JP4786843B2 - Retro-inverso peptides derived from interleukin-6 - Google Patents

Description

【００２３】
先に論じたように、これらRI IL-6-誘導ペプチドは、対応する全長のIL-6タンパク質と同じ活性を有し、また神経栄養および髄鞘栄養(myelinotrophic)活性を有する。本発明の１つの実施態様は、Ｔ細胞活性化有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有しかつSEQ ID NO:1で示されるRIペプチドまたは同様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドを、Ｔ細胞に投与することによる、Ｔ細胞活性化の促進方法である。
【００２４】
そのような類似体としては、例えば１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基のアラニンまたは別のアミノ酸での置換；１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基の欠失；１個以上のチロシンおよび／またはフェニルアラニン残基の置換；１個以上のフェニルアラニン残基の欠失；ならびにペプチド内の１個以上のアミノ酸の保存的置換を含む。リシン／アルギニンおよびチロシン／フェニルアラニン残基の置換または欠失は、トリプシンおよびキモトリプシンそれぞれによるペプチド分解の受けやすさを減らす。
【００２５】
本発明における使用のために企図されるこれらのペプチド配列の別の変更は、重要でない挿入および欠失を含む。保存的アミノ酸置換が企図される。そのような置換は、例えば、それらの側鎖の化学的性質に関連したアミノ酸の族内で生じる置換である。アミノ酸の族としては、塩基性に荷電したアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電の極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）；ならびに芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）を包含する。特に、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの分離した置換または、アスパラギン酸のグルタミン酸での分離した置換または、スレオニンのセリンでの分離した置換または、アミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸での同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ペプチドの特性に大きな影響を与えないことが、一般に受け入れられる。SEQ ID NO:1で示される配列を含む任意のRIペプチドまたはその挿入物、欠失物または置換物の、軸索生長、髄鞘形成、脱髄逆転および神経細胞死の阻止を促進する能力は、以下に示される実施例において提供されるアッセイを用いて決定することができる。
【００２６】
種々の化学的修飾は、安定性、生物活性およびペプチドの血液脳障壁(blood brain barrier)を越える能力を改善する。１つのそのような修飾は、脂肪族または芳香族の酸の誘導体での脂肪族アミノ末端修飾であり、アミド結合を形成する。そのような誘導体としては、例えばCH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO（n=1〜10）、C₆H₅CH₂COおよびH₂N(CH₂)_nCO（n=1〜10）を包含する。別の修飾は、アミド／エステル結合によりペプチドに結合される、脂肪族または芳香族アミン／アルコールの誘導体でのカルボキシ末端修飾である。そのような誘導体としては先に挙げたものを包含する。ペプチドはまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の修飾の両方を有することができ、誘導体は、先に挙げたものから独立して選択される。ペプチドはまたグリコシル化されることができ、アルファアミノ基もしくはD-Asnまたはその両方が、グルコースまたはガラクトースで修飾される。別の企図される修飾においては、選択された主鎖アミド結合が還元される（NH-CH₂）。他の修飾としては、アミド結合における選択された窒素のN-メチル化および、ペプチド上の酸基の少なくとも１つが芳香族または脂肪族のエステルとして修飾されるエステル化を含む。上記修飾の任意の組合せがまた企図される。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、細胞を、軸索生長促進有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、そしてSEQ ID NO:1で示される、RI IL-6-誘導ペプチドまたは上記したのと同様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドを投与することによる、分化しているかまたは分化していない神経細胞における軸索生長を促進する方法である。
【００２８】
任意のそのようなペプチドの軸索生長を刺激する能力は、以下の実施例１〜９に記載された方法を用いて、当業者が容易に決定することができる。任意の特定のIL-6-誘導ペプチドの本来のIL-6の同じ活性を仲介する能力は、実施例10〜12において論じられた親ペプチドについての標準アッセイを用いて決定することができる。
【００２９】
細胞増殖培地中での神経栄養活性のための、本発明のRIペプチドの典型的最小量は通常、少なくとも約５ng/mlである。イン ビトロ(in vitro)での使用のために、この量またはそれ以上の量の本発明のRIペプチドが予想される。典型的には、0.1〜約10g/mlの範囲の濃度のこれらのペプチドが使用される。任意の特定の組織のための有効量は、実施例１にしたがって決定することができる。
【００３０】
Ｔ細胞、Ｂ細胞または神経細胞は、本発明のRIペプチドを細胞に直接投与することによって、イン ビトロ(in vitro)またはイクス ビボ(ex vivo)で処置されることができる。これは、例えば細胞を特定の細胞タイプのために適当な増殖培地中で培養し、次いでペプチドを培地に添加することによって行うことができる。典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物において、処置されるべき細胞がイン ビボ(in vivo)にあるときには、幾つかの技術のうちの１つによって組成物を投与することができる。最も好ましくは、組成物は、ペプチドの所望の局所濃度を与えるのに十分な量で、血液中に直接注射される。これらのRIペプチドは、Dペプチド結合の故に、イン ビボ(in vivo)で長く持続する。リシンおよびアルギニン残基を欠くペプチドにおいては、タンパク質分解が減らされる。より小さいペプチド（すなわち、50-mer以下）は、血液脳障壁を最も多く越えるようであり、CNS疾患の治療のために中枢神経系に入る（バンクス(Banks)ら、Peptides, 13:1289-1294, 1992参照）。
【００３１】
神経疾患の治療のためには、直接頭蓋内注入または脳脊髄流体中への注入をまた、所望の局所濃度のニューロトロフィン(neurotrophin)を与えるのに十分な量で使用することができる。両方の場合に、製薬上許容される注射用担体が使用される。そのような担体としては、例えばホスフェート緩衝塩水およびリンゲル溶液が含まれる。あるいは、直接局所注入または全身投与によって、組成物を末梢神経組織へ投与することができる。種々の慣用の投与方式が予想され、静脈内、肺、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜外、鞘内、局所および経口を含む。局所投与のための製薬上許容される担体としては、クリーム、ジェル、ペースト、軟膏、ローション、懸濁液、エマルジョンおよび分散液を含む。
【００３２】
本発明のペプチド組成物は、単位投与形態で、例えば注射用組成物または、患者へ投与される毎日の投与量と等価な投与量での局所調製物で、または制御された放出組成物として、包装され、投与されることができる。PBS中または凍結乾燥解形態で活性成分の毎日の投与量を含む中隔封止されたびんは、単位投与の例である。好ましい実施態様においては、IL-6効果、例えばＴ細胞活性化を促進するため、および神経変性疾患または脱髄疾患の治療のための、脊椎動物の体重に基づく、本発明のRIペプチドの毎日の全身投与量は、約0.01〜約10,000g/kgの範囲にある。より好ましくは、毎日の全身投与量は、約0.1〜1,000g/kgである。最も好ましくは、毎日の全身投与量は、約10〜100g/kgである。局所に投与される物質の毎日の投与量は、ほぼより少ない大きさのオーダーである。ペプチドが胃腸内系でのタンパク質分解に抵抗性であるので、経口投与が特に好ましい。
【００３３】
本発明の１つの好ましい実施態様においては、ペプチドは局所的に、神経細胞にイン ビボ(in vivo)で、その移植により投与される。例えば、ポリ乳酸、ポリガラクト酸(polygalactic acid)、再生コラーゲン、多層リポソームおよび多くの他の慣用の蓄積処方物が、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に処方することができる生物侵食性または生物分解性物質を含む。これらの物質は、移植されると、徐々にこわれ、周囲の組織に活性物質を放出する。生物侵食性、生物分解性および他の蓄積処方物の使用は、本発明において特に企図される。注入ポンプ、マトリックス封鎖(entrapment)系および経皮デリバリー装置との組合せがまた企図される。ペプチドはまた、米国特許第5,529,914号に記載されているように、移植の前に、ポリエチレングリコール等角(conformal)コーティング中に封入されることができる。
【００３４】
本発明のペプチドはまた、ミセルまたはリポソーム中に封入されることができる。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的にした組織に結合することができるレセプター、リガンドまたは抗体の使用によって、特定の組織、例えば神経組織を標的にし得る。これらの処方物の製造は、当技術分野においてよく知られている（ラディン(Radin)ら、Meth. Enzymol., 98:613-618, 1983）。
【００３５】
目下、神経系の構造完全性の完全な機能再生および回復を促進することができる、入手可能な薬剤がない。これは特にCNSの場合に本当である。神経栄養因子の使用による末梢神経のどのような程度の再生も、本発明の範囲内にある。さらには、神経栄養因子は、神経母集団または脳の特定領域の変性に関連する神経変性疾患の治療において治療上有用であり得る。パーキンソン病の主な原因は、黒質のドーパミン作用性のニューロンの変性である。プロサポシンに対する抗体は、ヒト脳切片中の黒質のドーパミン作動性ニューロンを免疫組織学的に染色するので、本発明のRIペプチドは、パーキンソン病の治療において治療上有用であり得る。年をとると視野の喪失に至る視覚神経変性疾患である、網膜神経障害がまた、本発明のRIペプチドを用いて治療可能である。
【００３６】
脳のニューロン母集団に到達するために、神経栄養因子は、大脳内に投与されなければならない、というのは、これらのタンパク質は血液脳障壁を越えないからであると長く信じられてきた。米国特許第5,571,787号は、サポシンCから誘導される、ヨウ素化した神経栄養18-merフラグメントが血液脳障壁を越えることを開示する。このように、約22個までのアミノ酸を有するRIペプチドがまたこの障壁を越え、かくして、静脈内投与することができる。他のニューロン母集団、例えば運動ニューロンは、脳脊髄流体中への直接注入がまた代替経路として想像されるが、これはまた静脈内注射によって処置することができる。
【００３７】
細胞は、ミエリン形成を促進するかまたは脱髄を防止するように、イン ビボ(in vivo)、イクス ビボ(ex vivo)またはイン ビトロ(in vitro)で、上記した方法で処置されることができる。神経繊維の脱髄をもたらす疾患［MS、急性転移性白質脳炎、脳および／または脊髄への外傷、進行性多焦点白質脳炎、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィーおよび未成熟の幼児における白質の悪展開(maldevelopment)（室周囲白軟化症(periventicular leucomalacia)）を含む］は、本発明の神経栄養ペプチドを疾患に冒された細胞へ投与することによって、遅らせるか、または停止させることができる。
【００３８】
本発明のRI IL-6誘導ペプチド組成物はまた、Ｔ細胞活性化を助け、培養された運動ニューロンの生存率を高め、かつ神経栄養因子およびミエリン促進物質の効果を決定するために使用することができる。しかしながら、より実際には、それらは、実験室試薬として、および造血を促進し、神経細胞をイン ビトロ(in vitro)で維持するために、細胞増殖培地の成分としての即時用途を有する。
【００３９】
本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている自動化された固相プロトコールを用いて合成される。ペプチドはすべて、使用前に、逆相カラムでの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、約95％より上の純度まで精製される。
【００４０】
以下の実施例は説明的なものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４１】
実施例１
軸索生長の刺激
NS20Y神経芽腫細胞を、10％子牛胎児血清(FCS)を含むDMEM中で増殖させる。細胞をトリプシンで除き、30mmペトリ皿中で、カバーガラス上で培養する。20〜24時間後、培地を、0.5%FCSおよび0、0.5、1、2、4または8ng/mlのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）を含む2mlのDEMEと取り替える。細胞をさらに24時間培養し、PBSで洗浄し、ブワン溶液(Bouin's solution)（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸15:5:1）で30分間固定した。固定液をPBSで除き、位相差顕微鏡下で軸索生長について評点付けをした。１つの細胞直径以上長いと明らかに定義された１つ以上の軸索を示す細胞は、正であると評点をつけられた。各皿の異なる部分で、少なくとも200個の細胞について評点を付けて、軸索を有する細胞のパーセンテージを決定し、アッセイは二重に行った。
【００４２】
実施例２
細胞死の阻止
NS20Y細胞を実施例１のようにして培養し、８ng/mlのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の存在下または不在下にて0.5％ウシ胎児血清中のカバーグラス上で２日間増殖させる。培地を除き、PBS中の0.2％トリパンブルーを各ウェルに加える。青色に染色された死細胞を、倒立顕微鏡にて全体中のパーセンテージとして評点付けをし、各ウェルの４領域で400個の細胞を数える。二重アッセイでの平均誤差は５％であった。
【００４３】
実施例３
イクス ビボ (ex vivo) での軸索生長の促進
クフラー(Kuffler)ら（J. Neurobiol. 25:1267-1282, 1994）により記載されたようにして、ラット成体から脊髄神経節を除き、感覚ニューロンを調製した。ニューロンを0.5ng/mlのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）で処理する。処理の３日後、最長の軸索突出の長さをマイクロメーターのグリッドで測定する。RIペプチドで処理したニューロン中の最長の軸索は、対照（非-RI）ペプチドで処理したものまたは未処理の対照より約３倍長い。48時間の処理後、すべての細胞は、神経増殖因子(NGF)に同様に応答し、そこで、広範囲の分岐が観察される。これらの結果は、IL-3誘導ペプチドが感覚ニューロンの分化を促進することを示す。
【００４４】
実施例４
ラットモデルにおける脱髄の逆転
実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト多発性硬化症(MS)のラットモデルである。ラットにおいては、EAEは、外来タンパク質（モルモットの脊髄）を注入することによって誘発され、それは、11日後に、白質における炎症および脱髄をもたらす。この脱髄は、活発に脱髄しているヒトMS障害にみられるものと似ている（リュウ(Liu)ら、Multiple Sclerosis 1:2-9, 1995）。
【００４５】
モルモットの脊髄および完全フロイントアジュバント(CFA)のエマルジョンの注入によって、ルイス(Lewis)ラットにEAEが誘発される。14日目、弱っているのが明らかなときに、RI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）での処置を開始し（200g/kg筋肉内）、毎日８日間続ける。６匹のラットは、賦形剤のみを注入される。14日および22日に、１歩の長さ（筋肉の弱りの尺度）を評点付けする。さらに、mm²当たりの脊髄における脱髄障害（斑）の数および大きさを、22日に評点付けする。最後に、脳中のコレステロールエステルの量（ミエリン破壊のマーカー）を、22日に評点付けする。
【００４６】
両群の１歩の長さは14日目に減少し、それに対して、８日間の処置後、IL-6誘導ペプチドで処置した動物は正常に戻ったが、賦形剤処置した動物は戻らない。コレステロールエステル含量の有意の減少が、処置群の脳において観察される。さらに、脊髄障害の数は、IL-6誘導ペプチドでの処置の10日後に有意に減少する。最後に、平均の障害の大きさは有意に減少する。対照動物と実験動物との間の体重減少の差はない。これらの結果は、IL-6誘導ペプチドでの全身処置後に、EAEの有意の臨床的生化学的かつ形態学的な逆転を示す。この作用は、ミエリン修復に直接作用しない、最近のMS薬の抗炎症効果とは違う。
【００４７】
実施例５
イクス ビボ (ex vivo) の髄鞘形成アッセイ
新生児マウスの小脳外植片を、サトミ(Satomi)（Zool. Sci. 9:127-137, 1992）にしたがって調製する。軸索生長および髄鞘形成を、培養で22日間観察し、その期間中に、新生児マウスの小脳は普通ニューロン分化し、髄鞘形成が開始する。17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI IL-6誘導ペプチドを、外植片の調製後第２日に加え（３つの対照および３つの処置外植片）、軸索の生長および髄鞘形成を、ビデオカメラの付いた明視野顕微鏡(bright field microscope)下で査定する。サポシンCを、約1〜10g/mlの濃度での正の対照として使用する。髄鞘形成は、IL-6誘導ペプチドによって、サポシンCを用いたときと同様の程度にまで刺激される。
【００４８】
あるいは、髄鞘形成は、³⁵Sをスルホリピド（以下に記載するように、ミエリンに限定的である）に組み込むことによってアッセイすることができる。
【００４９】
実施例６
³⁵ S のスルホリピドへの組み込み
初代のミエリン含有シュヴァン(Schwann)細胞を、0.5％ウシ胎児血清(FBS)を含む低サルフェート培地(DMEM)中で48時間インキュベートした後、³⁵S-メチオニンおよび、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI IL-6誘導ペプチドを添加する。サポシンCを正の対照として使用する。細胞をPBSですすぎ、採取し、100リットルの蒸留水中で超音波処理する。一定分量の細胞溶解物をタンパク質分析のために除き、残りを5mlのクロロホルム／メタノール（2:1、体積／体積）で抽出する。脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、ヒライワ(Hiraiwa)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4778-4781に記載されているようにして、抗スルファチドモノクローナル抗体を用いて免疫染色する。ペプチドおよびサポシンC処置後、同様の量のスルファチドが観察される。
【００５０】
実施例７
外傷性虚血性 CNS 障害の治療における RI ペプチドの使用
脳または脊髄に外傷性障害を有するヒトが、滅菌塩水溶液または蓄積形態での約100g/kgのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の全身注入を受ける。感覚または運動神経機能の獲得による改善が査定される（すなわち、増加された手足の動き）。さらなる改善が生じなくなるまで治療を続ける。
【００５１】
実施例８
脱髄疾患の治療における RI ペプチドの使用
初期段階のMSと診断された患者に、実施例７と同じ投与量範囲を用いた全身注入によって、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI IL-6誘導ペプチドが与えられる。投与は毎日または毎週繰り返され、筋肉の強度の改善、筋骨格協調および髄鞘形成（MRIにより決定）が観察される。慢性再発MSを有する患者を、次の再発が生じるときに、同じ方法で治療する。
【００５２】
実施例９
IL-6 増殖アッセイ
IL-6に関するほとんどのバイオアッセイは、IL-6依存性ネズミ・ハイブリドーマ細胞系、例えば、MH60 B9、及び7TD1（ATCC CRL 1851）に対するこのサイトカインの増殖効果に依存する。IL-6アッセイに関する詳細なプロトコールは、Cytokines, a Practical a pproach, Balkwill, F., ed., IRL Press, New York, second edition, 1995, pp. 365-366中に見られる。この内容全体を本明細書中に援用する。IL-6依存性ネズミ・ハイブリドーマ細胞系B9は、哺乳動物IL-6のための信頼でき、かつ、感度のよいアッセイを提供する。B9細胞を、75cm² フラスコ内で、５％ FCSと約 100pg／ml（10IU／ml）のIL-6を補ったRPMI 1640培地中で培養する。培養物を、２〜３日毎に、１：５〜１：10に分け、そしてその細胞密度が約５×10⁵ 細胞／mlに達するときに、IL-6を再供給する。培養物を、湿度調節されたCO₂ インキュベーター内で37℃で維持する。
【００５３】
B9細胞を、供給（feeding）から２日後に洗浄し、そして５％ FCSを補ったRPMI 1640培地中に５×10⁴ 細胞／mlの密度に再懸濁させる。IL-6標準を、96ウェル・マイクロタイテーション・プレート内で 100ｌ容量中３連で順次２倍希釈シリーズとして、分配する。標準の力価測定を、 100pg／ml（10IU／ml）から開始し、そして 0.1pg／ml（0.01IU／ml）まで希釈する。IL-6活性について計測される予定の、17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRI IL-6由来ペプチドの適当な希釈物を、 100ｌ容量において３連で作製する。ネガティブ・コントロールとして、培養基単独を含ませる。細胞懸濁液(100ｌ）を、各ウェルに添加し、そしてそのプレートを、湿度調節CO₂ インキュベーター内で37℃で約72時間、インキュベートする。テトラゾリウム塩MTT(10ｌ）を各ウェルに添加し、そして上記プレートをさらに 4.5時間インキュベートする。酸ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）(25ｌ）を、ウェル当りに添加し、上記プレートを顕度調節CO₂ インキュベーター内で一夜37℃でインキュベートし、そしてその吸収を、プレート・リーダーを用いて 620nmで測定する。吸収対IL-6の濃度の標準曲線をプロットする。RI IL-6由来ペプチド・サンプル中の活性の測定のために、テスト結果を上記標準曲線と比較して、上記特定のペプチドがIL-6活性を有するかどうかを決定する。
【００５４】
実施例10
IL-6 IgG 分泌アッセイ
IL-6を、EBV 形質転換ヒト・リンパ芽細胞系、例えば、CESS（ATCC TIB 190）内での分化及びIgG分泌を高めるその能力により、評価することができる。CESS細胞を、活発な長期増殖培養物から収穫する。上記細胞を、予め24〜48時間、サブ培養する。多くの死細胞を含み、又は遅く増殖している培養物は、上記アッセイにおいてよく働かないであろう。細胞を、１回洗浄し、そして培養基中に10⁶ 細胞／mlまで再懸濁させる。IL-6(100ｌ）、又は17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRI IL-6由来ペプチドを、各細胞濃度において、６つの複製培養物に添加する。培地だけを、ネガティブ・コントロールとして６ウェルから成る１セットに添加する。細胞を、空気中５％ CO₂の雰囲気中、37℃において５〜７日間、インキュベートする。細胞上清を収穫し、そして免疫グロブリン含量についてアッセイする。
【００５５】
アフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG(75ｌ）を、重炭酸塩コーティング・バッファー中に小分けし、そして室温で一夜インキュベートする。抗血清の個々のバッチを、事前滴定し、高、中、及び低濃度のIgG をもって、最適シグナル対ノイズ比を決定する。ウェルを、PBS／Tween-20 で３回洗浄する。残存タンパク質結合部位をブロックするために、100ｌ PBS／BSA／Tween-20を、各ウェルに添加し、そして30〜90分間室温でインキュベートする。PBS 中で希釈した正常ヤギ血清（４％）を、このステップにおいて使用することもできる。ウェルを、PBS／Tweenで３回洗浄し、そして75ｌのテスト上清と標準を２連で添加する。プールされた正常ヒト血清、又はPBS／BSA／Tween-20中 1,000ng／mlにおける部分精製されたIgG のいずれかの倍化希釈を用いた11点の標準曲線を、バッファーだけのゼロ標準とともに、各プレートに対して、２連で設定した。プレートを、１〜２時間室温でインキュベートする。ウェルをPBS／Tween-20で３回洗浄する。各ウェルに、PBS／BSA／Tween-20中で希釈された、アルカリ性ホスファターゼ（AP）−結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトIgG のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(HPO）75ｌを添加する。抗血清の個々のバッチを滴定して、最適希釈を決定する。
【００５６】
実施例11
IL-6 由来ペプチドによる TNF 放出の阻害
17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRIペプチドを、TNF のLPS 誘導放出を阻害するその能力についてアッセイする。マクロファージバクテリアのリポ多糖(LPS）の添加により活性化され、培養基中へのTNF の放出をもたらし、これは、酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA）を用いて、アッセイされることができる。IL-6は、TNF のLPS 誘導放出を阻害することが知られている（Aderka et al., J. Immunol. 143 : 3517-3523, 1989）。LPS 刺激前にIL-6由来ペプチドにより処理された培養物中、放出されたTNF の量は、上記ペプチドを与えなかった培養物に比較して、有意に低下される。
【００５７】
本発明は、上記詳細な説明中に記載されている態様のみに限定されるものではないことはいうまでもない。本発明の本質を保持する態様の全ては、本発明の範囲内にあると解釈されるべきである。しかしながら、本発明は、上記特許請求の範囲のみにより限定される。[0001]
Field of Invention
The present invention relates to retro-inverso peptides derived from interleukin-6 (IL-6). These peptides have the same activity as the original parent protein and also have neurotrophic activity.
[0002]
Background of the Invention
Cytokines are proteins produced during the natural and specific immune effector phases that serve to mediate and regulate immune and inflammatory responses. Cytokines, like other polypeptide hormones, start their actions by binding to specific receptors on the surface of target cells. One of the best known families of cytokines are interleukins that mediate natural immunity. For a detailed description of the structure and function of interleukins, see Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, WB Saunders Company, Philadelphia, pp.225-243, 1991. reference.
[0003]
IL-6 is a multifunctional cytokine with a molecular weight of 26 kDa that is produced by both lymphoid and nonlymphoid cells and regulates immune responses, acute responses, and hematopoiesis. A detailed review of the structure and function of this cytokine can be found in The Cytokine Handbook, 3rd edition, edited by Thomson, A., Academic Press, San Diego, CA, 1998, and Barton, Clin. Immunol. Immunopathol. 85: 16-20, 1997.
[0004]
Since many cells can produce and respond to IL-6, it can be an autocrine regulator of growth and / or differentiation in many systems. Within the immune system, it has been shown, in part, to be an autocrine activator of peripheral T and NK cells mediated through IL-2 (Garman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 7629-7633). In the thymic development process, IL-6 can be important with IL-2, IL-4, and IL-7 in thymic development. IL-6 also promotes IgG secretion by activated B cells. In addition, IL-6 induces the liver to produce acute proteins such as C-reactive protein and inhibits albumin production (Morrone et al., J. Biol. Chem. 263: 12554). -12558, 1988).
[0005]
IL-6 is also involved in T cell activation, proliferation, and differentiation. IL-6 induces IL-3 receptor (Tac antigen) expression in one T cell line (Noma et al., 1987) and thymocytes, and a second for IL-2 production by T cells. (Garman et al., 1987). IL-6 promotes proliferation of human T cells or mouse peripheral T cells stimulated by PHA.
[0006]
IL-6 also inhibits several important inflammatory responses, including LPS-induced IL-1 and TNF synthesis in vitro and in vivo (Aderka et al., J. Immunol. 143: 3517-3523, 1989; Ulich et al., J. Immunol. 146: 2316-2323, 1991). IL-6 has also been found to protect against lung injury in a disease model of lung inflammation (Chen et al., Infect, Immun. 61: 97-102, 1993).
[0007]
Neurotrophins and neurotrophic factors are proteins or peptides that can affect the survival, target innervation and / or function of a neuronal population (Barde, Neuron, 2: 1525- 1534, 1989). The efficacy of neurotrophins in vivo and in vitro is well documented. For example, ciliary neurotrophic factor (CNTF) promotes the survival of chicken embryonic ciliary ganglia in vitro, and cultured sympathetic nerves, sensory and spinal motility. Helps neurons survive (Ip et al., J. Physiol. Paris, 85: 123-130, 1991).
[0008]
A major obstacle to the therapeutic use of peptides in vivo is that they are susceptible to proteolysis. Retro-inverso peptides are isomers of linear peptides in which the direction of the sequence is reversed (retro) and the chirality (D or L) of each amino acid is reversed (inverso). There are also partially modified retro-inverso isomers of linear peptides in which only some peptide bonds are reversed and the chirality of the amino acid residues in the reversed portion is reversed. The main advantage of such peptides is their increased activity in vivo due to improved resistance to proteolysis (for review, Chorev et al., Trends Biotech., 13: 438-445, 1995). Such retro-inverso analogs show increased metabolic stability, but their biological activity is often greatly compromised (Guichard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9765- 9769, 1994). For example, Richman et al. (J. Peptide Protein Res., 25: 648-662)^Three-Phe^FourIt was determined that analogs of linear and cyclic leuenkephalins modified at the amide bond have activities in the range of 6-14% of the original leuenkephalins. Chorev et al. (Ibid) reported that a peptide that inhibits the binding of vitronectin to its receptor, retro-inversion, is 50,000 times less effective than the parent isomer and 4,000 times more than the parent cyclic peptide. It has been shown to result in another peptide that works. Guichard et al. (TIBTECH 14, 1996) teach that retro-inverso (all D-retro) antigen mimetics can only occur with random coil, loop or cyclic conformational peptides. In the case of “helical” peptides, under the solvent conditions used to assess antigen mimeticity, mimicry of proper function is expected unless the helix is actually absent. .
[0009]
There is a need for IL-6 derived neurotrophic peptides that exhibit increased metabolic stability while retaining biological activity.
[0010]
Summary of the Invention
One embodiment of the invention is an isolated retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids, the peptide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one aspect of this preferred embodiment, at least one basic charged amino acid of the sequence is replaced with another basic charged amino acid. In another aspect of this preferred embodiment, at least one acidic charged amino acid of the sequence is replaced with another acidic charged amino acid. Advantageously, at least one nonpolar amino acid of the sequence is replaced with another nonpolar amino acid. Preferably, at least one uncharged amino acid of the sequence is replaced with another uncharged amino acid. In another aspect of this preferred embodiment, at least one aromatic amino acid of the sequence is replaced with another aromatic amino acid. Advantageously, the peptide is CH at the amino terminus, the carboxy terminus or both the amino terminus and the carboxy terminus._ThreeCO, CH_Three(CH₂)_nCO, C₆H_FiveCH₂CO and H₂N (CH₂)_nIt is modified with a moiety independently selected from the group consisting of CO (n = 1-10). Preferably the peptide is glycosylated. In another aspect of this preferred embodiment, one or more amide bonds of the peptide are reduced. Preferably, one or more nitrogens in the peptide are methylated. In yet another aspect of this preferred embodiment, one or more carboxylic acid groups in the peptide are esterified. Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0011]
Another embodiment of the present invention is a composition comprising a retro-inverso peptide having about 17 to about 40 amino acids and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the peptide comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 1. .
[0012]
The present invention also provides a method of promoting axonal growth or myelination in a mammal in need thereof, wherein the method comprises an amount effective to promote axonal growth or myelination in the mammal. Administering a composition comprising a retro-inverso peptide having from 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human. In one aspect of this preferred embodiment, the administration step is direct local infusion, systemic, intracranial, intracerebral spinal, topical or oral.
[0013]
The present invention also provides a method of promoting T cell activation, wherein the method comprises a T cell having an effective amount of T cell activation promoting 17 to about 40 amino acids, SEQ ID NO: 1 Contacting with a composition comprising a retro-inverso peptide comprising a sequence represented by
[0014]
In another embodiment of the invention, the sequence shown in SEQ ID NO: 1 has 17 to about 40 amino acids for use in promoting axonal growth or myelination in a mammal. Retro-inverso peptides comprising are provided. Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one aspect of the preferred embodiment, the mammal is a human.
[0015]
The invention also provides a retro-inverso peptide having from 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 for use in promoting T cell activation in a mammal in need thereof I will provide a. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.
[0016]
Yet another embodiment of the present invention provides a retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in a mammal in need of axonal growth or It is to be used in the manufacture of a medicament for promoting myelination. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.
[0017]
The present invention also provides a retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 for promoting T cell activation in a mammal in need thereof. Provide for use in the manufacture of drugs. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.
[0018]
Detailed Description of the Preferred Embodiment
The present invention provides retro-inverso (RI) peptides derived from interleukin-6 (IL-6) that mediate similar effects as natural IL-6, including regulation of immune responses, acute responses, and hematopoiesis To do. The term “derived from” indicates that the peptide contains the active region of interleukin-6 or an analog thereof as defined below.
[0019]
In addition, these RI IL-6-derived peptides activate peripheral T and NK cells, promote IgG secretion by activated B cells, induce the liver to produce acute proteins, Promotes proliferation and inhibits inflammatory responses including lipopolysaccharide (LPS) -induced IL-1 and tumor necrosis factor (TNF) synthesis. These RI IL-6 derived peptides also protect against lung injury in lung inflammation.
[0020]
These peptides also have therapeutic uses in promoting functional recovery after toxic, traumatic, ischemic, degenerative and inherited disorders to the peripheral and central nervous systems. These peptides are also useful to promote increased myelination and counteract the effects of demyelinating diseases. These IL-6-derived peptides are also useful in mediating effects similar to natural IL-6. The ability of a particular retro-inverso peptide to mediate similar effects as the parent peptide can be determined by one skilled in the art using standard IL-6 assays described in the Examples below. The use of these peptides facilitates the treatment of various diseases. This is because they are more stable and easier to synthesize than the original cytokines or recombinant cytokines.
[0021]
Specific RI IL-6-derived peptides of the present invention and the parent proteins from which they are derived are shown in Table 1.
[0022]
[Table 1]

[0023]
As discussed above, these RI IL-6-derived peptides have the same activity as the corresponding full-length IL-6 protein, and also have neurotrophic and myelinotrophic activity. One embodiment of the present invention is an RI comprising an effective amount of a T cell activation RI peptide having 17 to about 40 amino acids and having the same activity as shown in SEQ ID NO: 1 A method of promoting T cell activation by administering a peptide to T cells.
[0024]
Such analogs include, for example, substitution of one or more lysine and / or arginine residues with alanine or another amino acid; deletion of one or more lysine and / or arginine residues; one or more tyrosine And / or substitution of phenylalanine residues; deletion of one or more phenylalanine residues; and conservative substitution of one or more amino acids in the peptide. Substitution or deletion of lysine / arginine and tyrosine / phenylalanine residues reduces susceptibility to peptide degradation by trypsin and chymotrypsin, respectively.
[0025]
Other alterations in these peptide sequences contemplated for use in the present invention include non-critical insertions and deletions. Conservative amino acid substitutions are contemplated. Such substitutions are, for example, substitutions that occur within a family of amino acids related to their side chain chemistry. The amino acid family includes basic charged amino acids (lysine, arginine, histidine); acidic charged amino acids (aspartic acid, glutamic acid); nonpolar amino acids (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, Tryptophan); uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine); and aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine). In particular, a separate substitution of leucine with isoleucine or valine, or a separate substitution of aspartic acid with glutamic acid, or a separate substitution of threonine with serine, or similar conservatives of amino acids with structurally related amino acids It is generally accepted that conservative amino acid substitutions consisting of substitutions do not significantly affect the properties of the peptide. The ability of any RI peptide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an insert, deletion or substitution thereof to promote axon growth, myelination, demyelination reversal and prevention of neuronal cell death is It can be determined using the assay provided in the examples shown below.
[0026]
Various chemical modifications improve stability, biological activity and the ability of the peptide to cross the blood brain barrier. One such modification is an aliphatic amino terminal modification with a derivative of an aliphatic or aromatic acid, forming an amide bond. Such derivatives include, for example, CH_ThreeCO, CH_Three(CH₂)_nCO (n = 1-10), C₆H_FiveCH₂CO and H₂N (CH₂)_nCO (n = 1-10) is included. Another modification is a carboxy terminal modification with a derivative of an aliphatic or aromatic amine / alcohol linked to the peptide by an amide / ester bond. Such derivatives include those listed above. Peptides can also have both amino-terminal and carboxy-terminal modifications, and derivatives are selected independently from those listed above. The peptides can also be glycosylated and the alpha amino group or D-Asn or both are modified with glucose or galactose. In another contemplated modification, the selected backbone amide bond is reduced (NH—CH₂). Other modifications include N-methylation of selected nitrogens at the amide bond and esterification where at least one of the acid groups on the peptide is modified as an aromatic or aliphatic ester. Any combination of the above modifications is also contemplated.
[0027]
Another embodiment of the present invention relates to a RI IL-6-derived peptide or the above, having an effective amount of axon growth-promoting, 17 to about 40 amino acids and represented by SEQ ID NO: 1 A method of promoting axonal growth in differentiated or undifferentiated nerve cells by administering an RI peptide comprising an analog thereof having the same activity as described above.
[0028]
The ability of any such peptide to stimulate axonal growth can be readily determined by one skilled in the art using the methods described in Examples 1-9 below. The ability of any particular IL-6-derived peptide to mediate the same activity of native IL-6 can be determined using standard assays for the parent peptide discussed in Examples 10-12.
[0029]
A typical minimum amount of a RI peptide of the invention for neurotrophic activity in cell growth media is usually at least about 5 ng / ml. This amount or more of the RI peptide of the present invention is envisaged for in vitro use. Typically, these peptides are used at concentrations ranging from 0.1 to about 10 g / ml. An effective amount for any particular tissue can be determined according to Example 1.
[0030]
T cells, B cells or neurons can be treated in vitro or ex vivo by administering the RI peptide of the present invention directly to the cells. This can be done, for example, by culturing the cells in an appropriate growth medium for a particular cell type and then adding the peptide to the medium. Typically in vertebrates, preferably mammals, when the cells to be treated are in vivo, the composition can be administered by one of several techniques. Most preferably, the composition is injected directly into the blood in an amount sufficient to provide the desired local concentration of peptide. These RI peptides are long-lasting in vivo because of D peptide binding. In peptides lacking lysine and arginine residues, proteolysis is reduced. Smaller peptides (ie 50-mer or less) appear to cross the blood brain barrier most often and enter the central nervous system for the treatment of CNS diseases (Banks et al., Peptides, 13: 1289-1294 , 1992).
[0031]
For the treatment of neurological diseases, direct intracranial injection or injection into cerebrospinal fluid can also be used in an amount sufficient to give the desired local concentration of neurotrophin. In both cases, a pharmaceutically acceptable injectable carrier is used. Such carriers include, for example, phosphate buffered saline and Ringer's solution. Alternatively, the composition can be administered to peripheral nerve tissue by direct local injection or systemic administration. Various conventional modes of administration are anticipated, including intravenous, pulmonary, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, epidural, intrathecal, topical and oral. Pharmaceutically acceptable carriers for topical administration include creams, gels, pastes, ointments, lotions, suspensions, emulsions and dispersions.
[0032]
The peptide composition of the present invention is in unit dosage form, for example, an injectable composition or a topical preparation at a dosage equivalent to the daily dosage administered to a patient, or as a controlled release composition. Can be packaged and administered. Septum-sealed bottles containing daily doses of active ingredient in PBS or in lyophilized solution are examples of unit doses. In a preferred embodiment, the daily RI peptide of the present invention based on vertebrate body weight for promoting IL-6 effects such as T cell activation and for the treatment of neurodegenerative or demyelinating diseases. Systemic dosages range from about 0.01 to about 10,000 g / kg. More preferably, the daily systemic dosage is about 0.1 to 1,000 g / kg. Most preferably, the daily systemic dose is about 10-100 g / kg. Daily doses of topically administered substances are on the order of nearly smaller sizes. Oral administration is particularly preferred because the peptide is resistant to proteolysis in the gastrointestinal system.
[0033]
In one preferred embodiment of the invention, the peptide is administered locally to a neuronal cell in vivo by implantation thereof. For example, polylactic acid, polygalactic acid, regenerated collagen, multilamellar liposomes and many other conventional storage formulations can be formulated with biologically active neurotrophic peptide compositions or bioerodible or Contains biodegradable substances. When implanted, these materials gradually break down, releasing the active material into the surrounding tissue. The use of bioerodible, biodegradable and other accumulation formulations is specifically contemplated in the present invention. Combinations with infusion pumps, matrix entrapment systems and transdermal delivery devices are also contemplated. The peptide can also be encapsulated in a polyethylene glycol conformal coating prior to implantation, as described in US Pat. No. 5,529,914.
[0034]
The peptides of the invention can also be encapsulated in micelles or liposomes. Liposome encapsulation technology is well known. Liposomes can be targeted to specific tissues, such as neural tissue, through the use of receptors, ligands or antibodies that can bind to the targeted tissue. The manufacture of these formulations is well known in the art (Radin et al., Meth. Enzymol., 98: 613-618, 1983).
[0035]
Currently, there are no drugs available that can promote full functional regeneration and restoration of the structural integrity of the nervous system. This is especially true for CNS. Any degree of regeneration of peripheral nerves through the use of neurotrophic factors is within the scope of the present invention. Furthermore, neurotrophic factors may be therapeutically useful in the treatment of neurodegenerative diseases associated with degeneration of neuronal populations or specific areas of the brain. The main cause of Parkinson's disease is degeneration of nigral dopaminergic neurons. Since antibodies against prosaposin immunohistologically stain substantia nigra dopaminergic neurons in human brain sections, the RI peptides of the present invention may be therapeutically useful in the treatment of Parkinson's disease. Retinal neuropathy, a optic neurodegenerative disease that leads to visual field loss with age, can also be treated with the RI peptides of the present invention.
[0036]
To reach the neuronal population of the brain, it has long been believed that neurotrophic factors must be administered into the cerebrum because these proteins do not cross the blood brain barrier. US Pat. No. 5,571,787 discloses that an iodinated neurotrophic 18-mer fragment derived from saposin C crosses the blood brain barrier. Thus, RI peptides having up to about 22 amino acids also cross this barrier and can thus be administered intravenously. Other neuronal populations, such as motor neurons, can also be treated by intravenous injection, although direct injection into cerebrospinal fluid is also envisioned as an alternative route.
[0037]
Cells can be treated in the manner described above in vivo, ex vivo or in vitro to promote myelination or prevent demyelination. . Diseases that result in demyelination of nerve fibers [MS, acute metastatic leukoencephalitis, trauma to the brain and / or spinal cord, progressive multifocal leukoencephalitis, metachromatic leukodystrophy, adrenal leukodystrophy, and white matter in premature infants Maldevelopment (including periventicular leucomalacia) can be delayed or stopped by administering the neurotrophic peptides of the invention to the affected cells.
[0038]
The RI IL-6 derived peptide composition of the present invention is also used to help activate T cells, increase the survival of cultured motor neurons, and determine the effects of neurotrophic factors and myelin promoters Can do. More practically, however, they have immediate use as laboratory reagents and as components of cell growth media to promote hematopoiesis and to maintain nerve cells in vitro.
[0039]
The peptides of the invention are synthesized using automated solid phase protocols that are well known in the art. All peptides are purified to purity above about 95% by high performance liquid chromatography (HPLC) on reverse phase columns before use.
[0040]
The following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention.
[0041]
Example 1
Stimulation of axonal growth
NS20Y neuroblastoma cells are grown in DMEM containing 10% fetal calf serum (FCS). Cells are removed with trypsin and cultured on coverslips in 30 mm Petri dishes. After 20-24 hours, the medium was washed with 0.5% FCS and 0, 0.5, 1, 2, 4 or 8 ng / ml RI IL-6 derived peptide (having 17 to about 40 amino acids, SEQ ID NO: 1 Replace with 2 ml of DEME containing (including the sequence shown in). The cells were further cultured for 24 hours, washed with PBS and fixed with Bouin's solution (saturated aqueous picric acid / formalin / acetic acid 15: 5: 1) for 30 minutes. The fixative was removed with PBS and scored for axonal growth under a phase contrast microscope. Cells showing one or more axons clearly defined as longer than one cell diameter were scored as positive. In different parts of each dish, at least 200 cells were scored to determine the percentage of cells with axons and the assay was performed in duplicate.
[0042]
Example 2
Prevention of cell death
NS20Y cells were cultured as in Example 1 and in the presence of 8 ng / ml RI IL-6 derived peptide (having 17 to about 40 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 1). Alternatively, grow for 2 days on a cover glass in 0.5% fetal calf serum in the absence. Remove the medium and add 0.2% trypan blue in PBS to each well. Blue stained dead cells are scored as a percentage of the total on an inverted microscope and 400 cells are counted in 4 regions of each well. The average error in duplicate assays was 5%.
[0043]
Example 3
Ix Vivo (ex vivo) Of axonal growth in Japan
Sensory neurons were prepared by removing spinal ganglia from adult rats as described by Kuffler et al. (J. Neurobiol. 25: 1267-1282, 1994). Neurons are treated with 0.5 ng / ml RI IL-6 derived peptide (having 17 to about 40 amino acids and including the sequence shown in SEQ ID NO: 1). Three days after treatment, the length of the longest axon protrusion is measured with a micrometer grid. The longest axons in neurons treated with RI peptide are about 3 times longer than those treated with control (non-RI) peptide or untreated controls. After 48 hours of treatment, all cells respond similarly to nerve growth factor (NGF), where extensive branching is observed. These results indicate that IL-3 derived peptides promote sensory neuron differentiation.
[0044]
Example 4
Reversal of demyelination in a rat model
Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) is a rat model of human multiple sclerosis (MS). In rats, EAE is induced by injecting a foreign protein (guinea pig spinal cord), which leads to inflammation and demyelination in white matter after 11 days. This demyelination is similar to that seen in actively demyelinating human MS disorders (Liu et al., Multiple Sclerosis 1: 2-9, 1995).
[0045]
Infusion of an emulsion of guinea pig spinal cord and complete Freund's adjuvant (CFA) induces EAE in Lewis rats. On day 14, when it appears to be weak, treatment with a RI IL-6 derived peptide (having 17 to about 40 amino acids, including the sequence shown in SEQ ID NO: 1) is initiated. (200g / kg intramuscular), continue for 8 days daily. Six rats are injected with vehicle only. On 14th and 22nd, the length of one step (a measure of muscle weakness) is scored. In addition, mm²The number and size of demyelinating disorders (plaques) in the spinal cord is scored on day 22. Finally, the amount of cholesterol ester in the brain (marker of myelin destruction) is scored on the 22nd.
[0046]
The length of one step in both groups decreased on day 14, whereas animals treated with IL-6 derived peptides returned to normal after 8 days of treatment, whereas vehicle treated animals returned. Absent. A significant decrease in cholesterol ester content is observed in the brain of the treatment group. Furthermore, the number of spinal cord disorders is significantly reduced after 10 days of treatment with IL-6 derived peptides. Finally, the average obstacle size is significantly reduced. There is no difference in weight loss between control and experimental animals. These results show a significant clinical biochemical and morphological reversal of EAE after systemic treatment with IL-6 derived peptides. This effect is different from the recent anti-inflammatory effects of MS drugs that do not directly affect myelin repair.
[0047]
Example 5
Ix Vivo (ex vivo) Myelination assay
Neonatal mouse cerebellar explants are prepared according to Satomi (Zool. Sci. 9: 127-137, 1992). Axon growth and myelination are observed in culture for 22 days, during which time the cerebellum of newborn mice normally undergo neuronal differentiation and myelination begins. A RI IL-6 derived peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is added on the second day after preparation of the explant (3 controls and 3 extra treatments). Graft), axon growth and myelination are assessed under a bright field microscope with a video camera. Saposin C is used as a positive control at a concentration of about 1-10 g / ml. Myelination is stimulated by IL-6 derived peptides to the same extent as with saposin C.
[0048]
Alternatively, myelination is³⁵It can be assayed by incorporating S into sulfolipid (which is limited to myelin, as described below).
[0049]
Example 6
³⁵ S Incorporation into sulfolipid
Primary myelin-containing Schwann cells were incubated in low sulfate medium (DMEM) containing 0.5% fetal bovine serum (FBS) for 48 hours,³⁵Add S-methionine and a RI IL-6 derived peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Saposin C is used as a positive control. Cells are rinsed with PBS, harvested and sonicated in 100 liters of distilled water. An aliquot of cell lysate is removed for protein analysis and the remainder is extracted with 5 ml of chloroform / methanol (2: 1, volume / volume). The lipid extract is chromatographed and immunostained with an anti-sulfatide monoclonal antibody as described in Hiraiwa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 4778-4781. Similar amounts of sulfatide are observed after peptide and saposin C treatment.
[0050]
Example 7
Traumatic ischemic CNS In the treatment of disorders RI Use of peptides
Humans with traumatic disorders in the brain or spinal cord have about 100 g / kg of RI IL-6 derived peptide (having 17 to about 40 amino acids, shown in SEQ ID NO: 1, in sterile saline solution or in accumulated form Receive a systemic injection). The improvement due to the acquisition of sensory or motor function is assessed (ie increased limb movement). Continue treatment until no further improvement occurs.
[0051]
Example 8
In the treatment of demyelinating diseases RI Use of peptides
RI IL comprising about 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 by systemic infusion using the same dosage range as in Example 7 in patients diagnosed with early stage MS -6 derived peptides are given. Dosing is repeated daily or weekly, improving muscle strength, musculoskeletal coordination and myelination (determined by MRI) are observed. Patients with chronic relapse MS are treated in the same way when the next relapse occurs.
[0052]
Example 9
IL-6 Proliferation assay
Most bioassays for IL-6 rely on the proliferative effects of this cytokine on IL-6-dependent murine hybridoma cell lines such as MH60 B9 and 7TD1 (ATCC CRL 1851). Detailed protocols for the IL-6 assay can be found in Cytokines, a Practical aproach, Balkwill, F., ed., IRL Press, New York, second edition, 1995, pp. 365-366. This entire content is incorporated herein by reference. The IL-6 dependent murine hybridoma cell line B9 provides a reliable and sensitive assay for mammalian IL-6. B9 cells, 75cm² Incubate in RPMI 1640 medium supplemented with 5% FCS and approximately 100 pg / ml (10 IU / ml) IL-6. The culture is divided every 2-3 days, 1: 5 to 1:10, and the cell density is about 5 × 10 5.^Five Resupply IL-6 when cells / ml are reached. Cultivate the culture with humidity-controlled CO₂ Maintain at 37 ° C in an incubator.
[0053]
B9 cells were washed 2 days after feeding and 5 × 10 5 in RPMI 1640 medium supplemented with 5% FCS.^Four Resuspend to a density of cells / ml. Distribute IL-6 standards in 96-well microtiter plates as serial 2-fold dilutions in triplicate in 100 l volumes. Standard titration starts at 100 pg / ml (10 IU / ml) and is diluted to 0.1 pg / ml (0.01 IU / ml). An appropriate dilution of a RI IL-6 derived peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1, to be measured for IL-6 activity, is made in triplicate in a volume of 100 l. . As a negative control, culture medium alone is included. Cell suspension (100 l) is added to each well and the plate is washed with humidity-controlled CO.₂ Incubate in an incubator at 37 ° C for approximately 72 hours. Tetrazolium salt MTT (10 l) is added to each well and the plate is incubated for an additional 4.5 hours. Sodium dodecyl sulfate (SDS) (25 liters) was added per well, and the plate was adjusted to the visibility control CO.₂ Incubate overnight at 37 ° C. in an incubator and measure the absorbance at 620 nm using a plate reader. Plot a standard curve of absorption versus concentration of IL-6. To measure activity in RI IL-6 derived peptide samples, test results are compared to the standard curve to determine whether the particular peptide has IL-6 activity.
[0054]
Example 10
IL-6 IgG Secretion assay
IL-6 can be evaluated by its ability to enhance differentiation and IgG secretion within an EBV transformed human lymphoblast cell line, eg, CESS (ATCC TIB 190). CESS cells are harvested from an active long-term growth culture. The cells are subcultured in advance for 24-48 hours. Cultures containing many dead cells or growing slowly will not work well in the assay. Cells are washed once and 10% in culture medium.⁶ Resuspend to cells / ml. IL-6 (100 l) or RI IL-6 derived peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is added to 6 replicate cultures at each cell concentration. Media alone is added to a set of 6 wells as a negative control. Cells in air with 5% CO₂Incubate at 37 ° C. for 5-7 days. Cell supernatants are harvested and assayed for immunoglobulin content.
[0055]
Affinity purified goat anti-human IgG (75 l) is aliquoted in bicarbonate coating buffer and incubated overnight at room temperature. Individual batches of antisera are pre-titrated and the optimal signal to noise ratio is determined with high, medium and low concentrations of IgG. The wells are washed 3 times with PBS / Tween-20. To block remaining protein binding sites, 100 l PBS / BSA / Tween-20 is added to each well and incubated for 30-90 minutes at room temperature. Normal goat serum (4%) diluted in PBS can also be used in this step. The wells are washed 3 times with PBS / Tween and 75 l of test supernatant and standard are added in duplicate. An 11-point standard curve using either a pooled normal human serum or a doubling dilution of partially purified IgG at 1,000 ng / ml in PBS / BSA / Tween-20, with a buffer-only zero standard, Duplicate settings were made for each plate. Plates are incubated for 1-2 hours at room temperature. The wells are washed 3 times with PBS / Tween-20. To each well is added 75 liters of alkaline phosphatase (AP) -bound affinity purified goat anti-human IgG horseradish peroxidase (HPO) diluted in PBS / BSA / Tween-20. Titrate individual batches of antisera to determine optimal dilution.
[0056]
Example 11
IL-6 Depending on the peptide derived TNF Release inhibition
An RI peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is assayed for its ability to inhibit LPS-induced release of TNF. Activated by the addition of macrophage bacterial lipopolysaccharide (LPS), leading to the release of TNF into the culture medium, which can be assayed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). IL-6 is known to inhibit LPS-induced release of TNF (Aderka et al., J. Immunol. 143: 3517-3523, 1989). In cultures treated with IL-6 derived peptides prior to LPS stimulation, the amount of TNF released is significantly reduced compared to cultures that did not receive the peptide.
[0057]
It goes without saying that the present invention is not limited only to the embodiments described in the detailed description. All embodiments that retain the essence of the invention should be construed as being within the scope of the invention. However, the invention is limited only by the following claims.

Claims (10)

  A retro-inverso peptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 1. The peptide may be CH ₃ CO, CH ₃ (CH ₂ ) _n CO, C ₆ H ₅ CH ₂ CO and H ₂ N (CH ₂ ) _n CO at the amino terminus, carboxy terminus, or both amino terminus and carboxy terminus. The peptide according to claim 1, wherein the peptide is modified with a moiety independently selected from the group consisting of (n = 1 to 10).   2. The peptide of claim 1, wherein the peptide is glycosylated.   2. The peptide of claim 1, wherein the one or more amide bonds are reduced.   2. The peptide of claim 1, wherein one or more nitrogens in the peptide are methylated.   The peptide according to claim 1, wherein one or more carboxylic acid groups in the peptide are esterified.   A composition for promoting axonal growth or myelination in a mammal, comprising a retro-inverso peptide consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 8. A composition according to claim 7, wherein the mammal is a human.   Use of a retro-inverso peptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the manufacture of a medicament for promoting axonal growth or myelination in a mammal.   10. Use according to claim 9, wherein the mammal is a human.