JP4775714B2 - Protein identification method and protein identification apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、ペプチド断片分析によるタンパク質同定方法およびタンパク質同定装置に関する。 The present invention relates to a protein identification method and a protein identification apparatus based on peptide fragment analysis.
タンパク質の機能を決定するには、タンパク質の一次構造を解析する必要がある。このタンパク質の一次構造解析には、タンパク質を切断し、ペプチド化する必要があるが、タンパク質は多様であるため、画一的にペプチド化させることは困難である。 To determine the function of a protein, it is necessary to analyze the primary structure of the protein. In order to analyze the primary structure of this protein, it is necessary to cleave the protein and make it into a peptide. However, since there are various proteins, it is difficult to uniformly form a peptide.
タンパク質を効率よく分解し、ペプチドを収量良く回収するには、(1)タンパク質を変性させ立体構造障害による分解の不均一性を減少させること、(2)還元してタンパク質分子内にある分子間のS−S結合を切断し、生成した反応性に富むシステイン残基SH基を保護すること、(3)残基特異性の高いタンパク質分解酵素を用いることが重要であり、このために、タンパク質化学では、タンパク質試料を変性、還元アルキル化した後にタンパク質分解酵素により消化することで断片化ペプチド試料を調整することが一般的である。 In order to efficiently degrade proteins and recover peptides with good yield, (1) to denature proteins and reduce heterogeneity of degradation due to steric hindrance, and (2) between molecules in the protein molecule after reduction. It is important to protect the cysteine residue SH group, which is rich in reactivity, by cleaving the S—S bond of (3), and (3) to use a proteolytic enzyme with high residue specificity. In chemistry, it is common to prepare a fragmented peptide sample by denaturing and reductively alkylating the protein sample and then digesting with a proteolytic enzyme.
この変性剤やアルキル化剤などは、多くのタンパク質分解酵素を阻害するため、溶液状態で操作する場合には、酵素が許容できる変性剤・アルキル化剤濃度まで希釈するか、あるいは、逆相クロマトグラフィー法、透析法、有機溶媒沈殿法などで変性剤、アルキル化剤を除去することが必要であることが知られている。(特許文献1参照) These denaturing agents and alkylating agents inhibit many proteolytic enzymes, so when operating in solution, dilute to a denaturing agent / alkylating agent concentration acceptable by the enzyme, or use reverse-phase chromatography. It is known that it is necessary to remove denaturing agents and alkylating agents by a graphic method, a dialysis method, an organic solvent precipitation method, and the like. (See Patent Document 1)
逆相クロマトグラフィー法を用いたものとして、酵素消化ペプチド断片を逆相クロマトグラフィーカラムで濃縮・脱塩した後、カラムにトラップさせ、その後逆相クロマトグラフィー−質量分析計に導入する構成が提案されている。(非特許文献1参照)
タンパク質のペプチド化による断片化において、酵素消化が不十分であるため等によって断片化が不完全に行われる場合がある。このような不完全な断片化では、タンパク質の切れ残りなど分子量が大きなペプチド断片が生じることになる。 In protein fragmentation by peptideization, fragmentation may be incomplete due to insufficient enzymatic digestion. Such incomplete fragmentation results in peptide fragments having a large molecular weight such as uncut protein.
この分子量が大きなペプチド断片は、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着し分離に悪影響を及ぼす他、カラム自体も劣化させる原因となるという問題がある。 This peptide fragment having a large molecular weight is adsorbed on a reverse phase chromatography column for peptide separation and adversely affects the separation, and also causes a deterioration of the column itself.
また、不完全な断片化で生じた分子量の大きなペプチド断片の存在は、質量スペクトルの複雑化や、同一の情報の二重取得といった測定誤差の要因となり、正確なペプチド断片の情報を得る上で妨げとなるという問題がある。 In addition, the presence of peptide fragments with large molecular weight caused by incomplete fragmentation may cause measurement errors such as complicated mass spectra and double acquisition of the same information. There is a problem of hindering.
特に、導入したタンパク質をオンラインで還元アルキル化後、酵素消化を行い、ペプチド分離−質量分析を行うカラムスイッチングシステムでは、酵素消化が不十分なことも多く、上述した問題が顕著となる。 In particular, in the column switching system in which the introduced protein is subjected to reductive alkylation online, followed by enzymatic digestion and peptide separation-mass spectrometry, the enzymatic digestion is often insufficient, and the above-described problems become significant.
また、この不十分なペプチド断片化による分子量の大きなペプチド断片の発生の問題は、酵素消化によるペプチド断片化に限らず、化学的手法による化学断片化においても同様に発生するものである。 The problem of generation of peptide fragments having a large molecular weight due to insufficient peptide fragmentation is not limited to peptide fragmentation by enzyme digestion, but also occurs in chemical fragmentation by chemical techniques.
そこで、本発明は上記課題を解決して、分析の妨げとなる分子量の大きなペプチド断片を排除し、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によってタンパク質同定を行うことを目的とする。 In view of the above, an object of the present invention is to solve the above problems, eliminate peptide fragments having a large molecular weight that hinder analysis, and perform protein identification using peptide fragments having a molecular weight suitable for analysis.
本発明は、逆相クロマトグラフィー分離前の段階において、RAMカラムでペプチド混合物を濃縮させることによって、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着したり、タンパク質を同定する配列情報を複雑化・増加させない程度の、比較的小さな分子量のペプチド断片のみをRAMカラムにトラップさせ、一方、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着してペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りや、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片については、このRAMカラムを通過させてトラップさせないことによって、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によるタンパク質の同定を行うという目的を達成する。 In the present invention, the peptide mixture is concentrated on the RAM column in the stage before the reverse phase chromatography separation, so that it is not adsorbed on the reverse phase chromatography column for peptide separation and the sequence information for identifying the protein is not complicated or increased. Only a relatively small molecular weight peptide fragment is trapped on a RAM column, while the protein residue and the sequence information are complicated by adsorbing to a reversed-phase chromatography column for peptide separation and adversely affecting peptide separation. The peptide fragment having a large molecular weight that is increased is not trapped by passing through this RAM column, thereby achieving the object of identifying the protein by the peptide fragment having a molecular weight suitable for analysis.
本発明は、タンパク質同定方法の方法態様と、タンパク質同定装置の装置態様とすることができる。 This invention can be made into the method aspect of a protein identification method, and the apparatus aspect of a protein identification apparatus.
本発明のタンパク質同定方法の態様は、目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定方法において、ペプチド断片化後のペプチド混合物を濃縮用RAMカラムに導入する工程、分子量の小さなペプチド断片を濃縮用RAMカラムにトラップする工程、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用RAMカラムで素通りさせて廃棄する工程、濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入して逆相分離する工程、分離したペプチド断片を質量分析に導入する工程を有する。 The embodiment of the protein identification method of the present invention is to identify a protein by peptide fragmentation of the target protein, separation of the peptide fragment from the peptide mixture obtained by this peptide fragmentation by reverse phase chromatography, and mass spectrometry In the method, a step of introducing a peptide mixture after peptide fragmentation into a concentration RAM column, a step of trapping a peptide fragment having a low molecular weight in a concentration RAM column, a peptide fragment having a large molecular weight and the remaining protein in a concentration RAM column A step of passing through and discarding, a step of introducing the peptide fragment trapped in the RAM column for concentration into a reverse phase chromatography column for peptide separation and reverse phase separation, and a step of introducing the separated peptide fragment into mass spectrometry.
濃縮用RAMカラムは、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を素通りさせ、分子量の小さなペプチド断片のみをトラップし、このトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入することによって、ペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りが逆相クロマトグラフィー分離カラムに導入されることを防ぐことができ、また、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片が質量分析に導入されることを防ぐことができる。 The concentration RAM column allows peptide fragments with a large molecular weight and residual proteins to pass through, traps only peptide fragments with a low molecular weight, and introduces the trapped peptide fragments into a reversed-phase chromatography column for peptide separation. Protein fragments that can adversely affect the separation of proteins can be prevented from being introduced into reverse-phase chromatography separation columns, and peptide fragments with large molecular weights that can complicate and increase sequence information are introduced into mass spectrometry. Can be prevented.
また、ペプチド断片は酵素消化ペプチド断片化によって行う他、化学ペプチド断片化によって行うことができる。酵素消化ペプチド断片化では、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化して行う。 The peptide fragment can be obtained by chemical peptide fragmentation as well as by enzymatic digestion peptide fragmentation. In enzymatic digestion peptide fragmentation, the target protein is reductively alkylated and then digested with a proteolytic enzyme.
また、本発明のタンパク質同定装置は、目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定装置であり、ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用RAMカラムと、この濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離するペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと、濃縮用RAMカラムへのペプチド混合物の導入と、濃縮用RAMカラムからトラップしたペプチド断片を導出する切り替えバルブと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムで分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置とを備える。 In addition, the protein identification apparatus of the present invention is a protein identification that identifies a protein by peptide fragmentation of the target protein, separation of the peptide fragment from the peptide mixture obtained by this peptide fragmentation by reverse phase chromatography, and mass spectrometry A concentration RAM column for introducing a peptide mixture after peptide fragmentation and trapping the peptide fragments, and a reverse phase chromatography for peptide separation for separating the peptides by introducing the peptide fragments trapped in the concentration RAM column. Introducing a peptide mixture into a chromatography column, a RAM column for concentration, a switching valve for deriving peptide fragments trapped from the RAM column for concentration, and a peptide separated by a reversed-phase chromatography column for peptide separation, mass spectrometry A mass spectrometer for performing .
ここで、切り替えバルブは、ペプチド混合物を導入する導入ポートと、排出ポートと、濃縮用RAMカラムと接続する2つの接続ポートと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートを有する。この切り替えバルブは、濃縮用RAMカラムの接続ポートに導入ポートと排出ポートとを接続する切り替えによって、ペプチド混合物を濃縮用RAMカラムに導入し、分子量の小さなペプチド断片をトラップし、濃縮用RAMカラムの接続ポートとペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートとを接続する切り替えによって、濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムへ導出する。 Here, the switching valve has an introduction port for introducing the peptide mixture, a discharge port, two connection ports connected to the RAM column for concentration, and a connection port connected to the reverse phase chromatography column for peptide separation. This switching valve introduces the peptide mixture into the concentration RAM column by switching the connection port between the introduction port and the discharge port to the connection port of the concentration RAM column, traps a peptide fragment having a small molecular weight, and By switching the connection port to connect the connection port connected to the peptide separation reverse phase chromatography column, the peptide fragment trapped in the concentration RAM column is led to the peptide separation reverse phase chromatography column.
また、本発明の濃縮用RAMカラムは、分子量の小さなペプチド断片を濃縮用RAMカラムにトラップさせ、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用RAMカラムで素通りさせる。これによって、ペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りが逆相クロマトグラフィー分離カラムに導入されることを防ぎ、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片が質量分析に導入されることを防ぐ。この濃縮用RAMカラムは接触制限充填材を充填する構成とすることができる。 In the concentration RAM column of the present invention, a peptide fragment having a small molecular weight is trapped on the concentration RAM column, and a peptide fragment having a large molecular weight and the remaining protein are passed through the concentration RAM column. This prevents large amounts of peptide fragments from being introduced into the mass spectrometry, which prevents the introduction of protein residues that adversely affect peptide separation into the reversed-phase chromatography separation column and complicates and increases the sequence information. To prevent it. This concentration RAM column can be configured to be filled with a contact limiting filler.
導入したタンパク質をオンラインで還元アルキル化後、酵素消化を行い、ペプチド分離−質量分析を行うカラムスイッチングシステムでは、酵素消化が不十分なことも多いため、本発明の濃縮用RAMカラム導入の効果はより顕著となる。 In column switching systems that perform reductive alkylation of introduced proteins online, then perform enzyme digestion, and perform peptide separation-mass spectrometry, enzyme digestion is often insufficient. It becomes more prominent.
本発明によれば、分析の妨げとなる分子量の大きなペプチド断片を排除し、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によってタンパク質同定を行うことができる。 According to the present invention, peptide fragments having large molecular weights that hinder analysis can be excluded, and protein identification can be performed using peptide fragments having molecular weights suitable for analysis.
以下、本発明の実施の形態について、図を参照しながら詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
図1は、本発明のタンパク質同定装置の概略構成を説明するための図である。 FIG. 1 is a diagram for explaining a schematic configuration of a protein identification apparatus of the present invention.
図1において、本発明のタンパク質同定装置1は、ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用RAMカラム2と、この濃縮用RAMカラム2にトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離してイオン化するイオン化部3と、イオン化部3で分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置5と、ペプチド混合物の濃縮用RAMカラム2への導入と、濃縮用RAMカラム2にトラップしたペプチド断片をイオン化部3への導出を切り替える切り替えバルブ4を備える。
In FIG. 1, a protein identification apparatus 1 of the present invention introduces a
切り替えバルブ4は、ペプチド混合物を導入する導入ポート4aと、排出ポート4bと、濃縮用RAMカラム2を接続するための2つの接続ポート4c、4fと、イオン化部3を接続する接続ポート4eと、移動相を導入するためのポート4dを備える。
The
導入ポート4aにはインジェクタ14が接続される。このインジェクタ14には、送液ポンプ11により送られた試料導入液21に同定対象の試料が注入され、切り替えバルブ4の導入ポート4aに導入される。インジェクタ14に注入される試料としては、例えば、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化する酵素消化ペプチド断片化、あるいは化学断片化で断片化した断片化ペプチドを用いる。
An
また、移動相を導入するためのポート4dには、送液ポンプ12,13により移動相22,23が導入される。送液ポンプ12,13とポート4dとの間には、グラジエントミキサ15、抵抗管17が接続されたジョイント16が接続され、移動相22,23によるグラジエントを行うことができる。
The
なお、試料導入液21,移動相液22,23と送液ポンプ11、12,13との間にはデガッサ18を設けてもよい。デガッサ18を設けることで、試料導入液21や移動相22,23中に含まれる酸素分子や窒素分子を排出し、下流側の流路中での気泡の発生を防ぐことができる。
A degasser 18 may be provided between the
接続ポート4c、4fの両端には濃縮用RAMカラム2が接続される。また、排出ポート4bは、切り替えバルブ4を切り替えることで、濃縮用RAMカラム2の一端と接続され、試料導入液21とともに濃縮用RAMカラム2を通過した大きな分子量のペプチド断片やタンパク質の切り残りを排出する。
The
また、導出ポート4fには、フィルタ19を介してイオン化部3に接続され、切り替えバルブ4を切り替えることで、濃縮用RAMカラム2に接続され、移動相22,23とともに濃縮用RAMカラム2にトラップしたペプチド断片をイオン化部3に導入する。
In addition, the
イオン化部3は、濃縮用RAMカラム2から導入されたペプチド断片の多プロトン化分子をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと兼用するエレクトロスプレーキャピラリ(以下では、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラム3bとする)に通して分離した後、エレクトロスプレーユニット3aでイオン化して質量分析装置5に導入する。
The
ここで、濃縮用RAMカラム2は、分子量の大きな高分子化合物は保持することなく通過させ、分子量の小さな低分子化合物をのみを保持する性質を備えるカラムであり、特殊な表面構造と細孔サイズにより、ある条件では低分子量の目的成分を保持しつつ、かつ細孔内に入らないタンパク質を素通りさせることができる。本発明は、この濃縮用RAMカラムを酵素消化ペプチド断片によるペプチドマッピングシステムに適用することで、切れ残りのタンパク質や、不完全な断片化で生じた分子量の大きなペプチド断片を選択的に取り除くことができる。
Here, the
このカラムとしては、例えば、Shim-pack MAYI-ODS(島津製作所)、ISPR-GFF(Regis Technologies inc),Lichrospher PR-18 ADS(Merck)がある。Shim-pack MAYI-ODSでは、シリカゲルの外表面を親水性ポリマーでコーティングし、細孔内部のみをオクタデシル基(ODS)で化学装飾る表面構造であり、タンパク質のような高分子は細孔内部に入れず、また、外表面の親水性ポリマーにブロックされるため、固定相ODSには保持されずに溶出され、一方、誘起低分子化合物は細孔内部に浸透し、内部表面の固定相に保持されるものである。 Examples of this column include Shim-pack MAYI-ODS (Shimadzu Corporation), ISPR-GFF (Regis Technologies Inc), and Lichrospher PR-18 ADS (Merck). Shim-pack MAYI-ODS is a surface structure in which the outer surface of silica gel is coated with a hydrophilic polymer and only the inside of the pores is chemically decorated with octadecyl groups (ODS). In addition, because it is blocked by the hydrophilic polymer on the outer surface, it elutes without being retained in the stationary phase ODS, while the induced low molecular weight compound penetrates into the pores and is retained in the stationary phase on the inner surface. It is what is done.
次に、本発明のタンパク質同定装置の動作例について、図2,3を用いて説明する。 Next, an operation example of the protein identification device of the present invention will be described with reference to FIGS.
はじめに、切り替えバルブ4を切り替えることで、導入ポート4aにインジェクタ14の流路を接続しておく(図2中のA)。目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物を用意しておき、このペプチド混合物をインジェクタ14から注入し、試料導入液21とともに導入ポート4aに導入する。
First, the flow path of the
ペプチド断片化は、例えば、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化する酵素消化ペプチド断片化、あるいは、化学的手法による化学断片化を用いることができる(図2中のB)。 Peptide fragmentation can use, for example, enzymatic digestion peptide fragmentation in which the target protein is reductively alkylated and then digested with a proteolytic enzyme, or chemical fragmentation by a chemical technique (B in FIG. 2).
導入ポート4aから導入されたペプチド混合物(タンパク質酵素消化物)は、接続ポートfから濃縮用RAMカラム2内に導入され、接続ポート4c、排出ポート4bを通して排出される(図2中のD)。送液ポンプ11を駆動して試料導入液21を送液し続けることによって、濃縮用RAMカラム2では、導入されたペプチド混合物に対して、脱塩、切り残りのタンパク質の除去、分子量の大きなペプチド断片の除去を行うとともに、低分子量のペプチド断片を濃縮して保持する(図2中のC)。
The peptide mixture (protein enzyme digest) introduced from the
次に、切り替えバルブ4を切り替えて、導入ポート4dにグラジエントミキサ15の流路を接続する(図3中のE)。送液ポンプ12,13を駆動して移動相22,23の送液を開始し、接続ポート4d、4cを通して濃縮用RAMカラム2に移動相を導入し(図3中のF)、濃縮用RAMカラム2にトラップされているペプチド断片を移動相とともに、接続ポート4f、導出ポート4eを通してイオン化部3に導入する(図3中のG)。
Next, the switching
イオン化部3は、導入されたペプチド断片を分離してイオン化し、質量分析装置5に導入する(図3中のH)。
The
上記図1〜3に示す例では、ペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離した後、質量分析計で検出する構成において、質量分析計のイオン化をエレクトロスプレー法で行う形態を示しているが、エレクトロスプレー法に限らず、逆相クロマトグラフィーで分離した後、フラクションコレクタで分取し、MALDI法(Matrix Asssisted Laser Desortion/Ionization(マトリックス支援レーザ脱離イオン化法))でイオン化する形態としてもよい。 In the example shown in FIGS. 1 to 3, in the configuration in which peptide fragments are separated by reverse phase chromatography and then detected by a mass spectrometer, the mass spectrometer is ionized by an electrospray method. Not only the spray method but also separation by reverse phase chromatography, fractionation with a fraction collector, and ionization by MALDI method (Matrix Assessed Laser Desortion / Ionization) may be used.
図4は、本発明のタンパク質同定装置の概略構成の別例を説明するための図である。なお図4において、フィルタ19までの構成は図1に示した構成と同様であるため、フィルタ19の構成について説明する。図1に示した構成はオンラインによる構成であるのに対して、図4に示す構成はオフラインによる構成である。
FIG. 4 is a diagram for explaining another example of the schematic configuration of the protein identification device of the present invention. 4, the configuration up to the
RAMカラム4にトラップされているペプチド断片を移動相とともに接続ポート4f、導出ポート4eを通して分析カラム31へ導入する。分析カラム31は、導入されたペプチド断片を分離し、UV等の検出器32を通す。検出器32で検出されたピーク又は時間によって分取し。フラクションコレクタ又はMALDIプレートスポッター33に導入する。
The peptide fragment trapped in the
フラクションコレクタ又はMALDIプレートスポッター33に分取されたペプチド成分あるいは画分は、MALDI(Matrix Asssisted Laser Desortion/Ionization)−TOFMS(Time of Flight Mass Spectrometry(飛行時間型質量分析))装置34に導入する。なお、フラクションコレクタとしては、例えば、島津FRC-10A(商品名)があり、MALDIプレートスポッターとしては、例えば、島津AccuSpot(商品名)がある。
Peptide components or fractions fractionated by the fraction collector or
1…タンパク質同定装置、2…濃縮用RAMカラム、3…イオン化部、3a…ペプチド断片をエレクトロスプレーユニット、3b…ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラム、4…切り替えバルブ4、4a…導入ポート、4b…排出ポート、4c…接続ポート、4d…移動相導入ポート、4e…導出ポート、4f…接続ポート、5…質量分析装置、11,12,13…送液ポンプ、14…インジェクタ、15…グラジエントミキサ、16…Tジョイント、17…抵抗管、18…デザッサ、21…試料導入液、22,23…移動相、31…分析カラム、32…検出器、33…フラクションコレクタ、MALDIプレートスポッター、34…MALDI−TOFMS装置。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Protein identification apparatus, 2 ... Condensation RAM column, 3 ... Ionization part, 3a ... Electrospray unit for peptide fragments, 3b ... Reverse phase chromatography column for peptide separation, 4 ...
Claims (5)
ペプチド断片化後のペプチド混合物を濃縮用RAMカラムに導入し、
分子量の小さなペプチド断片を濃縮用RAMカラムにトラップし、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用RAMカラムで素通りさせて廃棄し、
濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入して逆相分離し、分離したペプチド断片を質量分析に導入することを特徴とする、タンパク質同定方法。 In a protein identification method for identifying a protein by subjecting the target protein to peptide fragmentation, separating the peptide fragment from the peptide mixture obtained by this peptide fragmentation by reverse phase chromatography, and mass spectrometry,
Introducing the peptide mixture after peptide fragmentation into a RAM column for concentration,
The peptide fragment with a low molecular weight is trapped on a concentration RAM column, the peptide fragment with a high molecular weight and the remaining protein are passed through the concentration RAM column and discarded.
A protein identification method comprising introducing a peptide fragment trapped in a concentration RAM column into a reversed-phase chromatography column for peptide separation, reverse-phase separation, and introducing the separated peptide fragment into mass spectrometry.
ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用RAMカラムと、
前記濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離するペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと、
ペプチド混合物を導入する導入ポートと、排出ポートと、濃縮用RAMカラムと接続する2つの接続ポートと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートを有し、ペプチド混合物の濃縮用RAMカラムへの導入と、濃縮用RAMカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムへの導出とを切り替える切り替えバルブと、
前記ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムで分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置とを備え、
前記濃縮用RAMカラムは、
分子量の小さなペプチド断片を濃縮用RAMカラムにトラップさせ、
分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用RAMカラムで素通りさせることを特徴とするタンパク質同定装置。 In a protein identification apparatus for identifying a protein by subjecting the target protein to peptide fragmentation, separating the peptide fragment from the peptide mixture obtained by this peptide fragmentation by reverse phase chromatography, and mass spectrometry,
A concentration RAM column for introducing a peptide mixture after peptide fragmentation to trap peptide fragments;
A peptide separation reverse phase chromatography column for separating peptides by introducing the trapped peptide fragments into the concentration RAM column;
A RAM column for concentrating peptide mixtures, having an introduction port for introducing a peptide mixture, an exhaust port, two connection ports for connecting to a RAM column for concentration, and a connection port for connecting to a reverse phase chromatography column for peptide separation A switching valve that switches between the introduction of the peptide fragment and the peptide fragment trapped in the concentration RAM column to the reverse phase chromatography column for peptide separation,
A mass spectrometer for performing mass spectrometry by introducing the peptide separated by the reverse phase chromatography column for peptide separation,
The concentration RAM column is
Trap peptide fragments with low molecular weight on a RAM column for concentration,
A protein identification apparatus characterized in that a peptide fragment having a large molecular weight and the remaining protein are passed through a concentration RAM column.
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