JP4804344B2 - Reactive dye-coupled magnetic particles and protein separation and purification method - Google Patents
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Description
本発明は磁性化された高分子マトリックス及びタンパク質に対するアフィニティリガンド機能を有するトリアジン色素からなる反応性色素結合磁性粒子およびこの粒子を用いたタンパク質分離精製に関するものである。 The present invention relates to a reactive dye-coupled magnetic particle comprising a magnetized polymer matrix and a triazine dye having an affinity ligand function for protein, and protein separation and purification using the particle.
従来、酵素、抗体、ペプチドなどタンパク質の分離精製法としてアフィニティカラムクロマトグラフィ法が広く用いられてきた。この場合、目的とするタンパク質それぞれに特異的に強い相互作用を有するリガンドをシリカゲル、アガロースなどの担体に結合させた吸着体をカラムに充填し、これを固定相としてカラムクロマトグラフィーを行なってきた。この方法では、目的とするタンパク質を分離精製するために多段階の煩雑なカラム精製が必要となり、多くの時間と労力を必要とした。またこの方法は多段階の固定相反応であり、このままでは自動化が極めて困難であった。また、これらのカラムアフィニティカラムクロマトグラフィ法においてすでにトリアジン色素が吸着体として用いられているが、いずれも非磁性体であり、またこれらの吸着体はカラムに充填して固定化相として用いられるものであって、溶液中に均一分散された液相流動反応で使用するものではなかった(非特許文献１、非特許文献２)。 Conventionally, affinity column chromatography has been widely used as a method for separating and purifying proteins such as enzymes, antibodies and peptides. In this case, a column is packed with an adsorbent obtained by binding a ligand having a specific strong interaction with each target protein to a carrier such as silica gel or agarose, and this is used as a stationary phase for column chromatography. In this method, in order to separate and purify the target protein, a complicated multi-stage column purification is required, and much time and labor are required. In addition, this method is a multi-stage stationary phase reaction, and it has been extremely difficult to automate it. In these column affinity column chromatography methods, triazine dyes are already used as adsorbents, but they are all non-magnetic substances, and these adsorbents are packed into a column and used as an immobilized phase. Therefore, it was not used in a liquid phase flow reaction uniformly dispersed in a solution (Non-patent Document 1, Non-patent Document 2).
近年、ポストゲノム研究の主要な課題として、遺伝情報に基づいて細胞内で発現されているタンパク質の構造や機能を総合的に解析しようとするいわゆるプロテオミクスが注目され、このため迅速、簡便且つ自動化可能な新規なタンパク質の分離精製法が強く望まれている。 In recent years, as a major issue in post-genomic research, so-called proteomics, which seeks to comprehensively analyze the structure and function of proteins expressed in cells based on genetic information, has attracted attention, and thus can be quickly, easily and automated There is a strong demand for a novel method for separating and purifying proteins.
現在タンパク質の分離精製に用いられているアフィニティカラムクロマトグラフィ法に使用されている吸着体は、タンパク質に対して異なる特異性を持つリガンド（基質、抗体、補酵素など）をシリカゲルやアガロースのような担体に吸着または結合させたものである。タンパク質の分離精製に際してはこれらの吸着体を固定相としてカラムに充填し、目的とするタンパク質を含む溶液をこのカラムに通過させることにより不純物の除去および目的物の選択的吸着を行い、分離精製を行なうものである。このような吸着体を用いるアフィニティカラムクロマトグラフィ法は、異なるアフィニティ機能を持つ多くの吸着体をそれぞれのカラムに充填し、試料液をこれらひとつひとつのカラムに順次に通過させ、多段階の吸着、分離を行なわなければならず多くの時間と労力を必要とした。 Adsorbents currently used for affinity column chromatography methods used for protein separation and purification are ligands (substrates, antibodies, coenzymes, etc.) with different specificities for proteins and carriers such as silica gel and agarose. It is adsorbed or bound to. When separating and purifying proteins, these adsorbents are packed into a column as a stationary phase, and a solution containing the target protein is passed through this column to remove impurities and selectively adsorb target substances. To do. In such affinity column chromatography using adsorbents, many adsorbents with different affinity functions are packed in each column, and the sample solution is sequentially passed through each of these columns to perform multistage adsorption and separation. It had to be done and required a lot of time and effort.
また、１本のカラム吸着が終了したあと、これらの吸着体に吸着された目的物を溶出しなければならないが、このために多量の溶出液を通過させて目的物を取り出さなければならず、得られた溶出液中の目的物の濃度は極めて薄く、この溶出液から目的物のタンパク質を取り出すためには溶出液の濃縮を必要とした。この濃縮工程もまた、多くの時間と労力を必要とした。 In addition, after the adsorption of one column is completed, the target object adsorbed on these adsorbents must be eluted, and for this purpose, a large amount of eluate must be passed through to take out the target object. The concentration of the target substance in the obtained eluate was extremely thin, and it was necessary to concentrate the eluate in order to extract the target protein from this eluate. This concentration process also required a lot of time and effort.
このように従来の吸着体を用いる方法では、それぞれの反応をマニュアルでバッチ処理を行なうため、これら多段階の一連の工程を自動化することは極めて困難であった。 As described above, in the method using the conventional adsorbent, each reaction is batch-processed manually, so that it is extremely difficult to automate a series of these multi-step processes.
一方、現在行なわれているアフィニティカラムクロマトグラフィ法においては、それぞれのタンパク質に特異的に強い相互作用を有する基質、補酵素、抗体などを不溶性の支持体に結合させた固体吸着体をカラムに充填して使用するもので、一般にこれら吸着体は高価であり、また汎用性が低いため、タンパク質に含まれる多くの不純物を完全に除去するためには相互作用の異なる多種のカラムを組み合わせる必要があることから、全体として非常に高コストとなる。 On the other hand, in the current affinity column chromatography method, a solid adsorbent, in which a substrate, coenzyme, antibody or the like having a strong interaction specifically with each protein is bound to an insoluble support, is packed in the column. In general, these adsorbents are expensive and have low versatility, so it is necessary to combine various columns with different interactions in order to completely remove many impurities contained in proteins. Therefore, it becomes very expensive as a whole.
したがって、解決しようとする問題点は、カラムアフィニティカラムクロマトグラフィ法は多くの時間と労力を必要とする点、多段階の一連の工程を自動化することが極めて困難である点、および、全体として非常に高コストとなる点である。 Therefore, the problems to be solved are that the column affinity column chromatography method requires a lot of time and labor, it is extremely difficult to automate a multi-step series, and overall, it is very difficult. This is a high cost.
発明者らは前記の課題を解決するための手段として、新規なトリアジン色素結合磁性粒子およびタンパク質の分離精製を創出した。 The inventors have created a novel triazine dye-bound magnetic particle and protein separation and purification as means for solving the above-mentioned problems.
第１の発明は磁性化された高分子マトリックス、及びこの高分子マトリックスに結合したトリアジン色素を有している反応性色素結合磁性粒子である。この反応性色素結合磁性粒子とは液相反応を可能にする分散性を持つ微小な粒子であって、しかもこの粒子が磁性であり、且つ高分子マトリックスに結合されたアフィニティリガンド機能を有するものである。本発明に用いられる高分子マトリックスとしては水酸基、反応性極性基を有するアガロース、シリカなどの高分子ゲル、天然高分子多糖類、合成ポリマーなどを用いることができる。反応性極性基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基などが用いられる。さらに本発明で使用するトリアジン色素（反応性色素）はタンパク質に特異的な親和性を有するトリアジン色素であって表１に示すように多くの種類から選択することが出来る。
表１には、シグマ社（ＳＩＧＭＡ）等から容易に入手できるものを挙げたものであるが、それ以外のものも含めると９０種類以上のトリアジン色素が調製されている。また、これらのトリアジン色素は例えば、図１の符号１に示されるように補酵素と類似した立体構造を有し、スルホン基、もしくはアミノ基などの反応基を有し、このような構造がタンパク質との親和性の要因のひとつである。さらに本発明においてはこのトリアジン色素結合粒子が磁性化されていることによって、タンパク質の分離精製が均一に分散された液相で行なわれた後、吸着されたタンパク質が磁石により容易に分離されることを特徴とするものである。The first invention is a reactive dye-coupled magnetic particle having a magnetized polymer matrix and a triazine dye bound to the polymer matrix. These reactive dye-bound magnetic particles are fine particles with dispersibility that enable a liquid phase reaction, and these particles are magnetic and have an affinity ligand function bound to a polymer matrix. is there. As the polymer matrix used in the present invention, a polymer gel such as agarose or silica having a hydroxyl group and a reactive polar group, a natural polymer polysaccharide, a synthetic polymer, or the like can be used. As the reactive polar group, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, or the like is used. Further, the triazine dye (reactive dye) used in the present invention is a triazine dye having a specific affinity for a protein, and can be selected from many types as shown in Table 1.
Table 1 lists those readily available from Sigma (SIGMA) and the like, and 90 or more types of triazine dyes have been prepared when others are included. In addition, these triazine dyes have, for example, a three-dimensional structure similar to a coenzyme as shown by reference numeral 1 in FIG. 1, and have a reactive group such as a sulfone group or an amino group. It is one of the factors of affinity. Furthermore, in the present invention, since the triazine dye-binding particles are magnetized, after the protein separation and purification are performed in a uniformly dispersed liquid phase, the adsorbed protein can be easily separated by a magnet. It is characterized by.
第１の発明は、アフィニティリガンドとして反応性色素の一種であるトリアジン色素を選択する事により、その特異的構造に由来するタンパク質との特異的親和性を用いて、多種類のタンパク質の分離・精製に適用することを可能とし、汎用性が高いタンパク質の分離精製を可能にする。この場合、高価なリガンドを使用せず、安価で多種類が得られるトリアジン色素を固定化した磁性粒子を用いることにより、低コストのタンパク質分離法が可能となった。また、第１の発明の重要な点は従来の非磁性の吸着体に代えて磁性体微粒子を含む高分子マトリックスからなる粒子を創生したことにあり、このことによりタンパク質の分離・精製において磁石による分離・精製を可能としたことである。さらに、それぞれのタンパク質を各種の色素によって識別することも可能であり、分離精製にとどまらずタンパク解析などへの応用も考えられる。 In the first invention, by selecting a triazine dye, which is a kind of reactive dye, as an affinity ligand, separation and purification of many kinds of proteins using specific affinity with a protein derived from its specific structure. This makes it possible to separate and purify proteins with high versatility. In this case, a low-cost protein separation method has become possible by using magnetic particles on which triazine dyes that are inexpensive and can be obtained in a variety of ways are used without using expensive ligands. In addition, the important point of the first invention is to create particles made of a polymer matrix containing magnetic fine particles in place of the conventional non-magnetic adsorbent, which makes it possible to separate magnets in protein separation and purification. It was possible to separate and purify by. Furthermore, it is possible to identify each protein by various dyes, and it is possible to apply not only to separation and purification but also to protein analysis.
第２の発明はタンパク質の分離精製において、前記反応性色素結合磁性粒子を用いるタンパク質の分離精製試薬である。 The second invention is a protein separation and purification reagent using the reactive dye-bound magnetic particles in protein separation and purification.
第２および第６の発明は、反応性色素結合磁性粒子を試薬として用いることによって、タンパク質の分離精製において従来の非磁性アフィニティリガンド結合吸着体では不可能であった均一分散による液相反応吸着と、磁石を用いた固液分離を同一の容器内で行なうことが可能となった。さらに吸着されたタンパク質の溶出も液相反応で行なう事が出来るため、溶出液の量が少なくてすみ、煩雑な濃縮工程をはぶいて高濃度の目的物を得ることが可能である。またこの反応性色素結合磁性粒子を用いることにより、一連の工程の自動化が容易となった。つまり、このような反応と磁石による固液分離を繰り返すことにより、複雑な多段の分離・精製工程を連続化することが可能となり、ロボティクスなどを用いてこれら一連の工程を自動化することも容易となる。 In the second and sixth inventions, by using reactive dye-bound magnetic particles as reagents, liquid phase reaction adsorption by uniform dispersion, which was impossible with conventional non-magnetic affinity ligand-bound adsorbents in protein separation and purification, Thus, solid-liquid separation using a magnet can be performed in the same container. Furthermore, since the adsorbed protein can be eluted by a liquid phase reaction, the amount of the eluate can be reduced, and a high concentration target product can be obtained through a complicated concentration step. In addition, the use of the reactive dye-coupled magnetic particles facilitates automation of a series of steps. In other words, by repeating such a reaction and solid-liquid separation using a magnet, it becomes possible to continue complicated multi-stage separation and purification processes, and it is easy to automate these series of processes using robotics and the like. Become.
第３の発明は高分子マトリックスが反応性極性基を有するクロスリンクされた高分子ゲルである反応性色素結合磁性粒子である。 A third invention is a reactive dye-coupled magnetic particle whose polymer matrix is a cross-linked polymer gel having a reactive polar group.
第３の発明は、クロスリンクされた高分子マトリックスを用いることによって磁性粒子を非水溶化し、かつ、多孔質化することにより色素の反応性及び反応量を増加することが可能となった。 The third invention makes it possible to increase the reactivity and amount of the dye by making the magnetic particles water-insoluble and making them porous by using a cross-linked polymer matrix.
第４の発明は高分子マトリックスが反応性極性基を有する合成ポリマーである反応性色素結合磁性粒子である。 The fourth invention is a reactive dye-bonded magnetic particle whose polymer matrix is a synthetic polymer having a reactive polar group.
第４の発明は、トリアジン色素との反応性を有する合成ポリマーを用いる事によってクロスリンクを必要とせず、トリアジン色素を容易にそのマトリックス内に固定化することが可能となった。 In the fourth invention, the use of a synthetic polymer having reactivity with the triazine dye does not require cross-linking, and the triazine dye can be easily immobilized in the matrix.
第５の発明は反応性極性基が水酸基またはアミノ基、カルボキシル基である反応性色素結合磁性粒子である。 The fifth invention is a reactive dye-coupled magnetic particle in which the reactive polar group is a hydroxyl group, an amino group or a carboxyl group.
第５の発明は、トリアジン色素の立体構造に由来する、スルホン基、もしくはアミノ基などの反応基と結合する反応性極性基として水酸基またはアミノ基、カルボキシル基である高分子マトリックスを用いることにより化学結合によるトリアジン色素の安定的な固定化を可能にした。 According to a fifth aspect of the present invention, a chemical matrix is formed by using a polymer matrix that is a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group as a reactive polar group that binds to a reactive group such as a sulfone group or an amino group derived from the three-dimensional structure of a triazine dye. It enables stable immobilization of triazine dyes by bonding.
第６の発明は目的とするタンパク質を含む溶液中に請求項１の反応性色素結合磁性粒子を混合し、目的タンパク質を吸着させた反応性色素結合磁性粒子を磁気分離により溶液から分離し、吸着されたタンパク質を精製および溶出させるタンパク質分離精製法である。 According to a sixth aspect of the present invention, the reactive dye-bound magnetic particles of claim 1 are mixed in a solution containing the target protein, and the reactive dye-bound magnetic particles having the target protein adsorbed are separated from the solution by magnetic separation and adsorbed. This is a protein separation and purification method for purifying and eluting the purified protein.
本発明の反応性色素結合磁性粒子としてのトリアジン色素結合磁性粒子は高分子マトリックス例えば、クロスリンクされた高分子ゲルからなるマトリックス中に微細な磁性粉末または磁性体微粒子を含有または結合させることにより磁性化し、このマトリックスにアフィニティ機能を有するトリアジン色素を結合させることにより作製される。またこの場合、高分子マトリックスの性質によっては最初に色素リガンドを固定化し、その後磁性微粒子を吸着または固定化させて色素リガンド結合磁性粒子を作製しても良い。 The triazine dye-bonded magnetic particles as the reactive dye-bonded magnetic particles of the present invention are magnetic by containing or binding a fine magnetic powder or fine magnetic particles in a polymer matrix, for example, a matrix composed of a cross-linked polymer gel. And a triazine dye having an affinity function is bound to this matrix. Further, in this case, depending on the properties of the polymer matrix, the dye ligand may be immobilized first, and then the magnetic fine particles may be adsorbed or immobilized to produce the dye ligand-bound magnetic particles.
本発明のトリアジン色素結合磁性粒子は以下のような性質を有する。
１．バッファーなどの水溶液中で容易に分散し、均一な液相反応を可能にする。
２．磁石により容易に固液分離を行なう事が出来る。
３．磁石を除去することにより再び溶液中に再分散される。
４．異なるトリアジン色素を結合することにより、種々の異なるタンパク質を選択的に吸着分離できる。The triazine dye-coupled magnetic particles of the present invention have the following properties.
1. It is easily dispersed in an aqueous solution such as a buffer to enable a uniform liquid phase reaction.
2. Solid-liquid separation can be easily performed with a magnet.
3. It is redispersed in the solution again by removing the magnet.
4). By binding different triazine dyes, various different proteins can be selectively adsorbed and separated.
本発明に用いられる高分子マトリックスとしてはアガロース、シリカなどの高分子ゲル、天然高分子多糖類、水酸基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性極性基を有する合成ポリマーなどを用いることが出来る。 As the polymer matrix used in the present invention, polymer gels such as agarose and silica, natural polymer polysaccharides, synthetic polymers having reactive polar groups such as hydroxyl groups, amino groups and carboxyl groups can be used.
また、マトリックスを磁性化する方法としては、これらの高分子マトリックスを水溶液中で膨潤させ、分散した微小磁性体粒子をマトリックス中に吸着させたのち、固定化する方法、ポリマーと磁性体微粒子とを混練成形する方法、ポリマー粒子上に物理的あるいは化学的な方法で磁性体微粒子を固定化する方法などがあるが、これらの方法で作製された高分子マトリックスが溶液中に分散された場合、磁石により容易に集積および再分散されるものであればいずれの方法でもよく、その製法に限定されるものではない。 In addition, as a method for magnetizing the matrix, these polymer matrices are swollen in an aqueous solution, and dispersed fine magnetic particles are adsorbed in the matrix and then immobilized. There are methods such as kneading and molding, and methods of immobilizing magnetic fine particles on polymer particles by physical or chemical methods. When the polymer matrix produced by these methods is dispersed in a solution, a magnet Any method can be used as long as it can be easily collected and re-dispersed by the method described above, and the production method is not limited thereto.
これらの方法で使用される磁性体微粒子としてはフェライト、マグネタイトのような酸化鉄、マンガンー亜鉛合金などの磁性体微粒子が用いられる。これらの磁性体微粒子は粒径として好ましくは1μm以下が望ましい。また、これら磁性体微粒子の前駆体として金属イオンなどの水溶液を高分子マトリックスに吸着させた後、磁性体に変換してもよい。 As the magnetic fine particles used in these methods, magnetic fine particles such as iron oxides such as ferrite and magnetite, and manganese-zinc alloys are used. These magnetic fine particles preferably have a particle size of 1 μm or less. Further, an aqueous solution of metal ions or the like may be adsorbed on the polymer matrix as a precursor of these magnetic fine particles, and then converted into a magnetic material.
本発明で用いられる反応性色素はタンパク質に親和性を有するトリアジン色素が用いられるが、これらはタンパク質の種類や目的に応じて適宜選択される。 As the reactive dye used in the present invention, a triazine dye having affinity for a protein is used, and these are appropriately selected according to the kind and purpose of the protein.
これらトリアジン色素の高分子マトリックスへの結合方法としては高分子マトリックスの極性基、たとえば水酸基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性極性基を用いてトリアジン色素との化学結合を行なう。また色素の固定化は高分子マトリックスの磁性化工程の前または後のいずれでも良いが、高分子マトリックスの種類に応じて適宜選択する。 As a method for bonding these triazine dyes to the polymer matrix, chemical bonding to the triazine dye is performed using a polar group of the polymer matrix, for example, a reactive polar group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group. The dye may be immobilized before or after the polymer matrix magnetizing step, but is appropriately selected according to the type of the polymer matrix.
本発明のトリアジン色素結合磁性粒子は水溶液あるいは有機溶剤中において容易に均一に分散されることが必要である。具体的には比重として0.9−1.5好ましくは 1.0−1.3 の範囲が望ましい。またトリアジン色素結合磁性粒子は溶液中で分散が容易であれば不定形でもよいが、好ましくは球状もしくはこれに近い形状を有する粒径1-500μmの粒子、更に好ましくは 10-150μmの範囲のものが望ましい。 The triazine dye-bonded magnetic particles of the present invention must be easily and uniformly dispersed in an aqueous solution or an organic solvent. Specifically, the specific gravity is in the range of 0.9-1.5, preferably 1.0-1.3. The triazine dye-coupled magnetic particles may be indefinite as long as they can be easily dispersed in a solution, but preferably have a spherical shape or a shape close to this and have a particle size of 1-500 μm, more preferably 10-150 μm. Is desirable.
このようなトリアジン色素結合磁性粒子を用いてタンパク質などの分離精製を行なう場合、まず目的とするタンパク質を含む溶液中に前記磁性粒子を分散する。この溶液を、例えばピペットなどを用いて吸引・吐出を繰り返すことなどによりゆるやかに攪拌し、タンパク質を該磁性粒子に吸着する。次にこのタンパク質吸着トリアジン色素結合磁性粒子を容器の外部に磁石を接触させて固液分離を行なう。 When performing separation and purification of proteins using such triazine dye-bound magnetic particles, the magnetic particles are first dispersed in a solution containing the target protein. The solution is gently agitated, for example, by repeating suction and discharge using a pipette or the like, and the protein is adsorbed to the magnetic particles. Next, the protein-adsorbed triazine dye-bound magnetic particles are subjected to solid-liquid separation by bringing a magnet into contact with the outside of the container.
こうして集積されたタンパク質吸着トリアジン色素結合磁性粒子は次の容器に移され、新しい溶出液を加えて攪拌することにより、吸着されたタンパク質が溶出される。
以上の吸着、固液分離、溶出を多段で繰り返すことにより、数種類の異なるトリアジン色素結合磁性粒子を用いて多段階の吸着・精製を連続で行なうことが可能となる。以下に本発明の実施例を図面に基づいて説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。The protein-adsorbed triazine dye-coupled magnetic particles thus collected are transferred to the next container, and the adsorbed protein is eluted by adding a new eluate and stirring.
By repeating the above adsorption, solid-liquid separation, and elution in multiple stages, it is possible to continuously perform multiple stages of adsorption / purification using several different types of triazine dye-bound magnetic particles. Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings, but the present invention is not limited to these embodiments.
トリアジン色素結合磁性粒子の作製について、以下に説明する。
まず、非磁性トリアジン色素（Reactive Blue 2）結合体を作製する。
図１に示した市販のクロスリンクされたアガロースゲルからなる粒子２（Sepharose CL 4B、Amersham Bioscience製）100mｌをガラスフィルター上に取り、10倍量の精製水を用いて吸引洗浄し、この洗浄したゲルを薬さじによって微生物培養坂口フラスコに移した。
これに100mｌの水に溶かしたトリアジン色素 Reactive Blue 2（SIGMA製）0.3g(構造式を図１中、符号１で表示)を加え、塩析効果によって次のカップリング反応の進行を容易にするために、さらに、22％NaCl溶液10mｌを加えた。ゲルの破壊を行なわないよう、ゲルが色素とよく混合する程度に回転子等を用いないで、約30分間振とう攪拌を行った。さらに、色素と担体間のカップリング反応を行なうために、1gの結晶Na2CO3を加えて、pH10.5のアルカリ条件下にし、60℃で約12時間振とう攪拌し、反応させた。反応終了後、ゲル懸濁液をガラスフィルターに移し、1ｌの水、1ｌの1M NaCl、2ｌの水の順序でろ液の着色が見られなくなるまで色素ゲルを洗浄した。これによって、図１の符号３で示す非磁性トリアジン色素結合体が作製される。The production of triazine dye-coupled magnetic particles will be described below.
First, a non-magnetic triazine dye (Reactive Blue 2) conjugate is prepared.
100 ml of the commercially available cross-linked agarose gel particle 2 (Sepharose CL 4B, manufactured by Amersham Bioscience) shown in FIG. 1 was placed on a glass filter, washed with 10 times the amount of purified water, and washed. The gel was transferred to a microbial culture Sakaguchi flask with a spoon.
To this, 0.3 g of triazine dye Reactive Blue 2 (manufactured by SIGMA) dissolved in 100 ml of water (the structural formula is shown by reference numeral 1 in FIG. 1) is added to facilitate the progress of the next coupling reaction by the salting out effect. In addition, 10 ml of 22% NaCl solution was added. In order not to destroy the gel, the mixture was shaken and stirred for about 30 minutes without using a rotor or the like to such an extent that the gel was well mixed with the pigment. Further, in order to carry out a coupling reaction between the dye and the carrier, 1 g of crystalline Na 2 CO 3 was added, and the reaction was carried out by stirring under 60 ° C. for about 12 hours under alkaline conditions of pH 10.5. After completion of the reaction, the gel suspension was transferred to a glass filter, and the dye gel was washed in the order of 1 l water, 1 l 1M NaCl, 2 l water until no coloration of the filtrate was observed. As a result, a nonmagnetic triazine dye conjugate indicated by reference numeral 3 in FIG. 1 is produced.
次に、作製された前記非磁性トリアジン色素結合体を用いてトリアジン色素（Reactive Blue 2）結合磁性粒子を作製する。
作製した非磁性トリアジン色素結合体３についての10グラムを2％炭酸ナトリウム溶液中に分散し、常温にて膨潤を行なった。この溶液中に2％炭酸ナトリウムに分散した平均径 1μmのフェライト微粒子を加えてゆるやかに攪拌し、10分程度放置し、色素結合体にフェライト微粒子を取り込ませた後、精製水で洗浄した。Next, triazine dye (Reactive Blue 2) -coupled magnetic particles are produced using the produced nonmagnetic triazine dye conjugate.
10 grams of the produced nonmagnetic triazine dye conjugate 3 was dispersed in a 2% sodium carbonate solution and swollen at room temperature. Ferrite fine particles having an average diameter of 1 μm dispersed in 2% sodium carbonate were added to this solution, and the mixture was gently stirred and allowed to stand for about 10 minutes. After incorporating the fine ferrite particles into the dye-bound body, it was washed with purified water.
このようにして得られたトリアジン色素結合磁性セファロース粒子は磁石を容器外から接触させることにより、容易に固液分離を行なう事が出来た。
このようにして作製されたトリアジン色素結合磁性粒子を図２〜図４に示す。The triazine dye-bound magnetic sepharose particles thus obtained could be easily separated into solid and liquid by bringing a magnet into contact with the outside of the container.
The triazine dye-coupled magnetic particles thus prepared are shown in FIGS.
トリアジン色素（Reactive Blue 2）結合磁性粒子を用いたタンパク質の分離精製方法について以下に説明する。 A method for separating and purifying proteins using triazine dye (Reactive Blue 2) -coupled magnetic particles will be described below.
実施例１で得られたトリアジン色素結合磁性セファロース粒子を用いて代表的なタンパク質であるBSAの吸着実験を行なった。 Using the triazine dye-bound magnetic sepharose particles obtained in Example 1, an adsorption experiment for BSA, which is a typical protein, was performed.
市販牛血清アルブミン（BSA，SIGMA製）を50mM Tris/HClバッファー(pH 7.0)に溶かし、BSAを2mg/mｌ含む溶液とした。この溶液に実施例１で調整したトリアジン色素結合磁性粒子を分散し、常温にて吸着させた。 Commercial bovine serum albumin (BSA, manufactured by SIGMA) was dissolved in 50 mM Tris / HCl buffer (pH 7.0) to obtain a solution containing 2 mg / ml BSA. The triazine dye-coupled magnetic particles prepared in Example 1 were dispersed in this solution and adsorbed at room temperature.
このBSA吸着トリアジン色素結合磁性粒子を磁石により分離し、さらにバッファー溶液で洗浄・分離した後、1.5 M NaClを加えたバッファー溶液にて溶出を行なった。この溶出液をA280nmの吸光度で測定することにより溶出したBSAを定量した。一方実施例１で得られた非磁性トリアジン色素結合セファロース粒子を用いて比較実験を行なった結果、BSAの非磁性粒子に対する吸着量は本発明の磁性粒子とほぼ同様の値を示した。 The BSA-adsorbed triazine dye-bound magnetic particles were separated by a magnet, further washed and separated with a buffer solution, and then eluted with a buffer solution to which 1.5 M NaCl was added. The eluted BSA was quantified by measuring the eluate at an absorbance of A280 nm. On the other hand, as a result of a comparative experiment using the nonmagnetic triazine dye-bound Sepharose particles obtained in Example 1, the amount of BSA adsorbed to the nonmagnetic particles showed almost the same value as the magnetic particles of the present invention.
続いて、磁性ポリマーマトリックスを用いるトリアジン色素（Reactive Red 120）結合磁性粒子によるタンパク質の分離精製について説明する。 Subsequently, protein separation and purification using triazine dye (Reactive Red 120) -bonded magnetic particles using a magnetic polymer matrix will be described.
表面に水酸基を有する市販のポリマー磁性粒子（平均径2μｍ Chemagen社製）をバッファー溶液中に分散し、トリアジン色素 Reactive Red 120とpH 10で室温で３時間、水酸基とのカップリング反応を行なった。反応後精製水でよく洗浄し、Reactive Red 結合ポリマー磁性粒子を得た。 Commercially available polymer magnetic particles having a hydroxyl group on the surface (average diameter: 2 μm, manufactured by Chemagen) were dispersed in a buffer solution, and a coupling reaction with a hydroxyl group was performed with triazine dye Reactive Red 120 at pH 10 for 3 hours at room temperature. After the reaction, it was thoroughly washed with purified water to obtain Reactive Red-bonded polymer magnetic particles.
このトリアジン色素結合磁性粒子を用いて実施例２と同様、BSAの分離実験を行ない、吸着されたBSAをA280nmの吸光度で測定した。この結果色素結合ポリマー磁性粒子は実施例１で作製した色素リガンド結合磁性セファロース粒子に比較してBSAの吸着量は２５％であった。 Using this triazine dye-coupled magnetic particles, a BSA separation experiment was conducted in the same manner as in Example 2, and the adsorbed BSA was measured by the absorbance at A280 nm. As a result, the amount of adsorbed BSA in the dye-bonded polymer magnetic particles was 25% as compared with the dye-ligand-bonded magnetic sepharose particles prepared in Example 1.
トリアジン色素（Reactive Green 19）結合磁性粒子による酵素の分離精製
実施例１と同様の方法でトリアジン色素としてReactive Green 19（SIGMA製） を市販のクロスリンクアガロース（Sepharose CL-4B、Amersham Bioscience製）に固定化し、その後この粒子にマグネタイト微粒子を含浸させて磁化し、Reactive Green結合磁性粒子を作製した。Separation and Purification of Enzyme Using Triazine Dye (Reactive Green 19) Binding Magnetic Particles Reactive Green 19 (manufactured by SIGMA) as a triazine dye in the same manner as in Example 1 was added to commercially available cross-linked agarose (Sepharose CL-4B, manufactured by Amersham Bioscience). After immobilization, the particles were impregnated with magnetite fine particles and magnetized to produce Reactive Green bonded magnetic particles.
この色素結合磁性粒子を用いて、細菌 S. thermovulgaris IFO 13089 に存在するValine脱水素酵素の分離精製を試みた。 Using these dye-bound magnetic particles, separation and purification of Valine dehydrogenase present in the bacterium S. thermovulgaris IFO 13089 was attempted.
S. thermovulgaris IFO 13089（湿重量４５ｇ）をpH7.2の10mＭリン酸緩衝液に懸濁後、超音波破砕、遠心分離により粗抽出液を調製した。この粗抽出液中に前記のReactive Green結合粒子を混合し吸着を行なった。磁気分離により非吸着のタンパク質を分離した後、吸着された酵素を緩衝液250mlと0.5M NaClを用いて段階的に塩濃度を上げ、磁気分離を用いて３段階で吸着タンパク質の溶出を行なった。そのタンパク質溶出液から目的とする酵素を含む溶液を透析し、さらに10mMのL-Valineの存在下、1mMの補酵素（NAD）を用いて磁性分離により段階的に目的酵素の抽出を行なった。
目的とする酵素（L-Valine脱水素酵素）は基質（L-Valine）及び補酵素（NAD）と複合体を形成し、選択的に遊離された。収率は、原料の粗抽出物6500mgから9.1mgの目的とする高純度の精製酵素（L-Valine脱水素酵素）が得られた。この方法によって目的とする酵素を効率よく分離精製できることが確かめられた。After suspending S. thermovulgaris IFO 13089 (wet weight 45 g) in 10 mM phosphate buffer at pH 7.2, a crude extract was prepared by ultrasonic disruption and centrifugation. The above-mentioned Reactive Green binding particles were mixed in this crude extract and adsorbed. After separating the non-adsorbed protein by magnetic separation, the salt concentration of the adsorbed enzyme was increased stepwise using 250 ml of buffer and 0.5 M NaCl, and the adsorbed protein was eluted in three steps using magnetic separation. . The solution containing the target enzyme was dialyzed from the protein eluate, and the target enzyme was extracted stepwise by magnetic separation using 1 mM coenzyme (NAD) in the presence of 10 mM L-Valine.
The target enzyme (L-Valine dehydrogenase) formed a complex with the substrate (L-Valine) and coenzyme (NAD) and was selectively released. The yield was 9.1 mg of the crude crude extract of the raw material, yielding the desired high-purity purified enzyme (L-Valine dehydrogenase). It was confirmed that the target enzyme can be efficiently separated and purified by this method.
以上説明した各実施例は本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば以上の説明においてはトリアジン色素としてReactive Blue 2，Reactive Red 120およびReactive Green 19についてのみ説明したがこれらに限られず、少なくとも表１に記載したトリアジン色素を用いることができる。また、磁性化された高分子マトリックスについても前述した粒子に限られるものではないことはいうまでもない。 Each of the embodiments described above is specifically described for better understanding of the present invention, and does not limit other embodiments. Therefore, changes can be made without changing the gist of the invention. For example, in the above description, only Reactive Blue 2, Reactive Red 120, and Reactive Green 19 have been described as triazine dyes. However, the present invention is not limited thereto, and at least the triazine dyes listed in Table 1 can be used. Needless to say, the magnetized polymer matrix is not limited to the aforementioned particles.
本発明は、種々の分野、例えば、農水産、食品、家庭用品、薬学、衛生や保健等の医療、工学、生化学の各分野で用いられ、詳細には、タンパク質やタンパク質から誘導される高分子物質等の生体物質を扱うことが要求される分野で用いられるがこれらの場合に限られるものではない。 The present invention is used in various fields, for example, fields of agriculture, fisheries, food, household goods, pharmacy, medicine such as hygiene and health, engineering, biochemistry, and more specifically, proteins and proteins derived from proteins. It is used in fields where it is required to handle biological substances such as molecular substances, but is not limited to these cases.
１ トリアジン色素
２ 粒子
３ トリアジン色素結合体1 Triazine dye 2 Particle 3 Triazine dye conjugate
Claims (6)
生成した非磁性トリアジン色素結合体を液中に分散して膨潤させ、平均径1μmのフェライト微粒子を加えて攪拌して、前記色素結合体にフェライト微粒子を取り込ませてトリアジン色素結合磁性粒子を生成する方法。The produced non-magnetic triazine dye conjugate is dispersed and swollen in the liquid, and ferrite fine particles having an average diameter of 1 μm are added and stirred to incorporate the ferrite fine particles into the dye conjugate to produce triazine dye-coupled magnetic particles. Method.
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