously described and started in some of the most promising cell lines. MEDI-507hu 2.2.404 was from a plate predominated with a 16K cell / well plate. Subcloning was performed on clones MEDI-507hu2.2.204. On 2 plates each at 0.5 and 5 cells / well. X was performed and kept warm for about 3 weeks.
[0303]
A subclone labeled clone # 204.11 was generated on a 5 cell / well plate (originally calculating the starting viable cell density). This specific plate grew in 33 pieces of 96 wells. 29 clones (from all plates) were labeled and screened with an ELISA. 29 out of 5 clones were selected for tensile in 48 well plates and then in 5-7 day T-25 flasks for incubation. A total of 5 clones were incubated for an additional 5-7 days and then tensioned in T-75 flasks. After 5-7 days, cells from these flasks are used to prepare frozen glass bottles for each clone, and the remainder of the cells are used to test antibody production rate, growth rate, and adaptability to serum-free medium. It was done. After the screening process was completed, the best clone frozen glass bottles of the best cell line were thawed and several glass bottles of each were expanded for settlement and further evaluated in culture.
[0304]
Comparison of in vitro functionality and biological properties of humanized MEDI-507 and rat LO-CD2a
Relative binding affinity, inhibition of mixed lymphocyte reaction (MLR), ability to induce hyporesponsiveness to alloantigen in secondary MLR, and that of rat LO-CD2a due to CD2 cell loss in Hu-CD2 transgenic mice Studies were performed comparing the functional and biological activities of humanized MEDI-507. The results show that the two antibodies behave similarly.
[0305]
Relative binding to Jurkat cells
A Jurkat cell-based binding assay was performed to compare the competitive binding of the study lot of human MEDI-507 (lot, PA112955) with that of rat LO-CD2a (lot SO82 / 83). 1.3 × 10⁶ 300 μL of Jurkat cells at 4 ° C at a cell density of cells / ml¹²⁵Incubated with 20 μL of 4 mM solution of I-labeled rat LO-CD2a and 80 μL of chilled (unlabeled) rat LO-CD2a or humanized MEDI-507. The effective concentration of labeled rat LO-CD2a was 0.2 nM. Unlabeled rat LO-CD2a and humanized MEDI-507 varied from 2 nM to 0 nM. The effective concentration of chilled LO-CD2a served as a control for nonspecific binding in tubes containing 20 nM.
[0306]
After incubating at 4 ° C. for 30 minutes, 240 μL of this reaction mixture was layered on top of 50 μL of silicone oil mixture (AR-200 2: 1 (v / v): Thomas silicone oil) in a thin polypropylene tube. It was centrifuged at 14,000 × g for 5 minutes in a microcentrifuge. Separation of labeled antibody from bound antibody was accomplished by precipitating cells through an oil plug. The oil layer was cut and counted. 100 μL of reaction mixture before separation was directly counted to determine total input cpm. Assay analysis shows a similar binding pattern between rat LO-CD2a and humanized MEDI-507.
[0307]
Inhibition of MLR
The ability of rat LO-CD2a (lot SO82 / 83) and two different study lots of humanized MEDI-507 (lot QAS and ASQ) to inhibit the mixed lymphocyte reaction was tested. Irradiated human stimulator PBMC was incubated with human responder individuals PBMC from different donors in the presence of rat LO-CD2a, humanized MEDI-507, and appropriate isotype controls at concentrations ranging from 10 to 60 ng / mL. Incubate at 37 ° C for 5 days.^ThreePulsed with H-thymidine and thymidine incorporation was determined. This result (FIG. 46) shows that both rat LO-CD2a and humanized MEDI-507 similarly inhibit MLR in a dose-dependent manner.
[0308]
Induced hyporesponsiveness
An important biological property of rat LO-CD2a is its ability to induce in vitro alloantigen-specific hyporesponsiveness. The ability of humanized MEDI-507 (Lot QAS and ASQ) to induce hyporesponsiveness was compared to that of rat LO-CD2a (Lot SO82 / 83).
[0309]
Primary MLRs were performed in the presence of 10 ng / ml, 60 ng / ml and 200 ng / ml in humanized MEDI-507, rat LO-CD2a, or appropriate isotype control, and antibody-free control cultures. After incubation for 7-8 days, the cells were separated from the culture, placed in Ficoll, washed, resuspended in culture medium and allowed to “rest” at 37 ° C. for 3-4 days. Cells from these cultures were used as responding solid cells in secondary MLR cultures containing irradiated stimulator cells from the original donor. The culture is then incubated for an additional 48 hours,^ThreePulsed with H-thymidine and thymidine incorporation was determined. Analysis of the results (FIG. 61) shows that humanized MEDI-507 also induces a hyporesponsive state against alloantigen attack.
[0310]
CD2 cell loss
The effects of humanized MEDI-507 and rat LO-CD2a on human CD2 receptor transplanted into mice (Hu-CD2 transgenic mice) were compared. Twenty-five Hu-CD2 transgenic mice were assigned to one of five groups, humanized MEDI-507 (0.12 mg / kg or 0.006 mg / kg), rat LO-CD2a (0.12 mg / kg or 0 .06 mg / kg) or buffer control (5 mice / group). Mice were bled on days 0 (prior to receiving dose), 1, 3, 7, 14, 21, 28, 36 and 44, and blood was analyzed for CD2 lymphocytes.
[0311]
Whole blood was collected in a tube containing heparin. Four 20 μL aliquots were distributed into 96-well, round-bottom tissue culture plates, stained with the appropriate antibody, and treated with FACS rice to lyse erythrocytes and fix stained cells. After washing to remove unbound antibody and cell debris, the remaining lymphocyte population was analyzed by flow cytometry.
[0312]
FIG. 62 shows that low dose humanized MEDI-507 and rat LO-CD2a (0.006 mg / kg, in these mice it would be a 0.15 μg dose) had no detectable effect on the total number of CD2 cells. Showed that. These mice were not examined after the 14th time point. High doses of humanized MEDI-507 and rat LO-CD2a (0.12 mg / kg, in these mice it becomes a 3.0 μg dose) had a significant loss effect on the total number of CD2 cells. The recruitment of CD2 retaining cells in transgenic mice treated with high doses of humanized and rat antibodies could also be compared.
[0313]
(Industrial applicability)
As described above, the present invention produces a humanized antibody from LO-CD2a that inhibits T cell activation and proliferation in humans or non-human primates to inhibit graft rejection, together with immune response Also disclosed are methods of inhibiting and inhibiting graft rejection.
[0314]
Numerous modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and therefore, the invention can be practiced otherwise than as specifically described within the scope of the claims set forth above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Two-color staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using biotinylated LO-CD2a and Leu-5bPE
The following parameters followed for this staining:
FIG. 2: Human PBMC stained with LO-CD2a-FITC and then a) T11-PE (Coulter antibody against CD2) conjugated to phycoerythrin (PE), or b) conjugated to phycoerythrin (PE) Stained with Leu-5B-PE (Becton-Dickinson antibody against CD2). In either case, there was no staining with secondary antibody altered by pretreatment with LO-CD2a.
FIG. 3. Human PBMC stained with LO-CD2a-FITC and then a) T11-PE (Coulter antibody against CD2) conjugated to phycoerythrin (PE) or b) conjugated to phycoerythrin (PE) Stained with Leu-5B-PE (Becton-Dickinson antibody against CD2). In either case, there was no staining with secondary antibody altered by pretreatment with LO-CD2a.
FIG. 4. Effect of LO-CD2a on membrane markers. 2 × 10⁶ PBMCs at cells / ml were cultured in the absence (solid line) or presence (dashed line) of LO-CD2a (200 ng / ml). At the time indicated in the figure, cells were harvested and processed for cytofluorometer analysis. a) and b); PBMC is anti-CD3 (Leu-4a-FITC), anti-CD4 (T4-RD) mAbs, anti-class II antigen (LO-DRa-FITC) or anti-CD8 (T8-RD) monoclonal antibody (mAbs) ). Negative controls for commercial mouse mAbs were aliquots of the same cells stained with FITC or rhodamine labeled mouse IgGs. Rat mAbs negative controls were cells incubated with standard rat serum followed by FITC-labeled mouse anti-rat mAb (MARK-FITC). Results are shown as percentage of positive cells.
FIG. 5. Effect of LO-CD2a on membrane markers and human blood lymphocyte cultures with and without the addition of LO-CD2a. 1 × 10⁶ Lymphocyte cultures at cells / ml were: a) anti-CD2 (Leu-5b-FITC), anti-CD4 (T_Four Labeled at the indicated time with -RD1) mAb, or anti-CD8 (T8-RD) mAb. Negative controls for commercial mouse mAbs were aliquots of the same cells stained with FITC or rhodamine labeled mouse IgGs. Negative controls for rat mAbs were standard rat serum and then cells incubated with FITC labeled mouse anti-rat mAb (MARK-FITC). Results are shown as percentage of positive cells.
FIG. 6: Effect of LO-CD2a and Leu-5b on CD2 expression. Human PBMC are incubated at the time indicated with a) LO-CD2a (200 ng / ml) or b) Leu-5b (dialyzed against PBS and diluted 1: 2), and a) CD2 ( Expression of Leu-5b-FITC and T11-RD1) and binding of LO-CD2a (Mark-3-FITC), or b) CD2 (LO-CD2a-FITC, T11-RD1) and Leu-5b goat anti-mouse ( GAM-FITC) stained for expression.
FIG. 7: Effect of LO-CD2a on MLR. a) Inhibition of MLR in mixed lymphocyte cultures incubated for 6 days in the presence of increasing concentrations of LO-CD2a added at time zero. Cultures were harvested at 6 days. b) Inhibition of MLR in mixed lymphocyte cultures incubated with different concentrations of LO-CD2a added at time zero. Cultures were harvested at 24 hour intervals. c) by mixed lymphocyte culture in the absence (solid line) or presence (dashed line) of LO-CD2a (200 ng / ml)^ThreeH-thymidine (HT) incorporation (cpm). d) Inhibition of MLR by LO-CD2a (200 ng / ml) added at different times after the start of incubation. Cultures were harvested on day 6. All cultures were triplicated at a final volume of 200 μg / well (1 × 10 × of each donor / ml⁶ Cell). 8 hours before culture collection^ThreeH-thymidine was added. The result of c) is cpm × 10 captured per well taken at the indicated time^Three As shown. The results of a), b) and d) are shown as percentage inhibition of MLR in triplicate cultures (mean ± standard deviation) compared to control cultures (without LO-CD2a).
FIG. 8. Effect of LO-CD2a on blasts during MLC. Peripheral blood mononuclear cells were cultured in mixed lymphocyte cultures with or without the addition of 200 ng / ml of LO-CD2a. At the indicated time points, cells were removed and analyzed by flow cytometry after staining with an antibody against CD2 (Leu5b-FITC). The blasts were gated by forward and side scatter and the expression of the indicator marker was quantified in the blasts.
FIG. 9: Effect of LO-CD2a on resting cells during MLC. Human lymphocytes were cultured with or without the addition of LO-CD2a (200 ng / ml). At the indicated time points, cells were removed and stained with CD3 (Leu4a-FITC), CD4 (T4-RD1), CD8 (T8-RD1) or CD25 (LO-TACT-1-FITC). Resting lymphocytes are confirmed by differential gating on size and granularity, and the results are shown as a percentage of total resting lymphocyte staining with the indicated antibody (FIG. 9). The percentage of resting cells that stained positively with Leu-5b in cultures with and without LO-CD2a is shown in FIG.
FIG. 10. Effect of LO-CD2a on resting cells during MLC. Human lymphocytes were cultured with or without the addition of LO-CD2a (200 ng / ml). At the indicated time points, cells were removed and stained with CD3 (Leu4a-FITC), CD4 (T4-RD1), CD8 (T8-RD1) or CD25 (LO-TACT-1-FITC). Resting lymphocytes are confirmed by differential gating on size and granularity, and the results are shown as a percentage of total resting lymphocyte staining with the indicated antibody (FIG. 9). The percentage of resting cells that stained positively with Leu-5b in cultures with and without LO-CD2a is shown in FIG.
FIG. 11: Effect of LO-CD2a on mitogen-stimulated lymphocytes. PBMC were cultured for 96 hours in the absence or presence of OKT3 (100 ng / ml), Con-A (10 μg / ml) and PHA (1 μg / ml). In parallel cultures, LO-CD2a (200 ng / ml) was added 1 hour after mitogen (gray bar) or 1 hour before mitogen (white bar). Checkered bars represent cultures performed in the presence of LO-CD2a only. (Triad) culture lasts 8 hours of incubation^ThreePulse-labeled with H-thymidine.
FIG. 12: Effect of LO-CD2a on mitogen-driven activation of PMBC. PMBC from two donors_S Were cultured for 96 hours in the presence of OKT3 (100 ng / ml), CON-A (10 μg / ml) and PHA (1 μg / ml). In parallel culture, LO-CD2a (200 ng / ml) was added on day 0 (0 hour), day 1 (24 hours), or day 2 (48 hours). The graph shows the percentage of inhibition of mitogen-induced growth by LO-CD2a in each donor.
FIG. 13: Effector cells and target cells in the presence of LO-CD2a (⁵¹Inhibition of NK activity by incubation of CR-labeled K562 cells). Three concentrations of LO-CD2a were tested: 5 μg / ml, 1 μg / ml and 0.5 μg / ml. Effector cells that were peripheral blood lymphocytes with NK activity are shown as percent solubility of labeled target cells. Two standard test materials were tested at three E / T ratios: 200/1, 100/1, 50/1.
FIG. 14: Effector cells and target cells in the presence of LO-CD2a (⁵¹Inhibition of NK activity by incubation of CR-labeled K562 cells). Three concentrations of LO-CD2a were tested: 5 μg / ml, 1 μg / ml and 0.5 μg / ml. Effector cells that were peripheral blood lymphocytes with NK activity are shown as percent solubility of labeled target cells. Two standard test materials were tested at three E / T ratios: 200/1, 100/1, 50/1.
FIG. 15 Total lymphocytes per μl of peripheral blood of Cynomolgus monkey that received 20 mg / day of LO-CD2a for 10 days (day 0-9).
FIG. 16 PBMCs of cynomolgus monkeys that received LO-CD2a at 20 mg / day for 10 days (day 0-9) were CD2 (Leu-5b), CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), natural killer cells (CD8) And CD11b), and stained on the indicated days with monoclonal antibodies against B cells (anti-IgM) and analyzed by flow cytometry. Results are shown as a percentage of total number of stained cells per microliter of blood.
FIG. 17 NK activity of cynomolgus monkeys receiving LO-CD2a at 20 mg / day for 10 days (day 0-9). NK activity was assayed at 11 and 22 days and expressed as% solubility at 25/1, 50/1 and 100/1 E / T.
FIG. 18. Serum concentration of LO-CD2a in cynomolgus monkeys that received antibody at 20 mg / day for 10 days (day 0-9). Monoclonal antibodies were measured by Elisa as described herein and expressed in μg / ml.
FIG. 19: Changes in IgG antibody against LO-CD2a in cynomolgus monkeys receiving 20 mg / day LO-CD2a for 10 days (day 0-9). Antibodies against monoclonal antibodies are measured at serial dilutions of serum drawn on the designated date by a sandwich ELISA as described in the text and are indicated by an optical density (absorbance) of 492 nm.
FIG. 20: Effect of LO-CD2a on baboon lymphocytes.
a) Blood was obtained from baboons on the indicated day and cells bound to anti-CD2 antibodies T11-RD1 and Leu-5b-FITC, LO-CD2a and MARK3-FITC, FITC to detect bound LO-CD2a And stained with a mouse anti-rat kappa 1b antibody.
b) Serum samples taken on the indicated days were evaluated for level of LO-CD2a by Elisa.
FIG. 21: Effect of LO-CD2a on baboon lymphocytes.
MARK3-FITC and MARK2b-8-biotin (biotin-conjugated mouse monoclonal anti-rat IgG2b) where blood is drawn on the indicated day and cells are detected with PE-conjugated streptavidin to detect bound LO-CD2a Antibody).
a) No cell pretreatment.
b) Incubation with LO-CD2a, 2.5 μg / ml prior to staining to detect any sites not occupied by circulating antibodies.
FIG. 22: Effect of LO-CD2a on baboon lymphocytes.
Blood samples were collected on the indicated days and stained with T4-RD1 (CD4), T8-RD1 (CD8) or MARK3-FITC (binding to LO-CD2a).
FIG. 23. Leukocytes, lymphocytes and creatinine of patient # 1 treated with ATG then LO-CD2a for allograft rejection.
FIG. 24: Serum levels of LO-CD2a during and after treatment in patient # 1.
FIG. 25. Creatinine in patient # 2 before, during and after treatment with LO-CD2a.
FIG. 26. White blood cell and lymphocyte counts in patient # 2 before, during and after treatment with LO-CD2a.
FIG. 27: Serum levels of LO-CD2a in patient # 2 taken immediately before and 2.5 hours after each injection.
FIG. 28. White blood cell count, lymphocyte count and serum creatinine level in patient # 3 who received LO-CD2a for renal allograft rejection.
29. Markers of LO-CD2a and (2) Leu5b, (3) Leu4 (CD3), (4) Leu3a (CD4), (5) Leu2b (CD8) and (6) Leu11 (anti-CD16) NK cells. Two-color staining. LO-CD2a binding was detected with goat anti-rat IG-FITC. The upper set (1-6) of the two-color histogram shows two-color staining. The lower set (7-12) shows single staining with each antibody.
FIG. 30: Markers of LO-CD2a and (2) Leu5b, (3) Leu4 (CD3), (4) Leu3a (CD4), (5) Leu2b (CD8) and (6) Leu11 (anti-CD16) NK cells. Two-color staining. LO-CD2a binding was detected with goat anti-rat IG-FITC. The upper set (1-6) of the two-color histogram shows two-color staining. The lower set (7-12) shows single staining with each antibody.
FIG. 31: Rat isotype control for LO-CD2a (Pharmingen, purified rat IgG2b, kappa), or LO-CD2a and CD4 (c, d), CD8 (e, f), CD16 (g, h), CD19 (i , J) and two-color staining of human PBL with phycoerythrin-conjugated antibodies against CD2 (k, l). LO-CD2a and isotype controls were detected with FITC-conjugated affinity purified F (ab ′) 2 anti-rat immunoglobulin (Southern Biotechnology). The antibodies against CD antigen were all phycoerythrin-conjugated antibodies obtained from Becton Dickinson [CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), CD16 (Leu-11b), CD19 (Leu12) and CD2 (LeuSb)]. In each case, staining with the isotype control is shown in the first histogram and LO-CD2a is shown in the second histogram. Histogram a shows the pattern with the isotype control and b shows the pattern with LO-CD2a.
FIG. 32: Rat isotype control for LO-CD2a (Pharmingen, purified rat IgG2b, kappa), or LOCD2a and CD4 (c, d), CD8 (e, f), CD16 (g, h), CD19 (i, j) ) And two-color staining of human PBL with phycoerythrin-conjugated antibodies to CD2 (k, l). LO-CD2a and isotype controls were detected with FITC-conjugated affinity purified F (ab ′) 2 anti-rat immunoglobulin (Southern Biotechnology). The antibodies against CD antigen were all phycoerythrin-conjugated antibodies obtained from Becton Dickinson [CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), CD16 (Leu-11b), CD19 (Leu12) and CD2 (LeuSb)]. In each case, staining with the isotype control is shown in the first histogram and LO-CD2a is shown in the second histogram. Histogram a shows the pattern with the isotype control and b shows the pattern with LO-CD2a.
FIG. 33. Indirect cytofluorescence analysis of staining of COS cells transfected with wild type CD2. The left panel shows a histogram of staining of COS cells transfected with a control vector without CD2, and the right set of panels shows a histogram of staining of COS cells transiently transfected with a vector containing the complete CD2 molecule. In each set, the upper histogram shows staining with murine W632 (an antibody against class I known to be expressed by COS cells) and 76-2-11 (an isotype control for murine W632). The middle panel shows staining with Leu5b (anti-CD2 from Becton Dickinson) and 76-2-11, isotype matched controls for Leu5b staining, the lower panel with rats for LO-CD2a and LO-CD2a. Staining with isotyped controls is shown.
FIG. 34 Chimeric LO-CD2a V_L The nucleotide and amino acid sequence of the chain.
FIG. 35: Chimeric LO-CD2a V_L The nucleotide and amino acid sequence of the chain.
FIG. 36: Chimeric LO-CD2a V_L The nucleotide and amino acid sequence of the chain.
FIG. 37: Chimeric LO-CD2a V_H The nucleotide and amino acid sequence of the chain.
FIG. 38: Chimeric LO-CD2a V_H The nucleotide and amino acid sequence of the chain.
FIG. 39. Amino acid sequences of light chain variable regions of rat LO-CD2a, human HUM5400 and humanized LO-CD2a.
FIG. 40: Nucleotide and amino acid sequences of humanized LO-CD2a variable region.
FIG. 41. Nucleotide and amino acid sequence of humanized LO-CD2a variable region.
FIG. 42. Nucleotide and amino acid sequences of humanized LO-CD2a variable region.
FIG. 43. Amino acid sequences of the heavy chain variable regions of rat LO-CD2a, human Amu5-3, and humanized LO-CD2a.
FIG. 44. Nucleotide and amino acid sequences of the heavy chain variable region of humanized LO-CD2a.
FIG. 45. Nucleotide and amino acid sequence of heavy chain variable region of humanized LO-CD2a.
FIG. 46. Nucleotide and amino acid sequence of the heavy chain variable region of humanized LO-CD2a.
FIG. 47. Binding of rat LO-CD2a, humanized LO-CD2a to Jurkat cells.
FIG. 48. With rat LO-CD2a, humanized LO-CD2a, and control rats and human immunoglobulinsIn a test tubeInduced hyporesponsiveness.
FIG. 49. Inhibition of primary MLR by LO-CD2a and response of T cells cultured with LO-CD2a in the primary MLR to antigens in the secondary MLR or to third party stimulators in the MLR.
FIG. 50. Inhibition of primary MLR by LO-CD2a and response of T cells cultured with LO-CD2a in the primary MLR to antigens in the secondary MLR or to third-party stimulators in the MLR.
FIG. 51. Response of T cells cultured with LO-CD2a in primary MLR to antigen in secondary MLR or tetanus toxoid in secondary culture.
FIG. 52 F (ab ′) of LO-CD2a against MLR₂ The action of the fragments.
FIG. 53: Intact LO-CD2a antibody and LO-CD2a F (ab ′)₂ Comparison of the inhibition of PBMC growth by soluble OKT3 of the fragments.
FIG. 54: APC for inhibition of LO-CD2a_S Effect on proliferation induced by plate-bound OKT3.
FIG. 55. Amino acid sequences of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a, humanized antibody MEDI-507, and human Amu5-3.
FIG. 56. Amino acid sequences of the heavy chain variable region of rat LO-CD2a, humanized antibody MEDI-507, and human Amu5-3.
FIG. 57: Plasmid maps of hcmv-V11ys-kr-neo and hcmv-VhLys-gammal-neo.
FIG. 58: Plasmid map of pEE6hCMV-B and pEE12.
FIG. 59: Comparison of rat LO-CD2a and Jurkat cell humanized MEDI-507 antibody based on binding assay.
FIG. 60. Comparison of the ability of LO-CD2a, humanized MEDI-507 antibody, and human IgG to inhibit lymphocyte mixing reaction. The MLR response of one responder / stimulator pair is shown as an example of relative inhibition of the response by rat LO-CD2a or MEDI-507. Rat IgG2b or human IgG is an isotype control.
FIG. 61 Comparison of rat LO-CD2a and humanized MEDI-507 antibody in a hyporesponsiveness assay. In summary, a total 7 day MLR was performed in 6-well plates in the presence of rat LO-CO2a, MEDI-507 or control rat or human IgG. The culture was made ficoll to remove dead cells and placed in the medium for 3-4 days. The cells were then evaluated for their ability to proliferate against a secondary challenge with the original heteromorphic stimulator. Shown is the control percentage of proliferation associated with re-challenged cultures of primary MLR that did not receive exogenous antibody. This “medium” treated culture is measured as a 100% response.
FIG. 62: Comparison of rat LO-CD2a and humanized MEDI-507 antibody effects on CD2 cell count.

Claims (6)

All the CDR, a humanized antibody derived from LO-CD2a, produced from a cell line deposited as ATCC HB11423,
Framework of the heavy chain variable region before Kihi DOO antibody is
In the framework of human Amu5-3 described in FIGS. 55 and 56 ,
Amino 47,67,70,72,76,85, and 8 7, one of the amino acid 12,13,28, 4 8, 2, 3 or 4 and replaced with an amino acid of the LO-CD2a humanized antibody, characterized in that to those were. A humanized antibody of claim 1, wherein the framework of the heavy chain variable region before Kihi DOO antibody, in the framework of human Amu5-3 described in FIGS. 55 and 56, amino acids 12 and 13, A humanized antibody , wherein 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85 and 87 are substituted with the amino acid of LO-CD2a . The humanized antibody of claim 1, wherein the framework of the light chain variable region of the humanized antibody is the framework of human HUM5400 described in Figure 39 , wherein one or more amino acids 9, 12, 41. A humanized antibody , wherein 41, 42, 50, 51, and 82 are substituted with the amino acid of LO-CD2a . The humanized antibody of claim 3, wherein the framework of the light chain variable region of the humanized antibody is amino acid 9, 12, 41, 42, 50, in the framework of human HUM5400 described in FIG. A humanized antibody , wherein 51 and 82 are substituted with the amino acids of LO-CD2a .   The humanized antibody according to claim 1, wherein the heavy chain variable region of the humanized antibody has the amino acid sequences of FIGS. 55 and 56.   The humanized antibody according to claim 3, wherein the light chain variable region of the humanized antibody has the amino acid sequence of FIG.

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