JP4794183B2 - Method for producing carboxyl group-modified ultradispersed diamond, carboxyl group-modified ultradispersed diamond and DNA-fixed ultradispersed diamond - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ドラッグデリバリーシステムに利用可能なカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法及び生体分子固定に用いられるカルボキシル基修飾した超分散ダイヤモンドに関する。 The present invention relates to a method for producing a carboxyl group-modified ultradispersed diamond that can be used in a drug delivery system, and a carboxyl group-modified ultradispersed diamond used for biomolecule immobilization.
ドラッグデリバリーシステムを利用すると、薬物の体内輸送を制御できるので、標的組織以外の組織に薬物が作用することによる副作用の発現を抑制したり、適量の薬物を標的組織内に長く維持させることによって少ない薬量で治療を行ったりすることが可能となる。ドラッグデリバリーシステムの課題の一つに、生体分子及び／又は薬物の運搬体の選定が挙げられる。運搬体材料に対してはサイズ、生体適合性、生体分子及び／又は薬物の固定能等、多くの制約がある。 The drug delivery system can be used to control the transport of drugs in the body, reducing the occurrence of side effects caused by the drug acting on tissues other than the target tissue, and maintaining a suitable amount of drug in the target tissue for a long time. It is possible to treat with a dose. One of the problems with drug delivery systems is the selection of biomolecules and / or drug carriers. There are many constraints on the carrier material such as size, biocompatibility, biomolecule and / or drug immobilization capabilities.
運搬体に好適なサイズを有し、かつ化学的に安定な微粒子として、超分散ダイヤモンドが知られている。超分散ダイヤモンドは生体適合性を有するので、生体分子及び／又は薬物を十分に担持させることができれば、運搬体として利用可能であると考えられる。 Super-dispersed diamond is known as fine particles having a size suitable for a carrier and chemically stable. Since ultra-dispersed diamond has biocompatibility, it can be used as a carrier if it can sufficiently carry biomolecules and / or drugs.
牛澤ら著、「ケミカル フィジクス レターズ」（351号、2002年１月４日、105〜108頁、非特許文献１）は、粒径１〜２μmのダイヤモンド粉末の表面を強酸で酸化することによってカルボキシル修飾し、これを酸塩化物にした後、DNAを固定する方法を記載している。ダイヤモンド粉末を強酸で処理することによって、ダイヤモンド粉末の表面にある生体不適合な官能基を除去できる上、導入されたカルボキシル基にはDNAが結合し得る。しかし、粒径１〜２μmのダイヤモンド粉末やそれにDNAを固定したものは沈降し易く、分散性が低いという問題がある。このためカルボキシル基修飾等の反応が進行し難く、十分な量のDNAを固定できない。また体液等の中でも分散状態になり難く、体内をスムーズに移動できないので、良好な運搬体であるとは言えない。 Ushizawa et al., “Chemical Physics Letters” (No. 351, January 4, 2002, pp. 105-108, Non-Patent Document 1) oxidizes the surface of diamond powder having a particle size of 1 to 2 μm with a strong acid to produce carboxyl. A method is described in which DNA is fixed after modification to acid chloride. By treating the diamond powder with a strong acid, a bioincompatible functional group on the surface of the diamond powder can be removed, and DNA can be bound to the introduced carboxyl group. However, diamond powder having a particle diameter of 1 to 2 μm and those having DNA immobilized thereon are liable to settle and have low dispersibility. For this reason, reactions such as carboxyl group modification are difficult to proceed, and a sufficient amount of DNA cannot be immobilized. Further, it is difficult to be dispersed in body fluids and the like and cannot move smoothly through the body, so it cannot be said to be a good carrier.
従って本発明の目的は、DNA等を固定可能であって、良好な分散性を示す超分散ダイヤモンド及びその製造方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a super-dispersed diamond that can fix DNA and the like and exhibits good dispersibility, and a method for producing the same.
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、ナノサイズの粒径を有する高分散性のダイヤモンドの懸濁液を超遠心分離することによって、高分散性の微粒子を強酸によって酸化可能になり、カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドを得られることを発見し、本発明に想到した。 As a result of diligent research in view of the above object, the present inventor can oxidize highly dispersed fine particles with a strong acid by ultracentrifugating a suspension of highly dispersed diamond having a nano-sized particle size. The present inventors have found that a carboxyl group-modified ultradispersed diamond can be obtained, and have arrived at the present invention.
すなわち、本発明のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法は、(a) 一次粒径の平均が１〜50 nmの超分散ダイヤモンドと強酸を反応させ、もって前記超分散ダイヤモンドを酸化させる工程と、(b) 酸化させた超分散ダイヤモンドに塩基性溶液を加えて中和する工程と、(c) 酸性溶液で洗浄する工程とを有し、各工程の後で溶液から超分散ダイヤモンドを超遠心分離することを特徴とする。 That is, the method for producing a carboxyl group-modified superdispersed diamond of the present invention comprises (a) reacting a superdispersed diamond having an average primary particle size of 1 to 50 nm with a strong acid, thereby oxidizing the superdispersed diamond; (b) a step of neutralizing the oxidized superdispersed diamond by adding a basic solution; and (c) a step of washing with an acidic solution. After each step, the ultradispersed diamond is ultracentrifugated from the solution. It is characterized by doing.
前記超分散ダイヤモンドの懸濁液を超遠心分離することによって得られた前記超分散ダイヤモンドと強酸を反応させるのが好ましい。前記超遠心の回転数は、10000〜100000 rpmとするのが好ましい。 It is preferable to react the super-dispersed diamond obtained by ultracentrifugation of the suspension of the super-dispersed diamond with a strong acid. The number of rotations of the ultracentrifugation is preferably from 10,000 to 10,000 rpm.
前記超分散ダイヤモンドは(a) 表面炭素原子に結合した官能基を有し、(b) 0.5 m3／kg以上の全吸収空間及び(c) 1.50×105m2／kg以上の比表面積を有し、かつ(d) 前記超分散ダイヤモンドの２次粒子の95％以上は粒径30〜1000 nmであるのが好ましい。 The ultradispersed diamond has (a) a functional group bonded to surface carbon atoms, (b) a total absorption space of 0.5 m 3 / kg or more, and (c) a specific surface area of 1.50 × 10 5 m 2 / kg or more. And (d) 95% or more of the secondary particles of the ultradispersed diamond preferably have a particle size of 30 to 1000 nm.
本発明のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドは、本発明の製造方法によって得られるもので、生体分子の固定に用いられることを特徴とする。 The carboxyl group-modified ultradispersed diamond of the present invention is obtained by the production method of the present invention and is characterized by being used for immobilizing biomolecules.
本発明の製造方法により、表面炭素をカルボキシル基によって修飾したナノサイズの超分散ダイヤモンドを得ることができる。カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドは大きな表面電位を有し、優れた分散性を示す上、DNA等の生体分子を効率よく固定できる。カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドにDNAを固定したものも、高分散性であるので、ドラッグデリバリーシステムに好適である。 By the production method of the present invention, nano-sized super-dispersed diamond whose surface carbon is modified with a carboxyl group can be obtained. Carboxyl group-modified ultradispersed diamond has a large surface potential, exhibits excellent dispersibility, and can efficiently fix biomolecules such as DNA. Those in which DNA is immobilized on carboxyl group-modified ultradispersed diamond are also highly dispersible, and are therefore suitable for drug delivery systems.
(1) 原料
原料とする超分散ダイヤモンド（Ultra Dispersed Diamond、以下UDDと言う）は、ナノメートルオーダーの粒径を有するダイヤモンド微粒子の個体が最低限４個、通常数10個〜数100個程度凝集したものである。UDDの一次粒径の平均は１〜50 nmである。粒度分布測定装置（例えばHORIBA LA-550）を使用すると、UDDの（一次）凝集粒径を測定可能である。この方法によって求めたUDDのメジアン径（中央値）は概ね50〜120 nmである。
(1) Raw material The ultra-dispersed diamond (ultra-dispersed diamond, hereinafter referred to as UDD) is a minimum of 4 diamond particles with a particle size of nanometer order, usually several tens to several hundreds. It is a thing. The average primary particle size of UDD is 1-50 nm. Using a particle size distribution measuring device (for example, HORIBA LA-550), it is possible to measure the (primary) agglomerated particle size of UDD. The median diameter (median value) of UDD obtained by this method is approximately 50 to 120 nm.
UDDの２次粒子の数平均粒径（φMn）は概ね150〜650 nmである。UDDのうち95％は30〜1000 nmの範囲に粒径を有するのが好ましく、粒径1000 nm以上のもの及び粒径30 nm以下のものを実質的に含んでいないのが好ましい。UDD２次粒子の粒径は、電気泳動光散乱光度計モデルELS-8000を用いた動的光散乱測定の結果によるものである。電気泳動光散乱法の測定範囲は1.4 nm〜５μmである。この範囲にある粒子は、液中で並進、回転、屈折等のブラウン運動を行っており、その位置、方位、形態を時云刻云生えている。電気泳動光散乱法は、この現象を利用し、媒体中を沈降する粒子の大きさと沈降速度の関係から粒径を測定するものである。具体的には、ブラウン運動をしている粒子にレーザ光を照射すると、粒子によって散乱した光は各粒子の粒径に対応したユラギを示す。光子検出法を用いてこのユラギを観測し、結果を光子相関法（ランダム変動の解析手法の一つ；理化学辞典）を用いて解析することによって、粒径を求めることができる。 The number average particle diameter (φMn) of the secondary particles of UDD is approximately 150 to 650 nm. It is preferable that 95% of UDDs have a particle size in the range of 30 to 100 nm, and it is preferable that substantially no particle having a particle size of 1000 nm or more and 30 nm or less is included. The particle size of UDD secondary particles is based on the results of dynamic light scattering measurement using an electrophoretic light scattering photometer model ELS-8000. The measurement range of the electrophoretic light scattering method is 1.4 nm to 5 μm. Particles in this range perform Brownian motions such as translation, rotation, and refraction in the liquid, and their positions, orientations, and forms always occur. The electrophoretic light scattering method uses this phenomenon to measure the particle size from the relationship between the size of particles that settle in the medium and the sedimentation speed. More specifically, when laser light is irradiated onto particles that are in Brownian motion, the light scattered by the particles exhibits a sag corresponding to the particle size of each particle. The particle size can be obtained by observing this fluctuation using the photon detection method and analyzing the result using the photon correlation method (one of the random fluctuation analysis methods; physics and chemistry dictionary).
UDDは、Cu、Kα線を線源とするＸ線回析スペクトル（XD）において、ブラッグ(Bragg)角（2θ±2°）43.9°に最も強いピークを有し、73.5°、95°に特徴的な強いピークを有するのが好ましい。またブラッグ角17°に強く偏在したハローがあり、26.5°にピークが実質的にないのが好ましい。 UDD has the strongest peak at the Bragg angle (2θ ± 2 °) of 43.9 ° in the X-ray diffraction spectrum (XD) using Cu and Kα rays as the source, and features 73.5 ° and 95 °. It is preferable to have a strong peak. Further, it is preferable that there is a strongly distributed halo at a Bragg angle of 17 ° and there is substantially no peak at 26.5 °.
UDDは多数の欠陥及び空隙を有しており、1.50×105 m2／kg以上の比表面積を有するのが好ましい。またp／ps＝0.995（ここで、pはN2ガスにより充填された孔内部の表面積を表し、psはN2ガスの単層を形成するための窒素ガス分圧を表す）において測定された吸収空間は、0.5 m3／kg以上であるのが好ましい。 UDD has many defects and voids, and preferably has a specific surface area of 1.50 × 10 5 m 2 / kg or more. Also measured at p / p s = 0.995 (where p represents the surface area inside the hole filled with N 2 gas and p s represents the partial pressure of nitrogen gas for forming a single layer of N 2 gas) It is preferable that the absorbed space is 0.5 m 3 / kg or more.
UDDの元素組成比は炭素72〜89.5％、水素0.8〜1.5％、窒素1.5〜2.5％及び酸素10.5〜25.0％であるのが好ましい。UDD表面の炭素には、アルキル基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基等、多くの官能基が結合している。このように表面に多くの官能基を有するUDDは優れた分散性を有しており、大きなpH変化が無ければ、数ヶ月保存してもほとんど沈降しない。 The elemental composition ratio of UDD is preferably 72-89.5% carbon, 0.8-1.5% hydrogen, 1.5-2.5% nitrogen, and 10.5-25.0% oxygen. Many functional groups such as an alkyl group, a carboxyl group, a carbonyl group, a hydroxyl group, a nitro group, and an amino group are bonded to the carbon on the UDD surface. Thus, UDD having many functional groups on the surface has excellent dispersibility, and if there is no large pH change, it hardly precipitates even after storage for several months.
このような粒径及び凝集状態のUDDを得られる限り、原料の製造方法は特に限定されない。ダイヤモンドの合成法としては爆射法、フラックス法、高温高圧法等が知られているが、これらのうち好ましいのは爆射法である。爆射法は爆薬を爆発させる等によって動的な衝撃を加え、グラファイト構造の原料物質をダイヤモンド構造の粒子に直接変換し、顆粒状のダイヤモンドを得る方法である。爆射法によって粗ダイヤモンド（ブレンドダイヤモンド、以下はBDという）を作製し、これに適当な後処理をすることによって、狭い粒径分布で良好な分散状態のUDDを得ることができる。 As long as the UDD having such a particle size and agglomerated state can be obtained, the raw material production method is not particularly limited. As a method for synthesizing diamond, an explosion method, a flux method, a high-temperature and high-pressure method, and the like are known. Of these, the explosion method is preferable. The explosion method is a method in which a dynamic shock is applied by exploding an explosive or the like, and a raw material material having a graphite structure is directly converted into particles having a diamond structure to obtain granular diamond. A rough diamond (blended diamond, hereinafter referred to as BD) is prepared by an explosion method, and an appropriate post-treatment is performed on the rough diamond to obtain a UDD in a well dispersed state with a narrow particle size distribution.
爆射法によって得られるUDDは、3.20×103 kg／m3〜3.40×103 kg／m3の密度を有する。アモルファス炭素の密度は（1.8〜2.1）×103 kg／m3、グラファイト炭素の密度は2.26×103 kg／m3、天然ダイヤモンドの密度は3.51×103 kg／m3であり、静的な圧力印加法（非爆射法）による人工ダイヤモンドの密度は3.47〜3.50であるから、爆射法によって得られたUDDは天然ダイヤモンドや静的圧力法によるダイヤモンドより小さな密度を有するということができる。 The UDD obtained by the explosion method has a density of 3.20 × 10 3 kg / m 3 to 3.40 × 10 3 kg / m 3 . The density of amorphous carbon is (1.8 to 2.1) × 10 3 kg / m 3 , the density of graphite carbon is 2.26 × 10 3 kg / m 3 , the density of natural diamond is 3.51 × 10 3 kg / m 3 , static Because the density of artificial diamond by the non-explosive method is 3.47 to 3.50, it can be said that the UDD obtained by the explosive method has a smaller density than natural diamond or diamond by the static pressure method .
次に、爆射法を例にとって、UDDの製造方法を具体的に説明するが、もちろん本発明の修飾UDDの原料はこの製造方法によって得られたものに限定されない。 Next, the production method of UDD will be described in detail by taking an explosion method as an example, but of course, the raw material of the modified UDD of the present invention is not limited to that obtained by this production method.
(A) 爆射式初期BD製造工程
胴内に電気雷管を装着し、爆薬を収納した片面プラグ付き鋼鉄製パイプを、純チタン製の耐圧容器に入れた水と氷の中に水平に沈める。爆薬の例として、シクロトリメチレントリニトロアミン、シクロテトラメチレンテトラニトラミン、トリニトロトルエン、トリニトロフェニルメチルニトロアミン、四硝酸ペンタエリトリット、テトラニトロメタン及びこれらの混合物が挙げられる。具体的には、TNT(トリニトロトルエン)／HMＸ(シクロテトラメチレンテトラニトラミン)＝50／50を使用することができる。鋼鉄製パイプに鋼鉄製のヘルメットを被せて爆薬を爆裂させると、容器中の水及び氷中に初期BDが生成する。
(A) Explosive-type initial BD manufacturing process An electric detonator is installed in the fuselage, and a steel pipe with a single-sided plug containing explosive is submerged horizontally in water and ice in a pressure vessel made of pure titanium. Examples of explosives include cyclotrimethylenetrinitroamine, cyclotetramethylenetetranitramine, trinitrotoluene, trinitrophenylmethylnitroamine, pentaerythritol tetranitrate, tetranitromethane, and mixtures thereof. Specifically, TNT (trinitrotoluene) / HMX (cyclotetramethylenetetranitramine) = 50/50 can be used. When a steel helmet is put on a steel pipe to explode the explosive, initial BD is generated in the water and ice in the container.
(B) BDの酸化性分解処理工程
55〜56重量％の濃HNO3に分散させたBDをオートクレーブに入れ、加圧及び加熱する。14気圧、150〜180℃程度で10〜30分間、加圧・加熱することによって、BDを酸化性分解することができる。この工程により、炭素系夾雑物、無機夾雑物等を分解できる。
(B) Oxidative decomposition process of BD
BD dispersed in 55-56% by weight concentrated HNO 3 is placed in an autoclave, and pressurized and heated. BD can be oxidatively decomposed by applying pressure and heating at 14 atm and 150 to 180 ° C. for 10 to 30 minutes. By this step, carbon-based impurities, inorganic impurities, etc. can be decomposed.
(C) １次酸化性エッチング処理工程
酸化性分解処理したBDの分散物を加圧・加熱する。18気圧、200〜240℃程度に加圧及び加熱するのが好ましい。１次酸化性エッチング処理段階では、主にBD表面を被覆する硬質炭素を除去する。
(C) Primary oxidizing etching treatment step BD dispersion treated by oxidizing decomposition is pressurized and heated. It is preferable to pressurize and heat to about 18 to 200 ° C. In the primary oxidative etching treatment step, hard carbon mainly covering the BD surface is removed.
(D) ２次酸化性エッチング処理工程
２次酸化性エッチング処理は、主にBD凝集体を構成するUDD間のイオン透過性界面ギャップ及びUDD表面の結晶欠陥部に除去し難い状態で存在する極く少量の硬質炭素を除去するための工程である。したがって、加圧及び加熱の条件は１次酸化性エッチング処理より厳しくする必要がある。好ましい処理条件は、25気圧、230〜250℃程度である。２次酸化性エッチング処理を施した被処理液のpHは、通常2.0〜6.95である。
(D) Secondary oxidative etching process The secondary oxidative etching process is an electrode that exists in an ion-permeable interface gap between UDDs constituting BD aggregates and a crystal defect portion on the UDD surface that is difficult to remove. This is a process for removing a small amount of hard carbon. Therefore, the conditions for pressurization and heating need to be stricter than the primary oxidizing etching process. Preferred treatment conditions are about 25 atm and about 230 to 250 ° C. The pH of the liquid to be treated that has been subjected to the secondary oxidizing etching treatment is usually 2.0 to 6.95.
酸化性分解処理工程、１次酸化性エッチング処理工程及び２次酸化性エッチング処理工程の圧力及び温度を上述の範囲とすることは、必ず順守すべき条件というわけではない。しかし除去し難い成分を十分に取り除くためには、圧力及び温度を、工程順に大きくするのが好ましい。 Setting the pressure and temperature of the oxidative decomposition treatment step, the primary oxidative etching treatment step, and the secondary oxidative etching treatment step to the above ranges is not necessarily a condition to be observed. However, in order to sufficiently remove components that are difficult to remove, it is preferable to increase the pressure and temperature in the order of the steps.
(E) 中和工程
２次酸化性エッチング処理したBDを含む硝酸水溶液に、それ自身揮発性の又はその分解反応生成物が揮発性の塩基性材料を添加する。添加により、溶液のpHは２〜6.95から7.05〜12に上昇する。塩基性材料の例としてヒドラジン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジプロピルアミン、アリルアミン、アニリン、N,N-ジメチルアニリン、ジイソプロピルアミン、ジエチレントリアミンやテトラエチレンペンタミンのようなポリアルキレンポリアミン、2-エチルヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、ピペリジン、ホルムアミド、N,N-メチルホルムアミド、尿素を挙げることができる。
(E) Neutralization Step A basic material that is volatile in itself or volatile in its decomposition reaction product is added to a nitric acid aqueous solution containing BD subjected to secondary oxidative etching. Addition increases the pH of the solution from 2-6.95 to 7.05-12. Examples of basic materials are hydrazine, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethanolamine, propylamine, isopropylamine, dipropylamine, allylamine, aniline, N, N-dimethylaniline, diisopropylamine, diethylenetriamine And polyalkylene polyamines such as tetraethylenepentamine, 2-ethylhexylamine, cyclohexylamine, piperidine, formamide, N, N-methylformamide, and urea.
例えば塩基性材料としてアンモニアを用いる場合、酸と下記式のように反応してガスを生じる。
HNO3＋ NH3 → NH4NO3→ N2O ＋ ２H2O
N2O → N2 ＋ (O)
３HNO3＋ NH3 →NH4NO2＋ N2O3 ＋ H2O ＋ O2 ＋ (O)
NH4NO2→ N2 ＋ ２H2O
N2O3＋ NH3 → ２N2 ＋ ３H2O
N2O3→ N２ ＋ O２ ＋ (O)
NH4NO2＋ ２NH3 →２N2 ＋ H2O ＋ ３H2
H2 ＋ (O)→ H2O
HCl ＋ NaOH → Na＋ ＋ Cl− ＋ H2O
HCl ＋ NH3 → NH4 ＋ ＋ Cl−
NH4 ＋ →NH3 ＋ H＋
H2SO4＋ ２NH3→N2O ＋ SO2 ＋ NO2
発生したN2、O2、N2O、H2O、H2、SO2ガスは系外に放出できるので、残存物による系に対する影響はほとんどなくなる。アンモニアの添加量は硝酸の１〜1.5当量とするのが好ましく、1.25当量とするのがより好ましい。
For example, when ammonia is used as a basic material, it reacts with an acid as shown in the following formula to generate gas.
HNO 3 + NH 3 → NH 4 NO 3 → N 2 O + 2H 2 O
N 2 O → N 2 + (O)
3HNO 3 + NH 3 → NH 4 NO 2 + N 2 O 3 + H 2 O + O 2 + (O)
NH 4 NO 2 → N 2 + 2H 2 O
N 2 O 3 + NH 3 → 2N 2 + 3H 2 O
N 2 O 3 → N 2 + O 2 + (O)
NH 4 NO 2 + 2NH 3 → 2N 2 + H 2 O + 3H 2
H 2 + (O) → H 2 O
HCl + NaOH → Na + + Cl − + H 2 O
HCl + NH 3 → NH 4 + + Cl −
NH 4 + → NH 3 + H +
H 2 SO 4 + 2NH 3 → N 2 O + SO 2 + NO 2
Since the generated N 2 , O 2 , N 2 O, H 2 O, H 2 , and SO 2 gases can be released out of the system, there is almost no influence on the system by the residue. The amount of ammonia added is preferably 1 to 1.5 equivalents of nitric acid, and more preferably 1.25 equivalents.
中和工程においては、硝酸水性懸濁液中のBD内に残存する硝酸まで、アニオンより一般的にイオン半径が小さいカチオンが浸透して攻撃することにより、各反応部位で反応相手との間で小爆発を伴う激しい中和反応、分解反応、不純物脱離溶解反応、ガス生成反応、表面官能基生成反応を生起し、ガスが発生し系の昇圧昇温も生じ得るものと考えられる。その結果、BD凝集体が個々のUDDに解体される。このような小爆発を伴う中和工程により、UDDの比表面積及び孔部吸着空間が大きくなると思われる。 In the neutralization step, a cation with a generally smaller ionic radius than the anion penetrates and attacks the nitric acid remaining in the BD in the nitric acid aqueous suspension, so that each reaction site can interact with the reaction partner. It is considered that intense neutralization reaction accompanied by small explosion, decomposition reaction, impurity desorption dissolution reaction, gas generation reaction, surface functional group generation reaction occurs, gas is generated, and pressure increase of the system can also occur. As a result, BD aggregates are disassembled into individual UDDs. It seems that the neutralization process accompanied by such a small explosion increases the specific surface area and pore adsorption space of UDD.
(F) デカンテーション工程
UDDを含有する懸濁液に水を加え、充分にデカンテーションする。デカンテーション操作は、３回以上行うのが好ましい。
(F) Decantation process
Add water to suspension containing UDD and thoroughly decant. The decantation operation is preferably performed three times or more.
(G) 洗浄工程
デカンテーションを施したUDD懸濁液に硝酸を加え、撹拌する。攪拌にはメカニカルマグネチックスターラー等を使用できる。洗浄後、静置して上層排液と下層懸濁液に分ける。UDDは下層懸濁液に含まれているので、上層排液を除去する。例えばUDD含有液１kgに対して硝酸水溶液50 kg加えた場合、上層排液と下層懸濁液とは明瞭に層分離しないが、UDDを含む下層懸濁液の容量は、上層排液の容量のほぼ１／４程度である。上層排液中にはダイヤモンド形の1.2〜2.0 nm径程度の超々微粒子が存在し得るが、この超々微粒子を回収するのは不可欠ではない。なぜなら、この超々微粒子は液層中の不純部を巻き込んで凝集し易く、機械的圧力では分解不能な不良UDDを生成し易いので、回収しても良好な分散性を示すUDDを得難いからである。
(G) Washing process Add nitric acid to the decanted UDD suspension and stir. For stirring, a mechanical magnetic stirrer or the like can be used. After washing, leave to separate into upper layer drainage and lower layer suspension. Since UDD is contained in the lower layer suspension, the upper layer drainage is removed. For example, when 50 kg of nitric acid aqueous solution is added to 1 kg of UDD-containing liquid, the upper layer drainage and the lower layer suspension are not clearly separated, but the volume of the lower layer suspension containing UDD is the volume of the upper layer drainage. It is about 1/4. In the upper layer drainage liquid, diamond-shaped ultra-fine particles having a diameter of about 1.2 to 2.0 nm may exist, but it is not essential to collect these ultra-fine particles. This is because the ultra-fine particles are likely to agglomerate by impregnating the impure part in the liquid layer, and it is easy to produce a defective UDD that cannot be decomposed by mechanical pressure. .
(H) 遠心分離工程
超高速遠心分離機を用いてUDD懸濁液を遠心脱水分離する。回転速度は10000〜30000 RPMとするのが好ましく、20000 RPM程度とするのがより好ましい。
(H) Centrifugation process The UDD suspension is centrifuged and dehydrated using an ultra-high speed centrifuge. The rotation speed is preferably 10,000 to 30,000 RPM, more preferably about 20,000 RPM.
(I) UDD懸濁水性液の調製工程
遠心分離により得られた脱水物に水を加え、UDD懸濁水性液を調製する。懸濁水性液のUDD濃度は0.05〜16％とするのが好ましく、0.1〜12％とするのがより好ましく、１〜10％とするのが特に好ましい。濃度が16％を超えていると、懸濁水性液の保存安定性に支障をきたすことが多い。濃度が0.05％未満であると、後述する表面修飾工程において濃縮を要する場合が多い。懸濁水性液のpHを4.0〜10.0に調節するのが好ましく、pH 5.0〜8.0とするのがより好ましく、pH 6.0〜7.5にするのが特に好ましい。懸濁水性液中に分散しているUDD粒子の平均粒径（１次粒子）は、概ね２nm〜50 nm（数平均で80％以上、重量平均で70％以上）であり、狭分散形である。
(I) UDD suspension aqueous solution preparation process Water is added to the dehydrated product obtained by centrifugation to prepare a UDD suspension aqueous solution. The UDD concentration of the suspension aqueous solution is preferably 0.05 to 16%, more preferably 0.1 to 12%, and particularly preferably 1 to 10%. If the concentration exceeds 16%, the storage stability of the aqueous suspension is often hindered. When the concentration is less than 0.05%, concentration is often required in the surface modification step described later. The pH of the aqueous suspension is preferably adjusted to 4.0 to 10.0, more preferably pH 5.0 to 8.0, and particularly preferably pH 6.0 to 7.5. The average particle size (primary particles) of the UDD particles dispersed in the suspension aqueous solution is approximately 2 nm to 50 nm (number average is 80% or more, weight average is 70% or more). is there.
(J) UDD微粉末の作製工程
遠心分離工程後の脱水物を乾燥させると、UDD微粉末を得ることができる。UDD微粉末の粒径分布範囲は極めて狭く、２次粒子の平均粒径は数平均で150〜650 nm、典型的には300〜500 nmである。
(J) Production process of UDD fine powder UDD fine powder can be obtained by drying the dehydrated product after the centrifugation process. The particle size distribution range of the UDD fine powder is extremely narrow, and the average particle size of the secondary particles is 150 to 650 nm on a number average, typically 300 to 500 nm.
(2) カルボキシル基修飾
(A) 前処理
UDD懸濁水性液は0.01〜７重量％程度のものが市販されている。カルボキシル基修飾UDDの作製には、1.5〜４重量％のものを用いるのが好ましい。超遠心分離によって、UDD懸濁水性液からUDDを分離することができる。超遠心分離はUDDが十分に沈殿するまで行えばよい。具体的には10000〜100000 rpmで５〜40分間程度超遠心にかけると、UDDを分離できる。超遠心処理の回転数は20000〜50000 rpmとするのがより好ましい。UDD微粉末は、そのまま使用可能である。
(2) Carboxyl group modification
(A) Pretreatment
A UDD suspension aqueous solution having a concentration of about 0.01 to 7% by weight is commercially available. For the production of the carboxyl group-modified UDD, it is preferable to use 1.5 to 4% by weight. UDD can be separated from the aqueous UDD suspension by ultracentrifugation. Ultracentrifugation may be performed until UDD is sufficiently precipitated. Specifically, UDD can be separated by ultracentrifugation at 10,000 to 10,000 rpm for about 5 to 40 minutes. The number of rotations of ultracentrifugation is more preferably 20000 to 50000 rpm. UDD fine powder can be used as it is.
(B) 酸化
デカンテーションによって溶媒を除去したUDDに強酸を加え、UDDを強酸に分散させる。強酸としては濃硫酸、濃硝酸及びこれらの混合物が好ましく、濃硫酸と濃硝酸からなる混酸がより好ましい。濃硫酸：濃硝酸の混合比は特に限定されないが、６：４〜９：１とするのが好ましい。強酸の添加量は、UDDが十分に浸漬するように設定すれば良い。UDDを強酸に分散させて十分に反応を進行させるために、超音波を照射する。超音波の周波数は10〜100 kHzが好ましく、20〜50 kHzがより好ましい。照射時間は20〜60分程度とするのが好ましい。
(B) Oxidation A strong acid is added to UDD from which the solvent has been removed by decantation, and UDD is dispersed in the strong acid. As the strong acid, concentrated sulfuric acid, concentrated nitric acid and a mixture thereof are preferable, and a mixed acid composed of concentrated sulfuric acid and concentrated nitric acid is more preferable. The mixing ratio of concentrated sulfuric acid: concentrated nitric acid is not particularly limited, but is preferably 6: 4 to 9: 1. What is necessary is just to set the addition amount of a strong acid so that UDD may fully immerse. Ultrasound is irradiated to disperse UDD in strong acid and allow the reaction to proceed sufficiently. The frequency of the ultrasonic wave is preferably 10 to 100 kHz, and more preferably 20 to 50 kHz. The irradiation time is preferably about 20 to 60 minutes.
UDDの分散物を加熱し、強酸との反応を進行させる。例えば50〜150℃に加熱し、12〜48時間程度、攪拌しながら加熱することによって、UDDと強酸が十分に反応する。酸化処理前のUDDは表面にニトロ基等の置換基を有しているが、強酸と反応させることによってこれらの置換基を除去できる。またUDDの表面にあるsp2炭素を酸化し、カルボキシル基を導入することができる。UDDの分散物を攪拌しながら加熱するには、サーモミキサーを使用するのが好ましい。例えばUDD分散物をサーモミキサーのチューブに入れ、90℃で24時間、1000 rpmで振動させると、カルボキシル基を有するUDDを得ることができる。 The UDD dispersion is heated to allow the reaction with strong acid to proceed. For example, by heating to 50 to 150 ° C. and stirring for about 12 to 48 hours, UDD and strong acid react sufficiently. The UDD before oxidation treatment has a substituent such as a nitro group on the surface, but these substituents can be removed by reacting with a strong acid. It can also oxidize sp 2 carbon on the surface of UDD and introduce carboxyl groups. A thermomixer is preferably used to heat the UDD dispersion with stirring. For example, when a UDD dispersion is put in a thermomixer tube and vibrated at 1000 rpm for 24 hours at 90 ° C., a UDD having a carboxyl group can be obtained.
反応させた後、超遠心にかけ、分離したカルボキシル基修飾したUDDと強酸を分離する。10000〜100000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけると、カルボキシル基修飾UDDを分離できる。超遠心処理の回転数は20000〜50000 rpmとするのがより好ましい。 After the reaction, ultracentrifugation is performed to separate the separated carboxyl group-modified UDD and strong acid. Carboxyl-modified UDD can be separated by ultracentrifugation at 10,000 to 100,000 rpm for about 5 to 30 minutes. The number of rotations of ultracentrifugation is more preferably 20000 to 50000 rpm.
(C) 中和処理
カルボキシル基修飾UDDにアルカリ性溶液を加えて中和する。アルカリ性溶液としては水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が好ましい。水酸化ナトリウム水溶液を使用する場合、濃度は0.01〜0.5 moL／Lにするのが好ましい。
(C) Neutralization treatment An alkaline solution is added to the carboxyl group-modified UDD to neutralize it. As the alkaline solution, an aqueous sodium hydroxide solution and an aqueous potassium hydroxide solution are preferred. When using an aqueous sodium hydroxide solution, the concentration is preferably 0.01 to 0.5 moL / L.
カルボキシル基修飾UDDにアルカリ性溶液を加えたものに超音波を照射するのが好ましい。超音波照射によって、UDDをアルカリ性溶液中に凝集が少ない状態で分散させることができる。反応後、超遠心にかけ、分離したカルボキシル基修飾したUDDとアルカリ性溶液を分離させる。20000〜60000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけると、カルボキシル基修飾UDDとアルカリ性溶液が分離する。 It is preferable to irradiate ultrasonic waves to a carboxyl group-modified UDD plus an alkaline solution. By ultrasonic irradiation, UDD can be dispersed in an alkaline solution with little aggregation. After the reaction, ultracentrifugation is performed to separate the separated carboxyl group-modified UDD from the alkaline solution. When ultracentrifugation is performed at 20000 to 60000 rpm for about 5 to 30 minutes, the carboxyl group-modified UDD and the alkaline solution are separated.
(D) 塩酸処理
カルボキシル基修飾UDDを塩酸で洗浄する。塩酸によって、中和処理後に残留しているナトリウム等の金属イオンを除去することができる。塩酸として、0.01〜0.5 moL／Lの塩酸が挙げられる。中和処理工程と同様に、塩酸を加えたものに超音波照射してカルボキシル基修飾UDDを分散させた後、超遠心分離をして塩酸を除去する。
(D) Hydrochloric acid treatment Wash the carboxyl group-modified UDD with hydrochloric acid . Hydrochloric acid can remove metal ions such as sodium remaining after the neutralization treatment. Examples of hydrochloric acid include 0.01 to 0.5 moL / L hydrochloric acid. As in the neutralization treatment step, the carboxylic acid-modified UDD is dispersed by irradiating with ultrasonic waves to the hydrochloric acid- added one, and then ultracentrifugated to remove hydrochloric acid .
(E) 洗浄
(a) 水を加えて超音波照射してカルボキシル基修飾UDDを分散させ、(b) 10000〜100000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけ、(c) 分離した水を除去する操作を繰り返し行い、カルボキシル基修飾UDDを洗浄する。(a) 〜(c) の水洗浄操作を２〜６回程度繰り返すことによって、残留した酸等を十分に除去することができる。洗浄後のカルボキシル基修飾UDDは減圧乾燥する。
(E) Cleaning
(a) Add water and irradiate with ultrasonic waves to disperse the carboxyl group-modified UDD, (b) Repeat ultracentrifugation at 10,000 to 10,000 rpm for 5 to 30 minutes, and (c) Remove the separated water repeatedly. Wash the carboxyl group-modified UDD. By repeating the water washing operations (a) to (c) about 2 to 6 times, the remaining acid and the like can be sufficiently removed. The washed carboxyl group-modified UDD is dried under reduced pressure.
(3) DNA固定
カルボキシル基修飾UDDにDNA等の生体分子を固定する方法は特に限定されず、一般的な方法に拠ることができる。図１を参照して、DNA固定方法の一例を説明する。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（以下、EDCと言う）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（以下、NHSと言う）をこの順にカルボキシル基修飾UDDに作用させ（図１(1)〜(3)）、カルボキシル基とNHSとを縮合させる。EDC溶液及びNHS溶液の濃度は10〜50 mMとするのが好ましく、20〜30 mMとするのがより好ましい。カルボキシル基及びNHSを含む溶液を10〜20時間程度攪拌すると、縮合反応を十分に進行させることができる（図１(4)）。
(3) DNA immobilization The method for immobilizing a biomolecule such as DNA to the carboxyl group-modified UDD is not particularly limited, and can be based on a general method. An example of a DNA fixing method will be described with reference to FIG. 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (hereinafter referred to as EDC) and N-hydroxysuccinimide (hereinafter referred to as NHS) are allowed to act on the carboxyl group-modified UDD in this order (FIG. 1 ( 1) to (3)), the carboxyl group and NHS are condensed. The concentration of the EDC solution and NHS solution is preferably 10 to 50 mM, and more preferably 20 to 30 mM. When the solution containing a carboxyl group and NHS is stirred for about 10 to 20 hours, the condensation reaction can sufficiently proceed (FIG. 1 (4)).
NHS縮合体に、DNAを加え、35〜40℃程度の温度で１〜５時間攪拌すると、NHSが脱離し、DNAのアミノ基末端がカルボニル基に結合する（図１(5) ）。DNAはポリマーであっても良いし、オリゴマーであっても良い。DNAにCy5蛍光標識しておくと、DNA固定したカルボキシル基修飾UDDを蛍光顕微鏡によって観察することができる。 When DNA is added to the NHS condensate and stirred at a temperature of about 35 to 40 ° C. for 1 to 5 hours, NHS is eliminated and the amino group end of DNA is bonded to the carbonyl group (FIG. 1 (5)). The DNA may be a polymer or an oligomer. When DNA is Cy5 fluorescently labeled, the carboxyl group-modified UDD immobilized with DNA can be observed with a fluorescence microscope.
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
(1) 強酸処理
UDD溶液（ビジョン開発株式会社製、UDDのメジアン径:150 nm、1.5重量％）１mLを超遠心にかけた。40000 rpmで20分間超遠心処理したところ、溶媒とUDDとが分離し、沈殿した。分離した溶媒を除去した後、濃硫酸と濃硝酸の９：１混合物を１mL加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射した。得られたUDD分散物をサーモミキサーのチューブに入れ替え、90℃で24時間、1000 rpmで振動させた。加温処理したUDD分散物を超遠心用のチューブに移し、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけ、分離した強酸を除去した。
Example 1
(1) Strong acid treatment
1 mL of UDD solution (made by Vision Development Co., Ltd., median diameter of UDD: 150 nm, 1.5% by weight) was subjected to ultracentrifugation. When ultracentrifugation was performed at 40000 rpm for 20 minutes, the solvent and UDD were separated and precipitated. After removing the separated solvent, 1 mL of a 9: 1 mixture of concentrated sulfuric acid and concentrated nitric acid was added and irradiated with ultrasonic waves (30 minutes, 42 kHz). The obtained UDD dispersion was replaced with a thermomixer tube, and the mixture was vibrated at 90 ° C. for 24 hours at 1000 rpm. The heated UDD dispersion was transferred to a tube for ultracentrifugation and subjected to ultracentrifugation (40000 rpm, 20 minutes) to remove the separated strong acid.
(2) アルカリ処理
(1) で得られたカルボキシル基修飾UDDに0.1 MのNaOH水溶液を加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射し、カルボキシル基修飾UDDを分散させた。カルボキシル基修飾UDDの分散物をサーモミキサーのチューブに移し、90℃で２時間、1000 rpmで振動させた。加温処理後、分散物を超遠心用のチューブに移し、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけた。NaOH水溶液とカルボキシル基修飾UDDが分離したので、NaOH水溶液を除去した。
(2) Alkali treatment
To the carboxyl group-modified UDD obtained in (1), a 0.1 M NaOH aqueous solution was added and irradiated with ultrasonic waves (30 minutes, 42 kHz) to disperse the carboxyl group-modified UDD. The dispersion of the carboxyl group-modified UDD was transferred to a thermomixer tube, and was vibrated at 90 ° C. for 2 hours at 1000 rpm. After the heating treatment, the dispersion was transferred to a tube for ultracentrifugation and subjected to ultracentrifugation (40000 rpm, 20 minutes). Since the aqueous NaOH solution and the carboxyl group-modified UDD were separated, the aqueous NaOH solution was removed.
(3) 塩酸処理
アルカリ処理後の酸化UDDに0.1 MのHCl水溶液を加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射した。得られた分散物をサーモミキサーのチューブに移し、90℃で２時間、1000 rpmで振動させた後、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけた。HCl水溶液とカルボキシル基修飾UDDが分離したので、HCl水溶液を除去した。
(3) 0.1 M HCl aqueous solution was added to the oxidized UDD after hydrochloric acid treatment and alkali treatment, and ultrasonic waves (30 minutes, 42 kHz) were irradiated. The resulting dispersion was transferred to a thermomixer tube, vibrated at 1000 rpm for 2 hours at 90 ° C., and then subjected to ultracentrifugation (40000 rpm, 20 minutes). Since the aqueous HCl solution and the carboxyl group-modified UDD were separated, the aqueous HCl solution was removed.
(4) 洗浄
(i) カルボキシル基修飾UDDに超純水を加えたものに超音波照射し（30分間、42 kHz）、(ii) 得られた分散物を超遠心（40000 rpm、20分間）にかけ、(iii) 分離した水を除去した。(i)〜(iii)の操作を３回繰り返し、カルボキシル基修飾UDDを洗浄した。
(4) Cleaning
(i) Ultrasonic irradiation of a carboxyl group-modified UDD plus ultrapure water (30 minutes, 42 kHz), (ii) Ultracentrifugation (40000 rpm, 20 minutes) and (iii) ) Separated water was removed. The operations (i) to (iii) were repeated three times to wash the carboxyl group-modified UDD.
(5) 測定
カルボキシル基修飾UDDのIR測定を行ったところ、図２に示すように、3500 cm-1付近にO-H結合に由来すると考えられるピークが現れ、1700 cm-1付近にCO二重結合に由来すると考えられるピークが現れていた。IR測定の結果、UDDにカルボキシル基修飾反応が起こったことが分かった。また金基板にカルボキシル基修飾UDDを滴下して表面電位を測定したところ、16 mVであった。
実施例２
(1) DNA固定
濃度25 mMのEDC溶液を加えてカルボキシル基修飾UDDを活性化処理した後、濃度25 mMのNHS溶液を加えて16時間混合した。これに、Cy5蛍光標識化した一本鎖DNA（21 mer）を加えて38℃で２時間攪拌したところ、Cy5標識DNAを担持したカルボキシル基修飾UDDが得られた。得られたDNA固定体は、超純水で洗浄し、乾燥した。
Example 2
(1) DNA fixation After activation of the carboxyl group-modified UDD by adding an EDC solution with a concentration of 25 mM, an NHS solution with a concentration of 25 mM was added and mixed for 16 hours. Cy5 fluorescently labeled single-stranded DNA (21 mer) was added to this and stirred at 38 ° C. for 2 hours. As a result, a carboxyl group-modified UDD carrying Cy5-labeled DNA was obtained. The obtained DNA fixed body was washed with ultrapure water and dried.
(2) 測定
DNA固定体を含む溶液をスライドガラス上に滴下し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。蛍光顕微鏡写真を図３(a) に示す。またDNA固定体を含む溶液を金基板に滴下し、表面電位顕微鏡（KFM顕微鏡）を用いて観察し、表面電位を測定した。得られた電位像を図４(a) に示し、表面電位を表１に併せて示す。
(2) Measurement
The solution containing the DNA fixed body was dropped on a slide glass and observed using a fluorescence microscope. A fluorescence micrograph is shown in FIG. In addition, a solution containing the DNA immobilized body was dropped on a gold substrate and observed with a surface potential microscope (KFM microscope) to measure the surface potential. The obtained potential image is shown in FIG. 4 (a), and the surface potential is also shown in Table 1.
比較例１
実施例１の原料として用いたUDD溶液（ビジョン開発株式会社製、UDDのメジアン径:150 nm、1.5重量％）を超遠心分離し、IR及び表面電位を測定した。結果を図２及び表１に併せて示す。実施例１(5) と同様にEDC及びNHSによってUDDを活性化し、これにDNAを３(b) 及び４(b) にそれぞれ示す。
Comparative Example 1
The UDD solution (made by Vision Development Co., Ltd., median diameter of UDD: 150 nm, 1.5% by weight) used as a raw material in Example 1 was ultracentrifuged, and IR and surface potential were measured. The results are shown in FIG. UDD was activated by EDC and NHS in the same manner as in Example 1 (5), and DNAs are shown in 3 (b) and 4 (b), respectively.
蛍光顕微鏡写真及びKFM顕微鏡写真において、カルボキシル基修飾を施していない方（比較例１）が、白い点を明確に観察できた。これは粒子間の凝集が強く起こっているためであると考えられる。したがって、カルボキシル基修飾を施していないものと比較して、カルボキシル基修飾UDDは優れた分散性を示すことが確認できた。 In the fluorescence micrograph and the KFM micrograph, the white point was clearly observed in the one not subjected to carboxyl group modification (Comparative Example 1). This is thought to be due to the strong aggregation between the particles. Therefore, it was confirmed that the carboxyl group-modified UDD showed excellent dispersibility as compared with those not subjected to carboxyl group modification.
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