JP4806135B2 - Novel compounds, spikelets containing the same, and uses thereof - Google Patents

Description

で表される化合物を含有する椿花抽出物が提供される。
また、本発明によれば、以下の式（１）〜式（６）のいずれか
【化４】

で表される化合物が提供される。
さらに、本発明によれば、上記椿花抽出物又は式（１）〜式（６）の少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する胃粘膜保護剤、アルコール吸収抑制剤及び糖吸収抑制剤が提供される。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明の椿花抽出物を得るために用いることができる植物の花は、ツバキ科（Theaceae）に属する植物の花であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヤブツバキ、ユキツバキ、ホンコンツバキ、サルウィンツバキ、ヤクシマツバキ、トウツバキ、ウラクツバキ、ワビスケ、カンツバキ、ナツツバキ、岩根絞、春曙光、太郎冠者等の種々の品種の花が挙げられる。なかでも、ヤブツバキ（Camellia Japonica L.)の花が好ましい。これらの植物は、日本、中国等に広く生育しているものであり、どこに生育しているものでも使用することができる。しかし、ツバキ科植物の花中に含有される成分は、原料とするツバキ科植物の種類及び産地等により、量や種類等に若干の差があると考えられるため、本発明の椿花抽出物を得るためには、日本国内で栽培されたものを用いることが好ましい。なお、ツバキ科植物の花としては、単種又は複数種のツバキ科植物の花のいずれを使用してもよい。ツバキ科植物の花は、通常、ガク片、花弁、心皮、雄ずい、雌ずい等を含むもので、かつ新鮮なものであることが好ましい。
【０００５】
本発明で使用される水性アルコールとしては、炭素数１〜３の脂肪族アルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。なかでも、メタノールが好ましい。また、水性アルコール水溶液としては、１〜５０重量％程度の水性アルコールを含有する水溶液が挙げられる。
【０００６】
本発明によれば、ツバキ科植物の花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液により抽出し、椿花抽出物を得る。この際、水性アルコール等は、ツバキ科植物の花の１〜１０倍（重量）程度、好ましくは１〜５倍程度使用することが適当である。
【０００７】
また、抽出は、冷浸又は温浸のいずれで行ってもよいが、５０〜８５℃程度の温度で、振盪下又は非振盪下に、上述したツバキ科植物の花を上述した溶剤に浸漬することによって行うことが適当である。振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜５時間程度行うことが適当であり、非振盪下に浸漬する場合は、１時間〜１０日間程度行うことが適当である。なお、抽出処理は、同一椿花材料について１回のみ行ってもよいが、２回以上繰り返して行うことが好ましい。
【０００８】
上記で得られる抽出物は、さらにｎ−ブタノールで抽出することが好ましい。この際、例えば、水、酢酸エチル等をｎ−ブタノールとともに加えて、分配抽出してもよい。分配抽出は、上記の水性アルコールでの抽出と同様に行うことができる。特に、分配抽出は、室温下、振盪下又は非振盪下に、水性アルコール又は水性アルコール水溶液により得られた抽出物又は後述するように濃縮した抽出物に対して、ｎ−ブタノールを１〜３０（重量）倍程度加えて行うことが適当である。
なお、ツバキ科植物の花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液により抽出した後又はさらにｎ−ブタノールで抽出した後、抽出物を濃縮することが好ましい。この際の濃縮は低温又は加温、かつ減圧下で行うことが好ましい。また、この濃縮は乾固するまで行ってもよいし、濃縮する前にろ過し、ろ液を濃縮して抽出物としてもよい。
【０００９】
得られた抽出物は、精製処理に付してもよい。精製処理は、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法等を単独又は組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のいずれか又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。例えば、薄層クロマトグラフィーの場合には、水―メタノール系の溶媒、高速液体クロマトグラフィーの場合にはメタノール−酢酸系の溶媒等を使用することができる。
【００１０】
上記で得られた水性アルコール（特に、メタノール）抽出物又はｎ−ブタノール抽出物を順相及び逆相薄層クロマトグラフィーに付し、さらに高速液体クロマトグラフィーに付した場合、上記に示す式（１）〜式（６）の６種の新規化合物に対応するスポット及びピークを得ることができる。
このように、本発明の椿花抽出物は、最終的に得られたピークを示す成分を精製することにより、式（１）〜式（６）の化合物を単離することができる。
【００１１】
本発明の方法によって得られる抽出物は、後述するように、活性酸素の消去作用、塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用、血小板凝集作用、ブドウ糖負荷による血糖値上昇抑制作用、アルコール吸収抑制作用、糖吸収抑制作用等の種々の作用が認められ、特に、胃粘膜保護剤、アルコール吸収抑制剤又は糖吸収抑制剤等として、そのままの状態であるいは適当な媒体で希釈して使用することができる。また、本発明の抽出物は、そのままの状態又は適当な媒体で希釈して、医薬的な治療効果を現さない量、つまり健康維持のための量で健康食品として用いてもよい。これらの場合の抽出物の形態は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の製剤のいずれであってもよい。
【００１２】
適当な媒体としては、例えば、乳糖、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成及び天然の珪酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母、酸化亜鉛、タルク、カオリン、硼酸末、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、次没子酸ビスマス、硫酸アルミニウムカリウム末、グリセリン、プロピレングリコール、脂肪油、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、界面活性剤等が挙げられる。
なお、上記の各種製剤は、医薬又は健康食品等の分野で広く採用されている公知の方法により製造することができる。
【００１３】
本発明の抽出物又は化合物の使用量は、濃縮、精製等の程度、使用目的、治療又は予防等の対象疾患、その疾患の程度、体重等により適宜調節することができるが、例えば、抽出物として、あるいは上記化合物を有効成分として、成人1日あたり、１μｇ〜１００００ｍｇ程度を２〜３回に分けて与えることが適当である。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明の椿花抽出物、それに含有される新規化合物及びそれらの作用についての実施例を、具体的に説明する。
【００１５】
（１）椿花の抽出及び椿花抽出物中に含有される新規化合物
椿花の抽出方法の概要を図１に示す。
伊豆大島で採取した新鮮な椿花（Camellia Japonica L.）６．０ｋｇをメタノール（９９．９％）６リットルに浸漬し、８０℃の加温下、３時間抽出した。これを３回繰り返し、得られたメタノールを合液し、メタノールを蒸発させることにより、メタノール抽出物を得た（４８０ｇ）。
次いで、得られたメタノール抽出物４８０ｇに、室温下、酢酸エチル及び水（１：１）を１リットルずつ加えて振り混ぜ、得られた酢酸エチル層及び水層をそれぞれ分液採取した。この操作を３回繰り返した。さらに、得られた水層に、室温下、ｎ−ブタノール（９９．８％）を３リットル加えて振り混ぜ、得られたｎ−ブタノール層及び水層をそれぞれ分液採取した。この操作を３回繰り返した。ｎ−ブタノール層及び水層から溶媒を蒸発させることにより、ｎ−ブタノール抽出物及び水抽出物を、それぞれ得た（１２１ｇ及び３３２ｇ）。メタノール抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物及び水抽出物の順相及び逆相薄層クロマトグラムを図２（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ示す。
【００１６】
続いて、得られたｎ−ブタノール抽出物を、ＳｉＯ₂カラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてＣＨＣｌ₃−メタノール−水を７：３：０．５→６：４：１→５：５：５（ｖ／ｖ）と、組成比を順次切り替えて分離し、１３のフラクションを得た（図３（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）。
得られた１３のフラクションのうち、フラクション５として得られた分画を、さらにＯＤＳカラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてメタノール（１０、３０、５０、６０、７０、１００％）→ＣＨＣｌ₃−メタノール−水（６：４：１（ｖ／ｖ））→メタノールと、組成比を順次切り替えて分離し、１２のフラクションを得た（図４（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）。
得られた１２のフラクションのうち、フラクション１０として得られた分画を、液体クロマトグラフ装置（島津製作所製：ＨＰＬＣ装置、送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＳ、示差屈折計：ＲＩＤ−６Ａ、ＹＭＣ−ＰＡＣ ＯＤＳカラム：４Ａ１２Ｓ０５−２５２０ＷＴ ＳＨ−３４３−５、流速：０．９ｍｌ／分、圧力：１７０〜１８０ｋｇｆ／ｃｍ²）と、移動相としてメタノール１％水溶液−酢酸とを用いて、２つのフラクションに分離し、上記式（１）及び式（２）の化合物をそれぞれ得た（式（１）の化合物：２６４ｍｇ及び式（２）の化合物：１７５ｍｇ）。
【００１７】
また、得られた１２のフラクションのうち、フラクション１１として得られた分画を、上記と同様に３つのフラクションに分離し、上記式（３）、式（４）及び式（５）の化合物をそれぞれ得た（式（３）の化合物：１５．４ｍｇ、式（４）の化合物：３４．１ｍｇ、及び式（５）の化合物：１３．６ｍｇ）。
さらに、得られた１２のフラクションのうち、フラクション１２として得られた分画から、移動相としてメタノール１％水溶液−酢酸、ＣＨ₃ＣＮ１％水溶液−酢酸を用いる以外、上記と同様に１つのフラクションを分離し、上記（６）の化合物を得た（式（６）の化合物：９．９ｍｇ）。
これらのクロマトグラムを図５（（ａ）：順相、（ｂ）：逆相）に示す。
式（１）〜式（４）の化合物の物性を図６〜図９に示す。なお、式（１）〜式（４）の各化合物の構造式の決定は、ＮＭＲ法により行った。また、式（１）及び（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）の各化合物のＨＰＬＣのチャートをそれぞれ図１０〜図１４に示す。
【００１８】
（２）活性酸素の消去活性
老化や炎症などの様々な病態に関与する活性酸素の消去活性として、インビトロの系において、キサンチンオキシダーゼ法によりＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性を検討した。
【００１９】
（ｉ）ＳＯＤ様活性の実験方法
キサンチン３ｍＭ、ＥＤＴＡ３ｍＭ、０.１５％ウシ血清アルブミン (ＢＳＡ)、ニトロブルーテトラゾリウム (ＮＢＴ)０.７５ｍＭをそれぞれ０．１ｍｌずつ加えて混合した。これに、各濃度の被験物質２.５ｍｌを加え、２５℃で１０分間予備加温した後、キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍｌを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。６ｍＭのＣｕＣｌ₂ を０．１ｍｌ加えて反応を停止させ、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、被験物質はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、蒸留水で順次希釈したものを用いた。また、被験物質２.５ｍｌの代わりに水を添加したものを対照として測定した。
【００２０】
（ii）ＤＰＰＨラジカル消去活性の実験方法
０．１Ｍ酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ５.５）１．０ｍｌ、２．０×１０^-4Ｍの１,１-ジフェニル-２-ピクリルヒドラジル (ＤＰＰＨ) ラジカル０．５ｍｌ、エタノール０．５ｍｌ及び各濃度の被験物質１．０ｍｌを混合し、室温にて３０分間放置した後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ＤＰＰＨはエタノールに溶解し、被験物質はＤＭＳＯに溶解した後、エタノールで順次希釈したものを用いた。
【００２１】
(iii）結果
表１に示したように、公知の抗酸化剤と同様に、椿花メタノール抽出物、酢酸エチルおよびｎ−ブタノール分画に活性酸素消去作用及びラジカル消去活性が認められた 。
【００２２】
【表１】

【００２３】
（３）胃粘膜保護作用
椿花抽出物及びその中に含まれる化合物の急性胃粘膜損傷ラットに対する影響を検討するとともに、胃腸出血に対する治療・予防効果を実証するために止血に関与する血小板凝集活性をあわせて検討した。
（ｉ）塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用の実験方法
ＳＤ系雄性ラット (８〜９週令、２５０ｇ前後) を２４時間絶食させた後、椿花メタノール抽出物 (１２５、２５０ ｍｇ／ｋｇ) 又はｎ−ブタノール分画(２５、５０ ｍｇ／ｋｇ) を経口投与し、１時間後に９９．５％エタノールを１．５ｍｌ経口投与した。１時間後に胃を摘出し、１．５％ホルマリンで組織を固定した後に、胃粘膜に生じた損傷の長さ (ｍｍ)を測定し、その合計値を損傷係数とした。
また、式（１）及び式（２）の化合物についても、上記と同様に胃粘膜に生じた損傷の長さ（ｍｍ）を測定し、損傷係数とした。
【００２４】
（ii）血小板凝集活性
日本白色種雄性ウサギの耳介動脈より全血を採取し、洗浄血小板 (５×１０⁶cells／μｌ、２２５μｌ／アッセイ) を調製し、1ｍＭのＣａＣｌ₂存在下に、種々濃度の椿花抽出物 (分画を含む) を添加し、血小板凝集活性を凝集計 (Hematracer) にて、光の透過率によって測定した。なお、１Ｕ／ｍｌトロンビンの凝集活性を凝集率１００％とした。
また、式（１）及び式（２）の化合物についても、上記と同様に血小板凝集活性を測定した。なお、この場合は、０．５U／ｍｌトロンビンの凝集活性を凝集率１００％とした。
【００２５】
（iii）結果
表２に示すように、エタノール誘発急性胃粘膜損傷モデルに対して、椿花メタノール抽出物（２５０ｍｇ／ｋｇ）及びｎ−ブタノール分画 （５０ｍｇ／ｋｇ）は、胃粘膜損傷を有意に抑制した。
また、表３に示すように、エタノール誘発急性胃粘膜損傷モデルに対して、式（１）の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ）及び式（２）の化合物（１０、２０ｍｇ／ｋｇ）は、胃粘膜損傷を有意に抑制した。
【００２６】
【表２】

【００２７】
【表３】

さらに、表４に示すように、メタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画及び酢酸エチル分画に、強い血小板凝集活性が認められ、臨床で出血を伴う胃腸損傷や外傷の止血に使用されているトロンビンの血小板凝集効果 (０．５〜１Ｕ／ｍｌの濃度で完全凝集を惹起する) と同様に強い凝集活性が認められた。
また、表５に示すように、式（１）及び式（２）の化合物にも、血小板凝集活性が認められた。
【００２８】
【表４】

【００２９】
【表５】

【００３０】
このことから、椿花のメタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画、式（１）及び式（２）の化合物は強い胃粘膜保護作用を有し、過度の飲酒による胃炎などの胃腸障害に対して適用できることが示唆された。また、強い血小板凝集活性を有していることより、出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) に対しても有用であることが示された。
【００３１】
（４）アルコール吸収抑制作用
（ｉ）実験方法
ウィスター系雄性ラット（５〜６週齢、体重：１３０ｇ）を２０〜２４時間絶食させた後にメタノール抽出物、ｎ−ブタノール分画及び酢酸エチル分画を、それぞれ経口投与し、３０分後に２０％エタノール５ｍｌ／ｋｇを経口投与した。経時的（０.５、１、２時間)に採血を行い、血中アルコール濃度をアルコールデヒドロゲナーゼ−アルデヒドデヒドロゲナーゼ法により測定した。
【００３２】
（ii）結果
表６に示したように、椿花メタノール抽出物（５００ｍｇ／ｋｇ）及びｎ−ブタノール分画 （１２５ｍｇ／ｋｇ）は、有意に血中エタノール濃度を低下させた。
【００３３】
【表６】

【００３４】
（５）糖吸収阻害活性
（ｉ）アルドース還元酵素阻害作用の実験方法
０．１Ｍ硫酸リチウム、１ｍＭのＤＬ-グリセルアルデヒド、酵素分画 (ラットレンズ由来)、各濃度の被験物質、０．０３ｍＭのニコチン酸アミドアデニンジムクレオチドリン酸の還元型（ＮＡＤＰＨ）を含む１３５ｍＭリン酸緩衝液 (ｐＨ７．０) を３０℃で３０分間インキュベートした後、塩酸を添加して反応を停止させた。これを強アルカリで処理し、６０℃で２０分間加熱した後、室温に戻してから生成したＮＡＤＰを蛍光法により定量した (励起波長：３６０ｎｍ、測定波長：４６０ｎｍ)。なお、被験物質はＤＭＳＯに溶解したものを用いた。
【００３５】
（ii）ブドウ糖吸収抑制作用の実験方法
ウィスター系雄性ラット（５〜６週令、１２０〜１５０ｇ）を２０時間絶食した後に、メタノール抽出エキス (500、1000 mg/kg) 又はｎ−ブタノール分画 (250、500 mg/kg) を経口投与した。３０分後にブドウ糖 (0.5 g/kg) を経口投与し、経時的に眼窩静脈より採血し、グルコースオキシダーゼ法により、血中グルコース濃度を測定した。
【００３６】
（iii）結果
アルドース還元酵素に対しては、IC50＝２３．８μｇ／ｍｌと、阻害作用が認められた。
また、グルコース負荷ラットにおける血糖値上昇に対しては、表７に示したように、メタノール抽出物は有意ではないものの血糖値上昇に対して抑制傾向を示した。ｎ−ブタノール分画は、500mg/kg の用量で、ブドウ糖負荷後３０分後の血糖値上昇に対して有意に抑制効果を示した。
【００３７】
【表７】

以上の結果から、椿花のメタノール抽出物及びｎ−ブタノール分画は、食後の過血糖を予防できるとともに、糖尿病の予防・改善に有用であることが認められた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、椿花を水性アルコール又は水性アルコール水溶液で抽出して得られる抽出物には、式（１）及び／又は式（２）の新規化合物が含有されていることが確認された。また、これらの成分に基づいて、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性；塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用及び血小板凝集活性；アルコール吸収抑制作用；ブドウ糖吸収抑制作用及びアルドース還元酵素阻害作用等を有していることが確認され、老化や動脈硬化など、フリーラジカルが関与する病態、出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) 、糖尿病の予防・改善等に有用であることが認められた。
【００３９】
また、本発明によれば、式（１）〜式（６）で表される新規化合物は、上記の椿花抽出物の各種作用・効果の源であり、医薬及び健康食品等への用途開発が期待される。
さらに、本発明によれば、椿花抽出物が、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去活性のような活性酸素の消去活性を有していることから、老化や動脈硬化など、フリーラジカルが関与する病態等に対して有効であり、また、塩酸エタノール誘発胃粘膜損傷に対する保護作用及び血小板凝集活性による出血を伴う胃腸障害 (急性胃炎、急性大腸炎) に対する予防及び治療に有用であり、さらに、アルコール吸収抑制作用を有しており、ブドウ糖吸収抑制作用及びアルドース還元酵素阻害作用等の糖尿病の予防・改善に有用であることが認められた。よって、医薬及び健康食品等への用途開発を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の椿花の抽出方法を説明するための概略図である。
【図２】本発明の椿花の各抽出物の薄層クロマトグラムである。
【図３】本発明の椿花のブタノール抽出物の薄層クロマトグラムである。
【図４】本発明の椿花のブタノール抽出物のフラクション５の薄層クロマトグラムである。
【図５】本発明の椿花抽出物中に含有される新規化合物を示す薄層クロマトグラムである。
【図６】本発明の式（１）の化合物の物性を示す図である。
【図７】本発明の式（２）の化合物の物性を示す図である。
【図８】本発明の式（３）の化合物の物性を示す図である。
【図９】本発明の式（４）の化合物の物性を示す図である。ＨＰＬＣのチャートである。
【図１０】本発明の式（１）及び（２）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１１】本発明の式（３）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１２】本発明の式（４）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１３】本発明の式（５）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。
【図１４】本発明の式（６）の化合物のＨＰＬＣのチャートである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel compound, an extract of spikelets containing the same, and uses thereof.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Traditionally, it has been used as a folk medicine for the treatment of vomiting and intestinal bleeds (intestinal bleeding), and is also known to have nourishing and tonic effects.
In recent years, research on cosmetics for beautifying skins such as conditioning and lightening using components contained in spikelets has been promoted.
As components of spikelets, leucoanthocyanins, anthocyanins and triterpene saponins are generally known. However, there are many unexplained parts of spikelets and their medicinal properties, and further research is required. ing.
[0003]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, an extract obtained by extracting spikelets with an aqueous alcohol or an aqueous alcoholic solution, wherein the extract is at least the following formula (1) or formula (2):
[Chemical 3]

A spikelet extract containing a compound represented by the formula:
According to the present invention, any one of the following formulas (1) to (6):

Is provided.
Furthermore, according to the present invention, there is provided a gastric mucosa protective agent, an alcohol absorption inhibitor, and a sugar absorption inhibitor containing the above-described spikelet extract or at least one compound of formulas (1) to (6) as an active ingredient. Is done.
[0004]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The flower of the plant that can be used for obtaining the camellia flower extract of the present invention is not particularly limited as long as it is a flower belonging to the family Camellia (Theaceae), and for example, a camellia camellia, a snowy camellia, a honkon camellia, There are various varieties of flowers such as Salwin's camellia, Yakushima bee, Japanese camellia, Japanese camellia, Wabiske, Japanese camellia, Japanese camellia, Iwane squeezed, Shuncho Ikari, Taro. Among these, flowers of Camellia Japonica L. are preferable. These plants are widely grown in Japan, China, etc., and any plant growing anywhere can be used. However, the component contained in the flowers of the camellia plant is considered to have a slight difference in the amount, type, etc. depending on the kind and origin of the camellia plant as a raw material. In order to obtain this, it is preferable to use what was cultivated in Japan. In addition, as a flower of a camellia plant, you may use either the flower of a single type or multiple types of camellia plant. The flowers of the camellia plant usually contain gourd pieces, petals, heart skin, stamens, pistils and the like, and are preferably fresh.
[0005]
Examples of the aqueous alcohol used in the present invention include aliphatic alcohols having 1 to 3 carbon atoms, such as methanol, ethanol, and propanol. Of these, methanol is preferable. Moreover, as aqueous alcohol solution, the aqueous solution containing about 1 to 50 weight% of aqueous alcohol is mentioned.
[0006]
According to the present invention, flowers of the camellia plant are extracted with aqueous alcohol or aqueous alcohol aqueous solution to obtain a camellia extract. At this time, it is appropriate to use the hydroalcohol or the like in an amount of about 1 to 10 times (by weight), preferably about 1 to 5 times that of the flowers of the camellia plant.
[0007]
The extraction may be performed by either cold immersion or digestion, but the above-mentioned camellia plant flowers are immersed in the above-mentioned solvent at a temperature of about 50 to 85 ° C. with shaking or without shaking. It is appropriate to do so. When soaking under shaking, it is appropriate to carry out for about 30 minutes to 5 hours, and when soaking under non-shaking, it is appropriate to carry out for about 1 hour to 10 days. In addition, although an extraction process may be performed only once about the same spikelet material, it is preferable to repeat it twice or more.
[0008]
The extract obtained above is preferably further extracted with n-butanol. At this time, for example, water, ethyl acetate or the like may be added together with n-butanol to perform partition extraction. Partition extraction can be performed in the same manner as the extraction with the aqueous alcohol. In particular, the partition extraction is performed by adding n-butanol to 1 to 30 (with respect to an extract obtained by aqueous alcohol or an aqueous alcohol alcohol solution or concentrated as described later at room temperature, with shaking or without shaking. It is appropriate to add about (weight) times.
In addition, after extracting the flower of a camellia plant with aqueous alcohol or aqueous alcohol aqueous solution, or after extracting with n-butanol further, it is preferable to concentrate an extract. The concentration at this time is preferably carried out at a low temperature or warming under reduced pressure. Further, this concentration may be carried out until dryness, or may be filtered before concentration, and the filtrate may be concentrated to obtain an extract.
[0009]
The obtained extract may be subjected to a purification treatment. For the purification treatment, a chromatographic method, an elution method using an ion exchange resin, or the like can be employed alone or in combination. For example, examples of the chromatographic method include normal phase chromatography, reverse phase chromatography, high performance liquid chromatography, centrifugal liquid chromatography, column chromatography, thin layer chromatography and the like, or a method of performing a combination thereof. . In this case, purification conditions such as a carrier and an elution solvent can be appropriately selected according to various chromatographies. For example, in the case of thin layer chromatography, a water-methanol solvent, and in the case of high performance liquid chromatography, a methanol-acetic acid solvent can be used.
[0010]
When the aqueous alcohol (particularly methanol) extract or n-butanol extract obtained above is subjected to normal phase and reverse phase thin layer chromatography, and further subjected to high performance liquid chromatography, the formula (1 ) To spots and peaks corresponding to the six new compounds of formula (6) can be obtained.
Thus, the spike extract of this invention can isolate the compound of Formula (1)-Formula (6) by refine | purifying the component which shows the peak finally obtained.
[0011]
As will be described later, the extract obtained by the method of the present invention has an action of scavenging active oxygen, a protective action against ethanol-induced gastric mucosal damage, a platelet aggregation action, a blood sugar level increase inhibiting action due to glucose load, an alcohol absorption inhibiting action, Various actions such as a sugar absorption inhibitory action are recognized, and in particular, it can be used as it is or diluted with an appropriate medium as a gastric mucosa protective agent, an alcohol absorption inhibitor, a sugar absorption inhibitor or the like. In addition, the extract of the present invention may be used as a health food in the state as it is or diluted with an appropriate medium, in an amount that does not exhibit a pharmaceutical therapeutic effect, that is, an amount for maintaining health. The form of the extract in these cases may be any of preparations such as powders, granules, tablets, capsules or liquids.
[0012]
Suitable media include, for example, lactose, starch, dextrin, calcium phosphate, calcium carbonate, synthetic and natural aluminum silicates, magnesium oxide, dry aluminum hydroxide, magnesium stearate, sodium bicarbonate, dry yeast, zinc oxide, talc, Kaolin, boric acid powder, zinc stearate, magnesium stearate, magnesium carbonate, precipitated calcium carbonate, bismuth hyposilicate, potassium aluminum sulfate powder, glycerin, propylene glycol, fatty oil, ethylene glycol, polyethylene glycol, sorbitol, surfactant Etc.
In addition, said various preparation can be manufactured by the well-known method widely employ | adopted in field | areas, such as a pharmaceutical or a health food.
[0013]
The amount of the extract or compound of the present invention can be appropriately adjusted according to the degree of concentration, purification, etc., the purpose of use, the target disease for treatment or prevention, the degree of the disease, the body weight, etc. Alternatively, it is appropriate to give about 1 μg to 10000 mg per day for an adult divided into 2 to 3 times with the above compound as an active ingredient.
[0014]
【Example】
Examples of the spike extract of the present invention, the novel compounds contained therein, and their actions will be specifically described below.
[0015]
(1) An outline of the extraction of spikelets and the extraction method of novel compound spikelets contained in the spikelet extract is shown in FIG.
6.0 kg of fresh camellia (Camellia Japonica L.) collected at Izu Oshima was immersed in 6 liters of methanol (99.9%) and extracted for 3 hours under heating at 80 ° C. This was repeated three times, and the obtained methanol was mixed and the methanol was evaporated to obtain a methanol extract (480 g).
Next, 1 liter of ethyl acetate and water (1: 1) were added to each 480 g of the obtained methanol extract at room temperature and shaken and mixed, and the resulting ethyl acetate layer and aqueous layer were separated and collected. This operation was repeated three times. Further, 3 liters of n-butanol (99.8%) was added to the obtained aqueous layer at room temperature and shaken and mixed, and the obtained n-butanol layer and aqueous layer were separated and collected. This operation was repeated three times. By evaporating the solvent from the n-butanol layer and the aqueous layer, an n-butanol extract and a water extract were obtained (121 g and 332 g), respectively. The normal phase and reverse phase thin layer chromatograms of the methanol extract, ethyl acetate extract, n-butanol extract and water extract are shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b), respectively.
[0016]
Subsequently, the obtained n-butanol extract was subjected to thin-layer chromatography using a SiO ₂ column, and while confirming the separation state, CHCl ₃ -methanol-water was used as the mobile phase 7: 3: 0.5 → 6: 4: 1 → 5: 5: 5 (v / v), the composition ratio was sequentially switched and separated to obtain 13 fractions (FIG. 3 (a): normal phase, (b): reverse phase). .
Of the 13 fractions obtained, the fraction obtained as fraction 5 was further confirmed by a thin layer chromatography using an ODS column, and the separation state was confirmed, while methanol (10, 30, 50, 60) was used as the mobile phase. , 70, 100%) → CHCl ₃ -methanol-water (6: 4: 1 (v / v)) → methanol and separation by sequentially switching the composition ratio to obtain 12 fractions (FIG. 4 (a)). : Normal phase, (b): reverse phase).
Among the 12 fractions obtained, the fraction obtained as fraction 10 was subjected to liquid chromatography (Shimadzu Corporation: HPLC, liquid pump: LC-10AS, differential refractometer: RID-6A, YMC-PAC. ODS column: 4A12S05-2520WT SH-343-5, flow rate: 0.9 ml / min, pressure: 170-180 kgf / cm ² ) and 1% aqueous methanol-acetic acid as mobile phase, separated into two fractions Thus, the compounds of the above formula (1) and formula (2) were obtained respectively (compound of formula (1): 264 mg and compound of formula (2): 175 mg).
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Moreover, among the obtained 12 fractions, the fraction obtained as fraction 11 was separated into three fractions in the same manner as described above, and the compounds of the above formulas (3), (4) and (5) were obtained. Obtained respectively (compound of formula (3): 15.4 mg, compound of formula (4): 34.1 mg, and compound of formula (5): 13.6 mg).
Furthermore, out of the obtained 12 fractions, one fraction was obtained in the same manner as above except that methanol 1% aqueous solution-acetic acid and CH ₃ CN 1% aqueous solution-acetic acid were used as the mobile phase from the fraction obtained as fraction 12. Separation gave the compound (6) (compound of formula (6): 9.9 mg).
These chromatograms are shown in FIG. 5 ((a): normal phase, (b): reverse phase).
The physical properties of the compounds of formulas (1) to (4) are shown in FIGS. In addition, determination of the structural formula of each compound of Formula (1)-Formula (4) was performed by NMR method. Moreover, the HPLC chart of each compound of Formula (1) and (2), Formula (3), Formula (4), Formula (5), and Formula (6) is shown in FIGS.
[0018]
(2) Active oxygen scavenging activity As an active oxygen scavenging activity involved in various pathologies such as aging and inflammation, in vitro systems were examined for SOD-like activity and DPPH radical scavenging activity by the xanthine oxidase method.
[0019]
(I) Experimental method for SOD-like activity Xanthine 3 mM, EDTA 3 mM, 0.15% bovine serum albumin (BSA) and nitroblue tetrazolium (NBT) 0.75 mM were added in an amount of 0.1 ml each and mixed. To this was added 2.5 ml of each test substance and pre-warmed at 25 ° C. for 10 minutes, and then 0.1 ml of xanthine oxidase solution was added and incubated at 25 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 0.1 ml of 6 mM CuCl ₂ and the absorbance at 560 nm was measured. The test substance was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted sequentially with distilled water. Moreover, what added water instead of 2.5 ml of test substances measured as a control | contrast.
[0020]
(Ii) Experimental method of DPPH radical scavenging activity 0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer (pH 5.5) 1.0 ml, 2.0 × 10 ⁻⁴ M 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 0.5 ml of radicals, 0.5 ml of ethanol and 1.0 ml of the test substance of each concentration were mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 517 nm was measured. DPPH was dissolved in ethanol, and the test substance was dissolved in DMSO and then diluted successively with ethanol.
[0021]
(iii) Results As shown in Table 1, similar to known antioxidants, active oxygen scavenging activity and radical scavenging activity were observed in the fraction of coconut flower methanol, ethyl acetate and n-butanol.
[0022]
[Table 1]

[0023]
(3) Gastric mucosal protective action The effect of platelet extract and compounds contained in it on acute gastric mucosal injury rats and platelet aggregation activity involved in hemostasis to demonstrate the therapeutic and preventive effects on gastrointestinal bleeding We examined together.
(I) Experimental method of protective action against ethanol-induced gastric mucosal damage SD male rats (8-9 weeks old, around 250 g) were fasted for 24 hours and then spiked methanol extract (125, 250 mg / kg) Alternatively, the n-butanol fraction (25, 50 mg / kg) was orally administered, and after 1 hour, 1.5 ml of 99.5% ethanol was orally administered. After 1 hour, the stomach was excised, the tissue was fixed with 1.5% formalin, the length of damage (mm) occurring in the gastric mucosa was measured, and the total value was taken as the damage factor.
For the compounds of the formulas (1) and (2), the length of damage (mm) occurring in the gastric mucosa was measured in the same manner as described above to obtain the damage coefficient.
[0024]
(Ii) Platelet aggregation activity Whole blood was collected from the auricular artery of a Japanese white male rabbit, and washed platelets (5 × 10 ⁶ cells / μl, 225 μl / assay) were prepared, and various kinds were prepared in the presence of 1 mM CaCl _2. Concentrated spikelet extracts (including fractions) were added, and platelet aggregation activity was measured by light transmittance with an aggregometer (Hematracer). The aggregation activity of 1 U / ml thrombin was defined as an aggregation rate of 100%.
Moreover, the platelet aggregation activity was also measured about the compound of Formula (1) and Formula (2) similarly to the above. In this case, the aggregation activity of 0.5 U / ml thrombin was defined as an aggregation rate of 100%.
[0025]
(Iii) Results As shown in Table 2, in contrast to the ethanol-induced acute gastric mucosal damage model, spiked methanol extract (250 mg / kg) and n-butanol fraction (50 mg / kg) significantly affected gastric mucosal damage. Suppressed.
Further, as shown in Table 3, the compound of formula (1) (20 mg / kg) and the compound of formula (2) (10, 20 mg / kg) were compared with the ethanol-induced acute gastric mucosa damage model. Was significantly suppressed.
[0026]
[Table 2]

[0027]
[Table 3]

Furthermore, as shown in Table 4, thrombin, which has strong platelet aggregation activity in the methanol extract, n-butanol fraction and ethyl acetate fraction, is used for hemostasis of gastrointestinal damage and trauma accompanied by bleeding in clinical practice. A strong aggregating activity was observed in the same manner as the platelet aggregating effect (causes complete aggregation at a concentration of 0.5 to 1 U / ml).
In addition, as shown in Table 5, platelet aggregation activity was also observed in the compounds of formulas (1) and (2).
[0028]
[Table 4]

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[Table 5]

[0030]
From this, the methanol extract of spikelets, n-butanol fraction, compounds of formula (1) and formula (2) have a strong gastric mucosal protective action, and against gastrointestinal disorders such as gastritis due to excessive drinking. It was suggested that it can be applied. In addition, it has been shown to be useful for gastrointestinal disorders accompanied by bleeding (acute gastritis and acute colitis) because of its strong platelet aggregation activity.
[0031]
(4) Alcohol absorption inhibitory effect (i) Experimental method Faster male Wistar rats (5-6 weeks old, body weight: 130 g) for 20-24 hours, then methanol extract, n-butanol fraction and ethyl acetate fraction Were orally administered, and after 30 minutes, 20% ethanol 5 ml / kg was orally administered. Blood was collected over time (0.5, 1 and 2 hours), and the blood alcohol concentration was measured by the alcohol dehydrogenase-aldehyde dehydrogenase method.
[0032]
(Ii) Results As shown in Table 6, spiked methanol extract (500 mg / kg) and n-butanol fraction (125 mg / kg) significantly decreased blood ethanol concentration.
[0033]
[Table 6]

[0034]
(5) Sugar absorption inhibitory activity (i) Experimental method of aldose reductase inhibitory action 0.1 M lithium sulfate, 1 mM DL-glyceraldehyde, enzyme fraction (from rat lens), test substance at each concentration, 0.03 mM A 135 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) containing a reduced form of nicotinamide adenine dimethiotide (NADPH) was incubated at 30 ° C. for 30 minutes, and then the reaction was stopped by adding hydrochloric acid. This was treated with a strong alkali, heated at 60 ° C. for 20 minutes, and then returned to room temperature, and the produced NADP was quantified by a fluorescence method (excitation wavelength: 360 nm, measurement wavelength: 460 nm). The test substance used was dissolved in DMSO.
[0035]
(Ii) Experimental method of glucose absorption inhibitory effect Fasting male Wistar rats (5-6 weeks old, 120-150 g) for 20 hours, followed by methanol extract (500, 1000 mg / kg) or n-butanol fraction ( 250, 500 mg / kg) was orally administered. Thirty minutes later, glucose (0.5 g / kg) was orally administered, blood was collected from the orbital vein over time, and blood glucose concentration was measured by the glucose oxidase method.
[0036]
(Iii) Results For aldose reductase, an inhibitory action was observed with IC50 = 23.8 μg / ml.
Moreover, as shown in Table 7, the methanol extract showed a tendency to suppress the increase in blood glucose level although it was not significant, as shown in Table 7. The n-butanol fraction showed a significant inhibitory effect on the increase in blood glucose level 30 minutes after glucose loading at a dose of 500 mg / kg.
[0037]
[Table 7]

From the above results, it was confirmed that the methanol extract and n-butanol fraction of camellia can prevent postprandial hyperglycemia and are useful for the prevention and improvement of diabetes.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has been confirmed that the extract obtained by extracting spikelets with aqueous alcohol or aqueous alcohol solution contains a novel compound of formula (1) and / or formula (2). . Also, based on these components, it has SOD-like activity and DPPH radical scavenging activity; protective action against ethanol-induced gastric mucosal damage and platelet aggregation activity; alcohol absorption inhibitory action; glucose absorption inhibitory action and aldose reductase inhibitory action, etc. It has been confirmed that it is useful for the prevention / improvement of pathologies involving free radicals such as aging and arteriosclerosis, gastrointestinal disorders with bleeding (acute gastritis, acute colitis), and diabetes. .
[0039]
In addition, according to the present invention, the novel compounds represented by the formulas (1) to (6) are sources of various actions and effects of the above-described coconut flower extract, and are developed for use in medicines and health foods. There is expected.
Further, according to the present invention, since the spike extract has SOD-like activity and scavenging activity of active oxygen such as DPPH radical scavenging activity, pathological conditions involving free radicals such as aging and arteriosclerosis. In addition, it is useful for the prevention and treatment of gastrointestinal disorders (acute gastritis, acute colitis) with bleeding due to the protective effect against ethanol-induced gastric mucosal damage and platelet aggregation activity. It has an inhibitory action and was found to be useful for the prevention and improvement of diabetes such as glucose absorption inhibitory action and aldose reductase inhibitory action. Therefore, it is possible to develop applications for medicines and health foods.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a method of extracting spikelets according to the present invention.
FIG. 2 is a thin layer chromatogram of each extract of spikelets according to the present invention.
FIG. 3 is a thin-layer chromatogram of a butanol extract of spikelets according to the present invention.
FIG. 4 is a thin layer chromatogram of fraction 5 of spiked butanol extract of the present invention.
FIG. 5 is a thin-layer chromatogram showing a novel compound contained in the spikelet extract of the present invention.
FIG. 6 is a view showing physical properties of the compound of the formula (1) of the present invention.
FIG. 7 shows the physical properties of the compound of formula (2) of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing physical properties of the compound of the formula (3) of the present invention.
FIG. 9 is a view showing physical properties of the compound of the formula (4) of the present invention. It is a chart of HPLC.
FIG. 10 is a HPLC chart of the compounds of the formulas (1) and (2) of the present invention.
FIG. 11 is a HPLC chart of the compound of the formula (3) of the present invention.
FIG. 12 is a HPLC chart of the compound of the formula (4) of the present invention.
FIG. 13 is a HPLC chart of the compound of the formula (5) of the present invention.
FIG. 14 is a HPLC chart of the compound of the formula (6) of the present invention.

Claims (9)

The Tsubakihana A is that extracts obtained by extraction with an aqueous alcoholic or aqueous-alcoholic solution, at least the following formula extract (1) or Formula (2)

A spikelet extract comprising a compound represented by:   The extract of Claim 1 is an extract obtained by further extracting with butanol, wherein the extract contains at least a compound represented by formula (1) or formula (2). Any of the following formulas (1) to (6)

A compound represented by   A gastric mucosa protective agent comprising the spikelet extract according to claim 1 or 2.   A gastric mucosa protective agent containing any one compound according to claim 3.   The alcohol absorption inhibitor containing the spikelet extract of Claim 1 or 2.   A sugar absorption inhibitor containing the spikelet extract according to claim 1 or 2. A health food containing the spikelet extract according to claim 1 or 2. A health food containing at least one of the compounds according to claim 3.

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