JP4779089B2 - Novel functional nucleic acid targeting NS3 protease and helicase of hepatitis C virus - Google Patents

Description

（二次構造中、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルであり、iは３〜９のいずれかの整数であり、jは３〜７のいずれかの整数であるが、但し、２i＋j≦２２であり、ｎ₁〜ｎ_jは、それぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であり、ｘ₁〜ｘ_iおよびｙ₁〜ｙ_iは、それぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であるが、但し、ｘ_kとｙ_k(ｋ＝1〜i)は互いに相補的な塩基であり、核酸塩基間をつなぐ実線は相補的塩基対の形成を示し、核酸塩基間の黒丸はワブル塩基対の形成を示す。）
ＲＮＡ分子の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウェア(Mulfoldプログラム（Zuker, M. (1989) Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180, 202-287.）など）に塩基配列を入力して予測することができ、このような方法で、あるＲＮＡ分子が二次構造(I)をとることが予測された場合に、そのＲＮＡ分子は二次構造(I)をとることができるものとする。あるいはまた、ＲＮＡ分子の二次構造は、RNA分解酵素による限定分解法、化学試薬による修飾法、修飾ヌクレオチド導入と限定分解を組み合わせた修飾干渉法のような実験的な手法で確認してもよい。
【００１２】
上記の塩基配列（１）のＮは塩基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個の塩基配列である。塩基配列（１）のＸおよびＹは互いに相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。Ｎ、ＸおよびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であるが、好ましくは、10〜13個である。
【００１３】
上記の二次構造(I)のｎ₁ｎ₂・・・ｎ_jは塩基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個の塩基配列である。二次構造(I)のｘ₁ｘ₂・・・ｘ_iおよびy₁y₂・・・y_iは互いに相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。２ｉ＋ｊは２２以下であるが、好ましくは、10〜13である。
【００１４】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに少なくとも14個のU（Uはウラシルである。）を有してもよい。
【００１５】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに１個のU（Uはウラシルである。）を有してもよい。
【００１６】
塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末端のUの後に、さらに5'-UCCUCUUCU-3'（配列中、Uはウラシルであり、Cはシトシンである。）の塩基配列を有してもよい。
【００１７】
本発明のＲＮＡ分子の例としては、下記の(i)〜(vii)のいずれかの塩基配列を有するものが挙げられる。
(i) ΔLoopII
5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号４）
(ii) ΔStemII
5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号５）
(iii) NEO-I
5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号６）
(iv) NEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号７）
(v) NEO-II
5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号８）
(vi) ΔNEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3'（配列番号９）
(vii) NEO-III-14U
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０）
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写因子の制御下に含む発現ベクターを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子または上記の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するために使用することができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、Ｃ型肝炎を予防および／または治療するために使用することができる。
【００２１】
本発明は、上記のＲＮＡ分子を有効成分として含み、Ｃ型肝炎を診断するための医薬組成物も提供する。
【００２２】
本明細書において、「相補的な塩基配列」とは、互いに塩基対を形成しうるような核酸の塩基配列をいう。塩基対として、ＲＮＡでは、アデニン(A)とウラシル(U)との対合、グアニン(G)とシトシン(C)との対合を例示することができ、また、GとUのワブル塩基対も含まれる。
【００２３】
「アプタマー」とは、アミノ酸のような小分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認識する核酸分子を意味する。
【００２４】
「ステム構造」とは、塩基対合により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。
【００２５】
「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造をいう。例えば、図１にはRNAアプタマーG9-I、G9-IIおよびG9-IIIの二次構造が示されているが、ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ構造である。
【００２６】
「ループ−ステム構造」とは、一本鎖のRNAがループとステムを形成した構造をいう。
【００２７】
「転写因子」とは、DNA遺伝情報がRNAへ転写される過程で転写を調節する因子をいう。この因子には、例えば、プロモーターやエンハンサーが含まれる。プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列などからなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核細胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在して、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、この場合、任意の誘導物質によって転写をコントロールすることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明を詳細に説明する。
【００２９】
Full-NS3 導入ベクターの構築
まず、NS3を完全にカバーする領域である、HCV前駆蛋白質のアミノ酸1027〜1657番をコードするcDNA断片を、pMAN34NSH（Kakiuchi,N. ら (1995) Bacterial expression and analysis of cleavage activity of HCV serine proteinase using recombinant and synthetic substrate, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）を鋳型としてPCR法により得た。次にこの断片をベクターpGEMEX-1(Promega)に挿入した。以上のようにして得られたpT7Full-NS3からは、ヒスチジン６残基が付加した完全長NS3が得られ、以下に説明するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３０】
蛋白質の発現と精製
NS3プロテアーゼ（ΔNS3; アミノ酸 1027-1218、25 kDa）とマルトース結合性蛋白質を付加させた完全長NS3（MBP-NS3; アミノ酸 985-1647、110 kDa）はすでに報告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で大腸菌HB101内で発現させ、精製した。NS3プロテアーゼの基質として用いた、NS5A-5B切断部位を含む17アミノ酸からなるペプチド（S1; Dns GEAGDDIVPC*SMSYTWT Dns：ダンシル残基、*：切断部位）およびNS4Aペプチド（P41; アミノ酸 1673-1692）も、すでに報告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で精製した。
pT7Full-NS3をBL21(DE3)に導入したのち、100 μg/mlのアンピシリンを含むL-ブロース培地中で、600 nmでの吸光度が0.5に達するまで30℃で培養し、さらにその時点から8時間培養した。Full-NS3はT7 RNA polymeraseプロモーターにより発現を調節されている。つぎに培養した大腸菌を遠心（6000回転、15分）し、ペレットをバッファーA[20 mM Tris-HCl (pH7.6)、0.5 M NaCl、5 mMイミダゾール]で懸濁し、さらにマイクロチップ-ホーンを用いてソニケーション（0℃、30秒、10回、インターバルを各回ごとに2分）した。この菌体溶液を遠心（12000回転、30分、4℃）し、上清をバッファーAで平衡化させたNi-NTAカラムにロードした。カラムをバッファーAで洗浄し、5 mMから1 Mのイミダゾールを含むバッファーAで溶出を行った。各フラクション中のFull-NS3は10% SDS-PAGEを行った後、クマシーブリリアントブルー染色により確認した。つぎにFull-NS3を含んだフラクションをTNEバッファー[10 mM Tris-HCl (pH7.6)、50 mM NaCl、1 mM EDTA] で透析し、これをTNEバッファーで平衡化させたポリ(U)-セファロース4Bカラムにロードし、TNEバッファーで洗浄した。溶出は、溶出バッファー[10 mM Tris-HCl (pH7.6)、1 M NaCl、1 mM EDTA]によって行い、先に述べた方法で、Full-NS3を含んだフラクションを選別し、TNEバッファーで透析した。さらにこれをAmicon Centriprep-10を用いて濃縮し、等量のグリセロールを加え、これを以下の実験に用いた。得られたFull-NS3は純度99%以上の高純度なものである。
【００３１】
フィルターバインディングアッセイによる平衡解離定数の決定
機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数（Kd）は、³²Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1から700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl₂、10 mM DTT]をニトロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッファーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性をもとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定数を決定した。
【００３２】
プロテアーゼ活性の測定
まず、RNAとΔNS3とP41をバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl₂、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質であるS1を加え、25℃で、40分（ΔNS3）または80分 (Full-NS3)インキュベートし、最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液を加えて反応を停止させた。この反応溶液をアセトニトリルの濃度勾配を用いた、逆相クロマトグラフィーカラムにロードした。切断された基質の蛍光シグナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００３３】
Full-NS3 のヘリカーゼ活性の測定
ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテリオファージM13mp18 1本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端を[γ-³²P]ATPでラベルした30塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl (pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。
Full-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 mM MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl₂、3 mM ATP]中で、室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6 fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を加えることで行った。このようにして得られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000で基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算出した。
【００３４】
G9-I RNA の作製
G9-I、およびΔNEO-III-14Uの変異体は、ミュータジェニックプライマーを用いたPCRにより、増幅し、シークエンシングを行うことにより配列を確認した。
【００３５】
G9-I アプタマーのステム - ループ領域の変異体の解析
G9-I、G9-II、G9-III（G9アプタマー）の二次構造は、Mulfoldプログラムにより推測し、G9アプタマーのステムIとループIIIが共通であることがわかった（図1）。これまでに本発明者らは、ステムIとステム-ループIIIがNS3プロテアーゼ活性の阻害に必須であることを明らかにしている。また、これらの領域中には、ループIIIにおける共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）を含んでいた（図1、2）。ステムIIの2つの2重鎖を欠失させたΔSII、およびループIIの大半を削除したΔLIIはG9-Iと同等にNS3プロテアーゼに対する阻害活性を持っていた（図2）。このことは、ステム-ループIIがNS3プロテアーゼに対する阻害に関しては、必須でないことを示唆している。しかしながら、ステム-ループIIIがステムIと直接連結しているdRIIは、G9-Iに比べて45%の阻害活性しか保持していなかった。本発明者らはG9-Iをもとに、G9-Iの阻害活性を維持するために最低限必要な共通構造を明らかにするため、さらに3つの変異体（dRII-Δ7A、dRII-Δ7A8U、dRII-Δ7A8U9U；図3）を作製し、その機能を解析した。これらのNS3プロテアーゼ阻害活性はdRIIと同様、G9-Iに比べて弱い阻害活性を示した（図4A）。この結果より、G9-Iと同等のNS3プロテアーゼ阻害活性を持つ変異体は、ステム-ループIIのスペーサー配列の長さを変化させても得られないことが示された。
さらにステム-ループIIの機能について解析するために、この領域に変異を加えたものを作製した。まず、ΔSIIとΔLIIのG9-Iから削除した部分の両方を削除した変異体であるNEO-Iを作製した（図2）。さらにNEO-IのステムIIの2本鎖部を1つずつ欠失させたものであるNEO-IIとNEO-IIIを作製した（図2）。これら3種の変異体のNS3プロテアーゼ阻害活性をしらべたところ、すべてが95％阻害し、G9-Iと同等の機能を維持していることがわかった（図4B）。以上の結果から、G9-Iの機能維持には、ステムIIの領域にいくつかの2重鎖構造が配列非依存的に必要であることが示された。
すでに本発明者らは、G9アプタマーの3'末端の11ヌクレオチドは、ΔNS3の結合には関与していないことを明らかにしている。そこで、今回得たNEO-IIIの3'端の1本鎖部を削除してΔNEO-IIIとし（図2）、その阻害活性を調べた。その結果、G9-Iと同等にΔNS3のプロテアーゼ活性を阻害することがわかった（図4A）。こうして、G9アプタマーと同等の機能をもつ最小のアプタマーが得られた。
【００３６】
NEO-III-14U の構築とそのターゲットへの結合性
これまでアプタマーのターゲットとして用いてきたFull-NS3は、NS2のC末端側の一部を有し、NS3のC末端側の一部を欠いているものであった。最近になって、NS3ヘリカーゼドメインの最後尾のβ鎖が、プロテアーゼドメインの活性部位と接しており、重要なはたらきをしている可能性があることが報告されたため、より生理的条件に近づけるためには完全なFull-NS3を用いる必要性が示唆された。そのため、本発明者らは今回完全長Full-NS3を精製し、用いた。
NS3ヘリカーゼは、3個のドメインからなり、1本鎖のオリゴヌクレオチドが、ドメインI、IIと、ドメインIIIのあいだの割れ目に結合することが報告されている。中でもホモリボポリマー、特にPoly(U)配列がよく結合し、しかもヘリカーゼ活性を阻害することが報告されている。そこで本発明者らは、HCVのNS3プロテアーゼとNS3ヘリカーゼの両方を阻害することを目的としてΔNEO-IIIの3'端に14U配列を付加させたNEO-III-14Uを構築した。
NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の効果を調べるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3に対する結合を比較し、Kd値を算出した（図5）。その結果、NEO-III-14U（マル；約10 nM）がG9-I（シカク；約90 nM）とΔNEO-III（ヒシガタ；約90 nM）に比べて、9倍もFull-NS3に対する親和性が高いことが明らかとなった。よって、NEO-III-14Uの(U)14配列は、Full-NSに対する親和性を高めるはたらきをすることが示された。
【００３７】
NEO-III-14U の Full-NS3 プロテアーゼ活性阻害効果
NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の、Full-NS3プロテアーゼ阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼに対する阻害活性を測定した（図6）。その結果、NEO-III-14U（マル）がΔNEO-III（ヒシガタ）よりもFull-NS3プロテアーゼ活性を阻害し、Full-NS3の2倍のモル量で約80%阻害することがわかった。また、poly(U)20存在下における同様の反応を解析した結果、Full-NS3プロテアーゼ活性に対する影響は見られなかった（サンカク）。さらにヘリカーゼ活性が、NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果に対して、負の調節を行うという可能性を否定するために、ATPおよびMg²⁺の存在下というヘリカーゼが活性化する条件で、NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ阻害活性を測定した（シカク）。その結果、NEO-III-14Uは高いプロテアーゼ阻害活性を保持していた。
以上のことから、今回新たに作製したNEO-III-14Uは、in vitroにおいてFull-NS3プロテアーゼを強力に阻害するものであることが示された。
【００３８】
NEO-III-14U による Full-NS3 ヘリカーゼ活性阻害効果
バクテリオファージM13mp 18 1本鎖DNAと、5'末端を[γ-³²P]ATPでラベルした30塩基の相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで得た基質をもちいて、Full-NS3のヘリカーゼ活性を測定した。その結果、基質濃度2.6 fmolに対して、Full-NS3の濃度100 nMでほぼ完全に基質は1本鎖となることがわかった（図7A；レーン2）。つぎにpoly(U)20のFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果をしらべたところ、poly(U)20がFull-NS3に対して2,000倍量で、Full-NS3ヘリカーゼ活性を50%阻害することがわかった（図7A；レーン7）。さらに、NEO-III-14Uの(U)14配列の、Full-NS3ヘリカーゼ活性阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3ヘリカーゼに対する阻害活性を測定した（図7B）。その結果、NEO-III-14UをFull-NS3の20〜50倍量加えることで、ヘリカーゼ活性をほぼ完全に抑制した（図7B；レーン13、14）。これに対してΔNEO-IIIは、NEO-III-14Uと同量を加えても低い阻害効果しかなかった（図7B；レーン6、7）。これらの結果から、NEO-III-14Uは、NS3プロテアーゼ活性とNS3ヘリカーゼ活性の両方を阻害し、強力にHCVの増殖を抑制できるものと期待できる。
【００３９】
NEO-III-14U による、 Full-NS3 と HCV RNA の 3' 末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害
Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製にかかわっていると思われていることから、この結合は、ヘリカーゼがHCVの2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなっていることが考えられる。よってこのステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害を調べた（図8）。
Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製に関わっていると考えられていることから、この結合は、NS3ヘリカーゼがHCVゲノムの2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなっていることが考えられる。よってこのステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害能を調べた（図8A、8B）。
まずプローブとして、32p-ラベルしたプラス鎖におけるvariable region-poly(U/C) stretch-3'X region (164ヌクレオチド；3'(+) UTRプローブ)とプラス鎖の1-127に対して相補的な3'(-) UTRプローブを調整した。NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5, 25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50, 100 and 200 μM)を含む反応液（Full-NS3；3'(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）を、室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて、30℃で15分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性を解析した。その結果、3'(+) UTRおよび3'(-) UTRに対するFull-NS3の結合は、NEO-III-14Uの濃度上昇とともに阻害された。特に3'(+) UTRにおいては、プローブに対して50当量過剰のNEO-III-14Uを加えると約１５％に抑制された。
【００４０】
アプタマー発現ベクター
上記のG9-I変異体アプタマーをコードするDNAを作製し、これを転写因子を含むベクターに組み込むことによって、G9-I変異体アプタマー発現ベクターを得ることができる。
G9-I変異体アプタマーをコードするDNAは、当業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えば、DNA/RNA合成機を用いて製造することができる。また、合成したDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術を利用して、あるいは、該DNAを含むベクターによって形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換および発現技術は、例えば、J. Sambrookら(Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second edition, 1989)に記載されている。発現系を構築するためのベクターとしては、pUCI9（宝酒造、京都）、pGREEN LANTERN（ライフテックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995))などのプラスミドベクター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等）などを使用できる。
上記ベクターにおいて、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの上流にはプロモーター配列を含むことができる。プロモーター配列は、G9-I変異体アプタマーの発現を調節する要素であり、ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスプロモーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロモーターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロモーター（例えば、tRNA^valプロモーター）など）、β−アクチンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロモーター（特に、tRNAプロモーター）、β−アクチンプロモーターが好ましく使用できる。さらに、転写因子としてプロモーターとエンハンサーの組み合わせを使用してもよい。エンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス由来のものが使用できる。
また、本発明のベクターにおいては、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの下流にターミネーター配列をさらに含むことができる。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれの配列も使用でき、ターミネーター配列としてUUUUUを使用できる。ベクターは、必要に応じて、抗生物質耐性遺伝子（例えば、Amp^r,、Neo^r)、栄養要求性を相補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含むことができる。
【００４１】
医薬組成物
本発明のアプタマーおよび発現ベクターは、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するために用いることができ、具体的には、Ｃ型肝炎を予防および／または治療するために用いることができる。
HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明のアプタマーまたは発現ベクターを導入することによって、細胞中のHCVのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはヘリカーゼを阻害し、HCVの増殖を阻止することができる。アプタマーまたは発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（"Lipidic vector systems for gene transfer"(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14, 173-206；中西守ら、蛋白質 核酸 酵素 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999))、リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、in vitroで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約１０^７pfu/ml以上である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法については、例えば、"Viral vectors in gene therapy" (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807-838に記載されている。
本発明のアプタマーまたは発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
また、本発明のアプタマーを用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のアプタマーを抗体の代わりに利用することができる。本発明のアプタマーを蛍光などで標識しておき、HCVに感染している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
［実施例１］ G9-I変異体アプタマーの作製
変異体アプタマーは後記の各鋳型DNAを用い、試験管内転写法により調製した。試験管内転写は、鋳型DNA（2.5μg）を40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、4.0 mM スペルミジン、10 mM DTT、15 mM MgCl₂、 0.05% Triton X-100、7.5 mM づつの４種類のNTPの存在下、T7RNAポリメラーゼ（0.08 μg/μl）に加え、全量20 μlで37℃で３時間反応した。反応後、７M尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離精製した。
(i)ΔloopII
ΔloopII forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGAGCTTCGGGATTTGAGGG-3'（配列番号１５）と
reverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用いた。
G-9IをコードしたDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 universal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらを試験管内転写によりRNAに転写して以下の実験に用いた。
(ii)ΔstemII
ΔstemII forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGACCAGAAGCTCTGGTTTGAGGG-3'（配列番号１７） と reverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (i) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(iii)NEO-I
合成NEO-I template DNA、
5'- GGGAGAACCGAGCTTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列番号１８）とNEO-I forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGAGCTTCGG-3'（配列番号１９）とreverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、PCRを行った（94℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを6回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 secのサイクルを12回）。得られたDNA断片を精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 universal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらをRNAに転写して以下の実験に用いた。
(iv)NEO-III
合成NEO-III template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列番号２０）とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１） とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(v)NEO-II
合成NEO-II template DNA、
5'- GGGAGAACCGGCTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT 3'（配列番号２２）とNEO-II forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGGCTCGGTT-3'（配列番号２３） とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (iv) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(vi)ΔNEO-III
合成NEO-III template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCT-3'（配列番号２４） とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）とΔNEO-III reverseプライマー、 5'-AGGAGAGAGGAAAGGTAGTCC-3'（配列番号２２）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
(vii)NEO-III-14U
合成NEO-III-14U template DNA、
5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号２５）とNEO-III forwardプライマー、
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１） とΔNEO-III-14U reverseプライマー、 5'- AAAAAAAAAAAAAAGGAGAGAGGAAAGG -3'（配列番号２６）を用い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
【００４４】
［実施例２］ G9-I変異体アプタマーのFull-NS3に対する結合性の測定
機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数（Kd）は、³²Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1から700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl₂、10 mM DTT]をニトロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッファーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性をもとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定数を決定した。
【００４５】
［実施例３］ G9-I変異体アプタマーのFull-NS3プロテアーゼ活性阻害効果の測定
まず、RNAアプタマーとFull-NS3プロテアーゼとP41をバッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl₂、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質であるS1（最終濃度49.8 μM）を加え、全量15 μlとし、25℃で、80分インキュベートした。反応は最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液を加えて停止させた。この反応溶液を逆相HPLC（TSKgel ODS-120T; 4 ml）にロードし、50 mM酢酸アンモニウムバッファー（pH 6.5）を含むアセトニトリルの濃度勾配を用い、溶出、分析した。切断された基質の蛍光シグナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００４６】
［実施例４］ G9-I変異体アプタマーのFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果の測定
ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテリオファージM13mp18 1本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端を[γ-³²P]ATPでラベルした30塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチド
5'-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG-3'（配列番号２７）
をアニーリングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl (pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。
Full-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 mM MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl₂、3 mM ATP]中（全量20μl）で、室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6 fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を加えることで行った。このようにして得られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000（富士フィルム）で基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算出した。
【００４７】
［実施例５］ G9-I変異体アプタマーによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害効果の測定
まずプローブ作製を以下の手順で行った。3'(+) UTRプローブの作製のために、プラス鎖のvariable region-poly U/C stretch-98 nucleotide X region (164ヌクレオチド) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'Xを鋳型として5'-AGTAATACGACTCACTATAGGAACGGGGAGCTAAACACTCC-3'（配列番号２８）と5'-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3'（配列番号２９）のプライマーを用いて増幅した。3'(-) UTRプローブの作製ために、HCV ゲノムの5'UTR (1-127) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'X由来の配列を鋳型として、 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGGAGGGGGGGTCCTGGAGG-3'（配列番号３０）と5'-GCCAGCCCCCGATTGGGGG-3'（配列番号３１）のプライマーを用いて増幅した。プライマー配列中の下線は、T７RNA プロモーター配列を意味する。得られた二つのDNA断片を鋳型として、α-32p-CTP (Amersham)の存在下、T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies)を用いて転写反応を行った。得られたそれぞれの断片を回収し、以下の実験操作に用いた。
NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5, 25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50, 100 and 200 μM)を含む反応液（5 mM HEPES (pH 7.9), 20 mM DTT, 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 0.5% glycerol, 2 mM ATP、15 μg E. coli tRNAそしてFull-NS3；3'(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）を室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて（全量25 μl）、30℃で15分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性をBAS2000によって解析した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸が提供された。本発明の新規機能性核酸は、Ｃ型肝炎の診断、予防および／または治療に有効である。
【００４９】
【配列表】

【００５０】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、G9-Iの塩基配列を示す。
【００５１】
【配列番号２】
配列番号２は、G9-IIの塩基配列を示す。
【００５２】
【配列番号３】
配列番号３は、G9-IIIの塩基配列を示す。
【００５３】
【配列番号４】
配列番号４は、ΔLoopIIの塩基配列を示す。
【００５４】
【配列番号５】
配列番号５は、ΔStemIIの塩基配列を示す。
【００５５】
【配列番号６】
配列番号６は、NEO-Iの塩基配列を示す。
【００５６】
【配列番号７】
配列番号７は、NEO-IIIの塩基配列を示す。
【００５７】
【配列番号８】
配列番号８は、NEO-IIの塩基配列を示す。
【００５８】
【配列番号９】
配列番号９は、ΔNEO-IIIの塩基配列を示す。
【００５９】
【配列番号１０】
配列番号１０は、NEO-III-14Uの塩基配列を示す。
【００６０】
【配列番号１１】
配列番号１１は、dRIIの塩基配列を示す。
【００６１】
【配列番号１２】
配列番号１２は、dRII-Δ7Aの塩基配列を示す。
【００６２】
【配列番号１３】
配列番号１３は、dRII-Δ7A8Uの塩基配列を示す。
【００６３】
【配列番号１４】
配列番号１４は、dRII-Δ7A8U9Uの塩基配列を示す。
【００６４】
【配列番号１５】
配列番号１５は、ΔloopII forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号１６】
配列番号１６は、reverseプライマーの塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号１７】
配列番号１７は、ΔstemII forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号１８】
配列番号１８は、NEO-Iを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号１９】
配列番号１９は、NEO-I forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号２０】
配列番号２０は、NEO-IIIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号２１】
配列番号２１は、NEO-III forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号２２】
配列番号２２は、NEO-IIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号２３】
配列番号２３は、NEO-II forwardプライマーの塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号２４】
配列番号２４は、NEO-IIIを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号２５】
配列番号２５は、NEO-III-14Uを合成するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号２６】
配列番号２６は、ΔNEO-III-14U reverseプライマーの塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号２７】
配列番号２７は、ヘリカーゼ活性を測定する際に用いた基質の塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号２８】
配列番号２８は、3'(+) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号２９】
配列番号２９は、3'(+) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号３０】
配列番号３０は、3'(-) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号３１】
配列番号３１は、3'(-) UTRプローブの作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 G9-I、G9-IIおよびG9-IIIアプタマーの二次構造を示す。
【図２】 G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図３】 G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図４】 G9-I変異体のプロテアーゼ活性阻害効果を示す。
【図５】 Full-NS3に対するRNAリガンドの結合曲線を示す。
【図６】 NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果を示す。
【図７】 NEO-III-14Uのヘリカーゼ活性阻害効果を示す。
【図８】 G9-I変異体アプタマーによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害効果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel functional nucleic acid targeting NS3 protease and helicase of hepatitis C virus, an expression vector containing DNA encoding the nucleic acid, and a pharmaceutical composition containing the nucleic acid or expression vector.
[0002]
[Prior art]
Hepatitis C virus (HCV) is a non-A non-B hepatitis pathogen and an RNA virus that is a major cause of chronic hepatitis. About 20% of HCV-derived chronic hepatitis shifts to cirrhosis and liver cancer, which is a cause of severe liver disease, and the number of infected people and patients is rapidly increasing in countries around the world. To date, interferon has been mainly used for the treatment of hepatitis C. However, since there is no effective therapeutic agent, the development is urgently needed.
[0003]
HCV has a plus-strand RNA consisting of about 9,600 nucleotides as a gene and is classified into the Flaviviridae family. The HCV gene is first converted into a precursor protein consisting of 3,010 amino acids, and this precursor protein is processed to produce a structural protein (core protein; C, coat protein; E1, E2) and a nonstructural protein (core protein; E1, E2) necessary for HCV growth. NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B).
[0004]
Serine protease (hereinafter referred to as “NS3 protease”) encoded by N / 3 of NS3, one of the nonstructural proteins, is cleaved between nonstructural proteins (hereinafter referred to as “NS3 protease”). NS4A / NS4B, NS4B / NS5A, NS5A / NS5B). Processing of this protein is a necessary step for virus growth. NS4A, as a cofactor, promotes the function of NS3 protease at all cleavage sites. Three-dimensional structure analysis reveals that NS3 protease has a trypsin-like structure with two β-barrels. Furthermore, as a result of structural analysis of the complex with NS4A, it has been reported that NS4A binds to the N-terminal β-barrel, which is the active center of NS3 protease, as an essential factor.
[0005]
In contrast, a helicase domain (hereinafter referred to as “NS3 helicase”) is encoded in about 2/3 of the C-terminal side of NS3. NS3 helicase acts to unwind DNA or RNA duplexes, depending on the nucleotide triphosphate. This enzyme has been found in all species belonging to the flavivirus family and is thought to play an important role in the replication of the viral genome. NS3 helicase has also been reported to bind well to the Poly (U) sequence, which is also present at the 3 ′ end of HCV RNA. In addition, structural analysis reveals that NS3 helicase consists of three domains (domains I, II, and III) that are separated by fissures. Moreover, as a result of structural analysis of a complex of deoxyuridine with octamer (dU8), it has been reported that dU8 binds to this crack, and this part is considered to be a substrate binding site.
[0006]
Based on the above, NS3 is considered to be an important enzyme for HCV growth. Therefore, those that can inhibit the activity of NS3 protease and NS3 helicase can be potent anti-HCV drugs. The present inventors have already obtained aptamers for NS3 protease by in vitro selection method, and they are G9-I, G9-II, and G9-III (FIG. 1). In addition, they have a common sequence (5′-GA (A / U) UGGGAC-3 ′), which seems to form a loop structure (FIG. 1). Furthermore, the inventors have found that these aptamers bind to ΔNS3 protease specifically and with high affinity in vitro (Kd about 10 nM), and MBP-NS3 (amino acids 985-1647, 110 kDa). ) Is inhibited by about 90% (JP-A-11-137252).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
In the present invention, novel functional nucleic acids targeting NS3 protease and helicase of hepatitis C virus are prepared by preparing various mutants in which mutations are introduced into various regions of the G9-I aptamer and analyzing their functions. The purpose is to obtain.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In this study, several types of G9-I mutants were prepared and their functions were analyzed. It was found that the stem I and stem-loop III structures are necessary to inhibit the protease activity of ΔNS3. This region contains the consensus sequence (5′-GA (A / U) UGGGAC-3 ′).
[0009]
In order to further analyze the functional structure of the G9 aptamer, the present inventors made a mutant in the stem II region and investigated its functional structure correlation. As a result, we succeeded in obtaining the smallest aptamer (ΔNEO-III) capable of inhibiting NS3 protease as well as G9-I. Finally, 14NE sequence was added to ΔNEO-III to construct a new RNA molecule, NEO-III-14U. As a result, we succeeded in inhibiting both HCV NS3 protease and NS3 helicase. The present invention has been completed based on the above findings.
[0010]
That is, the present invention provides an RNA molecule having the following base sequence (1) and capable of inhibiting HCV NS3 protease and / or NS3 helicase.
5'-AYNXB-3 '(1)
(In the sequence, A is 5′-GGGAGA-3 ′, X and Y are base sequences having 3 to 9 bases complementary to each other, and N is a base sequence having 3 to 7 bases. And B is 5'-UUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCUCU-3 ', provided that the total number of bases of N, X and Y base sequences is 22 or less.)
The RNA molecule of the present invention can have the following secondary structure (I).
[0011]
[Chemical 2]

(In the secondary structure, A is adenine, C is cytosine, G is guanine, U is uracil, i is an integer from 3 to 9, and j is an integer from 3 to 7. However, 2i + j ≦ 22 and n₁~ N_jAre each independently any nucleobase, x₁~ X_iAnd y₁~ Y_iAre each independently any nucleobase, provided that x_kAnd y_k(k = 1 to i) are mutually complementary bases, the solid line connecting the nucleobases indicates the formation of complementary base pairs, and the black circles between the nucleobases indicate the formation of wobble base pairs. )
The secondary structure of RNA molecules can be obtained by inputting the base sequence into general genetic information processing software (such as the Mulfold program (Zuker, M. (1989) Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180, 202-287.)). When an RNA molecule is predicted to have a secondary structure (I) by such a method, the RNA molecule shall have a secondary structure (I). . Alternatively, the secondary structure of the RNA molecule may be confirmed by an experimental method such as a limited degradation method using an RNA degrading enzyme, a modification method using a chemical reagent, or a modified interference method combining modified nucleotide introduction and limited degradation .
[0012]
N in the above base sequence (1) is a base sequence having 3 to 7 bases, preferably a base sequence having 4 to 7 bases. X and Y in the base sequence (1) are base sequences having 3 to 9 bases complementary to each other, and preferably base sequences having 3 to 9 bases complementary to each other. The total number of bases of the N, X and Y base sequences is 22 or less, preferably 10 to 13.
[0013]
N of the above secondary structure (I)₁n₂... n_jIs a base sequence having 3 to 7 bases, preferably a base sequence having 4 to 7 bases. X of secondary structure (I)₁x₂... x_iAnd y₁y₂... y_iIs a base sequence having 3 to 9 bases complementary to each other, preferably a base sequence having 3 to 9 bases complementary to each other. 2i + j is 22 or less, preferably 10-13.
[0014]
After the base sequence (1) and U at the 3 ′ end of the secondary structure (I), it may further have at least 14 U (U is uracil).
[0015]
After the base sequence (1) and U at the 3 ′ end of the secondary structure (I), it may further have one U (U is uracil).
[0016]
After the base sequence (1) and U at the 3 ′ end of the secondary structure (I), a base sequence of 5′-UCCUCUUCU-3 ′ (in the sequence, U is uracil and C is cytosine). You may have.
[0017]
Examples of the RNA molecule of the present invention include those having any of the following base sequences (i) to (vii).
(i) ΔLoopII
5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 4)
(ii) ΔStemII
5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 5)
(iii) NEO-I
5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 6)
(iv) NEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 7)
(v) NEO-II
5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 8)
(vi) ΔNEO-III
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3 '(SEQ ID NO: 9)
(vii) NEO-III-14U
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUUUUUUUUUUUUUU-3 '(SEQ ID NO: 10)
The present invention also provides an expression vector comprising DNA encoding the above RNA molecule under the control of a transcription factor.
[0018]
Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the above RNA molecule or the above expression vector as an active ingredient.
[0019]
The pharmaceutical composition of the present invention can be used to inhibit HCV NS3 protease and / or NS3 helicase.
[0020]
The pharmaceutical composition of the present invention can be used for preventing and / or treating hepatitis C.
[0021]
The present invention also provides a pharmaceutical composition for diagnosing hepatitis C, comprising the above RNA molecule as an active ingredient.
[0022]
In the present specification, the “complementary base sequence” refers to a nucleic acid base sequence that can form a base pair with each other. Examples of base pairs in RNA include adenine (A) and uracil (U) pairs, guanine (G) and cytosine (C) pairs, and G and U wobble base pairs. Is also included.
[0023]
“Aptamer” means a nucleic acid molecule that recognizes a protein from a small molecule such as an amino acid, and a macromolecule such as a virus.
[0024]
The “stem structure” refers to a stem-like structure of a nucleic acid that forms a double strand by base pairing.
[0025]
“Loop structure” refers to a loop-like structure of a single-stranded nucleic acid. For example, FIG. 1 shows the secondary structures of RNA aptamers G9-I, G9-II, and G9-III, but the ring-shaped part seen at the end of the stem structure is a loop structure.
[0026]
“Loop-stem structure” refers to a structure in which a single-stranded RNA forms a loop and a stem.
[0027]
“Transcription factor” refers to a factor that regulates transcription in the process of transcription of DNA genetic information into RNA. This factor includes, for example, a promoter and an enhancer. The promoter consists of TATA box, GC rich repeats, etc., and their position on the genome varies depending on eukaryotic cells, prokaryotic cells, and viruses. Enhancers are present in eukaryotic cells and viruses, are present upstream of promoters, and have a function of remarkably promoting transcription from promoters. A transcription factor can also include an operator, in which case transcription can be controlled by any inducer.
[0028]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be described in detail.
[0029]
Full-NS3 Construction of introduction vector
First, a cDNA fragment encoding amino acids 1027 to 1657 of the HCV precursor protein, which is a region completely covering NS3, was obtained by pMAN34NSH (Kakiuchi, N. et al. (1995) Bacterial expression and analysis of cleavage activity of HCV serine proteinase using Recombinant and synthetic substrate, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.) was obtained by PCR using the template. This fragment was then inserted into the vector pGEMEX-1 (Promega). From pT7Full-NS3 obtained as described above, full-length NS3 to which 6 histidine residues are added can be obtained and purified by affinity chromatography described below.
[0030]
Protein expression and purification
NS3 protease (ΔNS3; amino acids 1027-1218, 25 kDa) and full-length NS3 (MBP-NS3; amino acids 985-1647, 110 kDa) added with maltose-binding protein have been reported (Kakiuchi, N. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.) And expressed in E. coli HB101 and purified. The 17-amino acid peptide (S1; Dns GEAGDDIVPC * SMSYTWT Dns: dansyl residue, *: cleavage site) and NS4A peptide (P41; amino acids 1673-1692) containing NS5A-5B cleavage site used as NS3 protease substrate And purified by the method already reported (Kakiuchi, N. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.).
After introducing pT7Full-NS3 into BL21 (DE3), incubate at 30 ° C in an L-broth medium containing 100 μg / ml ampicillin until the absorbance at 600 nm reaches 0.5, and then 8 hours from that point. Cultured. Full-NS3 is regulated by the T7 RNA polymerase promoter. Next, the cultured Escherichia coli is centrifuged (6000 rpm, 15 minutes), and the pellet is suspended in buffer A [20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole]. And sonication (0 ° C, 30 seconds, 10 times, 2 minutes each interval). This bacterial cell solution was centrifuged (12000 rpm, 30 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was loaded onto a Ni-NTA column equilibrated with buffer A. The column was washed with buffer A and eluted with buffer A containing 5 mM to 1 M imidazole. Full-NS3 in each fraction was confirmed by Coomassie Brilliant Blue staining after 10% SDS-PAGE. Next, the fraction containing Full-NS3 was dialyzed with TNE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA], and this was equilibrated with TNE buffer. It was loaded onto a Sepharose 4B column and washed with TNE buffer. Elution is performed with elution buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 M NaCl, 1 mM EDTA], and the fraction containing Full-NS3 is selected by the method described above and dialyzed against TNE buffer. did. This was further concentrated using Amicon Centriprep-10, an equal amount of glycerol was added, and this was used in the following experiment. The obtained Full-NS3 has a high purity of 99% or more.
[0031]
Determination of equilibrium dissociation constants by filter binding assay
The equilibrium dissociation constant (Kd) of functional RNA (ΔNEO-III, NEO-III-14U) is³²It was calculated by binding 0.1 to 700 nM Full-NS3 to a certain amount of RNA labeled with P. Binding buffer containing RNA and Full-NS3 [50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 mM DTT] was passed through a nitrocellulose membrane and the membrane was washed once with binding buffer. Based on the radioactivity of the nitrocellulose membrane, a Scatchard plot was performed to determine the dissociation equilibrium constant.
[0032]
Protease activity measurement
First, RNA, ΔNS3 and P41 are buffered [50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 mM DTT] for 15 minutes at 25 ° C. Next, S1 as a substrate was added, incubated at 25 ° C. for 40 minutes (ΔNS3) or 80 minutes (Full-NS3), and the reaction was stopped by adding NaOH solution to a final concentration of 0.25 N. The reaction solution was loaded onto a reverse phase chromatography column using an acetonitrile gradient. Protease activity was calculated from the fluorescence signal of the cleaved substrate.
[0033]
Full-NS3 Measurement of helicase activity
Substrates used for measuring helicase activity are bacteriophage M13mp18 single-stranded DNA and T4 polynucleotide kinase at the 5 'end [γ-³²It was obtained by annealing a complementary oligonucleotide consisting of 30 bases labeled with P] ATP. Annealing was performed by denaturing at 94 ° C. for 3 minutes in a solution of 20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, and then slowly bringing it to 25 ° C. Furthermore, it refine | purified by gel filtration using Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE), and this was used for the measurement of helicase activity.
Full-NS3 1.8 μM with RNA inhibitor and reaction solution [25 mM MOPS-NaOH (pH7.0), 2.5 mM DTT, 100 μg / ml BSA (bovine serum albumin), 3 mM MgCl₂, 3 mM ATP] for 20 minutes at room temperature. This was followed by the addition of 2.6 fmol substrate and incubation at 37 ° C. for 30 minutes. To stop the reaction, add stop solution [0.1 M Tris-HCl (pH7.6, 20 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1% Nonidet P-40, 0.1% bromophenol blue, 0.1% xylene cyanol, 25% glycerol) I went there. The reaction solution thus obtained was subjected to 8% PAGE containing 0.5xTris-borate-EDTA, and the helicase activity was calculated by analyzing how the double chain of the substrate was unwound with BAS2000.
[0034]
G9-I RNA Making
The mutants of G9-I and ΔNEO-III-14U were amplified by PCR using a mutagenic primer, and the sequence was confirmed by sequencing.
[0035]
G9-I Aptamer stem - Analysis of mutants in the loop region
The secondary structure of G9-I, G9-II, and G9-III (G9 aptamer) was estimated by the Mulfold program, and it was found that stem I and loop III of G9 aptamer were common (FIG. 1). To date, the inventors have shown that stem I and stem-loop III are essential for the inhibition of NS3 protease activity. In addition, these regions contained a consensus sequence (5′-GA (A / U) UGGGAC-3 ′) in Loop III (FIGS. 1 and 2). ΔSII from which the two double chains of stem II were deleted and ΔLII from which most of loop II was deleted had inhibitory activity against NS3 protease in the same manner as G9-I (FIG. 2). This suggests that stem-loop II is not essential for inhibition against NS3 protease. However, dRII, in which stem-loop III is directly linked to stem I, retained only 45% inhibitory activity compared to G9-I. Based on G9-I, in order to elucidate the minimum common structure required to maintain the inhibitory activity of G9-I, the present inventors further developed three mutants (dRII-Δ7A, dRII-Δ7A8U, dRII-Δ7A8U9U; Fig. 3) was prepared and its function was analyzed. These NS3 protease inhibitory activities, like dRII, were weaker than G9-I (FIG. 4A). From this result, it was shown that a mutant having an NS3 protease inhibitory activity equivalent to that of G9-I cannot be obtained by changing the length of the spacer sequence of stem-loop II.
Furthermore, in order to analyze the function of stem-loop II, a mutation was made in this region. First, NEO-I, a mutant in which both of ΔSII and ΔLII deleted from G9-I were deleted, was prepared (FIG. 2). Furthermore, NEO-II and NEO-III, in which the two strands of stem II of NEO-I were deleted one by one, were prepared (Fig. 2). When the NS3 protease inhibitory activity of these three mutants was examined, it was found that they all inhibited 95% and maintained the same function as G9-I (FIG. 4B). From the above results, it was shown that several duplex structures are required in the stem II region in a sequence-independent manner to maintain the function of G9-I.
The present inventors have already revealed that 11 nucleotides at the 3 ′ end of the G9 aptamer are not involved in ΔNS3 binding. Therefore, the single-stranded portion at the 3 ′ end of NEO-III obtained this time was deleted to obtain ΔNEO-III (FIG. 2), and its inhibitory activity was examined. As a result, it was found that the protease activity of ΔNS3 was inhibited similarly to G9-I (FIG. 4A). Thus, the smallest aptamer having a function equivalent to that of the G9 aptamer was obtained.
[0036]
NEO-III-14U Construction and connectivity to targets
Until now, Full-NS3, which has been used as an aptamer target, has a part on the C-terminal side of NS2 and lacks a part on the C-terminal side of NS3. Recently, it has been reported that the last β-strand of the NS3 helicase domain is in contact with the active site of the protease domain and may play an important role in order to bring it closer to physiological conditions. This suggests the necessity of using full Full-NS3. Therefore, the present inventors purified and used full-length Full-NS3 this time.
NS3 helicase consists of three domains, and it has been reported that single-stranded oligonucleotides bind to the cleft between domains I and II and domain III. Among them, it has been reported that homoribopolymers, particularly Poly (U) sequences, bind well and inhibit helicase activity. Therefore, the present inventors constructed NEO-III-14U in which a 14U sequence was added to the 3 ′ end of ΔNEO-III for the purpose of inhibiting both NS3 protease and NS3 helicase of HCV.
In order to investigate the effect of the (U) 14 sequence added to NEO-III-14U, the binding of ΔNEO-III and NEO-III-14U to Full-NS3 was compared, and the Kd value was calculated (FIG. 5). As a result, NEO-III-14U (maru; about 10 nM) is 9 times more compatible with Full-NS3 than G9-I (deer; about 90 nM) and ΔNEO-III (Hishigata; about 90 nM) Was found to be high. Therefore, it was shown that the (U) 14 sequence of NEO-III-14U serves to increase the affinity for Full-NS.
[0037]
NEO-III-14U of Full-NS3 Protease activity inhibitory effect
In order to investigate the effect of (U) 14 sequence added to NEO-III-14U in inhibiting Full-NS3 protease, we measured the inhibitory activity of ΔNEO-III and NEO-III-14U against Full-NS3 protease (Fig. 6). . As a result, it was found that NEO-III-14U (Maru) inhibited Full-NS3 protease activity more than ΔNEO-III (Hishigata), and about 80% in a molar amount twice that of Full-NS3. Moreover, as a result of analyzing the same reaction in the presence of poly (U) 20, no effect on the activity of Full-NS3 protease was found (Sangaku). Furthermore, to negate the possibility that helicase activity negatively regulates the protease activity inhibitory effect of NEO-III-14U, ATP and Mg²⁺NEO-III-14U was assayed for the full-NS3 protease inhibitory activity under the condition that helicase was activated in the presence of (Sikaku). As a result, NEO-III-14U retained high protease inhibitory activity.
From the above, it was shown that the newly prepared NEO-III-14U strongly inhibits Full-NS3 protease in vitro.
[0038]
NEO-III-14U by Full-NS3 Helicase activity inhibitory effect
Bacteriophage M13mp 18 single-stranded DNA and 5 'end [γ-³²Full-NS3 helicase activity was measured using a substrate obtained by annealing a 30-base complementary oligonucleotide labeled with P] ATP. As a result, it was found that the substrate was almost completely single-stranded at a concentration of 100 nM of Full-NS3 for a substrate concentration of 2.6 fmol (FIG. 7A; lane 2). Next, the inhibitory effect of poly (U) 20 on Full-NS3 helicase activity was examined, and it was found that poly (U) 20 was 2,000 times the amount of Full-NS3 and inhibited Full-NS3 helicase activity by 50%. (FIG. 7A; lane 7). Furthermore, in order to investigate the effect of the (U) 14 sequence of NEO-III-14U in inhibiting Full-NS3 helicase activity, the inhibitory activity of ΔNEO-III and NEO-III-14U on Full-NS3 helicase was measured (FIG. 7B). ). As a result, helicase activity was almost completely suppressed by adding 20-50 times the amount of NEO-III-14U to Full-NS3 (FIG. 7B; lanes 13 and 14). In contrast, ΔNEO-III had only a low inhibitory effect even when the same amount as NEO-III-14U was added (FIG. 7B; lanes 6 and 7). From these results, NEO-III-14U can be expected to inhibit both NS3 protease activity and NS3 helicase activity and to strongly suppress the growth of HCV.
[0039]
NEO-III-14U by, Full-NS3 When HCV RNA of 3 ' Inhibition of binding to terminal positive and negative strands
It has been reported that the helicase domain of Full-NS3 specifically and strongly binds to the positive and negative strands at the 3 ′ end of HCV RNA. Since NS3 helicase is thought to be involved in the replication of the HCV genome, this binding may be an important step in unwinding the HCV duplex. Therefore, inhibition of this step may suppress HCV proliferation. Therefore, inhibition of binding between Full-NS3 and the positive and negative strands of the 3 ′ end of HCV RNA by NEO-III-14U was examined (FIG. 8).
It has been reported that the helicase domain of Full-NS3 specifically and strongly binds to the positive and negative strands at the 3 ′ end of HCV RNA. NS3 helicase is thought to be involved in the replication of the HCV genome, and this binding is considered to be an important step in unraveling the duplex of the HCV genome. Therefore, inhibition of this step may suppress HCV proliferation. Therefore, the ability of NEO-III-14U to inhibit the binding of Full-NS3 to the positive and negative strands of the 3 ′ end of HCV RNA was examined (FIGS. 8A and 8B).
First, as a probe, complementary to variable region-poly (U / C) stretch-3'X region (164 nucleotides; 3 '(+) UTR probe) in the positive strand of 32p-label and 1-127 of the positive strand 3 '(-) UTR probe was prepared. Includes NEO-III-14U (Figure 8A. 5, 25, 50 and 100 μM for 3 '(+) UTR, Figure 8B. 10, 50, 100 and 200 μM for 3' (-) UTR) The reaction solution (Full-NS3; 0.2 μM for 3 ′ (+) UTR, 0.4 μM for 3 ′ (−) UTR) was preincubated for 30 minutes at room temperature. Next, 3 ′ (+) UTR probe (FIG. 8A. 2.0 μM) or 3 ′ (−) UTR probe (FIG. 8B. 4.0 μM) was added to each reaction solution and incubated at 30 ° C. for 15 minutes. The reaction solution was passed through a nitrocellulose membrane and the binding activity was analyzed. As a result, binding of Full-NS3 to 3 ′ (+) UTR and 3 ′ (−) UTR was inhibited with increasing NEO-III-14U concentration. In particular, 3 ′ (+) UTR was suppressed to about 15% when a 50 equivalent excess of NEO-III-14U was added to the probe.
[0040]
Aptamer expression vector
A G9-I mutant aptamer expression vector can be obtained by preparing a DNA encoding the G9-I mutant aptamer and incorporating it into a vector containing a transcription factor.
DNA encoding the G9-I mutant aptamer can be produced by a nucleic acid chemical synthesis method well known in the art, for example, using a DNA / RNA synthesizer. In addition, using the synthesized DNA as a template, the polymerase chain reaction (PCR) technique is used, or the DNA is amplified using expression in a cultured host cell transformed with a vector containing the DNA. be able to. PCR techniques, transformation and expression techniques are described, for example, in J. Sambrook et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second edition, 1989). As vectors for constructing the expression system, plasmid vectors such as pUCI9 (Takara Shuzo, Kyoto), pGREEN LANTERN (Lifetech Oriental Co., Tokyo), pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6: 905-915 (July 1995)) Adenovirus vectors and retrovirus vectors (for example, Moloney murine leukemia virus) can be used as gene therapy vectors.
In the above vector, a promoter sequence can be included upstream of the DNA encoding the G9-I mutant aptamer. The promoter sequence is an element that regulates the expression of the G9-I mutant aptamer, such as a viral promoter (such as adenovirus VA1 promoter, SV40 promoter, human cytomegalovirus immediate early promoter, Moloney murine sarcoma virus promoter), phage promoter ( λPL promoter etc.), pol III promoter (human tRNA promoter (eg tRNA^valPromoter) and the like, and β-actin promoter and the like. A pol III promoter (particularly, a tRNA promoter) and a β-actin promoter can be preferably used. Furthermore, a combination of a promoter and an enhancer may be used as a transcription factor. As an enhancer, those derived from mammals and viruses can be used.
Further, the vector of the present invention can further contain a terminator sequence downstream of the DNA encoding the G9-I mutant aptamer. The terminator can be any sequence as long as it terminates transcription, and UUUUU can be used as the terminator sequence. The vector may optionally contain an antibiotic resistance gene (eg, Amp^r, Neo^r), A selectable marker gene or reporter gene, such as a gene that complements auxotrophy.
[0041]
Pharmaceutical composition
The aptamers and expression vectors of the present invention can be used to inhibit HCV NS3 protease and / or NS3 helicase, and specifically can be used to prevent and / or treat hepatitis C.
By introducing the aptamer or expression vector of the present invention into a tissue or cell (eg, liver) of a subject infected with HCV, the NS3 protease and / or helicase of HCV in the cell is inhibited, and proliferation of HCV is prevented. be able to. Aptamers or expression vectors can be introduced, for example, by encapsulating them in liposomes and incorporating them into cells ("Lipidic vector systems for gene transfer" (1997) RJ Lee and L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14 173-206; Mamoru Nakanishi et al., Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999)), Calcium Phosphate Method, Electroporation Method, Lipofection Method, Microinjection Method, Gene Gun Method, etc. It can be carried out. In the case of introducing a vector into a cell, for example, it is possible to take out a part of a cell at a disease site, perform gene transfer in vitro, and then return the cell to a tissue again, or Vectors can also be introduced directly into tissues. The virus titer for infection with a viral vector is usually about 10⁷pfu / ml or more. A method of using a viral vector for gene therapy is described in, for example, “Viral vectors in gene therapy” (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807-838.
The pharmaceutical composition containing the aptamer or expression vector of the present invention as an active ingredient can contain a pharmaceutically acceptable carrier (for example, a diluent such as a physiological saline or a buffer), if necessary. Administration depends on the severity of the disease state and the responsiveness of the organism, but at an appropriate dose, administration method, and frequency over the period until the effectiveness of treatment is observed or the reduction of the disease state is achieved. Just do it.
Moreover, hepatitis C can be diagnosed using the aptamer of the present invention. The aptamer of the present invention can be used in place of an antibody. The aptamer of the present invention is labeled with fluorescence, mixed with an extract of cells infected with HCV or a crushed product, and filtered through a nitrocellulose membrane. If HCV is present in the cell, it can be trapped on the membrane and detected.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
[0043]
[Example 1] Production of G9-I mutant aptamer
Mutant aptamers were prepared by in vitro transcription using each template DNA described below. For in vitro transcription, template DNA (2.5 μg) was added to 40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 4.0 mM spermidine, 10 mM DTT, 15 mM MgCl.₂In addition to T7 RNA polymerase (0.08 μg / μl), 0.05% Triton X-100, 7.5 mM each was added to T7 RNA polymerase (0.08 μg / μl) and reacted at 37 ° C. for 3 hours. After the reaction, it was isolated and purified by 7M urea-polyacrylamide gel electrophoresis.
(i) ΔloopII
ΔloopII forward primer,
5′-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGAGCTTCGGGATTTGAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and
A reverse primer, 5′-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 16) was used.
PCR was performed using DNA encoding G-9I as a template and the above primers (94 ° C, 75 sec-> 45 ° C, 75 sec-> 72 ° C-> 135 sec. Cycle 5 times, then 94 20 cycles of ℃, 75 sec-> 65 ℃, 75 sec-> 72 ℃, 135 sec). The obtained DNA fragment was purified and cloned, and the sequence was confirmed (using M13 universal primer and ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit). PCR fragments were obtained using a clone having the target sequence as a template, and these were transcribed into RNA by in vitro transcription and used in the following experiments.
(ii) ΔstemII
ΔstemII forward primer,
Using 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGACCAGAAGCTCTGGTTTGAGGG-3 '(SEQ ID NO: 17) and reverse primer, 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 16), a mutant aptamer gene was prepared by the same procedure as (i) above, and then RNA And used for the following experiments.
(iii) NEO-I
Synthetic NEO-I template DNA,
5'-GGGAGAACCGAGCTTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3 '(SEQ ID NO: 18) and NEO-I forward primer,
PCR was performed using 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGAGCTTCGG-3 '(SEQ ID NO: 19) and reverse primer, 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 16) (94 ° C, 75 sec-> 45 ° C, 75 sec-> 6 cycles of 72 ° C-> 135 sec, then 12 cycles of 94 ° C, 75 sec-> 65 ° C, 75 sec-> 72 ° C, 135 sec). The obtained DNA fragment was purified and cloned, and the sequence was confirmed (using M13 universal primer and ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit). PCR fragments were obtained using a clone having the target sequence as a template, transcribed into RNA, and used in the following experiments.
(iv) NEO-III
Synthetic NEO-III template DNA,
5′-GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 20) and NEO-III forward primer,
Using 5′-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 21) and reverse primer, 5′-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 16), a mutant aptamer gene was prepared in the same manner as (iii) above, and then RNA And used for the following experiments.
(v) NEO-II
Synthetic NEO-II template DNA,
5'-GGGAGAACCGGCTCGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT 3 '(SEQ ID NO: 22) and NEO-II forward primer,
Using 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCGGCTCGGTT-3 '(SEQ ID NO: 23) and reverse primer, 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 16), a mutant aptamer gene was prepared in the same manner as in (iv) above, and then RNA And used for the following experiments.
(vi) ΔNEO-III
Synthetic NEO-III template DNA,
5'-GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCT-3 '(SEQ ID NO: 24) and NEO-III forward primer,
Using 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3 '(SEQ ID NO: 21), ΔNEO-III reverse primer, 5'-AGGAGAGAGGAAAGGTAGTCC-3' (SEQ ID NO: 22), a mutant aptamer gene was prepared in the same manner as (iii) above. Then, it was transcribed into RNA and used for the following experiments.
(vii) NEO-III-14U
Synthetic NEO-III-14U template DNA,
5'-GGGAGAACCAGCTGGTTTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTTTTTTTTTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 25) and NEO-III forward primer,
Using 5′-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 21), ΔNEO-III-14U reverse primer, 5′-AAAAAAAAAAAAAGGAGAGAGGAAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 26), the mutant aptamer gene was obtained by the same operation as (iii) above. Then, it was transcribed into RNA and used in the following experiments.
[0044]
[Example 2] Measurement of binding of G9-I mutant aptamer to Full-NS3
The equilibrium dissociation constant (Kd) of functional RNA (ΔNEO-III, NEO-III-14U) is³²It was calculated by binding 0.1 to 700 nM Full-NS3 to a certain amount of RNA labeled with P. Binding buffer containing RNA and Full-NS3 [50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 mM DTT] was passed through a nitrocellulose membrane and the membrane was washed once with binding buffer. Based on the radioactivity of the nitrocellulose membrane, a Scatchard plot was performed to determine the dissociation equilibrium constant.
[0045]
[Example 3] Measurement of Full-NS3 protease activity inhibitory effect of G9-I mutant aptamer
First, RNA aptamer, Full-NS3 protease and P41 buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 mM DTT] for 15 minutes at 25 ° C. Next, S1 (final concentration 49.8 μM) as a substrate was added to make a total volume of 15 μl, and incubated at 25 ° C. for 80 minutes. The reaction was stopped by adding NaOH solution to a final concentration of 0.25 N. This reaction solution was loaded on reverse phase HPLC (TSKgel ODS-120T; 4 ml), and eluted and analyzed using a concentration gradient of acetonitrile containing 50 mM ammonium acetate buffer (pH 6.5). Protease activity was calculated from the fluorescence signal of the cleaved substrate.
[0046]
[Example 4] Measurement of full-NS3 helicase activity inhibitory effect of G9-I mutant aptamer
Substrates used for measuring helicase activity are bacteriophage M13mp18 single-stranded DNA and T4 polynucleotide kinase at the 5 'end [γ-³²Complementary oligonucleotide consisting of 30 bases labeled with P] ATP
5'-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG-3 '(SEQ ID NO: 27)
Obtained by annealing. Annealing was performed by denaturing at 94 ° C. for 3 minutes in a solution of 20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, and then slowly bringing it to 25 ° C. Furthermore, it refine | purified by gel filtration using Microcon Centrifugal Filter Device YM-50 (MILLIPORE), and this was used for the measurement of helicase activity.
Full-NS3 1.8 μM with RNA inhibitor and reaction solution [25 mM MOPS-NaOH (pH7.0), 2.5 mM DTT, 100 μg / ml BSA (bovine serum albumin), 3 mM MgCl₂, 3 mM ATP] (total volume 20 μl), preincubated for 20 minutes at room temperature. This was followed by the addition of 2.6 fmol substrate and incubation at 37 ° C. for 30 minutes. To stop the reaction, add stop solution [0.1 M Tris-HCl (pH7.6, 20 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1% Nonidet P-40, 0.1% bromophenol blue, 0.1% xylene cyanol, 25% glycerol) I went there. The reaction solution thus obtained was subjected to 8% PAGE containing 0.5xTris-borate-EDTA, and helicase activity was calculated by analyzing how the double strands of the substrate were unwound with BAS2000 (Fuji Film). did.
[0047]
[Example 5] Measurement of inhibitory effect of binding of Full-NS3 and positive and negative strands of 3 'end of HCV RNA by G9-I mutant aptamer
First, probe preparation was performed according to the following procedure. For the preparation of 3 '(+) UTR probe, cDNA corresponding to positive strand variable region-poly U / C stretch-98 nucleotide X region (164 nucleotides) was used as a template for plasmid p5'IL-3'X. Five'-AGTAATACGACTCACTATAAmplification was performed using primers GGAACGGGGAGCTAAACACTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 28) and 5′-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 29). To prepare a 3 '(-) UTR probe, a cDNA corresponding to 5'UTR (1-127) of the HCV genome was used as a template using a sequence derived from plasmid p5'IL-3'X as a template.TGTAATACGACTCACTATAAmplification was performed using primers GGGAGGGGGGGTCCTGGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 30) and 5′-GCCAGCCCCCGATTGGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 31). The underline in the primer sequence refers to the T7 RNA promoter sequence. Using the obtained two DNA fragments as templates, a transcription reaction was carried out using T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies) in the presence of α-32p-CTP (Amersham). The obtained fragments were collected and used for the following experimental operations.
Includes NEO-III-14U (Figure 8A. 5, 25, 50 and 100 μM for 3 '(+) UTR, Figure 8B. 10, 50, 100 and 200 μM for 3' (-) UTR) Reaction solution (5 mM HEPES (pH 7.9), 20 mM DTT, 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 0.5% glycerol, 2 mM ATP, 15 μg E. coli tRNA and Full-NS3; 0.2 μM for 3 ′ (+) UTR, 0.4 μM for 3 ′ (-) UTR) at room temperature For 30 minutes. Next, add 3 '(+) UTR probe (Fig. 8A. 2.0 μM) or 3' (-) UTR probe (Fig. 8B. 4.0 μM) to each reaction solution (25 µl in total) and 15 minutes at 30 ° C. Incubated. The reaction solution was passed through a nitrocellulose membrane, and the binding activity was analyzed by BAS2000.
[0048]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel functional nucleic acid targeting NS3 protease and helicase of hepatitis C virus has been provided. The novel functional nucleic acid of the present invention is effective for the diagnosis, prevention and / or treatment of hepatitis C.
[0049]
[Sequence Listing]

[0050]
[Sequence Listing Free Text]
[SEQ ID NO: 1]
SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of G9-I.
[0051]
[SEQ ID NO: 2]
SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of G9-II.
[0052]
[SEQ ID NO: 3]
SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of G9-III.
[0053]
[SEQ ID NO: 4]
SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of ΔLoopII.
[0054]
[SEQ ID NO: 5]
SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of ΔStemII.
[0055]
[SEQ ID NO: 6]
SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of NEO-I.
[0056]
[SEQ ID NO: 7]
SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of NEO-III.
[0057]
[SEQ ID NO: 8]
SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of NEO-II.
[0058]
[SEQ ID NO: 9]
SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of ΔNEO-III.
[0059]
[SEQ ID NO: 10]
SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of NEO-III-14U.
[0060]
[SEQ ID NO: 11]
SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of dRII.
[0061]
[SEQ ID NO: 12]
SEQ ID NO: 12 shows the base sequence of dRII-Δ7A.
[0062]
[SEQ ID NO: 13]
SEQ ID NO: 13 shows the base sequence of dRII-Δ7A8U.
[0063]
[SEQ ID NO: 14]
SEQ ID NO: 14 shows the base sequence of dRII-Δ7A8U9U.
[0064]
[SEQ ID NO: 15]
SEQ ID NO: 15 shows the base sequence of ΔloopII forward primer.
[0065]
[SEQ ID NO: 16]
SEQ ID NO: 16 shows the base sequence of the reverse primer.
[0066]
[SEQ ID NO: 17]
SEQ ID NO: 17 shows the base sequence of ΔstemII forward primer.
[0067]
[SEQ ID NO: 18]
SEQ ID NO: 18 shows the nucleotide sequence of a template DNA for synthesizing NEO-I.
[0068]
[SEQ ID NO: 19]
SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of NEO-I forward primer.
[0069]
[SEQ ID NO: 20]
SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of template DNA for synthesizing NEO-III.
[0070]
[SEQ ID NO: 21]
SEQ ID NO: 21 shows the nucleotide sequence of NEO-III forward primer.
[0071]
[SEQ ID NO: 22]
SEQ ID NO: 22 shows the base sequence of template DNA for synthesizing NEO-II.
[0072]
[SEQ ID NO: 23]
SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of NEO-II forward primer.
[0073]
[SEQ ID NO: 24]
SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of the template DNA for synthesizing NEO-III.
[0074]
[SEQ ID NO: 25]
SEQ ID NO: 25 shows the base sequence of the template DNA for synthesizing NEO-III-14U.
[0075]
[SEQ ID NO: 26]
SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence of ΔNEO-III-14U reverse primer.
[0076]
[SEQ ID NO: 27]
SEQ ID NO: 27 shows the base sequence of the substrate used for measuring helicase activity.
[0077]
[SEQ ID NO: 28]
SEQ ID NO: 28 is the base sequence of the primer used for the preparation of 3 ′ (+) UTR probe.
[0078]
[SEQ ID NO: 29]
SEQ ID NO: 29 shows the base sequence of a primer used for preparation of a 3 ′ (+) UTR probe.
[0079]
[SEQ ID NO: 30]
SEQ ID NO: 30 shows the base sequence of the primer used for preparation of the 3 ′ (−) UTR probe.
[0080]
[SEQ ID NO: 31]
SEQ ID NO: 31 shows the nucleotide sequence of a primer used for preparing a 3 ′ (−) UTR probe.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the secondary structure of G9-I, G9-II and G9-III aptamers.
FIG. 2 shows the secondary structure of a mutant of G9-I aptamer.
FIG. 3 shows the secondary structure of a mutant of G9-I aptamer.
FIG. 4 shows the protease activity inhibitory effect of G9-I mutant.
FIG. 5 shows an RNA ligand binding curve for Full-NS3.
FIG. 6 shows the inhibitory effect of NEO-III-14U on protease activity.
FIG. 7 shows the helicase activity inhibitory effect of NEO-III-14U.
FIG. 8 shows the inhibitory effect of G9-I mutant aptamer binding to Full-NS3 and the positive and negative strands at the 3 ′ end of HCV RNA.

Claims (3)

RNA molecule consisting of the following base sequence .
5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUUUUUUUUUUUUUU-3 '(SEQ ID NO: 10) An expression vector comprising DNA encoding the RNA molecule according to claim 1 under the control of a promoter . An agent for inhibiting NS3 protease and / or NS3 helicase, comprising the RNA molecule according to claim 1 or the expression vector according to claim 2 as an active ingredient.

Images