JP4798428B2 - Method for producing foreign enzyme protein, genetically modified silkworm used therefor, and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、外来酵素蛋白質遺伝子が染色体に組み込まれた遺伝子組換えカイコを利用した組換え型の外来酵素蛋白質の製造法に関する。また、絹糸腺または繭糸に組換え型の外来酵素蛋白質を産生することができる遺伝子組換えカイコ、並びに、その遺伝子組換えカイコの製造法に関する。 The present invention relates to a method for producing a recombinant foreign enzyme protein using a transgenic silkworm in which a foreign enzyme protein gene is incorporated into a chromosome. The present invention also relates to a genetically modified silkworm that can produce a recombinant foreign enzyme protein in silk gland or silk thread, and a method for producing the genetically modified silkworm.
従来、遺伝子組換え蛋白質は、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、細菌、酵母、または COS 細胞のような哺乳類由来細胞などに導入し、培地中でその細胞を増殖させた後、合成された蛋白質を回収することにより生産されている。しかし、このような方法では、十分な量の蛋白質の生産が難しいという問題がある。また、バキュロウイルスにより蛋白質遺伝子を昆虫や昆虫細胞に感染させて遺伝子組換え蛋白質を生産することも知られている。この方法では、哺乳類に近い蛋白質の翻訳後修飾が得られる長所があるが、外来蛋白質遺伝子の導入にウイルスを用いることから、その不活性化や封じ込めが必要であり、また、ウイルス接種が煩雑であるなどの問題がある。 Conventionally, a recombinant protein is a protein synthesized after introducing a gene encoding the amino acid sequence into a cell derived from a mammal such as a bacterium, yeast, or COS cell and growing the cell in a medium. It is produced by collecting. However, this method has a problem that it is difficult to produce a sufficient amount of protein. It is also known to produce recombinant proteins by infecting insects and insect cells with protein genes using baculovirus. This method has the advantage that post-translational modification of proteins close to mammals can be obtained. However, since viruses are used to introduce foreign protein genes, their inactivation and containment are necessary, and virus inoculation is complicated. There are some problems.
一方、最近、ミニコラーゲンやサイトカインのような分子量の小さい蛋白質をコードする遺伝子を、カイコの染色体に組み込ませて組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に外来蛋白質を生産させる方法が開発されている（特許文献１、２および３）。しかし、このような昆虫染色体への外来蛋白質遺伝子の組み込みによる遺伝子組換え技術においては、生産される組換え型外来蛋白質の生産量は十分ではなく、更に、組換え型外来蛋白質は低分子量のもので成功しているのみであり、これらの点で各種の課題があるものである。
また、酵母の転写制御因子 GAL4 と標的配列UAS からなる遺伝子発現系制御システムを利用した組換えカイコによる遺伝子の発現についての検討もなされており、酵母の GAL4/UAS システムは遺伝子組換えカイコにおいても機能し、導入遺伝子の発現制御に有効であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この報告では、緑色蛍光蛋白質（GFP）の遺伝子を発現させた例のみである。一方、遺伝子組換えカイコにおいて、医薬品や診断薬として使用される酵素を発現させて分泌・回収することについては、酵素がさらに高分子量であることや高次構造の維持が難しい点などから検討されていないのが実情である。
On the other hand, recently, a recombinant silkworm has been produced by integrating a gene encoding a low molecular weight protein such as minicollagen or cytokine into the silkworm chromosome, and a foreign protein is added to the silk gland or silk thread of the resulting recombinant silkworm. Have been developed (Patent Documents 1, 2, and 3). However, in such genetic recombination technology by incorporating a foreign protein gene into an insect chromosome, the amount of recombinant foreign protein produced is not sufficient, and the recombinant foreign protein has a low molecular weight. However, there are various problems in these respects.
In addition, the expression of genes by recombinant silkworms using a gene expression system control system consisting of the yeast transcriptional regulator GAL4 and the target sequence UAS has been studied. The yeast GAL4 / UAS system is also used in transgenic silkworms. It has been reported that it functions and is effective in controlling the expression of transgenes (Non-patent Document 1). However, this report is only an example in which a gene for green fluorescent protein (GFP) is expressed. On the other hand, in transgenic silkworms, the expression and secretion / recovery of enzymes used as pharmaceuticals and diagnostic agents has been studied from the viewpoint of the higher molecular weight of the enzymes and the difficulty in maintaining higher-order structures. The fact is not.
本発明の目的は、遺伝子組換えカイコを用いて、簡便な方法で大量に高分子量の外来酵素蛋白質を製造する方法を提供することにある。また、それに用いる遺伝子組換えカイコおよび遺伝子組換えカイコの製造法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing a high molecular weight foreign enzyme protein in a large amount by a simple method using a transgenic silkworm. Moreover, it is providing the manufacturing method of the genetically modified silkworm used for it, and a genetically modified silkworm.
本発明者らは鋭意検討の結果、目的とする高分子量の外来酵素蛋白質をコードする遺伝子がカイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合した構造を持つ DNA 配列を、トランスポゾン由来の DNA を利用してカイコ染色体に導入するとともに、酵母由来の遺伝子発現制御系である GAL4/UAS システムを機能させることにより、従来の遺伝子組換えカイコでは製造できなかった、高分子量の外来酵素蛋白質が、絹糸腺または繭糸中に大量に生産されることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have determined that a DNA sequence having a structure in which a gene encoding a target high molecular weight foreign enzyme protein is bound downstream of a promoter that is specifically expressed in the silkworm silk gland is converted into a transposon-derived DNA. By using the GAL4 / UAS system, which is a gene expression control system derived from yeast, and introducing it into the silkworm chromosome, the high-molecular-weight foreign enzyme protein that could not be produced by conventional genetically modified silkworms is transformed into silk thread. It has been found that it is produced in large quantities in glands or silks, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は、染色体に外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に外来酵素蛋白質を産生させた後、その絹糸腺または繭糸から外来酵素蛋白質を回収することを特徴とする外来酵素蛋白質の製造法に関する。
更に本発明は、遺伝子組換えカイコであって、
i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ii) UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子とを含む第二遺伝子とを
染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコに関する。
更に本発明は、
遺伝子組換えカイコの製造法であって、
i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子をカイコの染色体に組み込んだ第一の遺伝子組換えカイコを製造し、
それとは別に、
ii) UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子をカイコの染色体に取り込ませて第二の遺伝子組換えカイコを製造し、
iii) 次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させて
製造することを特徴とする遺伝子組換えカイコの製造法に関する。
That is, the present invention produces a transgenic silkworm in which a gene group that expresses a foreign enzyme protein in a chromosome is produced, and after producing the foreign enzyme protein in the silk gland or silk thread of the obtained recombinant silkworm, The present invention relates to a method for producing a foreign enzyme protein, which comprises recovering the foreign enzyme protein from a silk gland or silk thread.
Furthermore, the present invention is a transgenic silkworm,
i) a first gene comprising a gene of GAL4 or an analog thereof bound downstream of a promoter specifically expressed in the silk gland;
ii) A silk gland-specific protein gene is linked downstream of the UAS gene, and a second gene containing a foreign enzyme protein gene linked downstream of the silk gland-specific protein gene is incorporated into the chromosome. It relates to transgenic silkworms.
Furthermore, the present invention provides
A method for producing a transgenic silkworm, comprising:
i) producing a first genetically modified silkworm in which a first gene containing GAL4 or an analog thereof linked downstream of a promoter specifically expressed in the silk gland is incorporated into a silkworm chromosome;
Apart from that,
ii) A silk gland-specific protein protein gene is linked downstream of the UAS gene, and a second gene containing a foreign enzyme protein gene linked downstream of the silk gland-specific protein gene is incorporated into the silkworm chromosome. To produce a second transgenic silkworm,
iii) Next, the present invention relates to a method for producing a transgenic silkworm, characterized by being produced by crossing a first transgenic silkworm and a second transgenic silkworm.
本発明の製造法では、目的とする高分子量の組換え型外来酵素蛋白質を大量に製造することができる。また、夾雑物を多く含まない絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目的の外来酵素蛋白質の精製が容易であるという利点がある。更には、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しないことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安全に組換え酵素蛋白質の製造を実施することが可能となる。 In the production method of the present invention, a desired high-molecular-weight recombinant foreign enzyme protein can be produced in large quantities. In addition, since it can be recovered from silk glands or silks that do not contain much impurities, there is an advantage that the target foreign enzyme protein can be easily purified. Furthermore, since no virus such as baculovirus is used, it is not necessary to inactivate the virus, and the recombinant enzyme protein can be easily and safely produced.
本発明で製造することができる外来酵素蛋白質としては、特に限定されないが、分子量が、好ましくは少なくとも 3.5 万、より好ましくは 4.0 万〜20 万、更に好ましくは 4.5 万〜15 万の酵素蛋白質である。そのような蛋白質として、例えば、ヘキソキナーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を例示することができる。 The foreign enzyme protein that can be produced in the present invention is not particularly limited, but is an enzyme protein having a molecular weight of preferably at least 35,000, more preferably 40000 to 200,000, and even more preferably 45,000 to 150,000. . Examples of such proteins include hexokinase, alkaline phosphatase, peroxidase and the like.
本発明において、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群とは、その遺伝子群を染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコが、外来酵素蛋白質を絹糸腺または繭糸に産生させるように工夫した遺伝子群であれば特に限定しない。本発明においては、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群が、機能的に結合した転写制御因子をコードする DNA/該転写制御因子の標的プロモーターのシステム、例えば、酵母由来の転写制御系であるGAL4/UAS システムの機能もしくはそれと同様の機能を有するものが好ましい。具体的には、本発明においては、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群は、i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された転写制御因子、例えば、GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、ii) 該転写制御因子の標的プロモーター、例えば、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子とを含む遺伝子群であることが、その外来酵素蛋白質を大量に産生できることから好ましい。 In the present invention, the gene group that expresses the foreign enzyme protein is particularly a gene group in which the gene group is incorporated into the chromosome so long as the foreign enzyme protein is devised to produce silk gland or silk thread. Not limited. In the present invention, a gene group that expresses a foreign enzyme protein is a DNA that encodes a functionally linked transcriptional regulatory factor / target promoter system of the transcriptional regulatory factor, for example, a yeast-derived transcriptional regulatory system GAL4 / Those having the function of the UAS system or similar functions are preferred. Specifically, in the present invention, a group of genes that express a foreign enzyme protein includes i) a transcriptional regulatory factor bound downstream of a promoter that is specifically expressed in the silk gland, for example, a gene of GAL4 or an analog thereof. A first gene containing, and ii) a silk gland-specific expression protein gene is linked downstream of the target promoter of the transcriptional regulator, for example, the UAS gene, and is linked downstream of the silk gland-specific expression protein gene A gene group including a second gene containing a foreign enzyme protein gene is preferable because the foreign enzyme protein can be produced in large quantities.
本発明に用いる絹糸腺特異的に発現するプロモーターとは、カイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればいずれでもよいが、カイコ絹糸腺で特異的に蛋白質の発現を誘導するように工夫されたプロモーターが好ましい。例えば、フィブロイン L 鎖プロモーター、フィブロイン H 鎖プロモーター、p25 プロモーター、セリシンプロモーターなどのカイコ絹糸腺で特異的に発現される蛋白質遺伝子のプロモーターが挙げられる。そのうち、フィブロイン L 鎖蛋白質は後部絹糸腺で大量に産生され、少なくとも個体当たり約 30mg が分泌されている。これは絹糸腺中に分泌される主要な蛋白質の約 40% を占めており、p25 蛋白質の6 倍の発現量に当たる。よってフィブロイン L 鎖プロモーターは後部絹糸腺において高転写活性能を有している点から好ましい。また、セリシンプロモーターを用いると絹糸腺臓器が損なわれずに中部絹糸腺より、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を製造しやすく好ましい。 The promoter specifically expressed in the silk gland used in the present invention may be any promoter that works effectively in silkworm cells, but a promoter devised to specifically induce protein expression in the silkworm silk gland. Is preferred. For example, promoters of protein genes specifically expressed in silkworm silk glands such as fibroin L chain promoter, fibroin H chain promoter, p25 promoter, sericin promoter and the like can be mentioned. Among them, fibroin light chain protein is produced in large quantities in the posterior silk gland, and at least about 30 mg is secreted per individual. This accounts for about 40% of the main protein secreted into the silk gland, which is 6 times the expression level of the p25 protein. Therefore, the fibroin L chain promoter is preferable because it has a high transcription activity in the posterior silk gland. In addition, it is preferable to use a sericin promoter because it is easy to produce a foreign enzyme protein having an enzyme activity from the middle silk gland without damaging the silk gland organ.
本発明に用いる GAL 4 もしくはその類縁体とは、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS (upstream activating sequence) システム (Nature 288: 672-675, 1988: Development 118: 410-415, 1994) の機能もしくはそれと同様の機能を発揮するものであれば限定しない。GAL4 の類縁体としては、UAS 遺伝子に結合し、もしくは UAS 遺伝子を認識し、その下流にある構造遺伝子の転写活性を促進する酵母由来のGAL1、GAL10、GAL7 などが挙げられる（J. Bacteriol 158: 705-712）。UAS 遺伝子は、構造遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の転写活性化因子、即ち、GAL4 もしくはその類縁体が結合・認識する遺伝子であり、例えば、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域などが該当する。 GAL 4 or its analogs used in the present invention are those of the GAL4 / UAS (upstream activating sequence) system (Nature 288: 672-675, 1988: Development 118: 410-415, 1994), a transcription control system derived from yeast. It is not limited as long as it exhibits a function or a similar function. GAL4 analogs include yeast-derived GAL1, GAL10, and GAL7 that bind to the UAS gene or recognize the UAS gene and promote the transcriptional activity of structural genes downstream of it (J. Bacteriol 158: 705-712). The UAS gene is located upstream of the structural gene and is a transcription activator of the gene, that is, a gene that GAL4 or its analog binds and recognizes. For example, a 5 ′ untranslated region including a promoter region is applicable. To do.
本発明に用いる第二遺伝子は、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む。UAS 遺伝子とは、上記したように転写活性化因子の結合もしくは認識部位であり（J. Bacteriol 158:705-712）、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS システムが機能するものであれば限定しない。
本発明において、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子とは、絹糸腺で大量に発現している蛋白質をコードする遺伝子が好ましく、そのような蛋白質としては、フィブロイン H 鎖、フィブロイン L 鎖、セリシン、p25 などを例示できる。そのうち、上記したように、フィブロイン L 鎖蛋白質は大量に分泌され、また目的とする外来酵素蛋白質と融合蛋白質の形態で組み換え蛋白質を発現させる場合、分子量がフィブロイン H 鎖よりも小さい点から好ましい。
しかし、本発明において、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を用いる場合、さらに巨大な融合外来酵素蛋白質が絹糸腺で発現されるが、意外にも、外来酵素蛋白質の高次構造を維持したまま発現され、その結果、絹糸腺特異的発現蛋白質を除去した後、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を生産することができる。
The second gene used in the present invention includes a foreign enzyme protein gene in which a silk gland-specific expression protein gene is linked downstream of the UAS gene, and is linked downstream of the silk gland-specific expression protein gene. A UAS gene is a transcriptional activator binding or recognition site as described above (J. Bacteriol 158: 705-712), as long as the GAL4 / UAS system, a yeast-derived transcriptional control system, functions. Not limited.
In the present invention, the silk gland-specific expression protein gene is preferably a gene encoding a protein that is expressed in a large amount in the silk gland. Examples of such a protein include fibroin H chain, fibroin L chain, sericin, and p25. Can be illustrated. Among them, as described above, fibroin L chain protein is secreted in a large amount, and when expressing a recombinant protein in the form of a target foreign enzyme protein and fusion protein, the molecular weight is preferable from the viewpoint that the molecular weight is smaller than that of fibroin H chain.
However, in the present invention, when a foreign enzyme protein gene linked downstream of the silk gland-specific expression protein gene is used, a larger fusion foreign enzyme protein is expressed in the silk gland. As a result, it is possible to produce a foreign enzyme protein having enzymatic activity after removing the silk gland-specific protein.
本発明の第二遺伝子においては、その他にも、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子などが含まれてもよい。
精製ペプチドとしては、His タグ、FLAG、STREP、GST などが一般的で主としてアフィニティー精製が可能となるペプチドが好ましい。例えば、His タグは、ヒスチジン残基が連続して 6〜10 個結合したものであり、目的の外来酵素蛋白質に結合させて用いる。この His タグはキレート担体と相互作用するため、産生される外来酵素蛋白質の精製が容易に行える。FLAG は 8 アミノ酸（配列番号１０のアミノ酸配列）のペプチド Tag で、組み換えタンパク質に結合した融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質は Anti-FLAG抗体を用いて検出、精製を行なうことができる。STREP は、ストレプトアビジンに結合する 8 アミノ酸残基（配列番号１１のアミノ酸配列）から成るタグであり、ストレプトアビジン変異体タンパク質との可逆的な結合を利用して、組み換え体タンパク質を発現・精製・検出できる。GST は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼであり、組み換えタンパク質に結合した融合タンパク質として発現させれば、グルタチオンセファロース担体とアフィニティー結合させる事により比較的容易に産生される外来酵素蛋白質を精製できる。これらの精製ペプチドのなかでも、産生される外来酵素蛋白質の立体構造を保持させたい場合には、ペプチド残基の短い His を用いる事が好ましい。これらの精製ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されていることが好ましい。
In the second gene of the present invention, besides, a gene encoding a purified peptide for purifying the produced foreign enzyme protein, a fusion protein of the produced silk gland-specific expression protein and the foreign enzyme protein, A gene encoding a protease recognition peptide for releasing a foreign enzyme protein may be included.
As a purified peptide, a His tag, FLAG, STREP, GST and the like are generally used, and peptides capable of mainly affinity purification are preferred. For example, the His tag is composed of 6 to 10 consecutive histidine residues, and is used by binding to a target foreign enzyme protein. Since this His tag interacts with the chelate carrier, the produced foreign enzyme protein can be easily purified. FLAG is a peptide tag of 8 amino acids (amino acid sequence of SEQ ID NO: 10), expressed as a fusion protein bound to a recombinant protein, and the fusion protein can be detected and purified using an Anti-FLAG antibody. STREP is a tag consisting of 8 amino acid residues (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) that binds to streptavidin. Reversible binding to streptavidin mutant proteins is used to express, purify, and recombine recombinant proteins. It can be detected. GST is glutathione-S-transferase, and when expressed as a fusion protein bound to a recombinant protein, a foreign enzyme protein produced relatively easily can be purified by affinity binding to a glutathione sepharose carrier. Among these purified peptides, when it is desired to maintain the three-dimensional structure of the produced foreign enzyme protein, it is preferable to use His having a short peptide residue. The genes encoding these purified peptides are preferably inserted downstream of the silk gland specific expression protein gene and upstream of the foreign enzyme protein gene.
プロテアーゼ認識ペプチドとは、カイコの絹糸腺内に発現される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から外来酵素蛋白質をプロテアーゼにより切断して、絹糸腺特異的発現蛋白質を融合外来酵素蛋白質から遊離・除去させることができるペプチドであれば、特に限定しない。プロテアーゼ認識ペプチドとしては、スロンビン、ファクター Xa、TEV プロテアーゼ、PreScission プロテアーゼなどのプロテアーゼによって認識されるペプチドなどが挙げられる。例えば、スロンビンの認識ペプチドは配列番号８で示すアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列のうちの Arg と Gly の部位がスロンビンによって消化される。プロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子と外来酵素蛋白質遺伝子との間に位置し、融合蛋白外来酵素蛋白質遺伝子の上流に存在するのが好ましい。また、絹糸腺特異的発現蛋白質を確実に除去するため、複数種類のプロテアーゼ認識ペプチド遺伝子を用いてもよい。さらに、絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との間に、「第一のプロテアーゼ認識配列―精製ペプチド−第二のプロテアーゼ認識配列」を挿入すると、融合外来酵素蛋白質から絹糸腺特異的発現蛋白質を除去でき、しかも、得られる酵素を精製しやすいので好ましい。 A protease-recognizing peptide is a fusion protein of a silk gland-specific expression protein expressed in the silk gland of a silkworm and a foreign enzyme protein. The foreign enzyme protein is cleaved by a protease, and the silk gland-specific expression protein is fused to the foreign enzyme. The peptide is not particularly limited as long as it can be released / removed from the protein. Examples of the protease recognition peptide include peptides recognized by proteases such as thrombin, factor Xa, TEV protease, and PreScission protease. For example, the recognition peptide for thrombin has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the Arg and Gly sites in this amino acid sequence are digested by thrombin. The gene encoding the protease recognition peptide is preferably located between the silk gland specific expression protein gene and the foreign enzyme protein gene, and is present upstream of the fusion protein foreign enzyme protein gene. In addition, in order to reliably remove the silk gland specific expression protein, a plurality of types of protease recognition peptide genes may be used. Furthermore, when “first protease recognition sequence-purified peptide-second protease recognition sequence” is inserted between the silk gland-specific expressed protein and the foreign enzyme protein, the fusion gland-specific protein is expressed from the fusion foreign enzyme protein. Is preferable, and the resulting enzyme is easy to purify.
また、第一遺伝子または第二遺伝子が染色体に組み込まれた第一または第二の遺伝子組換えカイコのスクリーニングを容易にするために、第一または第二遺伝子は、マーカー遺伝子を有するのが好ましく、マーカー遺伝子としては、適切な発現部位特異的プロモーターの下流に結合された蛍光蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。発現部位特異的プロモーターとしては、カイコ細胞で発現可能なプロモーターであればいずれでもよく、例えば特開平６−２６１７７０号公報や特開昭６２−２８５７８７号公報に記載されているショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターやカイコアクチン遺伝子のプロモーター（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）、ショウジョウバエの視神経で発現することが知られている 3xP3 プロモーターなどが挙げられる。好ましくは、カイコアクチン遺伝子のプロモーターまたは 3xP3 プロモーターが用いられる。マーカーとしての蛍光蛋白質としては、例えば、緑色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質等を例示できる。 In order to facilitate screening of the first or second transgenic silkworm in which the first gene or the second gene is integrated into the chromosome, the first or second gene preferably has a marker gene, As the marker gene, a gene encoding a fluorescent protein bound downstream of an appropriate expression site-specific promoter is preferable. The expression site-specific promoter may be any promoter that can be expressed in silkworm cells. For example, a Drosophila heat shock protein gene described in JP-A-6-261770 and JP-A-62-285787. And the promoter of the silkworm actin gene (Nature Biotechnology 18 , 81-84, 2000), the 3xP3 promoter known to be expressed in the Drosophila optic nerve, and the like. Preferably, the promoter of the silkworm actin gene or the 3xP3 promoter is used. Examples of the fluorescent protein as a marker include a green fluorescent protein, a blue fluorescent protein, a red fluorescent protein, and a yellow fluorescent protein.
以上に説明した外来酵素蛋白質遺伝子、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子などの構造遺伝子の下流には、通常の遺伝子発現系の下流に設けられるポリ A 配列を結合させる。ポリ A 配列としては、例えば SV40 ポリ A やウシ成長ホルモンポリ A などの一般的に蛋白質の発現に実績のあるものなどが挙げられる。 A poly A sequence provided downstream of a normal gene expression system is linked downstream of structural genes such as the foreign enzyme protein gene and silk gland specific expression protein gene described above. Examples of the poly A sequence include those generally proven in protein expression such as SV40 poly A and bovine growth hormone poly A.
染色体に外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換えカイコは、第一遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第一の遺伝子組換えカイコを製造し、それとは別に、第二遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第二の遺伝子組換えカイコを製造し、次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させ製造することが好ましい。
加えて、本発明に用いる遺伝子組換えカイコは、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を絹糸腺から得るため、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコであることが好ましい。ここで、「絹糸を構成するペプチド」とは、絹糸を構成する内因性ペプチドであり、例えば、外因性の絹糸腺特異的発現蛋白質は除いたものである。
本発明において、そのような「絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ」を製造する場合、第一遺伝子を組み込む前のカイコ、第一の遺伝子組換えカイコ、第二遺伝子を組み込む前のカイコ、第二の遺伝子組換えカイコのいずれかのカイコを、あらかじめ、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコと交配させて F1 カイコを製造し、その F1 カイコを、それぞれのカイコとして用いることが好ましい。
A transgenic silkworm in which a gene group that expresses a foreign enzyme protein in a chromosome produces a first transgenic silkworm in which a first gene is integrated into a silkworm chromosome, and separately, a second gene is transformed into a silkworm. It is preferable to produce a second genetically modified silkworm that has been incorporated into the chromosome, and then cross and produce the first genetically modified silkworm and the second genetically modified silkworm.
In addition, the transgenic silkworm used in the present invention is preferably a silkworm in which production of a peptide constituting the silk thread is suppressed in order to obtain a foreign enzyme protein having enzyme activity from the silk gland. Here, the “peptide constituting the silk thread” is an endogenous peptide constituting the silk thread, for example, excluding the exogenous silk gland specific expression protein.
In the present invention, when producing such a “silk silk whose production of the peptide constituting the silk thread is suppressed”, the silkworm before incorporating the first gene, the first transgenic silkworm, and before incorporating the second gene. F1 silkworms are produced by crossing silkworms of the silkworms of the silkworm and the second genetically modified silkworm with silkworms in which the production of the peptides constituting the silk thread has been suppressed in advance. It is preferable to use as.
ここで、「絹糸を構成するペプチド」としては、特開２００４−１３５５２８号公報に記載のように、例えばフィブロイン L 鎖、H 鎖、セリシン、p25（fibrohexamarin）が挙げられるが、好ましくはフィブロイン L 鎖または H 鎖であり、より好ましくはフィブロインＬ鎖である。また、「絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ」としては、好ましくは絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ、より好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、さらに好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、さらにより好ましくはＮｄ−ｓＤが挙げられるが、絹糸を構成するペプチドの生産抑制の原因が、人為的か否か、また、変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコも含まれる。 Here, examples of the “peptide constituting the silk thread” include fibroin L chain, H chain, sericin, and p25 (fibrohexamarin) as described in JP-A No. 2004-135528, and preferably fibroin L chain. Or it is a H chain, More preferably, it is a fibroin L chain. In addition, “a silkworm in which the production of the peptide constituting the silk thread is suppressed” is preferably a silk thread by mutation of a gene region (including a coding region, a promoter region, and an untranslated region) encoding the peptide constituting the silk thread. Silkworms in which production of the constituent peptides is suppressed, more preferably silkworms of mutant strains in which the production of peptides constituting the silk thread is suppressed by the mutation, and more preferably, the production of peptides constituting the silk thread by the mutation are produced. The silkworms of the bare silkworm strains that are suppressed, and more preferably Nd-s D, can be mentioned, but whether or not the cause of the suppression of the production of the peptides constituting the silk thread is artificial and whether it depends on mutation Regardless, silkworms in which the production of peptides constituting the silk thread is suppressed are also included.
絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコは人為的に作出することが可能である。例えば、２重鎖の RNA を用いることにより、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製も可能である（Quan, G. X., Kanda, T. and Tamura, T.(2002):Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Molecular Biology 11217-222）。また、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製は、ウイルスをベクターとして用いることによっても行うことができる（Yamao, M., Katayama, N., Nakazawa, H., Yamakawa, M., Hayashi, Y., Hara, S., Kamei, K., & Mori, H. (1999).Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13(5), 511-516.）。
このように作出されたカイコにおいて、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているか否かは、絹糸腺の大きさで判断することができる。また、作出されたカイコの繭の重量、その繭の絹糸を構成するペプチドの含有量を計測することなどで判断することができる。
Silkworms in which the production of the peptides constituting the silk thread is suppressed can be artificially created. For example, by using double-stranded RNA, it is possible to produce so-called transgenic silkworms that lack the functions of certain silkworm genes (Quan, GX, Kanda, T. and Tamura, T. (2002): Induction). of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Molecular Biology 11217-222). In addition, so-called transgenic silkworms that lack the functions of certain genes in silkworms can also be produced by using viruses as vectors (Yamao, M., Katayama, N., Nakazawa, H., Yamakawa, M ., Hayashi, Y., Hara, S., Kamei, K., & Mori, H. (1999) .Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13 (5), 511-516.) .
Whether the production of the peptide constituting the silk thread is suppressed in the silkworm produced in this way can be determined by the size of the silk gland. It can also be determined by measuring the weight of the silkworm cocoons produced and the content of the peptide constituting the silk thread of the silkworm.
本発明において、第一遺伝子および第二遺伝子を、それぞれ、カイコの染色体に組み込ませる方法は、遺伝子が安定に染色体に組み込まれる方法であれば特に限定しない。カイコ卵に遺伝子をマイクロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法などを用いることができる。好ましくは、第一遺伝子または第二遺伝子を含み、トランスポゾン由来 DNA 配列を含有する外来遺伝子導入用ベクターを、トランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000）と同時にカイコ卵にマイクロインジェクションする方法が採用される。 In the present invention, the method for incorporating the first gene and the second gene into the silkworm chromosome is not particularly limited as long as the gene is stably incorporated into the chromosome. A method of microinjecting a gene into a silkworm egg, a method using a gene gun, or the like can be used. Preferably, a vector for introducing a foreign gene containing the first gene or the second gene and containing a transposon-derived DNA sequence is transferred to a silkworm egg simultaneously with a helper plasmid containing a transposase gene (Nature Biotechnology 18 , 81-84, 2000). The injection method is adopted.
トランスポゾン由来の DNA 配列は、１対の末端逆位配列を含み、この１対の末端逆位配列の間に、上記した絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子、あるいは、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子を配置させることによって、カイコ染色体に目的遺伝子を組み込むための外来遺伝子導入用ベクターを構築することができる。
トランスポゾン由来の DNA 配列としては、ショウジョウバエ由来のトランスポゾンmariner（Third International workshop on transgenesis of invertebrate organisms,p37-38,1999）およびMinos（Insect Mol.Biol.9,277-281,2000）や鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンである piggyBac（Nature Biotechnology 18,81-84,2000) などを用いることが可能できる。なかでも、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンである piggyBac 由来の DNA 配列を持ったトランスポゾンが好適に使用される。
piggyBac 由来の DNA 配列は、TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列を有するものであり、その DNA 配列の間に、上記した本発明の第一遺伝子または第二遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子導入用ベクターが構築される。
このように、トランスポゾン由来の DNA 配列を利用して外来遺伝子をカイコ染色体へ導入するためには、さらにトランスポザーゼをコードする遺伝子を発現できるヘルパープラスミドを同時に利用する。例えば、piggyBac 由来のトランスポザーゼを発現することが可能な DNA 配列を含むヘルパープラスミドを同時に導入することで、カイコ細胞内において転写・翻訳されたトランスポザーゼがその１対の末端逆位配列を認識してその間の第一遺伝子断片または第二遺伝子断片を切り出し、カイコ染色体へと転移させることにより、カイコ染色体へ第一遺伝子または第二遺伝子が導入される頻度を著しく向上させることができる。
The DNA sequence derived from the transposon includes a pair of terminal inversion sequences, and between the pair of terminal inversion sequences, GAL4 or an analog thereof bound downstream of the silk gland-specific promoter described above. Or a second gene containing a foreign enzyme protein gene linked to the downstream of the silk gland-specific expression protein gene. By arranging the gene, a vector for introducing a foreign gene for incorporating the target gene into the silkworm chromosome can be constructed.
Transposon-derived DNA sequences include Drosophila-derived transposon mariner (Third International workshop on transgenesis of invertebrate organisms, p37-38, 1999) and Minos (Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 2000) and lepidopterous insects. PiggyBac (Nature Biotechnology 18 , 81-84, 2000) can be used. Among them, a transposon having a DNA sequence derived from piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopterous insect, is preferably used.
The DNA sequence derived from piggyBac has a pair of terminal inversion sequences including a TTAA sequence. By inserting the above-described first gene or second gene of the present invention between the DNA sequences, a foreign sequence is obtained. A vector for gene transfer is constructed.
Thus, in order to introduce a foreign gene into a silkworm chromosome using a DNA sequence derived from a transposon, a helper plasmid capable of expressing a gene encoding a transposase is simultaneously used. For example, by simultaneously introducing a helper plasmid containing a DNA sequence capable of expressing a piggyBac-derived transposase, the transposase transcribed and translated in the silkworm cell recognizes the pair of terminal inversion sequences. The frequency at which the first gene or the second gene is introduced into the silkworm chromosome can be remarkably improved by cutting out the first gene fragment or the second gene fragment and transferring it to the silkworm chromosome.
このようにして、外来遺伝子導入用ベクターを使用し、トランスポザーゼをコードする遺伝子を持つヘルパープラスミドと同時にカイコ卵にインジェクションすることにより、第一遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第一の遺伝子組換えカイコ、並びに、第二遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第二の遺伝子組換えカイコを製造することができる。
これらの遺伝子組換えカイコを、通常の条件で催青し、孵化した幼虫を５令まで飼育し成虫を得る（G0 世代）。得られた G0 成虫の雌雄を交配し卵を得る。マーカーとして 3xP3 プロモーターまたはアクチンプロモーターを上流に有する蛍光蛋白質を持つようにした第一遺伝子または第二遺伝子を使用した場合、これらの卵のうち、蛍光を有するものを選別する。このとき、それぞれ、マーカーとして、緑色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質を用いたときは、緑色蛍光、青色蛍光、赤色蛍光、黄色蛍光があるものを卵の段階で選別できる。選別した卵を孵化させ、生育させる事により、目的とする第一または第二の遺伝子組換えカイコを簡便にかつ高確率で得ることができる。
次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとの雄雌を交配させ、卵を得る。得られる卵を蛍光顕微鏡または PCR 法等との検出により、染色体に第一遺伝子と第二遺伝子とのいずれをも含む卵を選別する。その卵を孵化させ、生育させることにより、本発明の遺伝子組換えカイコを得ることができる。
こうして得られた組換えカイコの子孫は、その染色体上に目的遺伝子を安定に保持することが可能である。
In this way, the first gene recombination in which the first gene was integrated into the silkworm chromosome by injecting into a silkworm egg simultaneously with a helper plasmid having a gene encoding a transposase using a vector for introducing a foreign gene. A silkworm and a second transgenic silkworm in which the second gene is integrated into the silkworm chromosome can be produced.
These transgenic silkworms are blanched under normal conditions, and hatched larvae are reared to 5 years old to obtain adults (G0 generation). The resulting G0 adult male and female are mated to obtain eggs. When the first gene or the second gene having a fluorescent protein having 3xP3 promoter or actin promoter upstream as a marker is used, those eggs having fluorescence are selected. At this time, when green fluorescent protein, blue fluorescent protein, red fluorescent protein, and yellow fluorescent protein are used as markers, those having green fluorescent, blue fluorescent, red fluorescent, and yellow fluorescent can be selected at the egg stage. . By hatching and growing the selected eggs, the desired first or second transgenic silkworm can be obtained easily and with high probability.
Next, males and females of the first transgenic silkworm and the second transgenic silkworm are mated to obtain an egg. The obtained egg is detected by a fluorescence microscope or a PCR method, and an egg containing both the first gene and the second gene in the chromosome is selected. The genetically modified silkworm of the present invention can be obtained by hatching and growing the eggs.
Recombinant silkworm progeny obtained in this way can stably retain the target gene on its chromosome.
本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、分子量の大きな蛋白質、すなわち、外来酵素蛋白質を発現させ、しかも、毒性があると考えられるＧＡＬ４／ＵＡＳ系システムを持つにもかかわらず、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能であり、しかも、子孫のカイコは、外来酵素蛋白質を発現させることが可能である。さらに、絹糸線からは、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を製造することができる。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明の遺伝子組換えカイコは、こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であり、また、大量に増やすことが可能である。
The transgenic silkworm obtained by the present invention expresses a protein having a large molecular weight, that is, a foreign enzyme protein, and has the GAL4 / UAS system system that is considered to be toxic, but is similar to a normal silkworm. In this way, the subculture can be maintained, and the offspring silkworm can express the foreign enzyme protein. Furthermore, a foreign enzyme protein having enzyme activity can be produced from the silk wire.
For example, eggs can be blanched under normal conditions, hatched ant moths are swept into artificial feed, etc., and reared under the same conditions as normal silkworms, so that they can be reared up to 5-year-old silkworms.
The transgenic silkworm obtained in the present invention hatches in the same manner as a normal silkworm. Males and females are discriminated at the stage of pupae, and after they have been bred, males and females are mated and eggs collected the next day. Eggs can be stored in the same way as normal silkworm eggs. The transgenic silkworm of the present invention can be passaged by repeating such breeding and can be increased in large quantities.
上記したように、本発明で用いられる遺伝子組換えカイコとは、外来酵素蛋白質遺伝子がカイコ染色体に導入されたカイコのことであり、そのカイコ染色体 DNA を常法に従って制限酵素処理したのち、常法に従って標識した外来酵素蛋白質遺伝子をプローブとしてサザンブロッティングを行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのことである。外来酵素蛋白質遺伝子が導入される染色体上の遺伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部位であれば特に制限はない。 As described above, the transgenic silkworm used in the present invention is a silkworm in which an exogenous enzyme protein gene has been introduced into the silkworm chromosome. After the silkworm chromosome DNA is treated with a restriction enzyme according to a conventional method, the conventional method is used. This is a silkworm that gives a positive signal when Southern blotting is performed using a foreign enzyme protein gene labeled according to the above as a probe. The locus on the chromosome where the foreign enzyme protein gene is introduced is not particularly limited as long as it does not inhibit the development, differentiation, and growth of silkworms.
このようにして得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸より、適当な、分離、抽出、精製の操作によって、外来酵素蛋白質を得ることができる。本発明においては、外来酵素蛋白質を酵素活性があるように製造するためには、遺伝子組換えカイコの絹糸腺から取り出すことが好ましい。
絹糸腺または絹糸からの外来酵素蛋白質を抽出する場合の 分解用バッファーについては特に制限はないが、外来酵素蛋白質の機能を有した状態で回収するためには、その外来酵素蛋白質の Km の至適 pH 付近が望ましい。さらに、プロテアーゼ認識ペプチドまたは精製ペプチド部位を付与した融合蛋白質として目的とする外来酵素蛋白質を発現させる場合、スロンビンなどの設計したプロテアーゼで処理した後、用いた精製部位に応じてキレート担体、グルタチオンセファロース、プロテイン G などの各種アフィニティー担体に担持させ、精製、濃縮させる事ができる。
A foreign enzyme protein can be obtained from the silk gland or silk thread of the transgenic silkworm thus obtained by appropriate separation, extraction and purification operations. In the present invention, in order to produce a foreign enzyme protein having enzyme activity, it is preferable to remove it from the silk gland of the transgenic silkworm.
There are no particular restrictions on the degradation buffer used to extract the foreign enzyme protein from the silk gland or silk thread, but in order to recover the foreign enzyme protein in a functional state, the Km of the foreign enzyme protein is optimal. Near pH is desirable. Furthermore, when expressing a target foreign enzyme protein as a fusion protein to which a protease recognition peptide or a purified peptide site is added, after treatment with a designed protease such as thrombin, a chelating carrier, glutathione sepharose, It can be supported on various affinity carriers such as protein G, and purified and concentrated.
絹糸腺または繭糸からの外来酵素蛋白質の抽出に使用する溶媒については特に制限はないが、外来酵素蛋白質を活性を保持した状態で回収するためには水溶媒系が好ましい。抽出に使用する水溶液は、外来酵素蛋白質の抽出を促進させるために適切な溶質を含むことが可能である。例えば、リン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸や、食塩、尿素、塩酸グアニジン、塩化カルシウムなどの塩類、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなどの極性有機溶媒などが挙げられる。また、抽出溶液の pH も特に限定はなく、目的とする外来酵素蛋白質を失活させない pH であれば、任意の pH を用いることができる。 There is no particular limitation on the solvent used for the extraction of the foreign enzyme protein from the silk gland or silk thread, but an aqueous solvent system is preferred in order to recover the foreign enzyme protein while maintaining its activity. The aqueous solution used for extraction can contain an appropriate solute to facilitate the extraction of the foreign enzyme protein. Examples include inorganic acids such as phosphoric acid, organic acids such as acetic acid, citric acid and malic acid, salts such as sodium chloride, urea, guanidine hydrochloride and calcium chloride, and polar organic solvents such as ethanol, methanol, acetonitrile and acetone. It is done. Further, the pH of the extraction solution is not particularly limited, and any pH can be used as long as it does not inactivate the target foreign enzyme protein.
抽出された外来酵素蛋白質を単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えば、目的とする外来酵素蛋白質が本来有する活性を指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体、抗体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離することができる。
例えば、ヘキソキナーゼは、ヘキソキナーゼ遺伝子を導入したカイコから絹糸腺を 20mM トリスバッファー（pH 7.4）中に摘出し、ホモジナイズによって得られる可溶性画分に回収することができる。さらに、得られた抽出液を、例えば HisTrap カラムに吸着させ、洗浄後、イミダゾールを含む緩衝液で溶出することにより、ヘキソキナーゼの純度を上げることができる。
このように製造されたヘキソキナーゼ等の酵素蛋白質は、従来の他の製造方法で製造された酵素蛋白質と同様に、医薬用途や各種の測定、診断用途に用いることができる。
There is no particular limitation on the method for isolating and purifying the extracted foreign enzyme protein, and a normal protein purification method can be used. For example, while using the activity inherent in the target foreign enzyme protein as an indicator, chromatography using silica gel carrier, ion exchange carrier, gel filtration carrier, chelating carrier, dye carrier, antibody, etc., ultrafiltration, It can be purified and isolated by a combination of desalting and concentration by gel filtration, dialysis, salting out, and the like.
For example, hexokinase can be recovered in a soluble fraction obtained by homogenization by extracting a silk gland from a silkworm into which a hexokinase gene has been introduced into a 20 mM Tris buffer (pH 7.4). Furthermore, the purity of hexokinase can be increased by adsorbing the obtained extract on, for example, a HisTrap column, washing and then eluting with a buffer containing imidazole.
Enzyme proteins such as hexokinase produced in this way can be used for pharmaceutical uses, various measurements, and diagnostic uses in the same manner as enzyme proteins produced by other conventional production methods.
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
本発明の遺伝子組換えカイコの繭からヘキソキナーゼを融合蛋白質として製造
実施例１は、本発明の遺伝子組換えカイコを製造しそのカイコの繭からヘキソキナーゼを融合蛋白質として製造する例である。すなわち、この例は、第一の遺伝子組換えカイコ（第一遺伝子、すなわち、3xP3-CFP/pBacFiL-GAL4の遺伝子を有する）と第二の遺伝子組換えカイコ（第二遺伝子、すなわち、pBac3xP-3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40の遺伝子を有する）との雌雄を交配させ、第一遺伝子および第二遺伝子を有する遺伝子組換えカイコを製造し、そのカイコの繭からヘキソキナーゼを含む融合蛋白質を生産させた例である。
１）第一遺伝子を含む第一の遺伝子組換えカイコの調製
第一の遺伝子組換えカイコとして、pBacFiL-GAL4/3xP3-CFP 遺伝子組み換えカイコを、Genetics 165: 1329-1340 に記載された方法に従って調製した。この組換えカイコは、フィブロイン L 鎖プロモーターの下流に結合された GAL4 遺伝子と、視神経発現プロモーターである 3xP3 および青色蛍光蛋白質 CFP 遺伝子とを含む第一遺伝子を、piggyBac 由来の TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列の間に挿入した外来遺伝子導入用ベクターとヘルパープラスミドと併用して染色体に挿入して製造したカイコである。
EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Example 1 Production of Hexokinase from the Recombinant Silkworm Spider of the Present Invention as a Fusion Protein Example 1 is an example in which the recombinant silkworm of the present invention is produced and hexokinase is produced from the silkworm spider as a fusion protein. That is, this example shows that the first transgenic silkworm (having the first gene, ie, 3xP3-CFP / pBacFiL-GAL4 gene) and the second transgenic silkworm (second gene, ie pBac3xP-3GFP) / UAS-FibL-THR-HXK-SV40) and a male and female are mated to produce a transgenic silkworm having a first gene and a second gene, and a fusion protein containing hexokinase is produced from the silkworm cocoon. This is an example of production.
1) Preparation of the first transgenic silkworm containing the first gene As the first transgenic silkworm, pBacFiL-GAL4 / 3xP3-CFP transgenic silkworm is prepared according to the method described in Genetics 165: 1329-1340 did. This recombinant silkworm is composed of a GAL4 gene linked downstream of the fibroin L chain promoter, a first gene containing 3xP3 optic nerve expression promoter and a blue fluorescent protein CFP gene, and a pair of piggyBac-derived TTAA sequences. It is a silkworm produced by inserting into a chromosome using a vector for introducing a foreign gene and a helper plasmid inserted between the terminal inverted sequences.
２）第二の遺伝子を含む遺伝子組換えカイコの調製
(i) ヘキソキナーゼ（HXK）遺伝子
HXK 遺伝子は HXK1（GeneBank 登録番号 M14410 の 718 番目〜2175 番目）の配列から配列番号１及び配列番号２に示すプライマーを設計し、Genomic ・PS Library, Yeast S. cervisiae（フナコシ社）を Template としたＰＣＲを行った後、T7Blue（タカラバイオ社）を用い TA クローニング法にて獲得した。このプライマーの端側には後の遺伝子構築のために 5’末端プライマーに Bgl II、3’末端プライマーにBamH I を付加した。
ここで、HXK1 の Open Reading Frame 内部にシークエンス反応用のプライマーを設計し、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer によってシークエンスを行った。ここでクローニングされた HXK 遺伝子の配列は配列番号３に示す。シーケンスされた配列をアミノ酸配列に置換し、NCBIのBlast検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Protein-protein blast）にかけたところ、Hexokinase isoenzyme 1（GeneBand 登録番号NP_116711）と99.4％の相同性を有し、また、hexokinase (HXK1) （GeneBand 登録番号AAA34698）と98.6％の相同性のあるクローンである事が確かめられた。
2) Preparation of transgenic silkworm containing the second gene
(i) Hexokinase (HXK) gene
The HXK gene was designed with the primers shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 from the sequence of HXK1 (GeneBank accession number M14410: 718th to 2175th), and Genomic • PS Library, Yeast S. cervisiae (Funakoshi) was used as the template. After performing PCR, it was obtained by TA cloning using T7Blue (Takara Bio). At the end of this primer, Bgl II was added to the 5 ′ end primer and BamH I was added to the 3 ′ end primer for the subsequent gene construction.
Here, primers for sequencing reaction were designed inside the Open Reading Frame of HXK1, and sequenced by ABI PRISM ™ 310 Genetic Analyzer. The sequence of the HXK gene cloned here is shown in SEQ ID NO: 3. Substitution of sequenced sequence with amino acid sequence and NCBI Blast search ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Protein-protein blast) gave Hexokinase isoenzyme 1 (GeneBand accession number NP_116711) And 99.4% homology, and 98.6% homologous clone with hexakinase (HXK1) (GeneBand accession number AAA34698).
(ii) フィブロイン L 鎖（FibL）遺伝子
フィブロイン L 鎖遺伝子 (GeneBank 登録番号 X17291 の 28 番目-767 番号目 : J. Mol. Biol., 210, 127-139, 1989) は、pBac (3xP3-DsRed2 + L-chain promoter/normal L-chain cDNA) (Eur. J. Biochem., 271,356-366 2003) からPst I部位とBamH I 部位を切り出して、pBluescriptII KS(-)のPst I 部位と BamH I部位にクローニングした。さらに後の遺伝子構築の目的で pBluescriptII SK(-)を EcoR I で消化し、配列番号４に示す合成 DNA を挿入する事により Xba I サイトを作った。
(ii) Fibroin light chain (FibL) gene Fibroin light chain gene (GeneBank accession number X17291, number 28-767: J. Mol. Biol., 210, 127-139, 1989) is pBac (3xP3-DsRed2 + The Pst I and BamH I sites were excised from (L-chain promoter / normal L-chain cDNA) (Eur. J. Biochem., 271,356-366 2003) and put into the Pst I and BamHI sites of pBluescriptII KS (-). Cloned. Further, for the purpose of gene construction later, pBluescriptII SK (-) was digested with EcoR I, and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 4 was inserted to create an Xba I site.
(iii) FibL-THR-HXK 遺伝子
精製部位（以下 THR と記す）は、発現した蛋白質が精製できる様、フィブロイン L 鎖遺伝子と HXK 遺伝子の間に、プロテアーゼであるスロンビン認識配列（Leu Val Pro Arg Gly Ser）と、キレートと相互作用する His タグである 6 個のヒスチジン残基(（His）６)、そしてさらにプロテアーゼである PreScission 認識配列（Lwu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro）の順に設計した。
上記の如く設計した THR は、配列番号５の オリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチドを合成し、KODplus（東洋紡（株）製）及び、Zero Blunt TOPO PCR クローニングキット(インビトロジェン（株）製)を用いて下記の手順で調製した。すなわち、KODplus に添付の 10×PCR バッファーを 5μl、150μM の配列番号５のオリゴヌクレオチド 、150μM の配列番号６のオリゴヌクレオチド、１mM MgSO４、0.2mM dNTPs、２単位 KODplus となるように各試薬を加え、全量 50μl とし、Perkin-Elmer 社 の DNA サーマルサイクラーにて 94℃ 2 min 1 回、94℃ 15sec から 68℃ 30 sec のサイクルを15 回、68℃ 7min 1 回の伸長反応を行った。次いでこの反応産物を Zero Blunt TOPO PCR クローニングキットの添付文書に従い、サブクローニングした。
(iii) The FibL-THR-HXK gene purification site (hereinafter referred to as THR) is located between the fibroin L chain gene and the HXK gene so that the expressed protein can be purified, the protease thrombin recognition sequence (Leu Val Pro Arg Gly Ser), six histidine residues ((His) 6 ) that are His tags that interact with the chelate, and a PreScission recognition sequence (Lwu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro) that is a protease.
The THR designed as described above synthesizes the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 and uses KODplus (Toyobo Co., Ltd.) and Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen Co., Ltd.). Was prepared by the following procedure. That is, 5 μl of 10 × PCR buffer attached to KODplus, 150 μM of SEQ ID NO: 5 oligonucleotide, 150 μM of SEQ ID NO: 6 oligonucleotide, 1 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTPs, and 2 units KODplus were added to each reagent. The total volume was 50 μl, and the extension reaction was performed once at 94 ° C. for 2 min, 94 ° C. for 15 min to 68 ° C. for 30 sec and 68 ° C. for 7 min once with a Perkin-Elmer DNA thermal cycler. The reaction product was then subcloned according to the package insert of the Zero Blunt TOPO PCR cloning kit.
(iv) pBII-FibL-THR-HXK の構築
Zero Blunt TOPO クローニングキットにサブクローニングした精製部位（THR）を制限酵素 Bgl II とBamH I で切り出し、前出の pBluescriptII KS(-)にクローニングされたフィブロイン L 鎖遺伝子の下流に挿入した。次いで TA クローニングで得たヘキソキナーゼ遺伝子を Bgl II と BamH I で切り出し、精製部位（THR）の下流に結合させ、図１に示される pBII-FibL-THR-HXK を構築した。
(iv) Construction of pBII-FibL-THR-HXK
The purified site (THR) subcloned in the Zero Blunt TOPO cloning kit was excised with restriction enzymes Bgl II and BamH I and inserted downstream of the fibroin L chain gene cloned in the above pBluescriptII KS (-). Next, the hexokinase gene obtained by TA cloning was excised with Bgl II and BamH I and ligated downstream of the purification site (THR) to construct pBII-FibL-THR-HXK shown in FIG.
(v) pBII UAS/SV40の構築
図２に示す pBII UAS/SV40 は次のようにして構築した。BacUAS-GFP (Genetics., 165,1329-1340 2003)を鋳型にし、PCR にて UAS-GFP-SV40term を含む領域を増幅させ、Zero Blunt TOPO クローニングキットにサブクローニングした。次いで、得られた UAS-GFP-SV40term領域 を pBluescriptII SK(-)のマルチクローニングサイトに挿入し、制限酵素 Bln I サイトを含む配列番号７およびおよび配列番号８のオリゴヌクレオチドをプライマーとした Inverse PCR を行い pBII UAS/SV40 を作製した。
(vi) pBII-UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の構築
pBII UAS/SV40を、制限酵素 Bln I で、また、pBII-FibL-THR-HXK を制限酵素Xba I で消化し、FibL-THR-HXK フラグメントをpBII-UAS/SV40 に挿入したし、図３に示される pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を構築した。このプラスミドをシークエンスすることにより、得られたプラスミドの塩基配列がUAS-FibL-THR-HXK-SV40 の順であることを確認した。
(v) Construction of pBII UAS / SV40 pBII UAS / SV40 shown in Fig. 2 was constructed as follows. Using BacUAS-GFP (Genetics., 165,1329-1340 2003) as a template, the region containing UAS-GFP-SV40term was amplified by PCR and subcloned into the Zero Blunt TOPO cloning kit. Next, the obtained UAS-GFP-SV40term region was inserted into the multiple cloning site of pBluescriptII SK (-), and Inverse PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 including the restriction enzyme Bln I site as primers. PBII UAS / SV40 was prepared.
(vi) Construction of pBII-UAS-FibL-THR-HXK-SV40
pBII UAS / SV40 was digested with restriction enzyme Bln I and pBII-FibL-THR-HXK was digested with restriction enzyme Xba I, and the FibL-THR-HXK fragment was inserted into pBII-UAS / SV40. The indicated pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 was constructed. By sequencing this plasmid, it was confirmed that the base sequence of the obtained plasmid was UAS-FibL-THR-HXK-SV40.
(vii) 第二遺伝子pBac3xP3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を含む遺伝子導入用プラスミド
の作製
遺伝子導入用プラスミドは、pBac [3xP3-EGFPafm] ベクター（Dev. Genes Evol.210,630-637,2000) の SV40 由来ポリ A 付加配列の下流にある EcoR I 部位に配列番号９のオリゴヌクレオチドを挿入し Nhe I 部位を付与した。
導入する遺伝子は pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を Spe I で消化し、pBac[3xP3-EGFPafm]ベクターの Nhe I 部位に挿入し、図４に示される様に遺伝子（pBac3xP3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40）を含む遺伝子導入用プラスミドを得た。
(vii) Plasmid for gene transfer containing the second gene pBac3xP3GFP / UAS-FibL-THR-HXK-SV40
As the plasmid for gene introduction, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 9 was inserted into the EcoR I site downstream of the poly-A addition sequence derived from SV40 of the pBac [3xP3-EGFPafm] vector (Dev. Genes Evol. 210, 630-637, 2000). Nhe I site was added.
The gene to be introduced was digested with pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 with Spe I, inserted into the Nhe I site of the pBac [3xP3-EGFPafm] vector, and the gene (pBac3xP3GFP / UAS-FibL) as shown in FIG. A plasmid for gene transfer containing -THR-HXK-SV40) was obtained.
(viii) 第二の遺伝子組換えカイコの作製
第二遺伝子を含む遺伝子導入用プラスミドとヘルパープラスミド pHA3PIG（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）をそれぞれ 200ng/ml の濃度で 0.5mM リン酸バッファー（pH7.0）、5mM KCl 中で調整し、15〜20nl を産卵後 4 時間以内のカイコ卵に対してマイクロインジェクションした。そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫（G0）を群内で掛け合わせ得られた次世代（G1）の卵を緑色蛍光タンパク質の蛍光観察から選択し、それを生育させることにより、HXK 遺伝子が染色体に導入されたカイコをスクリーニングした。カイコ卵へのインジェクションは 2 回実施し、合計 1434 個のカイコ卵に遺伝子をインジェクションし合計 7 蛾区から、第二の遺伝子組換えカイコが得られた。
(viii) Production of a second transgenic silkworm A plasmid for gene introduction containing the second gene and a helper plasmid pHA3PIG (Nature Biotechnology 18 , 81-84, 2000) at a concentration of 200 ng / ml in 0.5 mM phosphate buffer ( pH 7.0), adjusted in 5 mM KCl, 15-20 nl was microinjected into silkworm eggs within 4 hours after egg laying. Breeding larvae hatched from the silkworm eggs, selecting the next generation (G1) eggs obtained by crossing the resulting adults (G0) within the group from fluorescence observation of green fluorescent protein, and growing them Thus, silkworms in which the HXK gene was introduced into the chromosome were screened. The silkworm eggs were injected twice, and a total of 1434 silkworm eggs were injected with the gene, and a second transgenic silkworm was obtained from a total of 7 cocoons.
３）本発明の遺伝子組換えカイコの製造
図５に示すようにして、上記２）で得られた第二の遺伝子組換えカイコと上記１）で得られた第一の遺伝子組換えカイコとの雄雌を交配させ、卵を得た。得られる卵の PCR 法による検出で、染色体に第一遺伝子と第二遺伝子とのいずれを含む卵を選別した。その卵を孵化させ、生育させることにより、本発明の UAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の遺伝子組換えカイコを得た。
3) Production of the transgenic silkworm of the present invention As shown in FIG. 5, the second transgenic silkworm obtained in 2) above and the first recombinant silkworm obtained in 1) above. Males and females were mated to obtain eggs. By detecting the resulting egg by PCR, eggs containing either the first gene or the second gene in the chromosome were selected. The eggs were hatched and grown to obtain transgenic silkworms of the UAS-FibL-THR-HXK / FiL-GAL4 hybrid line of the present invention.
４）本発明の遺伝子組換えカイコの繭からのヘキソキナーゼの製造
本発明の遺伝子組換えカイコに繭を生産させ、その繭を可溶化し、ヘキソキナーゼが製造していることをイムノブロッティングにより確認した。まず、本発明の遺伝子組換えカイコが生産した繭を 60% チオシアン酸リチウムで 10mg/ml となるよう室温で可溶化した。次いで、得られる可溶化したものを、5M 尿素、20mM Tris-HCl(pH8.0) に透析し、さらに 4.5M 尿素 20mM Tris-HCl (pH8.0) に透析した。透析物を 12000rpm 20min 室温で遠心し、得られた上清に 12% メルカプトエタノールを含む SDS-PAGE サンプルバッファー (3 X) を加え 10-20% アクリルアミドグラジエントゲルにて SDS-PAGE を行った。SDS-PAGE 終了後、PVDF 膜(ミリポア社製) に 0.8mA/cm２ 1 時間の条件で繭可溶化蛋白質を転写した。転写後の PVDF 膜をブロックエース（大日本製薬社製）でプロッキングし、ウサギ抗フィブロインL 鎖抗血清 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 275: 40517-40528) を用いて１次抗体反応をさせ、次いで抗ウサギ Ig-HRP 標識抗体（アマシャムバイオサイエンス社）で２次抗体反応を行い、POD イムノステインセット（和光純薬工業社）で検出することにより、フィブロイン L 鎖と HXK が融合している蛋白質が得られることを確認した。
4) Production of hexokinase from recombinant silkworm cocoons of the present invention The recombinant silkworm of the present invention produced cocoons, solubilized the cocoons, and confirmed that hexokinase was produced by immunoblotting. First, koji produced by the transgenic silkworm of the present invention was solubilized with 60% lithium thiocyanate at room temperature so as to be 10 mg / ml. Subsequently, the solubilized product obtained was dialyzed against 5M urea, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), and further dialyzed against 4.5 M urea, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0). The dialyzed material was centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes at room temperature, SDS-PAGE sample buffer (3 X) containing 12% mercaptoethanol was added to the resulting supernatant, and SDS-PAGE was performed on a 10-20% acrylamide gradient gel. After SDS-PAGE was finished, to transfer the cocoon solubilized protein in the conditions of 0.8 mA / cm 2 1 hour to a PVDF membrane (Millipore). The PVDF membrane after transcription is blocked with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and the primary antibody reaction is performed using rabbit anti-fibroin light chain antiserum (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 275: 40517-40528). By performing a secondary antibody reaction with an anti-rabbit Ig-HRP labeled antibody (Amersham Biosciences) and detecting with a POD immunostain set (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a protein in which fibroin light chain and HXK are fused can be obtained. It was confirmed that it was obtained.
繭可溶化蛋白質のイムノブロッティング結果を図６に示す。図中レーン１は分子量マーカーであり、レーン２から４はネガティブコントロールである。レーン２はカイコ卵に遺伝子をインジェクションしていない系統、レーン３は UAS-FibL-THR-HXK-SV40 遺伝子組み換えカイコ系統、レーン４はFiL−GAL４ 系統に対応し、それぞれの繭可溶化蛋白質を試料としたものである。またレーン５と６はUAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の繭を可溶化した試料をイムノブロッティングしたものであり、フィブロイン L 鎖と精製部位とヘキソキナーゼの和に相当する分子量（７５Kda）にバンドが確認された。よって、UAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の繭中にヘキソキナーゼが分泌されている事が分かった。 FIG. 6 shows the result of immunoblotting of the solubilized protein. In the figure, lane 1 is a molecular weight marker, and lanes 2 to 4 are negative controls. Lane 2 corresponds to the line in which the gene is not injected into silkworm eggs, lane 3 corresponds to the UAS-FibL-THR-HXK-SV40 transgenic silkworm line, and lane 4 corresponds to the FiL-GAL4 line. It is what. Lanes 5 and 6 are immunoblotted samples of the solubilized sputum of the UAS-FibL-THR-HXK / FiL-GAL4 hybrid line. ) Confirmed the band. Therefore, it was found that hexokinase is secreted into the sputum of the UAS-FibL-THR-HXK / FiL-GAL4 hybrid strain.
実施例２
本発明の遺伝子組換えカイコの絹糸腺から酵素活性を有する組換えヘキソキナーゼの製
造
実施例２は、本発明の遺伝子組換えカイコを調製しそのカイコの絹糸腺から酵素活性を有するヘキソキナーゼを製造した例である。すなわち、この例は、第一の遺伝子組換えカイコ（第一遺伝子、すなわち、3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4 の遺伝子を有する）と第二の遺伝子組換えカイコ（第二遺伝子、すなわち、3xP3Pro-GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の遺伝子を有する）との雌雄を交配させ、第一遺伝子および第二遺伝子を有する遺伝子組換えカイコを製造し、そのカイコの絹糸腺から酵素活性を有するヘキソキナーゼを生産した例である。本実施例では、ヘキソキナーゼが絹糸腺から繭に移らず絹糸腺内に残るようにするため、本発明の遺伝子組換えカイコを、繭ができにくいように設計した。すなわち、第一の遺伝子組換えカイコとして、第一遺伝子を有するカイコとＮｄ−ｓＤ カイコ（正常に絹蛋白質を製造できない突然変異カイコ）とを交配させて得られるカイコ、すなわち、Ｎｄ−ｓＤ 系の第一の遺伝子組換えカイコを用いた。
すなわち、本実施例ではフィブロイン L 鎖の遺伝子とこの遺伝子が欠失を起こしているため、正常に絹タンパク質を合成できない突然変異系統Ｎｄ−ｓＤ （Mori K, Tanaka K,Kikuchi Y, Waga M, Waga S, Mizuno S.(1995) J Mol Biol. 251(2):217-28）を利用した。なお、この突然変異系統は独立法人農業生物資源研究所で保存・維持され、一般に提供されている。
Example 2
Production of recombinant hexokinase having enzyme activity from the silk gland of the transgenic silkworm of the present invention
Construction Example 2 is an example in which a genetically modified silkworm of the present invention was prepared and hexokinase having enzyme activity was produced from the silk gland of the silkworm. That is, this example shows that the first transgenic silkworm (having the first gene, ie 3xP3Pro-DsRed / SerPro-GAL4 gene) and the second transgenic silkworm (second gene, ie 3xP3Pro-GFP) / UAS-FibL-THR-HXK-SV40) and a male and female are mated to produce a transgenic silkworm having a first gene and a second gene, and hexokinase having enzyme activity from the silk gland of the silkworm Is an example of production. In this example, the genetically engineered silkworm of the present invention was designed so that it is difficult to cause wrinkles so that hexokinase remains in the silk gland without moving from the silk gland to the cocoon. That is, as a first transgenic silkworm, a silkworm obtained by crossing a silkworm having the first gene and an Nd-s D silkworm (mutant silkworm that cannot normally produce a silk protein), that is, Nd-s D The first transgenic silkworm of the system was used.
That is, in this example, a fibroin L chain gene and a mutant strain Nd-s D (Mori K, Tanaka K, Kikuchi Y, Waga M, Waga S, Mizuno S. (1995) J Mol Biol. 251 (2): 217-28). This mutant strain is conserved and maintained by the National Institute of Agrobiological Sciences and is generally provided.
１) 第一遺伝子（3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4）を含む遺伝子組換えカイコの調製
第一遺伝子を含む組換えカイコとして、3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4 遺伝子組換えカイコを、田村俊樹・内野恵郎・神田俊男・小林 功・小島 桂（2004）酵母のGAL4/UAS系を利用した中部絹糸腺特異的遺伝子発現系の作出．日蚕講要74,p51. に記載された方法に従って調製した。
この組換えカイコは、セリシンプロモーター（SerPro）の下流に結合された GAL4 遺伝子と、視神経発現プロモーターである 3xP3 および赤色蛍光蛋白質 DsRed 遺伝子とを含む第一遺伝子を、piggyBac 由来の TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列の間に挿入した外来遺伝子導入用ベクターとヘルパープラスミドと併用して染色体に挿入して製造したカイコである。
1) Preparation of transgenic silkworm containing the first gene (3xP3Pro-DsRed / SerPro-GAL4) As a recombinant silkworm containing the first gene, 3xP3Pro-DsRed / SerPro-GAL4 transgenic silkworm, Toshiki Tamura and Megumi Uchino Buro, Toshio Kanda, Isao Kobayashi, Katsura Kojima (2004) Creation of a gene expression system specific to the middle silk gland using the GAL4 / UAS system of yeast. It was prepared according to the method described in Nippon Steel Course 74, p51.
This recombinant silkworm has a first gene containing GAL4 gene linked downstream of sericin promoter (SerPro), optic nerve expression promoter 3xP3 and red fluorescent protein DsRed gene, and a pair of piggyBac-derived TTAA sequences. A silkworm produced by inserting into a chromosome using a vector for introducing a foreign gene and a helper plasmid inserted between the terminal inversion sequences.
２）Ｎｄ−ｓ Ｄ 系の第一の遺伝子組換えカイコの製造
上記１)の第一の遺伝子（3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4）を含む遺伝子組換えカイコと突然変異系のＮｄ−ｓＤ のカイコ（独立法人農業生物資源研究所から入手）との雌雄を交配し卵を得て、次いで、その卵を孵化・生育させ、さらに、目が赤色蛍光を示すカイコを選択してＮｄ−ｓＤ 系の第一の遺伝子組換えカイコを得た。
2) Nd-s D system first transgenic silkworms of the first manufacturing the above 1) gene (3xP3Pro-DsRed / SerPro-GAL4 ) transgenic silkworm and mutation system comprising of Nd-s D Males and females with silkworms (obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences) are mated to obtain eggs, then the eggs are hatched and grown, and silkworms whose eyes show red fluorescence are selected and Nd-s D The first transgenic silkworm of the system was obtained.
３）Ｎｄ−ｓ Ｄ 系の本発明の遺伝子組換えカイコの製造
上記２）で得られたＮｄ−ｓＤ 系の第一の遺伝子組換えカイコと、実施例１２）で得られた第二の遺伝子組換えカイコとの雌雄を交配させ、卵を得た。その卵を孵化・生育させ、得られるカイコの眼を実体蛍光顕微鏡で観察し、目が赤色蛍光と緑色蛍光を示すものを選択することにより、本発明の UAS-FibL-THR-HXK/Ser-GAL4 交雑系統でかつＮｄ−ｓＤ 系統の本発明の遺伝子組換えカイコを得た。
3) Production of Nd-s D system transgenic silkworm of the present invention Nd-s D system first transgenic silkworm obtained in 2) above and second example obtained in Example 12) Males and females with transgenic silkworms were mated to obtain eggs. The eggs are hatched and grown, and the resulting silkworm eyes are observed with a stereofluorescence microscope, and by selecting those that show red fluorescence and green fluorescence, the UAS-FibL-THR-HXK / Ser- of the present invention is selected. GAL4 and a hybrid strain was obtained transgenic silkworms of the present invention the Nd-s D line.
４）ヘキソキナーゼの酵素活性の評価
下記５）で得られる組換えヘキソキナーゼに酵素活性があるかどうかは、以下の方法により実施した。
第一試薬として、1ml中、グルコース 3.6mg、グルコース−６−リン酸脱水素酵素 1.5 単位、ATP 0.5mg、NADP 0.8mg、ジアホラーゼ 2.5 単位、ニトロテトラゾリウムブルー 1.0μmol を含む水溶液を用いた。第二試薬として 1ml 中 ATP 4.41mg を含む水溶液を用いた。
酵素活性の測定は、まず、サンプル（溶出画分）20μl、第一試薬 80μl、第二試薬 20μl の割合で添加した。これを室温で 3 時間保持した後、プレートリーダーにて 600nm の吸収波長を測定し吸光度の上昇するかどうかを調べた。なお、陰性コントロールには精製水を使用した。
4) Evaluation of enzyme activity of hexokinase Whether or not the recombinant hexokinase obtained in 5) below has enzyme activity was determined by the following method.
As a first reagent, an aqueous solution containing 3.6 mg of glucose, 1.5 units of glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5 mg of ATP, 0.8 mg of NADP, 2.5 units of diaphorase, and 1.0 μmol of nitrotetrazolium blue in 1 ml was used. An aqueous solution containing 4.41 mg of ATP in 1 ml was used as the second reagent.
The enzyme activity was measured by first adding 20 μl of sample (elution fraction), 80 μl of the first reagent, and 20 μl of the second reagent. After holding this at room temperature for 3 hours, the absorption wavelength at 600 nm was measured with a plate reader to examine whether the absorbance increased. Note that purified water was used as a negative control.
５）本発明遺伝子組換えカイコの絹糸腺からの、酵素活性を有するヘキソキナーゼの製造
上記３）で得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺中で、ヘキソキナーゼ融合蛋白質、すなわち、フィブロイン L 鎖配列とスロンビン認識配列と精製ペプチド部位（ヒスチジン残基 6 個の部位）と PreScission プロテアーゼ認識配列とヘキソキナーゼ配列を含む融合蛋白質を発現させた。その融合蛋白質をスロンビンで処理して切断し、組換えヘキソキナーゼ（精製ペプチド部位配列を含む）を得、そのヘキソキナーゼの精製ペプチド部位を利用して、ニッケル結合キレート担体を用い、酵素活性を有する組換えヘキソキナーゼを得た。以下に、これらを詳述する。
上記３）で得た本発明の組換えカイコの 5 令吐糸0日目から 5 令吐糸 1 日目になる合計 9 頭のカイコ中部絹糸腺を摘出し、リン酸緩衝液(0.02M リン酸ナトリウム pH7.4)を組織100μgあたり1mlとなるように添加した。これをガラスホモジナイザー（WHEATON社）でホモジナイズし、可溶性画分を取り分けた。次いで、その可溶性画分にスロンビン（アマシャムバイオサイエンス社）を 500unit 添加し、室温で 2 時間消化させ、さらに 4℃ で 16 時間の消化を行なうことにより組換え融合蛋白質から、フィブロイン L 鎖とプロテアーゼ認識配列を除去した。
5) Production of hexokinase having enzyme activity from the silk gland of the transgenic silkworm of the present invention In the silk gland of the transgenic silkworm obtained in 3) above, a hexokinase fusion protein, that is, fibroin L chain sequence and thrombin A fusion protein containing a recognition sequence and a purified peptide site (6 histidine residue sites), a PreScission protease recognition sequence and a hexokinase sequence was expressed. The fusion protein is cleaved by treating with thrombin to obtain a recombinant hexokinase (including a purified peptide site sequence). Using the purified peptide site of the hexokinase, a recombinant having enzyme activity using a nickel-binding chelate carrier Hexokinase was obtained. These are described in detail below.
A total of nine silkworm silk glands from the 5th instar silkworm to the 1st day of the 5th spit of the recombinant silkworm of the present invention obtained in 3) above were removed and phosphate buffer solution (0.02M phosphorous). Sodium acid pH 7.4) was added to 1 ml per 100 μg of tissue. This was homogenized with a glass homogenizer (WHEATON) to separate the soluble fraction. Next, 500 units of thrombin (Amersham Biosciences) was added to the soluble fraction, digested at room temperature for 2 hours, and further digested at 4 ° C for 16 hours to recognize fibroin L chain and protease from the recombinant fusion protein. The sequence was removed.
図７は、プロテアーゼ消化による組換え融合蛋白質の切断前後の蛋白質の結果を示すイムノブロッティングである。このイムノブロッティングでは、1次抗体としてフィブロインL 鎖に対する抗体を使用しているため、スロンビン消化すると、融合蛋白質のバンド消失が確認された（図７のレーン３）。すなわち、融合蛋白質中、プロテアーゼ認識配列部位と精製部位との結合が切断され組換えヘキソキナーゼ（精製部位配列を含む）を製造していることが支持された。
次いで、HiTrap Chelating HP 1ml（アマシャムバイオサイエンス社）に予め硫酸ニッケルを担体に結合させ、結合バッファー（0.02M リン酸ナトリウム 0.5M NaCl pH7.4）10mlを送液してからスロンビン消化したサンプルをシリンジにて添加した。サンプル添加後に結合バッファーを10ml送液し、素通り画分を回収した。サンプルの溶出は、溶出バッファー（0.02M リン酸ナトリウム 0.5M NaCl 0.5M イミダゾールpH7.4）3mlを送液し、計13画分にして回収精製した。
この画分の酵素活性を、上記４）のヘキソキナーゼの酵素活性による評価方法で評価したところ、精製後の組換えヘキソキナーゼが酵素活性を有している事が明らかとなった（図８）。また、SDS-PAGEの結果は、図８の８番目の画分にクーマシーブルーで染色されるバンドが見られた。このバンドは、精製部位およびPreScissionプロテアーゼ認識配列を含むヘキソキナーゼの分子量にほぼ相当する位置に見られ、精製された組換えヘキソキナーゼが得られたことが判明した（図９）。
FIG. 7 is an immunoblotting showing the protein results before and after cleavage of the recombinant fusion protein by protease digestion. In this immunoblotting, since an antibody against fibroin L chain was used as the primary antibody, the band disappearance of the fusion protein was confirmed upon digestion with thrombin (lane 3 in FIG. 7). That is, it was supported that the recombinant hexokinase (including the purified site sequence) was produced by cleaving the bond between the protease recognition sequence site and the purified site in the fusion protein.
Next, 1 ml of HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences) was previously bound with nickel sulfate to the carrier, 10 ml of binding buffer (0.02 M sodium phosphate 0.5 M NaCl pH 7.4) was fed, and the thrombin-digested sample was syringed. Was added. After the sample was added, 10 ml of the binding buffer was fed, and the flow-through fraction was collected. For elution of the sample, 3 ml of an elution buffer (0.02 M sodium phosphate 0.5 M NaCl 0.5 M imidazole pH 7.4) was fed and recovered and purified in a total of 13 fractions.
When the enzyme activity of this fraction was evaluated by the evaluation method based on the enzyme activity of hexokinase described in 4) above, it was revealed that the purified recombinant hexokinase has enzyme activity (FIG. 8). As a result of SDS-PAGE, a band stained with Coomassie blue was observed in the eighth fraction of FIG. This band was found at a position approximately corresponding to the molecular weight of hexokinase containing the purification site and the PreScission protease recognition sequence, and it was found that purified recombinant hexokinase was obtained (FIG. 9).
以上に詳細に説明したように、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS システムの機能を持つ遺伝子組換えカイコを利用した本発明の製造法により、目的とする高分子量の組換え型外来酵素蛋白質を大量に製造することができる。また、夾雑物を多く含まない絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目的の外来酵素蛋白質の精製が容易であるという利点がある。更には、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しないことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安全に組換え酵素蛋白質の製造を実施することが可能となる。 As described in detail above, the production method of the present invention using a genetically modified silkworm having the function of the GAL4 / UAS system, which is a transcription control system derived from yeast, provides the desired high molecular weight recombinant foreign enzyme. Protein can be produced in large quantities. In addition, since it can be recovered from silk glands or silks that do not contain much impurities, there is an advantage that the target foreign enzyme protein can be easily purified. Furthermore, since no virus such as baculovirus is used, it is not necessary to inactivate the virus, and the recombinant enzyme protein can be easily and safely produced.
Claims (18)
少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群は、
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子とを含む遺伝子群であって、
第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、遺伝子群であり、
融合蛋白質を産生させた後、その絹糸腺または繭糸から融合蛋白質を回収し、回収した融合蛋白質をプロテアーゼで処理して、融合蛋白質から絹糸腺特異的発現蛋白質を除去し、次いで、精製ペプチドに応じたアフイニテイー担体に担持させて、外来酵素蛋白質を精製する、
酵素活性を有する外来酵素蛋白質の製造法。 A transgenic silkworm incorporating a gene group that expresses a foreign enzyme protein having a molecular weight of at least 35,000 in the chromosome was produced, and the foreign enzyme protein was produced in the silk gland or silk thread of the resulting transgenic silkworm Thereafter, a method for producing a foreign enzyme protein having an enzyme activity, characterized in that the foreign enzyme protein is recovered from the silk gland or silk thread ,
A gene group that expresses a foreign enzyme protein having a molecular weight of at least 35,000,
i) a first gene comprising GAL4 or an analog thereof linked downstream of a promoter specifically expressed in the silk gland and including an analog of the analog selected from GAL1, GAL10 and GAL7;
ii) a gene group comprising a silk gland-specific expressed protein gene downstream of the UAS gene and a second gene including a foreign enzyme protein gene linked downstream of the silk gland-specific expressed protein gene. And
In the second gene, the foreign enzyme protein is released from the gene encoding the purified peptide for purifying the produced foreign enzyme protein and the fusion protein of the produced silk gland specific expression protein and the foreign enzyme protein. Including a gene encoding a protease recognition peptide, and a gene encoding a purified peptide and a gene encoding a protease recognition peptide are inserted downstream of the silk gland-specific expression protein gene and upstream of the foreign enzyme protein gene A group of genes,
After producing the fusion protein, the fusion protein is recovered from the silk gland or silk thread, the recovered fusion protein is treated with a protease to remove the silk gland-specific expressed protein from the fusion protein, and then according to the purified peptide To be supported on an affinity carrier to purify foreign enzyme protein,
A method for producing a foreign enzyme protein having enzyme activity .
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質遺伝子とを含む第二遺伝子であって、第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、第二遺伝子とを
染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコ。 A transgenic silkworm,
i) a first gene comprising GAL4 or an analog thereof linked downstream of a promoter specifically expressed in the silk gland and including an analog of the analog selected from GAL1, GAL10 and GAL7;
ii) a foreign protein protein gene having a molecular weight of at least 35,000 linked to the downstream of the silk gland-specific expressed protein gene and linked to the downstream of the UAS gene. A second gene comprising a gene encoding a purified peptide for purifying the produced foreign enzyme protein and a fusion protein of the produced silk gland-specific expressed protein and the foreign enzyme protein. A gene encoding a protease recognition peptide for releasing a foreign enzyme protein, a gene encoding a purified peptide and a gene encoding a protease recognition peptide are downstream of the silk gland-specific expression protein gene and the foreign enzyme protein gene A genetically modified silkworm that has been inserted upstream of the second gene into the chromosome.
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子をカイコの染色体に組み込んだ第一の遺伝子組換えカイコを製造し、
それとは別に、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子であって、第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、第二遺伝子をカイコの染色体に取り込ませて第二の遺伝子組換えカイコを製造し、
ｉｉｉ） 次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させて
製造することを特徴とする遺伝子組換えカイコの製造法。 A method for producing a transgenic silkworm, comprising:
i) GAL4 or its analog bound downstream of a promoter expressed specifically in the silk gland, and the first gene containing the gene of the analog selected from GAL1, GAL10 and GAL7 is integrated into the silkworm chromosome. Producing one transgenic silkworm,
Apart from that,
ii) a silk gland-specific expressed protein gene is linked downstream of the UAS gene, and a foreign enzyme protein gene having a molecular weight of at least 35,000 linked downstream of the silk gland-specific expressed protein gene. A gene encoding a purified peptide for purifying the produced foreign enzyme protein and a fusion protein of the produced silk gland-specific expressed protein and the foreign enzyme protein in the second gene, A gene encoding a protease recognition peptide for releasing a foreign enzyme protein is included. The gene encoding a purified peptide and the gene encoding a protease recognition peptide are downstream of the silk gland-specific expression protein gene and the gene of the foreign enzyme protein gene. upstream it is inserted, a second genetically by incorporating a second gene to silkworm chromosomes It manufactures example silkworm,
iii) Next, a method for producing a transgenic silkworm, wherein the first genetically modified silkworm and a second genetically modified silkworm are crossed and produced.
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