JP4756417B2 - Identification method of specific gonococci - Google Patents
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Description
本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）種の中からアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似のゲノム配列の一部を欠損した株を同定する方法及び該方法に用いることができる核酸に関する。 The present invention relates to a method for identifying a strain lacking a part of a genomic sequence similar to an aflatoxin biosynthesis gene cluster from among Aspergillus oryzae species and a nucleic acid that can be used in the method.
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）は古来より日本の醸造産業に利用されており、人間に対する安全性は、ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe:米国ＦＤＡ）として認められている。一方、麹菌の類縁糸状菌であるアスペルギルス・フラブスには、強い発ガン性のあるアフラトキシンを生産する株が存在する。すでに、麹菌がアフラトキシンを生産しないことは種々の科学的方法で検証されている。しかしながら、アスペルギルス・フラブスが有するアフラトキシン生産に必要と推定される酵素など２５遺伝子を含む約７０Ｋｂに及ぶアフラトキシン生合成遺伝子クラスター（非特許文献１）と類似する領域を持つ麹菌の存在も報告されており（非特許文献２）、麹菌のアフラトキシン非生産性を遺伝子のゲノム構造から完全に証明するまでには到ってなかった。 Aspergillus oryzae has been used in the Japanese brewing industry since ancient times, and safety to humans has been recognized as GRAS (Generally Recognized As Safe: US FDA). On the other hand, Aspergillus flavus, a filamentous fungus of Aspergillus oryzae, has a strain that produces aflatoxin with strong carcinogenicity. Already, various scientific methods have verified that koji molds do not produce aflatoxins. However, the presence of Aspergillus oryzae having a region similar to the aflatoxin biosynthetic gene cluster (Non-patent Document 1) covering about 70 Kb including 25 genes including enzymes presumed to be necessary for aflatoxin production possessed by Aspergillus flavus has been reported. (Non-patent document 2), the aflatoxin non-productivity of Neisseria gonorrhoeae has not yet been fully proved from the genome structure of the gene.
しかし、麹菌の中には、上記アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している可能性のある株の存在も報告されている（非特許文献２）。これらの株は、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的である。従って、これらの株を食品産業に使うことは消費者に対して安心感を与えることができ、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域をほとんど有する麹菌株を使用することに比べてより望ましい。しかし、現在このアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している麹菌株を簡便に識別する方法は確立されていない。 However, the presence of strains that may lack a part of the region similar to the aflatoxin biosynthesis gene cluster has been reported in Neisseria gonorrhoeae (Non-patent Document 2). It is definite that these strains have no ability to biosynthesize aflatoxins from the gene (genomic) structure. Therefore, using these strains in the food industry can give consumers a sense of security and is more desirable than using strains that have almost the same region as the aflatoxin biosynthesis gene cluster. However, there is currently no established method for easily identifying a koji strain lacking a region similar to this aflatoxin biosynthesis gene cluster.
本発明の目的は、麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのための核酸を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for easily identifying a strain lacking a region similar to the aflatoxin biosynthetic gene cluster in Neisseria gonorrhoeae and a nucleic acid for the method.
本願発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌のグループが、他の麹菌のグループと異なる固有の塩基配列を有していることを見出し、該固有の塩基配列を指標として、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌を同定することが可能であることに想到し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a group of koji molds lacking a part of a region similar to the aflatoxin biosynthesis gene cluster is different from other koji mold groups. It has been found that it has a base sequence, and it is possible to identify Neisseria gonorrhoeae that lacks a part of the region similar to the aflatoxin biosynthesis gene cluster using the unique base sequence as an index. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、麹菌のゲノムDNA中に、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域若しくはその部分領域が存在すること及び／又は前記5416nt〜13160ntの領域とその隣接領域との間の分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む、麹菌の同定方法であって、前記部分領域が１５塩基以上のサイズを有する、方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域から成る核酸、又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸であって、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌のゲノム内に存在する塩基配列から成る核酸を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の部分領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域から成り、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntにストリンジェントな条件においてハイブリダイズする核酸を含む、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌の同定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の同定試薬に含まれる前記プライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜5415ntの領域中の連続する１５塩基以上の部分領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域を含み、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜5415ntにハイブリダイズする核酸であるプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定するためのプライマーセットを提供する。
That is, the present invention is the presence or absence of a 5416nt to 13160nt region or a partial region thereof in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and / or the adjacent region of 5416nt to 13160nt. A method for identifying gonococci, comprising identifying gonococci lacking a part of an aflatoxin biosynthetic gene group-like sequence using as an index the presence of a fragmentation site between the regions, wherein the partial region comprises 15 bases A method having the above sizes is provided. The present invention also relates to a nucleic acid comprising a region of 5416nt to 13160nt in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a nucleic acid substituted with 10% or less of the base thereof, and an aflatoxin biosynthesis gene group-like sequence providing a nucleic acid consisting of nucleotide sequences present in the genome of Aspergillus oryzae lacking a part of. Et al is, the present invention consists consecutive 15 bases or more partial regions or those less than 10% of bases in the region of 5416nt~13160nt in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted region, Provided is a reagent for identifying Aspergillus oryzae that lacks a part of an aflatoxin biosynthetic gene group-like sequence, which includes a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions at 5416 nt to 13160 nt in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing. Furthermore, the present invention relates to the primer contained in the identification reagent of the present invention, a partial region of 15 bases or more in the region of 1nt to 5415nt in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or 10% or less thereof. A koji mold that lacks a part of the aflatoxin biosynthetic gene group-like sequence, comprising a region substituted with a base, and a primer that is a nucleic acid that hybridizes to 1nt to 5415nt in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A primer set for identification is provided.
本発明によれば、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。従って、本発明の方法を適用して同定された、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を容易に食品産業に利用することができ、ひいては消費者に対して安心感を与えることができる。 According to the present invention, it is possible to easily identify a gonococci that is definitive that there is no ability to biosynthesize aflatoxin, which lacks a part of the aflatoxin biosynthesis gene group-like sequence. Therefore, a koji mold that is identified by applying the method of the present invention and lacks a part of the aflatoxin biosynthetic gene group-like sequence and has no ability to biosynthesize aflatoxins is easily used in the food industry. And, in turn, can give consumers a sense of security.
本願発明者らは、独立行政法人酒類総合研究所の保存株であるアスペルギルス・オリゼRIB40株のゲノムDNA中のアフラトキシン生合成遺伝子群類似配列（以下、「AFクラスター」ということがある）の詳細を明らかにし、その塩基配列を公開している(DDBJ accession number: AB071288、AB076803、AB076804、AB182368)。RIB40株は、アスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスター全領域について、アスペルギルス・フラバスとほぼ同じ構造をしていることが明らかとなった。そこで、下記実施例において詳述するように、本願発明者らは、ＲＩＢ４０株のクラスター内に分散して存在する７遺伝子（aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs）を選択し、それぞれの塩基配列に基づき、麹菌ゲノム中の当該７遺伝子をＰＣＲ法により選択的に増幅、検出するためのプライマーセットを作成し、独立行政法人酒類総合研究所で保存している麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）２１０株について、上記プライマーセットを用いて、上記７遺伝子のゲノム中の存在をＰＣＲ法にて調査した。その結果、そのうち１２２株については７遺伝子全てが増幅し、これら遺伝子の全てがゲノム上に存在することが確認された。これら１２２株をグループ１とした。一方、７５株についてはaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子の増幅が認められず、これら４遺伝子が欠損している可能性が見いだされた。これら７５株をグループ２とした。
The inventors of the present application provide details of aflatoxin biosynthetic gene group similar sequences (hereinafter sometimes referred to as “AF clusters”) in the genomic DNA of Aspergillus oryzae RIB40 strain, a conserved strain of the National Research Institute for Liquors. Clarified and disclosed its nucleotide sequence (DDBJ accession number: AB071288, AB076803, AB076804, AB182368). The RIB40 strain was found to have almost the same structure as the Aspergillus flavus for the entire region of the aflatoxin biosynthetic gene cluster existing in Aspergillus flavus. Therefore, as described in detail in the following examples, the present inventors select 7 genes (aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs) that are dispersed in the cluster of RIB40 strain. Based on the respective base sequences, primer sets for selectively amplifying and detecting the 7 genes in the Aspergillus genome by the PCR method were prepared, and Aspergillus stored at the National Institute of Liquor Research. -About 210 strains of Aspergillus oryzae, the presence of the 7 genes in the genome was investigated by PCR using the above primer set. As a result, for 122 strains, all 7 genes were amplified and it was confirmed that all of these genes were present on the genome. These 122 strains were designated as
グループ２中のRIB 62株についてAFクラスター周辺のゲノム構造（塩基配列）を解析したところ、AFクラスター中のver-1の上流部位でAFクラスター中が切断され、これに続いてRIB40株やNCBIデータベースに登録されている塩基配列のいずれとも相同性のない領域が約8kb続き、さらに染色体のテロメアに続いていることを明らかにした（図１参照）。 Analysis of the genomic structure (base sequence) around the AF cluster of RIB 62 strains in Group 2 revealed that the AF cluster was cleaved at the upstream site of ver-1 in the AF cluster, followed by the RIB40 strain and the NCBI database. It has been clarified that a region having no homology with any of the nucleotide sequences registered in (1) continues for about 8 kb, followed by chromosome telomere (see FIG. 1).
RIB 62に見いだされたAFクラスターとテロメア間の特異的（ユニーク）部位の塩基配列の一部（図１中のRIB62の構造を示す図の上に書かれた灰色の箱の部分）をプローブにして、グループ２の７５株についてサザン解析をした結果、全ての菌株で同じサイズのバンドが検出された。一方RIB40と同じく、AFクラスターの全長を有すると思われる菌株（グループ１）ではバンドが検出されなかった。さらに、分断部位をふくむ領域（分断部位を挟んで上流から下流に到る配列）を増幅できるようなプライマーセットを設計し、このプライマーセットによるＰＣＲを行ったところ、全てのグループ２に属する菌株では同じサイズの増幅産物が得られ、グループ１では増幅産物は得られなかった。以上の結果から、グループ２に属する全ての菌株では、AFクラスターからテロメアにわたるゲノムの構造は同じ構造をとっていると結論づけた。
Using a part of the base sequence of the specific (unique) site between AF cluster and telomere found in RIB 62 (the gray box written on the diagram showing the structure of RIB62 in Fig. 1) as a probe As a result of Southern analysis of 75 strains of group 2, bands of the same size were detected in all strains. On the other hand, as with RIB40, no band was detected in the strain (Group 1) that seems to have the full length of the AF cluster. Furthermore, when a primer set that can amplify the region including the split site (sequence from upstream to downstream across the split site) was designed and PCR was performed using this primer set, all the strains belonging to Group 2 An amplification product of the same size was obtained, and no amplification product was obtained in
上記したように、グループ２に属する麹菌株はAFクラスターの半分以上を欠損しており、ゲノム構造上からアフラトキシンを生産する能力が失われていることが明白となった。すでに安全性が確立されている麹菌ではあるが、消費者への安心感を与えるためには、グループ２に属する麹菌を食品産業に用いることが極めて有効である。本願発明は、グループ２に属する麹菌を簡便に同定することができる麹菌の同定方法及びそのための核酸を提供するものである。 As described above, the koji mold belonging to group 2 is deficient in more than half of the AF cluster, and it has become clear that the ability to produce aflatoxin is lost from the genomic structure. Although it is a koji mold that has already been established for safety, it is extremely effective to use koji mold belonging to group 2 in the food industry in order to give consumers a sense of security. The present invention provides a method for identifying koji molds that can easily identify koji molds belonging to group 2 and a nucleic acid for the method.
アスペルギルス・オリゼRIB40株及びRIB62株のAFクラスター内の一部領域の構造を図１に示す。図１中、白抜きの矢印は、遺伝子及び転写の方向を示す。斜線を引いた領域が、約8kbの新規な配列部分（以下、便宜的に「8kb特異領域」ということがある）であり、黒塗りの部分がアスペルギルス・オリゼのテロメア領域の繰返し配列である。図１に示されるように、グループ２のRIB62株では、アフラトキシンの合成に必須的なaflR等の遺伝子が欠失している。 The structure of a partial region in the AF cluster of Aspergillus oryzae RIB40 strain and RIB62 strain is shown in FIG. In FIG. 1, open arrows indicate the gene and the direction of transcription. The hatched region is a novel sequence portion of about 8 kb (hereinafter sometimes referred to as “8 kb specific region” for convenience), and the black portion is a repetitive sequence of the telomeric region of Aspergillus oryzae. As shown in FIG. 1, in the RIB62 strain of group 2, genes such as aflR essential for aflatoxin synthesis are deleted.
RIB62株における、verAとavnAの間からテロメアに至る領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号１中の1654番目の塩基（以下、5'末端からＸ番目の塩基を「Ｘnt」のように表示する）から3184ntがverA遺伝子、4216nt〜5116ntがver-1遺伝子、5416nt〜13160ntが8kb特異領域、13161nt〜13267ntがテロメア領域である。 The base sequence of the region from verA and avnA to telomere in RIB62 strain is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. From the 1654th base in SEQ ID NO: 1 (hereinafter, the Xth base from the 5 ′ end is indicated as “Xnt”), 3184 nt is the verA gene, 4216 nt to 5116 nt is the ver-1 gene, and 5416 nt to 13160 nt is 8 kb The unique region, 13161nt to 13267nt, is the telomere region.
8kb特異領域は、アフラトキシン合成に必須的な、AFクラスターの一部を欠失している株に存在するので、配列番号１中の5416nt〜13160ntの領域である8kb特異領域若しくはその部分領域が存在すること又は前記5416nt〜13160ntの領域とその隣接領域との分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することが可能である。ここで、「部分領域」は、8kb特異領域が存在することを同定するのに足りるサイズを有する、8kb特異領域中の領域であり、連続する１５塩基以上の領域である。なお、規則により配列表には２本鎖ＤＮＡの場合でも１本鎖のみを記載することになっているから、配列番号１には１本鎖のみが記載されているが、現実の8kb特異領域及びその隣接領域は、二本鎖であり、従って、その検出には配列番号１に示される１本鎖の相補鎖も用いることができる。すなわち、「配列番号１」は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、具体的に記載されている１本鎖及びその相補鎖並びに二本鎖を包含する意味で用いている。
Since the 8 kb specific region exists in a strain lacking a part of the AF cluster, which is essential for aflatoxin synthesis, there is an 8 kb specific region or a partial region thereof, which is a region from 5416 nt to 13160 nt in SEQ ID NO: 1. It is possible to identify Neisseria gonorrhoeae lacking a part of the aflatoxin biosynthetic gene group-like sequence, using as an index the presence of a cleavage site between the 5416nt to 13160nt region and its adjacent region. Here, "partial region", having a size sufficient to identify that 8kb specific region exists is a region in the 8kb unique region, a region of more than 15 bases continue communicating. In the sequence listing, only one strand is described in the sequence listing even in the case of double stranded DNA. Therefore, only one strand is described in SEQ ID NO: 1, but the actual 8 kb specific region And its adjacent region is double-stranded, and therefore the single-stranded complementary strand shown in SEQ ID NO: 1 can also be used for the detection. That is, “SEQ ID NO: 1” is used to include a specifically described single strand, its complementary strand, and double strand unless it is clear from the context.
8kb特異領域及びその隣接領域の塩基配列が明らかになっているので、8kb特異領域若しくはその部分領域の存在又は8kb特異領域とその分断部位の存在は、それ自体周知の種々の方法により調べることができる。 Since the base sequence of the 8 kb specific region and its adjacent region has been clarified, the presence of the 8 kb specific region or its partial region or the presence of the 8 kb specific region and its fragmentation site can be examined by various methods known per se. it can.
まず、核酸プローブを用いる方法を挙げることができる。8kb特異領域の全長又はその部分領域、好ましくは１５塩基以上の領域にハイブリダイズする核酸をプローブとして用い、該核酸プローブが試料となる麹菌のゲノムDNAとハイブリダイズするか否かを調べる。なお、ここで、「ハイブリダイズするか否か」は、サザンブロット等の常法において、核酸プローブがハイブリダイズするか否かに基づいて標的核酸の存否を判定するために採用されているストリンジェントな条件においてハイブリダイズするという意味である。このような条件は、当業者にとって周知であり、下記の実施例にも具体的に記載されている。核酸プローブは、8kb特異領域内の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、１０％以下の塩基が置換した配列を有する核酸プローブを用いても検出は可能である。核酸プローブのサイズの上限は、特に限定されるものではなく、8kb特異領域の全長以下である。核酸プローブは、また、8kb特異領域とその隣接領域（3'側及び5'側のいずれでもよい）に跨る領域にハイブリダイズするように設定したものであってもよい。ただし、この場合には、8kb特異領域が存在しない場合にはハイブリダイズが起きないように、8kb特異領域とハイブリダイズする部分が核酸プローブの半分以上を占めることが好ましい。なお、周知の通り、通常、核酸プローブは、ハプテン標識、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオチン標識等の周知の標識で標識される。 First, a method using a nucleic acid probe can be mentioned. A nucleic acid that hybridizes to the full length of the 8 kb specific region or a partial region thereof, preferably a region of 15 bases or more is used as a probe, and it is examined whether or not the nucleic acid probe hybridizes to the genomic DNA of Aspergillus oryzae as a sample. Here, “whether or not to hybridize” means a stringent that is used to determine the presence or absence of a target nucleic acid based on whether or not a nucleic acid probe hybridizes in a conventional method such as Southern blotting. It means to hybridize under various conditions. Such conditions are well known to those skilled in the art and are also specifically described in the examples below. The nucleic acid probe is preferably a nucleic acid consisting of a region of 15 or more consecutive bases in an 8 kb specific region, but usually it can be detected using a nucleic acid probe having a sequence substituted with 10% or less of the base. . The upper limit of the size of the nucleic acid probe is not particularly limited, and is not more than the full length of the 8 kb specific region. The nucleic acid probe may also be set so as to hybridize to a region spanning the 8 kb specific region and its adjacent region (which may be either the 3 ′ side or the 5 ′ side). However, in this case, it is preferable that the portion that hybridizes with the 8 kb specific region occupies more than half of the nucleic acid probe so that hybridization does not occur when the 8 kb specific region does not exist. As is well known, the nucleic acid probe is usually labeled with a well-known label such as a hapten label, a fluorescent label, a radiolabel, an enzyme label, or a biotin label.
核酸プローブを用いる検出方法自体はこの分野において周知であり、例えば、サザンブロット法（下記実施例参照）を例示することができる。検出感度を高めるために、サザンブロット法に先立ち、試料DNAをPCR等の核酸増幅法により増幅してもよい（PCR−サザンブロット。増幅法は後述）。あるいは、核酸プローブを固相化し、試料DNAを標識して試料DNAが固相プローブにハイブリダイズするか否かを調べることによっても実施することができる。この場合も、検出感度を高めるために、固相プローブとのハイブリダイゼーションに先立ち、試料DNAをPCR等の遺伝子増幅法により増幅してもよく、この際に用いるヌクレオチドの一部として、蛍光標識や放射標識等で標識したヌクレオチドを用いることにより増幅DNAを標識することもできる。 The detection method itself using a nucleic acid probe is well known in this field, and for example, Southern blotting (see the following examples) can be exemplified. In order to increase the detection sensitivity, the sample DNA may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR prior to the Southern blot method (PCR-Southern blot. The amplification method will be described later). Alternatively, it can also be carried out by immobilizing the nucleic acid probe, labeling the sample DNA, and examining whether the sample DNA hybridizes to the solid phase probe. In this case as well, in order to increase the detection sensitivity, the sample DNA may be amplified by a gene amplification method such as PCR prior to hybridization with the solid phase probe. The amplified DNA can also be labeled by using nucleotides labeled with a radiolabel or the like.
8kb特異領域若しくはその部分領域及び／又は8kb特異領域とその隣接領域の間の分断部位の検出は、プライマーを用いるPCR等の核酸増幅法を利用して行うこともできる。核酸増幅法に用いるプライマーの少なくとも一方として、8kb特異領域内にハイブリダイズするものを用いることにより、増幅が起きるか否かに基づいて8kb特異領域中の部分領域の存在を検出することができる。なお、ここで、「ハイブリダイズする」とは、塩基配列の相補性に基づき、通常のPCRのアニーリング工程における条件下でハイブリダイズするという意味である。プライマーは、8kb特異領域内の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、１０％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても増幅が起きる場合が多い。プライマーのサイズは、特に限定されないが、通常、１５塩基〜５０塩基程度、好ましくは１８塩基〜４０塩基程度である。増幅領域のサイズは特に限定されないが、余りに大きいと増幅に時間がかかり、用いる試薬の量も増えるので、増幅領域のサイズは2000bp以下が好ましく、さらに1000bp以下が好ましい。一方、増幅断片を電気泳動等で容易に検出することができるために、増幅領域は、好ましくは50bp以上のサイズを有する。なお、PCR等の核酸増幅法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらを用いて容易に実施することができる。また、増幅が起きたか否かは、常法により、増幅反応の生成物を電気泳動にかけ、バンドが検出されるか否か等により容易に調べることができる。 Detection of the 8 kb specific region or a partial region thereof and / or the cleavage site between the 8 kb specific region and its adjacent region can also be performed using a nucleic acid amplification method such as PCR using a primer. By using at least one primer used in the nucleic acid amplification method that hybridizes within the 8 kb specific region, the presence of a partial region in the 8 kb specific region can be detected based on whether amplification occurs. Here, “hybridize” means to hybridize under the conditions in the normal PCR annealing step based on complementarity of base sequences. The primer is preferably a nucleic acid consisting of a region of 15 bases or more in a continuous region of 8 kb, but usually amplification often occurs even when a primer having a sequence substituted with 10% or less of the base is used. The size of the primer is not particularly limited, but is usually about 15 to 50 bases, preferably about 18 to 40 bases. The size of the amplification region is not particularly limited, but if it is too large, it takes time for amplification and the amount of reagent used increases. Therefore, the size of the amplification region is preferably 2000 bp or less, and more preferably 1000 bp or less. On the other hand, since the amplified fragment can be easily detected by electrophoresis or the like, the amplification region preferably has a size of 50 bp or more. Nucleic acid amplification methods such as PCR are well known, and kits and devices for such methods are also commercially available, and can be easily implemented using them. Whether or not amplification has occurred can be easily examined by subjecting the amplification reaction product to electrophoresis and detecting or not detecting a band by a conventional method.
核酸増幅法に用いる一対のプライマーは、両方とも8kb特異領域内に設定してもよいが、一方のプライマーとして8kb領域内にハイブリダイズするものを用い、他方のプライマーを隣接領域にハイブリダイズするものを用いることにより、分断部位を跨ぐ領域を増幅することができる。この方法によれば、8kb特異領域の存在のみならず、分断部位の存在、すなわち、8kb特異領域が、本願発明により明らかにされた位置に存在しているのか否かも同時に知ることができるので、検出結果の精度がより高く、好ましい。隣接領域に設定するプライマーは、3'側、5'側のいずれの隣接領域に設定してもよいが、他の位置にも存在し得る、3'側隣接領域であるテロメア領域よりは、5'側の隣接領域に設定することが好ましい（下記実施例参照）。さらに、所望により、念のために増幅産物（好ましくは数十bpの短いもの）の塩基配列を直接決定して、分断部位の存在を確認してもよい。 A pair of primers used in the nucleic acid amplification method may both be set in the 8 kb specific region, but one primer that hybridizes in the 8 kb region and the other primer hybridizes in the adjacent region By using this, it is possible to amplify a region straddling the divided site. According to this method, not only the presence of the 8 kb specific region, but also the presence of a fragmentation site, that is, whether or not the 8 kb specific region is present at the position clarified by the present invention, can be known at the same time, The accuracy of the detection result is higher and preferable. The primer to be set in the adjacent region may be set in either the 3 ′ side or 5 ′ side adjacent region, but may be present in other positions than the telomere region which is the 3 ′ side adjacent region. It is preferable to set the adjacent region on the “side” (see the following example). Furthermore, if necessary, the base sequence of the amplification product (preferably a short one of several tens of bp) may be directly determined just in case to confirm the presence of the cleavage site.
8kb特異領域は、全く新規な配列であるので、本願発明は、該8kb特異領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、8kb特異領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸をも提供する。このような核酸は、上記した本発明の方法に用いる核酸プローブやプライマーとして利用可能である。 Since the 8 kb specific region is a completely new sequence, the present invention relates to a nucleic acid comprising 15 or more consecutive regions in the 8 kb specific region or a nucleic acid substituted with 10% or less of the base, preferably 8 kb Also provided is a nucleic acid consisting of a region of 15 or more consecutive bases in a specific region. Such a nucleic acid can be used as a nucleic acid probe or primer used in the above-described method of the present invention.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１． アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌
すでに本願発明者らは、独立行政法人酒類総合研究所の保存麹菌株ＲＩＢ ４０株のアスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域のＤＮＡ塩基配列を決定している（DDBJ accession number: AB071288、AB076803、AB076804、AB182368）。その結果、ＲＩＢ４０株は、アスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスター全領域について、アスペルギルス・フラバスとほぼ同じ構造をしていることが明らかとなった。そこでＲＩＢ４０株のクラスター内に分散して存在する７遺伝子（aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs）を選択し、それぞれの塩基配列に基づき、麹菌ゲノム中の当該７遺伝子をＰＣＲ法により選択的に増幅、検出するためのプライマーセットを作成した。作成したプライマーセットの具体的な塩基配列は次の通りである。
aflT遺伝子用：フォワード側：5'-gcaccaaatgggtctttctcgt-3'
リバース側：5'-atccacggtgaagagggtaagg-3'
nor-1遺伝子用：フォワード側：5'-cggacgaggtctcattgaagcttt-3'
リバース側：5'-atcgatgatgaaggccgtga-3'
aflR遺伝子用：フォワード側：5'-ccggcgcataacacgtactc-3'
リバース側：5'-ggcgcttggccaataggttc-3'
norA遺伝子用：フォワード側：5'-ggctggaaaggggtaatggg-3'
リバース側：5'-tcttgcgaccctcacgagaa-3'
avnA遺伝子用：フォワード側：5'-aatcgcacccaatgagctgtct-3'
リバース側：5'-atggcccgggttctttagcaac-3'
verB遺伝子用：フォワード側：5'-gatgcaccatgacctcatgcgtta-3'
リバース側：5'-cacggcagcgttattgatcatctc-3'
vbs遺伝子用：フォワード側：5'-tgcgaatgctacggctctca-3'
リバース側：5'-caaccgccatctcctggtct-3'
独立行政法人酒類総合研究所で保存している麹菌２１０株について、上記プライマーセットを用いて、上記７遺伝子のゲノム中の存在をＰＣＲ法にて調査した結果、そのうち１２２株については７遺伝子全てが増幅し、これら遺伝子の全てがゲノム上に存在することが確認された。これら１２２株をグループ１とした。一方、７５株についてはaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子の増幅が認められず、これら４遺伝子が欠損している可能性が見いだされた。これら７５株をグループ２とした。
1. Aspergillus oryzae lacking a part of the sequence similar to the biosynthetic gene group of aflatoxin The inventors of the present application have already confirmed the aflatoxin production present in the Aspergillus flavus of the preservation strain RIB 40 of the National Research Institute for Liquors. The DNA base sequence of a region similar to the synthetic gene cluster has been determined (DDBJ accession number: AB071288, AB076803, AB076804, AB182368). As a result, it was revealed that the RIB40 strain has almost the same structure as the Aspergillus flavus for the entire region of the aflatoxin biosynthetic gene cluster existing in the Aspergillus flavus. Therefore, we select 7 genes (aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs) that are dispersed in the cluster of RIB40 strain, and based on each base sequence, select these 7 genes in the Koji mold genome. A primer set for selective amplification and detection by the PCR method was prepared. The specific base sequence of the prepared primer set is as follows.
For aflT gene: Forward side: 5'-gcaccaaatgggtctttctcgt-3 '
Reverse side: 5'-atccacggtgaagagggtaagg-3 '
For nor-1 gene: Forward side: 5'-cggacgaggtctcattgaagcttt-3 '
Reverse side: 5'-atcgatgatgaaggccgtga-3 '
For aflR gene: Forward side: 5'-ccggcgcataacacgtactc-3 '
Reverse side: 5'-ggcgcttggccaataggttc-3 '
For norA gene: Forward side: 5'-ggctggaaaggggtaatggg-3 '
Reverse side: 5'-tcttgcgaccctcacgagaa-3 '
For avnA gene: Forward side: 5'-aatcgcacccaatgagctgtct-3 '
Reverse side: 5'-atggcccgggttctttagcaac-3 '
For verB gene: Forward side: 5'-gatgcaccatgacctcatgcgtta-3 '
Reverse side: 5'-cacggcagcgttattgatcatctc-3 '
For vbs gene: Forward side: 5'-tgcgaatgctacggctctca-3 '
Reverse side: 5'-caaccgccatctcctggtct-3 '
As a result of investigating the presence of the above 7 genes in the genome using the above-mentioned primer set for the 210 strains of Koji mold preserved at the National Institute of Liquor Research, all 7 genes were found for 122 strains. Amplification confirmed that all of these genes were present on the genome. These 122 strains were designated as
２．アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌のゲノムの特徴
次いで、グループ２に属するＲＩＢ６２株についてアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列が存在する周辺のゲノム塩基配列を詳細に調査した。その結果、グループ１に属するＲＩＢ４０株のゲノム配列と比べて、ＲＩＢ４０株に存在するaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子を含むアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列中の約４０kbが欠落し、その延長上に約８Kbの配列が続き、さらに染色体のテロメア配列に続いていることが明らかになった。本発明者らは、これらの領域、すなわちＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列とそれに続く領域、さらに末端のテロメア領域までの塩基配列を全て解読した。解読した塩基配列の一部を上記の通り配列番号１に示す。アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌の当該部分のゲノム塩基配列の解読は世界ではじめてのことである。ＲＩＢ６２株のゲノム構造の解析結果から、ＲＩＢ６２株はグループ１のＲＩＢ４０株と共通に存在するver-1配列の上流で染色体の分断が生じ、その結果テロメア部分も含めた欠損を修復する過程で約８Kbの配列を含むテロメア配列が付加されたものと推定された。ＲＩＢ４０株とＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスター構造の模式図は上記の通り図１に示されている。
2. Characteristics of Neisseria gonorrhoeae genome that lacks a part of the sequence similar to aflatoxin biosynthetic gene group Next, the surrounding genomic bases where the sequence similar to the aflatoxin biosynthetic gene group exists for RIB62 strain belonging to group 2 The sequence was investigated in detail. As a result, compared with the genome sequence of the RIB40 strain belonging to
３． グループ２におけるaflR 遺伝子の非存在の確認
グループ２では、aflR 遺伝子を特異的に増幅する上記プライマーを用いたＰＣＲ法によってaflR が検出されなかった。aflR は、アスペルギルス・フラブスにおいてアフラトキシンの生合成遺伝子を正に制御する重要な制御因子であり、本遺伝子の破壊によりアフラトキシンが生産されないことが確認されている。そこでグループ２についてaflR 内の配列をプローブとして常法によりサザン解析を行った。なお、用いたプローブの塩基配列を配列番号４に示す。その結果、グループ２に属する全ての菌株においてaflR 遺伝子が存在しないことが確認できた。従って、グループ２に属するアスペルギルス・オリゼ株はアフラトキシンの生産能力を全く有しないことが証明された。
3. Confirmation of absence of aflR gene in group 2 In group 2, aflR was not detected by the PCR method using the above primers that specifically amplify the aflR gene. aflR is an important regulator that positively regulates aflatoxin biosynthesis genes in Aspergillus flavus, and it has been confirmed that disruption of this gene does not produce aflatoxins. Therefore, Southern analysis was performed for group 2 by a conventional method using the sequence in aflR as a probe. The base sequence of the probe used is shown in SEQ ID NO: 4. As a result, it was confirmed that the aflR gene was not present in all the strains belonging to Group 2. Therefore, it was proved that the Aspergillus oryzae strain belonging to Group 2 has no aflatoxin production ability.
４． ＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスターにおける分断部位とテロメア配列間の約８ｋｂの配列の特異性
ＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスターに存在する分断部位（配列番号１の5415ntと5416ntの間）からテロメア領域に続く約８Kbの配列について、ＮＣＢＩへの登録配列およびＲＩＢ４０株のゲノム配列に対して相同配列を検索をしたところ、いずれのデータベースにおいても相同する配列は見いだせなかった。ここに、ＲＩＢ６２株の約８KbについてはＲＩＢ６２株の特有の配列であることが明らかとなった。
4). Specificity of about 8 kb sequence between the fragmentation site and the telomere sequence in the cluster similar to the aflatoxin biosynthesis gene group of RIB62 strain The fragmentation site (SEQ ID NO: 1) present in the cluster similar to the aflatoxin biosynthesis gene group of RIB62 strain The homologous sequence was searched for the registered sequence in NCBI and the genome sequence of RIB40 strain for the sequence of about 8 Kb following the telomeric region from between 5415 nt and 5416 nt of No. 5516 nt), and no homologous sequence was found in any database. There wasn't. Here, about 8 Kb of the RIB62 strain was revealed to be a unique sequence of the RIB62 strain.
５． サザンブロット法によるグループ２株の同定
ＲＩＢ６２株が有するアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列、分断部位、それに続く特異的領域が他のグループ２にも存在するか否かを、ＲＩＢ６２株の8kb特異領域内の部分領域をプローブとしたサザン解析によって解析した。この方法をより具体的に説明する。プローブは、ＲＩＢ６２株のゲノムを鋳型とし、特異的配列を増幅できるプライマーセット(5'-agatgatcctgggatgcagaat-3'（配列番号５）と5'-aaattaagcgagcggttcagcg-3')（配列番号６）を用いたPCRにより増幅断片を得、市販のキット(PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche Diagnostics, GmbH Germany))を用いて増幅断片をハプテンの１種であるジゴキシゲニン(DIG)で標識することにより調製した。なお、このプローブがハイブリダイズする領域は、配列番号１の5887nt〜7141ntの領域であり、この領域は図１中の灰色のボックスで示されている。グループ２に属する７５株のゲノムDNA１５μgを、制限酵素SalIで３７℃、１晩分解した後に、１％アガロースゲル電気泳動した。なお、制限酵素SalI部位は図１に示されており、より詳細には、配列番号１中の3605nt〜3610nt、及び13052nt〜13057ntがSalI認識部位である。泳動ゲルを用い、Hybond-N+(Amersham Biosciences, Tokyo)にてサザンブロットとハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は、次の通りであった。メンブレンを1Mチャーチリン酸バッファー（pH7.2、ハイブリダイゼーションバッファー）中で68℃、30分以上プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを必要量（10ng/cm2）、1.5mlチューブに入れ5分間、軽い沸騰状態に保ち、その後氷水中で10分間急冷した。プローブをハイブリダイゼーションバッファーに加えた（メンブレンフィルター100cm2当たり3.5ml）。プレハイブリダイゼーション溶液からメンブレンを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液に移し、68℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。なお、ハイブリダイゼーション溶液はあらかじめ68℃まで加温した状態で用いた。ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件は次の通りであった。一晩ハイブリダイゼーション後のメンブレンを2×SSC（NaCl:17.53g, Sodium Citrate・2H2O:8.82g/L）に0.1%SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)を加えた溶液において、室温で、５分間以上、２回洗浄を行った。その後、68℃に加温しておいた0.5×SSCに0.1%SDSを加えた溶液において、68℃で10分以上、２回洗浄を行った。シグナル検出はDIG市販発光検出キット(Roche Diagnostics, GmbH Germany)の方法に従って行った。
5. Identification of group 2 strains by Southern blotting Whether or not a sequence similar to the aflatoxin biosynthetic system gene group possessed by the RIB62 strain, a cleavage site, and a specific region following it also exist in the other group 2 is determined. The analysis was performed by Southern analysis using a partial region in the specific region as a probe. This method will be described more specifically. The probe is a PCR using a primer set (5'-agatgatcctgggatgcagaat-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-aaattaagcgagcggttcagcg-3') (SEQ ID NO: 6) that can amplify a specific sequence using the genome of RIB62 strain as a template. Thus, the amplified fragment was prepared by labeling the amplified fragment with digoxigenin (DIG), a kind of hapten, using a commercially available kit (PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche Diagnostics, GmbH Germany)). The region to which this probe hybridizes is the region from 5887 nt to 7141 nt of SEQ ID NO: 1, and this region is indicated by a gray box in FIG. 15 μg of genomic DNA of 75 strains belonging to Group 2 was digested with restriction enzyme SalI at 37 ° C. overnight, and then subjected to 1% agarose gel electrophoresis. The restriction enzyme SalI site is shown in FIG. 1, and more specifically, 3605nt to 3610nt and 13052nt to 13057nt in SEQ ID NO: 1 are SalI recognition sites. Hybridization was performed with Southern blotting using Hybond-N + (Amersham Biosciences, Tokyo) using an electrophoresis gel. Hybridization conditions were as follows. The membrane was prehybridized in 1 M charillic acid buffer (pH 7.2, hybridization buffer) at 68 ° C. for 30 minutes or more. The required amount (10 ng / cm 2 ) of the probe was placed in a 1.5 ml tube, kept at a light boil for 5 minutes, and then rapidly cooled in ice water for 10 minutes. The probe was added to the hybridization buffer (3.5 ml per 100 cm 2 membrane filter). The membrane was removed from the prehybridization solution, transferred to the hybridization solution, and hybridized overnight at 68 ° C. The hybridization solution was preheated to 68 ° C. The conditions for washing after hybridization were as follows. Overnight hybridization in a solution of 0.1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) in 2 × SSC (NaCl: 17.53 g, Sodium Citrate · 2H 2 O: 8.82 g / L) for at least 5 minutes at room temperature Two washes were performed. Thereafter, washing was performed twice at 68 ° C. for 10 minutes or more in a solution in which 0.1% SDS was added to 0.5 × SSC that had been heated to 68 ° C. Signal detection was performed according to the method of DIG commercial luminescence detection kit (Roche Diagnostics, GmbH Germany).
その結果、RIB ４０株ではバンドが検出されないが、グループ２に属する７５株の麹菌株では全て約9.4Kbの位置に明確なバンドが検出された。この結果は、グループ２に属する全ての菌株が、ＲＩＢ６２と相同の特異的領域を有することを示している。 As a result, no band was detected in the RIB 40 strain, but a clear band was detected at a position of about 9.4 Kb in all 75 strains belonging to Group 2. This result shows that all strains belonging to Group 2 have a specific region homologous to RIB62.
また、上記方法により、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌に共通して存在する特異的配列をサザン解析により検出することによりアフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している全ての麹菌を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。 In addition, by the above method, aflatoxin biosynthetic gene group is detected by Southern analysis by detecting a specific sequence commonly present in Aspergillus oryzae lacking a part of the sequence similar to aflatoxin biosynthetic gene group. It was proved that all gonococci lacking a part of the sequence similar to can be identified and classified specifically and easily.
６． ＰＣＲによるグループ２株の同定
グループ２に属するＲＩＢ６２株のver-1配列に続く分断部位を越えてテロメアに続く一連の領域はグループ１には存在しないゲノム構造（塩基配列）となっていた。そこで、ＲＩＢ６２株のver-1配列及び分断部分に続く約８Kbの配列の分断部位に近い配列に基づいて、ＲＩＢ６２株の分断部分構造を含む領域を特異的にＰＣＲ法にて増幅するためのプライマーを設計した（配列a：配列番号２、配列b：配列番号３）。なお、配列番号２の配列は、配列番号１のセンス鎖の5253nt〜5279ntと同一の配列であり、配列番号３の配列は、配列番号１の6222nt〜6199ntのアンチセンス鎖と同一の配列である。従って、このプライマーセットを用いて配列番号１の配列を鋳型としてPCRを行なうと、これらのプライマーに挟まれる970bpの領域が増幅される。このプライマーセットを用いて全てのグループ２に分類された麹菌のゲノムを鋳型にしてＰＣＲを行った。PCRは、具体的に次のようにして行なった。ＰＣＲにはグループ２に属する７５株のそれぞれのゲノムＤＮＡ、プライマー(a)、プライマー(b)、１３μLのInsert Check-Ready-Mix(Code No.:PIK-251, TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan) を含む１５μＬの反応液を用いた。ＰＣＲ反応は、GeneAmp PCR sysytems9700(Applied Biosystems)を使用し、９４℃で４分保持後、変性反応（９４℃、２０秒）、アニーリング（６０℃、５秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）で２５サイクル行った。ＰＣＲ反応終了液３μLを、１×Tris-Acetate-EDTA（TAE）バッファーを用い１％アガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで２０分処理しゲルを紫外線照射してＰＣＲ産物を検出した。
6). Identification of group 2 strains by PCR A series of regions following the telomere beyond the split site following the ver-1 sequence of the RIB62 strain belonging to group 2 had a genomic structure (base sequence) that does not exist in
その結果、グループ１ではＰＣＲ反応生成物は検出されず、グループ２に属する７５株全てにおいてＲＩＢ６２株の配列から予想されるサイズと同じサイズのＰＣＲ増幅産物が検出された。増幅産物のサイズが全て同じであることから、グループ２の７５株は、ＲＩＢ６２株に特異的なアフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の欠損を生じた染色体の分断部位近傍のゲノム構造と同じゲノム構造を有している可能性が極めて高いことが明らかとなった。
As a result, no PCR reaction product was detected in
また、プライマー(a)、(b)を用いたＰＣＲ反応ではグループ２でしか反応生成物ができないことから、本プライマーを用いたＰＣＲ反応によって、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損しているグループ２の菌株を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。 In addition, since a PCR product using primers (a) and (b) can produce a reaction product only in group 2, a sequence similar to the aflatoxin biosynthetic gene group can be obtained by PCR using this primer. It was proved that the strain of group 2 lacking a part can be identified and classified specifically and easily.
本発明の方法により、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。本発明の方法を用いて同定された、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を食品産業等において用いることにより、消費者に対して安心感を与えることができる。 According to the method of the present invention, it is possible to easily identify a gonococcus definitive that there is no ability to biosynthesize aflatoxin from a gene (genome) structure. The use of koji molds that are identified using the method of the present invention and have a definite ability to biosynthesize aflatoxins in the food industry or the like can give a sense of security to consumers.
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