JP4755368B2 - High-density cell array substrate, manufacturing method, and use thereof - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な培養基板、該培養基板を用いる高密度細胞アレイ用基板およびそれらの製造法に関する。また、本発明は、高密度細胞アレイ用基板上で培地が分離された各細胞を化学物質等に対する評価、及び遺伝子導入操作等に利用する方法に関する。さらに、本発明は、その細胞評価、或いは遺伝子操作後、特定の活性を持つ細胞のみを剥離、回収する方法に関する。また、さらに、本発明は上記操作による医薬・毒物等の化学物質のスクリーニング方法、遺伝子導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンの薬物治療は血液細胞のガンなどでは非常に大きな成果をあげているが、ある種の固形ガンではいまだ十分な成果をあげるに至っていない。その理由の一つに、抗ガン剤の効果がガン細胞間で一様でないにもかかわらず、実際に投与する前にその有効性、必要量を調べる有効な手段がないことがあげられる。抗ガン剤の種類は多く、その処方も一様ではないため、簡便に複数の抗ガン剤をアッセイできる培養細胞を利用したシステムが開発できれば、実際に患者に処方する前に、腫瘍から採取したガン細胞を培養し、多種の抗ガン剤についてその効果の有無や必要な処方量を決定でき、現状では副作用の問題を十分回避できていないガンの薬物治療を大きく進展させることが期待できる。しかし、生検で採取できる細胞の量は微量であり従来の培養法では多種類の処方を検定できず、また従来の培養法では、多検体とすればそれだけの培養容器が必要となり、臨床の場において行うことはその規模の点からもまた必要な労力の点からもまったく現実的でない。
近年、実験動物の希少性や個体差に起因する低再現性、ヒトとの種差などの問題点が指摘され、ヒトなどの培養細胞を用いた薬物・毒物評価技術の開発が大きく注目されている。また、新薬開発の低コスト化、医薬品の安全性の確認、環境アセスメントなどの観点から、多種の薬物・毒物を同時に短時間でアッセイする技術の開発の必要性も強く指摘されている。これらの要求に対して、半導体加工技術として知られていたマイクロファブリケーション（微細加工）技術を応用して、数cm〜10cm程度の大きさをもつ基坂上で電気泳動やクロマトグラフィをおこなうデバイス（“ラボ・オン・チップ”）の開発が注目を集めている。たとえば核酸の電気泳動においては、従来別々の装置で行われていたゲルの作成、電気泳動、バンドの検出、データ解析の全てを全自動化したシステムがすでに市販されている。“ラボ・オン・チップ”技術を用いることで（１）少量のサンプルしか必要としない、（２）多検体を同時に大規模で並列的にアッセイできる、（３）システム化により手作業を自動化でき、高再現性が得られる、（４）廃液量が激減し環境に与える影響を極小にできる、（５）毒性のある試薬の使用量が激減し、安全性が高い、（６）分析コストの軽減化などが達成できるなどのメリットが得られる。
【０００３】
抗体や酵素がその高い特異性による微量測定、定量化を目的としている一方、生体が示す反応を理解するには、これまで実験動物に頼らねばならなかった。細胞はたとえ一個であってもコンピュータや化学コンビナートにも匹敵する複雑な情報処理能力と化学反応を示すため、単にその量を計測するのではなく、いわば対象となる薬物・毒物が生体に与える影響の質を計測するのに使えるのではないかとの視点から大きな期待がもたれている。
１細胞単位の計測をおこなうシステムとしては、フローサイトメーターがあり、膜表面抗原の定量的な計測が可能になるなど、免疫学の進歩に大きく貢献したが、すでに２０年以上の歴史をもち、今後も大きな進歩はないと考えられる。フローサイトメーターは血球などの浮遊系の細胞を対象としており、培養皿上で培養した付着性の細胞の場合には培養皿から回収して懸濁する必要があり、例えば、付着性ガン細胞の超多検体同時評価などには用いることができない。
近年、レーザースキャンサイトメトリーと呼ばれる、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージと蛍光顕微鏡を組み合わせた機械が市販されている。これはスライドグラス上の組織標本中の細胞を一個ずつ計測することを目的としている。すなわち一枚のプレパラート上の細胞はすべて同じ条件下の細胞であり、薬物の評価にこれを用いる場合、薬物の種類、条件の数だけプレパラートが必要となるため、多数の異なる薬物を異なる条件下で同時に評価するために用いることは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記の問題点の重要性を痛感し、多検体を同時にアッセイするシステムの研究開発を重ねた。
その結果、本発明者らは、水との親和性が異なる材料を用いて、１ｃｍ2に細胞５００〜１００，０００個という高密度で、またそれぞれの細胞の培地を完全に分離して培養できる高密度細胞アレイ用培養基板を作製することに成功した。また、本発明者らは、様々な化学物質を種々の濃度で自動注入するインクジェットプリンタヘッドを改造した化学物質自動注入装置（ナノディスペンサ）を製造し、1枚の高密度細胞アレイ用培養基板を使うだけで、一度に多検体のアッセイを行うことのできるシステムを完成させた。さらに、アッセイ後、基板上の特定の細胞のみを剥離、回収させることもできるようになり、その細胞をさらに別の用途へ利用することもできる技術を完成させた。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞付着性高分子に被覆された領域が高密度に並べられ、そのまわりを細胞非付着性の親水性高分子に被覆された領域、さらにそのまわりを細胞非付着性の強疎水性材料に被覆された領域が囲んだ新規な表面を有する高密度細胞アレイ用基板を提供する。
また、本発明は、少なくとも３種類の材料が積層化された支持体に対し、それぞれの層の一部が基板表面の一部として現れるようにレーザーアブレーションするという高密度細胞アレイ用基板の製造方法を提供する。
加えて、本発明は、高密度細胞アレイ用基板上で培地が分離された各細胞を化学物質等に対する評価、及び遺伝子導入操作等に利用する方法を提供する。
さらに、本発明は、その細胞評価、或いは遺伝子操作後、特定の活性を持つ細胞のみを剥離、回収する方法を提供する。
さらに、加えて、本発明は上記高密度細胞アレイを用いることを特徴とする医薬、毒物等の化学物質のスクリーニング方法、遺伝子導入方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本願明細書において用いられている、本発明に係る用語について以下に説明する。
細胞アレイ：
大規模並列アッセイを目的として、多数のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）を固定化したＤＮＡアレイが注目を集めている。アレイは元来「整列している」という程度の意味であるが、一部のＤＮＡアレイが半導体作製に用いる光リソグラフィを用いて作製されるためＤＮＡチップなどとも呼ばれる。ＤＮＡアレイ技術の延長として多数の抗体を配列させたプロテインアレイが開発されている。細胞アレイでは、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイに続く次世代技術として細胞を高密度に細胞を配列させる。本発明においては、並列多検体アッセイを目的として細胞付着性高分子に被覆された領域に１細胞ずつ付着させ、一枚の高密度細胞アレイ用基板上に細胞５００個〜１００，０００個を配列させる。
ナノディスペンサ：
本発明の細胞アレイ上では、各細胞毎に完全に分離した培地中で細胞培養をおこなうため、同時に５００種類〜１００，０００種類の培養条件を検討できる。化学物質を指定された量だけ注入する装置をディスペンサと呼び、ここでは各々のドメイン内の培地中にナノ〜マイクロリットルの薬物溶液を注入するためナノディスペンサと呼ぶ。
ハイスループットスクリーニング：
これまで新薬の開発や毒性評価において大量の培養皿や実験動物を用いざるをえず、活性のある薬物の探索に要するスクリーニングのコストは莫大なものであった。近年のコンビナトリアルケミストリ技術の発展にともない評価すべき物質の数は飛躍的に増加しており、低コストで高速な評価・探索の重要性がますます高まり、超並列化可能な新技術「ハイスループットスクリーニング」が強く求められている。
インクジェットプリンタヘッド：
市販のカラーインクジェットプリンタの多くのヘッドは使い捨てであり、ヘッド単体の価格は１，０００円程度である。この安価な，ヘッドで数ピコリットルの液滴が十分な精度で噴射できる。本システムでも薬剤毎にヘッドを使い捨てにすることにより、汚染の可能性やメンテナンスを最小限にすることができる。
共焦点レーザー走査顕微鏡：
光源にレーザーを用い、検出器に光電子倍増管を用いることで、高精度に再現性良い蛍光の検出が可能である。レーザー光はガルバノミラーを用いて焦点面上の必要な範囲のみを走査するので、大面積の観察でも退色がないため、本発明のシステムには最適である。
ラボオンチップ：
マイクロファブリケーション技術を用いて、反応層や流路などを一枚のチップ上にマイクロメートルサイズで作製し、一枚のチップで電気泳動やＰＣＲをおこなう新技術。必要な薬剤の微量化、高速化などが可能となる。
電子線重合：
電子線照射により発生させたラジカルを利用してラジカル重合をおこなう。大面積への共有結合的固定化が可能。すでに広く産業応用されており、低コストで運転できる。
レーザーアブレーション：
照射したレーザーのエネルギーにより表面を構成する分子間の結合を切ることで、照射表面を微細加工する技術。
【０００７】
決められたサイズの細胞付着性領域を作製して１細胞を基板上に多数配列させる技術は、これまでに少数、萌芽的な研究が報告されている。基本的に光リソグラフィ技術を用い、基材としてはシリコンまたはガラスを用いている。しかし、これらの方法は大量生産には向いておらず、またいずれの報告もミリメートル程度の大きさに数十から百個程度の細胞が配列しているだけである。これに対し本発明では、シリコンやガラスではなく安価なプラスチック材料を用いて基板を作製し、大量生産に適した加工法を選択しており、大幅な低コスト化が期待できる。また、本発明で利用する電子線重合およびレーザーアブレーションは大面積化が容易であり、高密度でセンチメートルの大きさをもつ基板を容易に作製できる。
なお、Ｙａｍａｔｏ Ｍ．， Ｋｗｏｎ Ｏ．Ｈ．， Ｈｉｒｏｓｅ Ｍ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ．， Ｏｋａｎｏ Ｔ．， ”Ｎｏｖｅｌ ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ”， Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｅｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５５， １３７（２００１）には、本発明でも用いる電子線照射法によりパターン伏に高分子を培養皿表面に固定化して、従来にない安価かつ簡便に複数種の細胞のパターン化共培養を達成したことが記載されている。また、Ｈｉｒｏｓｅ Ｈ．， Ｋｗｏｎ Ｏ．Ｈ．， Ｙａｍａｔｏ Ｍ．， Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ．， Ｏｋａｎｏ Ｔ．， ”Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｎｉｎｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｍｏｖｅｄ ｔｏ ａｎｏｔｈｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ”， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， １， ３７７−３８１（２０００）には、同一表面に二種類の高分子を固定化して細胞接着性弱疎水性ドメインと細胞非接着性高親水性ドメインを作製することが記載されている。いずれも本願発明の要素技術を示すものである。
【０００８】
本発明において、「高密度」とは、培養基板１ｃｍ2あたり５００〜１００，０００ヶ所の細胞付着性高分子が被覆された領域が各々分離した状態で配列することができる表面であることを意味する。好ましくは、培養基板が１ｃｍ2あたり１，０００〜５０，０００ヶ所、特に好ましくは、１０，０００〜３０，０００ヶ所を各々分離した状態で配列することできる表面を有することが特に好ましい。
本発明では、その細胞付着性領域それぞれに細胞を付着させるが、その付着させる細胞数には何ら制約はないが、細胞付着性領域の広さと細胞の大きさを考え、1ヶ所の細胞付着性領域に１〜２０個の細胞を付着させるのが良く、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個の細胞を付着させるのが良い。
本発明の細胞付着性高分子とは、例えば、イオン性基、親／疎水性基等を有するもの、また、それらを支持体表面に被覆後、グロー放電、コロナ放電などで表面処理を施したもの、さらには、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白質のいずれかもしくは組み合わせた高分子或いはそれらの処理物で良く、特に限定されるものではない。
【０００９】
本発明では、細胞付着性高分子として、刺激応答性高分子を用いることで、化学物質による検定、或いは遺伝子導入後等に、特定の活性を有する細胞のみを選択的に剥離させられる。
その刺激応答性高分子の一例である温度応答性高分子は、ホモポリマーであっても共重合体であってもよい。使用し得る温度応答性高分子の基本構成単位としては、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度７２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度５６℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、さらに１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン（同５６℃）、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン（同約６℃）、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下限臨界溶解温度３５℃）等のビニルエーテル誘導体、また細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、被覆物質と支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞付着性表面の親水、疎水性のバランスを調整する等の目的で、上記以外のモノマー類との共重合、重合体同士のグラフト重合または共重合、あるいは重合体、共重合体の混合物を用いてもよい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
また、刺激応答性高分子の一例である光応答性高分子としては、アゾベンゼン基を有する吸収性高分子のように光異性化反応を起こす高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体のように光イオン解離する感応基を有する温度応答性高分子、或いはスピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲルのように疎水性相互作用が光変化する温度応答性高分子を用いることができる。
被覆を施される支持体の材質は、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用いることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレートであってもよい。
【００１０】
支持体への細胞付着性高分子の被覆方法は、支持体と被覆物質を、（１）化学的な反応によって結合させる方法、（２）物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な反応によって結合させる場合は、電子線照射（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ；ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、支持体と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。
細胞付着性高分子として刺激応答性高分子を選択しない場合、その被覆量に制約はないが、細胞付着性高分子として刺激応答性高分子を選択した場合、その被覆量は、０．１〜５．０μｇ／ｃｍ2の範囲が良く、好ましくは０．３〜３．０μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは０．５〜２．５μｇ／ｃｍ2である。０．１μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該高分子上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に５．０μｇ／ｃｍ2以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。
高分子の被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆領域の染色や蛍光物質の染色による分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独或いは併用して求めることができる。本発明の細胞付着領域の広さが分析可能な範囲より狭い場合は、あらかじめ分析可能な広さで被覆量を求めておく必要があり、その条件と同条件で被覆すれば良い。
【００１１】
本発明の高密度細胞アレイ基板は、上記細胞付着性高分子が被覆された領域の周りを細胞非付着性の親水性高分子が被覆された領域で囲んだものである。
その細胞非付着性の親水性高分子が被覆された領域内にある細胞付着性高分子が被覆された領域の数は何ら制約されるものではないが、好ましくは1〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜５個である。本発明の高密度細胞アレイ基板はこの細胞非付着性の親水性高分子毎に培地が分割されるので、細胞非付着性の親水性高分子が被覆された領域内にある細胞付着性高分子が被覆された領域の数が少ないほど、多くの細胞を異なる条件下で培養できるようになり、したがって検体数も多くなり好ましい。
細胞非付着性の親水性高分子として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロースなどが挙げられるが、細胞を付着させず、水と親和性の高いものならばいずれのものでも良い。
細胞非付着性の親水性高分子の被覆量は、微量の培地の保持ができれば何ら制約されないが、その被覆量は、０．１〜２０．０μｇ／ｃｍ2の範囲が良く、好ましくは０．３〜１０．０μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは０．５〜５．０μｇ／ｃｍ2である。０．１μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、微量の培地のを保持し難く、逆に２０．０μｇ／ｃｍ2以上であると顕微鏡下で観察する際、この領域の凹凸の像が顕著となり好ましくない。ここに示す各分析値は、上記の方法に従えば求めることができる。
また、支持体への細胞非付着性の親水性高分子の固定は、細胞付着性高分子を被覆したときの方法に従えば良い。
【００１２】
本発明では、この細胞非付着性の親水性高分子が被覆された領域の周りをさらに細胞非付着性の強疎水性材料に被覆された領域が連続的に囲んだものである。
その材料は、細胞を付着させず、また水をもはじくものであれば何ら制約させないが、例えば、シリコーン高分子やその誘導体、フッ素含有高分子やその誘導体等が挙げられる。なお、本願明細書および図面において、「高分子」と「ポリマー」は同じ意味を有し、それぞれ置き換え可能である。
細胞非付着性の親水性高分子の被覆量は、微量の培地の保持ができれば何ら制約されないが、その被覆量は、０．１〜２０．０μｇ／ｃｍ2の範囲が良く、好ましくは０．３〜１０．０μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは０．５〜５．０μｇ／ｃｍ2である。０．１μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、微量の培地をはじき難く、逆に２０．０μｇ／ｃｍ2以上であると顕微鏡下で観察する際、この領域の凹凸の像が顕著となり好ましくない。ここに示す各分析値は、上記の方法に従えば求めることができる。
また、支持体への細胞非付着性の強疎水性高分子の固定は、細胞付着性高分子を被覆したときの方法に従えば良い。
【００１３】
本発明の高密度細胞アレイ基板の製造は、得られた高密度細胞アレイ基板表面に、少なくとも細胞を付着させられる領域、その外側に微量の培地を保持させられる領域、さらにその外側に微量の培地をはじける領域が形成されていれば何ら制約されるものではないが、例えば支持体側から細胞付着性高分子層、親水性高分子層、強疎水性材料層の順に積層されたものを用い、レーザーアブレーションにより各層の一部が基板の表面に現れるように削っていく方法が挙げられる。得られる構造体を図１に示す。その製造法は、図２に示す通りである。すなわち、ポリスチレンを基板として用い、プラズマ照射することにより細胞が接着できる細胞付着性領域となる。このポリスチレンの基板上に、親水性、強疎水性の２つの高分子を電子線照射法により順次、積層させた後、ＵＶエキシマレーザーの強度を変えながら、一層および二層の厚さだけ削って、親水性領域、細胞付着性領域を露出させる。この方法により、１細胞の大きさ（約５〜４０マイクロメートル四方）に十分な広さの細胞付着性領域を露出させることができる。この作業を繰り返して、５００個〜１００，０００個／ｃｍ2の密度で細胞アレイを作製することができる(図３)。
【００１４】
こうして得られた高密度細胞アレイ基板に対し、以下に示す方法で、細胞を付着させ、さらに親水性高分子の被覆領域ごとに独立して培地を付着させる。まず、高密度細胞アレイ基板への細胞付着は、常法通り、基板全体を覆うに十分な量の培地中に所定の細胞を分散させ、静置させるだけで良い。分散された細胞は沈降し、細胞付着性領域にのみ付着する。次に、過剰な培地を静かに吸引し続ければ、培地を親水性高分子の被覆領域ごとに独立して残すことができる。その際、さらに吸引して、インクジェットプリンタヘッドを用いてあらためて個々の細胞に対し培地の微量液滴を付着させる方法でも良い。
上記高密度細胞アレイの各々の細胞を含む培地に任意の濃度で化学物質（例えば、薬物、毒物等）を自動注入は、例えば、図４に示すようなインクジェットプリンタヘッドを改造した化学物質の自動希釈機能付き自動注入装置（ナノディスペンサー）を用いることでできる。本装置によれば、化学物質貯蔵タンク、希釈用培地貯蔵タンク、マイクロポンプ、マイクロバルブからなる自動希釈回路をプリンタヘッド流路に接続し、ポンプ、バルブおよびヘッドをコンピュータで制御し、薬物を任意の濃度で出力できる。出力する液量はすでに２〜数十ピコリットルオーダーの液滴の出力が実現しており問題ない。これをコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに設置した細胞アレイの真上に設置し、細胞アレイの位置を移動させながら注入する。
【００１５】
上記高密度細胞アレイ基板および上記自動注入装置に既存の共焦点レーザー走査顕微鏡，コンピュータ制御Ｘ−Ｙステージ、および細胞の生死、細胞活性を検出するための蛍光分析装置を組み合わせることにより、アッセイ系を確立することができる。
【００１６】
以下に本発明の技術の具体的に述べる。細胞アレイ用支持体としては、安価でありまた透明であるため光学顕微鏡観察に適したプラズマ処理ポリスチレン利用することができる。この上に刺激応答性高分子、さらにその上に、１細胞毎の培地の保持するために必要な親水性領域を形成する親水性高分子、そして、１細胞毎に培地を隔離させるために必要な疎水性領域を形成する疎水性高分子を積層して共有結合的に固定化する。各層の固定は、まず、最下層のモノマーを展開した後に電子線照射することで行い、これをくり返すことで完了する。これをＵＶレーザーを用いて任意サイズ、形にアブレーションすることにより、細胞付着性高分子に被覆された領域が高密度（１ｃｍ2に細胞５００個〜１００，０００個）で配列した基板を作製する。
また、インクジェットプリンタヘッドを改造した自動希釈機能付きナノディスペンサーを用いることにより、各々の細胞を含む培地に任意の濃度で薬物の自動注入が可能となる。スループットは細胞５００個〜１００，０００個あたり流路の洗浄なしで１分以内を実現する。洗浄は希釈系列の変更すなわち薬物の変更毎におこなうが、一洗浄あたり１０秒〜６０秒で行なうことが可能である。
細胞反応の検出については、既存の共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、Ｘ−Ｙステージをコンピュータ制御のものに交換して用いる。なお、ＴＯＦ−ＳＩＭＳと接続することにより１細胞中に発現する全タンパク質を定量的に検出することも可能である。例えば、１枚の細胞アレイにガン細胞と正常細胞をそれぞれ１万個ずつ播種し、薬物を作用させた後、細胞の生死、細胞活性を検出する蛍光性物質を用いて、多種類の薬物の濃度依存的なガン細胞殺傷能、細胞毒性を１枚の細胞アレイで同時にアッセイできる。これによって、超多検体細胞アッセイ自動化システムが安価で構築できる。
また、本システムは、臨床現場における抗ガン剤のスクリーニングのみならず、新薬開発や環境アセスメントなどにも用いることができる。
さらに、本発明の技術によれば、アレイ状に高密度に配置した細胞に遺伝子導入を行い、遺伝子発現した細胞のみ選択的にアレイ基板上から回収したり、あるいは化学物質に対する細胞活性を測定し、特定の反応性を示す細胞のみを選択的にアレイ基板上から回収することができる。回収した細胞を増殖させ組織として利用したり、細胞医薬や医療用具として利用可能である。
【００１７】
本発明ではヒトに作用する薬物・毒物を対象としてヒトおよび動物細胞を培養するが、これらの細胞を用いて１細胞〜少数の細胞づつ培地を分離して培養できる培養系に関する報告は存在しない。
また、本発明においては超多検体アッセイの全自動化を目的として、自動希釈機能付きナノディスペンサーを提供するが、マイクロメートルの空間制御とナノリットルの液滴量を実現する、このような精度のナノディスペンサーについても報告はない。インクジェットプリンタヘッドを改造したマイクロディスペンサーに関する報告はいずれも数桁大きなサイズである。最新のヘッドとＸ−Ｙステージを組み合わせることにより本発明のナノディぺンサーを作製することが可能となった。
本発明では、培地が完全に分離された１細胞１培養環境が５００〜１００，０００個配列した高密度細胞アレイ基板と自動希釈機能付ナノディスペンサを組み合わせることで、一枚のプレパラート上で５００〜１００，０００種類の異なる培養条件を達成し、薬物・毒物の迅速な超多検体評価を行なうことが可能であり、これらの点は従来技術には全く見られない。また、本発明は、特に莫大な情報量の高速処理が求められる新薬開発や環境アセスメントにも対応できる超多検体同時計測を可能にする点でも世界に類を見ない独創的な技術である。
本発明においては、臨床の現場で実際に医師が用いることを目的として、簡便でランニングコストが安価であることを１つの目的として最大眼重視している。
以上のように、本発明はきわめて独創的で、また従来の基礎研究的なレベルを大きく超えて産業応用可能性を大きくもつものである。
【００１８】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１〜５】
細胞付着性高分子としてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、親水性高分子としてポリアクリルアミド、さらに強疎水性高分子としてポリジメチルシロキサンを使用した。それぞれの層を作成するための使用したモノマー、及びポリマー溶液濃度を表１に示す。これらの溶液を用い、以下の方法で各層を作成した。まず、細胞付着性高分子被覆領域を作成するため、表1に示す濃度のＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーのイソプロピルアルコール溶液を０．０１ｍｌ／ｃｍ2の割合でポリスチレン製支持体上に塗布をした。このものへ０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、支持体表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを被覆させた。照射後、基板を水で十分に洗浄し、乾燥させることでポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を有する基板を得た。基板上のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド被覆量を表２に示す。次に、この上へ細胞非付着性の親水性高分子被覆領域を作成するため、表1に示す濃度のアクリルアミドモノマーのイソプロピルアルコール溶液を０．０１ｍｌ／ｃｍ2の割合で基板上に塗布をした。このものへ上記方法と同様な強度の電子線を照射させ、その後、洗浄、乾燥を行うことでポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層の上にポリアクリルアミド層を有する基板を得た。基板上のポリアクリルアミド被覆量を表２に示す。さらに、この上へ細胞非付着性の強疎水性高分子被覆領域を作成するため、表1に示す濃度のポリジメチルシロキサンのエタノール溶液を０．０１ｍｌ／ｃｍ2の割合で基板上に塗布をした。このものへ上記方法と同様な強度の電子線を照射させ、その後、洗浄、乾燥を行うことで上記基板上にポリジメチルシロキサン層を有する基板を得た。基板上のポリジメチルシロキサン被覆量を表２に示す。
得られた基板をコンピュータ制御のＸ−Ｙステージ上に置き、ＡｒＦエキシマレーザー（波長１９３ｎｍのパルスレーザー、浜松ホトニクス製Ｌ５９１０）を用いて、各層が基材表面に現れるように削っていった。その際、ポリアクリルアミド層を露出させるために０．１Ｊ／ｃｍ2の強度のレーザーを用いた。さらにその中心部に約３０μｍの正方形のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を露出させるために、さらに０．１Ｊ／ｃｍ2の強度のレーザーで表面を削った。これらの操作を繰り返し、１０，０００ヶ所／ｃｍ2のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を露出させた。反射型レーザー共焦点顕微鏡により、削られた表面がきわめて平坦であり、エッジもシャープであること、アブレートした結果、各層の厚さは約３０ｎｍであることが明らかになった。また、基材表面の元素分析をＥＳＣＡによって行ったところ、ポリアクリルアミド層としたところにＳｉ元素の存在は認められず、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層としている領域のＮ元素濃度はポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとそれと一致していることから、本実施例の操作により各層が基材の表面として露出できていることを確認することができた。
次に、得られた基板上にシリコーンゴムを介して壁を設け、その中へ５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０-8Ｍデキサメサゾン、１０-7Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞成長因子（ＦＧＦ）を含むウィリアムズＥ培地を培地として１０5個／ｍｌ濃度で分散されたラット初代肝実質細胞を播種した。５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で３時間静置させることで各ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層に１個のラット初代肝実質細胞が付着した。その一例として、実施例１の高密度細胞アレイ基板上の肝実質細胞のようすを図５に示す。細胞は細胞付着性高分子領域を認識し、選択的に接着していた。
次に、基板上の培地を静かに吸引し、インクジェットプリンタヘッドを改造したマイクロディスペンサーにより各親水性高分子被覆領域に１０ピコリットル上記培地中にの０〜４．５ｍＭのジクロルベンゼンを分散させたもの（０．５ｍＭ毎に１０種類。１０００個の各親水性高分子被覆領域毎に濃度を変えた。）を３７℃下で付着させた。１０分後、２．５ｍＭ以上のジクロルベンゼンが分散された培地中の細胞が形態的に異なっていた。
その後、本基板全体を上記培地で十分洗浄し、最終的に再び静かに培地を吸引し、各親水性高分子被覆領域のみに培地が残るようにした。そのまま２０℃で１５分間冷却し、基材表面から剥離しかけている細胞を、ジクロルベンゼン分散濃度別にシリンジを用いて剥離、回収することができた。
【００１９】
【比較例１〜４】
表１に示す溶液濃度のものを使う以外は、実施例１〜５と同様な製造法によって高密度細胞アレイ基板を得た。その後、同様な操作で細胞を播種し、親水性高分子被覆領域のみに培地を残すことを試みた。得られた基板の被覆量を表２に示す。親水性高分子の被覆量が少ないと培地を保持させることは困難であった。また、多すぎると含水した高分子層の凹凸が顕著になり、顕微鏡下での観察の際、視野が悪くなり、基材として適当なものではなかった。強疎水性高分子の被覆量が少ないと培地をはじかせることは困難であった。また、多すぎると高分子層の凹凸が顕著になり、顕微鏡下での観察の際、視野が悪くなり、基材として適当なものではなかった。
【００２０】
【表１】
【表２】
【実施例６】
細胞付着性高分子被覆領域を作成するため、２０ｗｔ％１，２−ナフトキノンジアジド−４−スルホン酸を側鎖に有するフェノール樹脂のジオキサン溶液を用いる以外、実施例１と同様な製造法によって高密度細胞アレイ基板を得た。得られた基板上の上記ポリマーの被覆量は１．１μｇ／ｃｍ2であった。その後、同様な操作で細胞を播種し、ジクロルベンゼンによるアッセイを行った。細胞の剥離、回収は各親水性高分子被覆領域毎に５分間、ＵＶ光を照射することで行えた。この方法によれば、光を各親水性高分子被覆領域毎に集められ、１ヶ所の親水性高分子被覆領域内にある細胞を選択的に剥離、回収できることを確認することができた。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の高密度細胞アレイ基板、及びそれを利用したアッセイ系により、使用する薬剤（例えば、抗ガン剤）の種類、使用濃度の最適化をおこなうことで、薬剤の副作用を大きく減少させると共に、疾患の薬物治療成績を大きく向上させることが可能である。このことは、患者の予後を向上させ、また再発率を下げることで、医療経済にも大きく貢献すること期待される。
また、本技術は、医薬品開発や環境アセスメント、基礎生命科学的研究にも利用でき、極めて有効な技術である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の高密度細胞アレイ基板の一例を示す図である。
【図２】本発明の高密度細胞アレイ基板を製造する一方法を示す工程図である。
【図３】（ａ）は高密度細胞アレイ基板に細胞と培地を配置した一部を示す図である。
（ｂ）は本発明の高密度細胞アレイ基板の一例を示す図である。
【図４】本発明のインクジェットプリンターを用いた多検体細胞のアッセイ方法を説明する図である。
【図５】本発明の高密度細胞アレイ基板表面上に配列した肝細胞の図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel culture substrate, a high-density cell array substrate using the culture substrate, and a method for producing them. The present invention also relates to a method of using each cell from which a medium has been separated on a substrate for a high-density cell array for evaluation of chemical substances and the like, gene transfer operation, and the like. Furthermore, the present invention relates to a method for exfoliating and collecting only cells having a specific activity after cell evaluation or genetic manipulation. Furthermore, the present invention relates to a screening method and a gene transfer method for chemical substances such as pharmaceuticals and toxicants by the above operation.
[0002]
[Prior art]
Cancer drug therapy has been very successful in cases such as blood cell cancer, but has not yet been fully successful in certain solid cancers. One of the reasons is that there is no effective means for examining the effectiveness and necessary amount before administration even though the effect of the anticancer agent is not uniform among cancer cells. Since there are many types of anti-cancer drugs and their prescriptions are not uniform, if a system that uses cultured cells that can easily assay multiple anti-cancer drugs can be developed, it was collected from the tumor before it was actually prescribed to the patient. By culturing cancer cells, it is possible to determine the effectiveness of various anti-cancer drugs and the required prescription amount, and it can be expected that the drug treatment for cancer that has not sufficiently avoided the problem of side effects can be greatly advanced. However, the amount of cells that can be collected by biopsy is very small, and conventional culture methods cannot test many types of prescriptions. Also, conventional culture methods require many culture vessels, and clinical trials are necessary. What is done in the field is not realistic either in terms of scale or required labor.
In recent years, problems such as low reproducibility due to the rarity and individual differences of laboratory animals and species differences with humans have been pointed out, and development of drug and toxicological evaluation techniques using cultured cells such as humans has attracted much attention. . In addition, the need to develop technology for simultaneously assaying various drugs and toxicants in a short time has been strongly pointed out from the viewpoints of cost reduction of new drug development, confirmation of drug safety, environmental assessment and the like. In response to these requirements, a device that performs electrophoresis and chromatography on a basic hill with a size of several centimeters to 10 centimeters by applying microfabrication technology known as semiconductor processing technology (“ The development of “lab on chip”) is attracting attention. For example, in the electrophoresis of nucleic acids, a system that fully automates all of gel preparation, electrophoresis, band detection, and data analysis that have been conventionally performed in separate apparatuses is already on the market. By using “lab-on-chip” technology, (1) only a small amount of sample is required, (2) multiple samples can be assayed in parallel on a large scale, and (3) manual operation can be automated by systematization. High reproducibility is obtained, (4) The amount of waste liquid is drastically reduced and the impact on the environment can be minimized, (5) The amount of toxic reagent used is drastically reduced, and safety is high, (6) Analysis cost Benefits such as mitigation can be achieved.
[0003]
While antibodies and enzymes are aimed at micro-measurement and quantification due to their high specificity, in order to understand the reactions exhibited by living organisms, it has been necessary to rely on experimental animals. Even if there is only one cell, it shows complicated information processing ability and chemical reaction comparable to those of computers and chemical complexes, so it is not just measuring the amount, but to say, the effect of the target drug / toxin on the living body There is great expectation from the point of view that it can be used to measure the quality of food.
As a system that performs cell-by-cell measurement, there is a flow cytometer, which has greatly contributed to the advancement of immunology, such as the ability to quantitatively measure membrane surface antigens. There will be no significant progress in the future. The flow cytometer is intended for floating cells such as blood cells, and in the case of adherent cells cultured on a culture dish, it must be recovered from the culture dish and suspended, for example, for adherent cancer cells. It cannot be used for ultra-multi-sample simultaneous evaluation.
In recent years, a machine called a laser scan cytometry that combines a computer-controlled XY stage and a fluorescence microscope is commercially available. This is intended to measure the cells in the tissue specimen on the slide glass one by one. In other words, all the cells on a single preparation are cells under the same conditions, and when using them for drug evaluation, preparations are required for the number of types of drugs and the number of conditions. It was difficult to use for evaluation at the same time.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have realized the importance of the above-mentioned problems and have repeatedly researched and developed a system for simultaneously assaying multiple specimens.
As a result, the inventors used materials with different affinity for water, 2 In addition, the present inventors have succeeded in producing a high-density cell array culture substrate that can be cultured at a high density of 500 to 100,000 cells and the culture medium of each cell can be completely separated. In addition, the inventors manufactured an automatic chemical substance injection device (nanodispenser) in which an ink jet printer head that automatically injects various chemical substances at various concentrations is modified, and a single culture substrate for a high-density cell array is prepared. We have completed a system that can be used to assay multiple samples at one time just by using it. Furthermore, after the assay, only specific cells on the substrate can be detached and recovered, and a technology has been completed that allows the cells to be used for further applications. The present invention has been completed based on such findings.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In the present invention, regions coated with cell-adhesive polymers are arranged at high density, and regions around them are coated with non-cell-adherent hydrophilic polymers, and around them are non-cell-adherent and strongly hydrophobic Provided is a high-density cell array substrate having a novel surface surrounded by a region covered with a conductive material.
The present invention also provides a method for producing a substrate for a high-density cell array, in which laser ablation is performed on a support in which at least three kinds of materials are laminated so that a part of each layer appears as a part of the substrate surface. I will provide a.
In addition, the present invention provides a method of using each cell from which a medium has been separated on a substrate for a high-density cell array for evaluation of chemical substances and the like, gene transfer operation, and the like.
Furthermore, the present invention provides a method for exfoliating and collecting only cells having a specific activity after cell evaluation or genetic manipulation.
In addition, the present invention provides a screening method for a chemical substance such as a medicine or a toxic agent, and a gene introduction method, characterized by using the above-described high-density cell array.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Terms used in the present specification will be described below.
Cell array :
For the purpose of large-scale parallel assay, DNA arrays on which a large number of DNA fragments (oligonucleotides) are immobilized have attracted attention. The array originally means “aligned”, but it is also called a DNA chip or the like because a part of the DNA array is produced using optical lithography used for semiconductor production. As an extension of the DNA array technology, a protein array in which a large number of antibodies are arranged has been developed. In the cell array, cells are arranged at high density as a next-generation technology following the DNA array and protein array. In the present invention, for the purpose of parallel multi-analyte assay, cells are attached one by one to a region coated with a cell-adhesive polymer, and 500 to 100,000 cells are arrayed on a single high-density cell array substrate. Let
Nano dispenser :
On the cell array of the present invention, cell culture is performed in a completely separated medium for each cell, so that 500 to 100,000 types of culture conditions can be examined simultaneously. A device that injects a specified amount of a chemical substance is called a dispenser, and here it is called a nanodispenser in order to inject a nano-microliter drug solution into the medium in each domain.
High throughput screening :
In the past, a large amount of culture dishes and experimental animals had to be used in the development of new drugs and toxicity evaluation, and the cost of screening required to search for active drugs has been enormous. With the development of combinatorial chemistry technology in recent years, the number of substances to be evaluated has increased dramatically, and the importance of low-cost, high-speed evaluation and search has become increasingly important. There is a strong demand for “screening”.
Inkjet printer head :
Many heads of commercially available color ink jet printers are disposable, and the price of a single head is about 1,000 yen. This inexpensive head can eject droplets of several picoliters with sufficient accuracy. In this system, the possibility of contamination and maintenance can be minimized by disposing the head for each medicine.
Confocal laser scanning microscope :
By using a laser as the light source and a photomultiplier tube as the detector, it is possible to detect fluorescence with high accuracy and good reproducibility. Since the laser beam scans only a necessary range on the focal plane using a galvanometer mirror, it is optimal for the system of the present invention because it does not fade even when observing a large area.
Lab on chip :
A new technology in which microfabrication technology is used to produce reaction layers and channels on a single chip in micrometer size, and electrophoresis and PCR are performed on a single chip. It is possible to reduce the amount of necessary drugs and increase the speed.
Electron beam polymerization :
Radical polymerization is performed using radicals generated by electron beam irradiation. Covalent immobilization on a large area is possible. Already widely used in industry, it can be operated at low cost.
Laser ablation :
Technology that finely processes the irradiated surface by cutting the bonds between the molecules that make up the surface by the energy of the irradiated laser.
[0007]
There have been few researches on the technology for creating a cell attachment region of a predetermined size and arranging a large number of cells on a substrate. Basically, a photolithographic technique is used, and silicon or glass is used as a base material. However, these methods are not suitable for mass production, and all reports only have tens to hundreds of cells arranged in a size of millimeter. On the other hand, in the present invention, a substrate is produced using an inexpensive plastic material instead of silicon or glass, and a processing method suitable for mass production is selected, so that significant cost reduction can be expected. Further, the electron beam polymerization and laser ablation utilized in the present invention can easily increase the area, and a substrate having a high density and a size of centimeter can be easily produced.
Yamato M. et al. , Kwon O. H. Hirose M .; , Kikuchi A. , Okano T .; "Novel patterned cell co-culture utility thermally responded polymer surfaces", J. et al. In Biomedical Metal Research, 55, 137 (2001), a polymer is immobilized on the surface of a culture dish by an electron beam irradiation method that is also used in the present invention, so that a plurality of types of cells can be patterned inexpensively and easily. It has been described that co-culture has been achieved. In addition, Hirose H. et al. , Kwon O. H. Yamato M. et al. , Kikuchi A. , Okano T .; , "Creation of designed cell sheets that are nininvasively harvested and moved to another surface", Biomacromolecules, 1, 377-381 (2000) And preparation of non-cell-adhesive highly hydrophilic domains. All show the elemental technology of the present invention.
[0008]
In the present invention, “high density” means a culture substrate of 1 cm. 2 It means that the surface covered with 500 to 100,000 cell-adhesive polymers is a surface that can be arranged in a separated state. Preferably, the culture substrate is 1 cm 2 It is particularly preferable to have a surface that can be arranged in a state where 1,000 to 50,000 locations per unit, particularly 10,000 to 30,000 locations are separated from each other.
In the present invention, cells are attached to each of the cell adhesion regions, but there are no restrictions on the number of cells to be attached, but considering the size of the cell adhesion region and the cell size, the cell adhesion properties at one
Examples of the cell adhesion polymer of the present invention include those having an ionic group, a hydrophilic / hydrophobic group, and the like, and surface treatment by glow discharge, corona discharge or the like after coating the surface of the support. In addition, the polymer may be any one or a combination of cell adhesion proteins such as fibronectin, collagen, laminin, or a combination thereof, and is not particularly limited.
[0009]
In the present invention, by using a stimulus-responsive polymer as the cell adhesion polymer, only cells having a specific activity can be selectively detached after an assay with a chemical substance or after gene introduction.
The temperature-responsive polymer that is an example of the stimulus-responsive polymer may be a homopolymer or a copolymer. Examples of the basic structural unit of the temperature-responsive polymer that can be used include (meth) acrylamide compounds such as acrylamide and methacrylamide, N-ethylacrylamide (lower critical solution temperature of homopolymer 72 ° C.), Nn— Propylacrylamide (21 ° C), Nn-propylmethacrylamide (27 ° C), N-isopropylacrylamide (32 ° C), N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), N-cyclopropylacrylamide (45) ), N-cyclopropylmethacrylamide (at 60 ° C), N-ethoxyethylacrylamide (at about 35 ° C), N-ethoxyethylmethacrylamide (at about 45 ° C), N-tetrahydrofurfurylacrylamide (at about 28 ° C). ° C), N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (about 3 N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives, such as N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethylmethylacrylamide (lower critical solution temperature of homopolymer 56 ° C.), N, N-diethylacrylamide N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives such as (32 ° C.), 1- (1-oxo-2-propenyl) -pyrrolidine (56 ° C.), 1- (1-oxo-2-propenyl) -Piperidine (about 6 ° C), 4- (1-oxo-2-propenyl) -morpholine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2- (Meth) acrylamide derivatives having a cyclic group such as methyl-2-propenyl) -piperidine, 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -morpholine Vinyl ether derivatives such as methyl vinyl ether (lower critical dissolution temperature of homopolymer 35 ° C), etc., and when it is necessary to adjust the critical dissolution temperature depending on the type of cell, it is necessary to increase the interaction between the coating substance and the support For the purpose of adjusting the balance between the hydrophilicity and hydrophobicity of the cell adhesion surface, copolymerization with monomers other than those mentioned above, graft polymerization or copolymerization of polymers, or polymers and copolymers. A mixture of these may also be used. It is also possible to crosslink within a range that does not impair the original properties of the polymer.
In addition, photoresponsive polymers that are examples of stimuli-responsive polymers include polymers that undergo photoisomerization reactions, such as absorbent polymers having an azobenzene group, vinyl derivatives of triphenylmethane leuco hydroxide and acrylamide. Temperature-responsive polymer having a sensitive group capable of photoion dissociation like a copolymer with a monomer, or N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran, a temperature response in which hydrophobic interaction is photo-changed Can be used.
The material of the support to be coated is not only a material such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., which are usually used for cell culture, but also a material that can generally be given a form, for example, Molecular compounds, ceramics, metals, etc. can all be used. The shape is not limited to a cell culture dish such as a Petri dish, and may be a plate.
[0010]
The method for coating the cell adhesion polymer on the support may be carried out by either (1) a method of bonding the support and the coating substance by a chemical reaction, or (2) a method utilizing physical interaction. It can be performed in combination. That is, (1) When bonding is performed by a chemical reaction, electron beam irradiation (EB), γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, or the like can be used. Further, when the support and the coating material have appropriate reactive functional groups, generally used organic reactions such as radical reaction, anion reaction, and cation reaction can be used. (2) As a method based on physical interaction, a coating material alone or a matrix compatible with the support is used as a medium (for example, a monomer forming the support or a monomer compatible with the support and the coating material). And the like using a physical adsorption such as coating and kneading.
When the stimulus-responsive polymer is not selected as the cell adhesion polymer, the coating amount is not limited, but when the stimulus-responsive polymer is selected as the cell adhesion polymer, the coating amount is 0.1 to 5.0 μg / cm 2 The range is preferably 0.3 to 3.0 μg / cm. 2 And more preferably 0.5 to 2.5 μg / cm 2 It is. 0.1 μg / cm 2 When the coating amount is smaller, the cells on the polymer are not easily detached even if a stimulus is given, and the working efficiency is remarkably deteriorated. Conversely, 5.0 μg / cm 2 If it is as described above, it is difficult for the cells to adhere to the region, and it becomes difficult to sufficiently attach the cells.
The amount of coating of the polymer is, for example, a Fourier transform infrared spectrometer total reflection method (FT-IR-ATR method), analysis by coating region staining or fluorescent material staining, and surface analysis by contact angle measurement alone or in combination. Can be obtained. When the area of the cell attachment region of the present invention is narrower than the range that can be analyzed, it is necessary to obtain the amount of coating in advance so that it can be analyzed.
[0011]
In the high-density cell array substrate of the present invention, the region coated with the cell adhesion polymer is surrounded by a region coated with a cell non-adhesive hydrophilic polymer.
The number of areas covered with the cell-adhesive polymer in the area covered with the non-cell-adhesive hydrophilic polymer is not limited at all, but preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 5. In the high-density cell array substrate of the present invention, since the medium is divided for each non-cell-adherent hydrophilic polymer, the cell-adhesive polymer in the region coated with the non-cell-adherent hydrophilic polymer It is preferable that the number of the regions covered with is smaller because more cells can be cultured under different conditions, and thus the number of specimens is increased.
Examples of the non-cell-adhesive hydrophilic polymer include polyacrylamide, polydimethylacrylamide, polyethylene glycol, and cellulose. Any polymer may be used as long as it does not attach cells and has high affinity with water. .
The coating amount of the non-cell-adherent hydrophilic polymer is not limited as long as a small amount of medium can be retained, but the coating amount is 0.1 to 20.0 μg / cm. 2 The range is good, preferably 0.3-10.0 μg / cm 2 More preferably, 0.5 to 5.0 μg / cm 2 It is. 0.1 μg / cm 2 When the coating amount is smaller, it is difficult to hold a small amount of medium, conversely, 20.0 μg / cm 2 When the above is observed, an uneven image in this region becomes remarkable when observed under a microscope, which is not preferable. Each analysis value shown here can be obtained according to the above method.
In addition, immobilization of the non-cell-adhesive hydrophilic polymer to the support may be performed according to the method when the cell-adhesive polymer is coated.
[0012]
In the present invention, the region coated with the non-cell-adherent strong hydrophobic material is continuously surrounded around the region coated with the non-cell-adherent hydrophilic polymer.
The material is not restricted as long as it does not attach cells and repels water, and examples thereof include silicone polymers and derivatives thereof, fluorine-containing polymers and derivatives thereof, and the like. In the present specification and drawings, “polymer” and “polymer” have the same meaning and can be replaced with each other.
The coating amount of the non-cell-adherent hydrophilic polymer is not limited as long as a small amount of medium can be retained, but the coating amount is 0.1 to 20.0 μg / cm. 2 The range is good, preferably 0.3-10.0 μg / cm 2 More preferably, 0.5 to 5.0 μg / cm 2 It is. 0.1 μg / cm 2 When the coating amount is smaller, it is difficult to repel a small amount of medium, conversely, 20.0 μg / cm 2 When the above is observed, an uneven image in this region becomes remarkable when observed under a microscope, which is not preferable. Each analysis value shown here can be obtained according to the above method.
Moreover, what is necessary is just to follow the method when the cell adhesion polymer is coat | covered for fixation of the cell nonadhesion strong hydrophobic polymer to a support body.
[0013]
The production of the high-density cell array substrate of the present invention is carried out by providing at least a region where cells can be attached to the surface of the obtained high-density cell array substrate, a region where a small amount of medium can be held outside, and a small amount of medium outside the region. As long as a region that repels is formed, there is no restriction, but for example, a layer in which a cell adhesion polymer layer, a hydrophilic polymer layer, and a strongly hydrophobic material layer are laminated in this order from the support side is used. There is a method of shaving so that a part of each layer appears on the surface of the substrate by ablation. The resulting structure is shown in FIG. The manufacturing method is as shown in FIG. That is, it becomes a cell-adhesive region to which cells can adhere by irradiating with plasma using polystyrene as a substrate. After laminating two hydrophilic and strong hydrophobic polymers on this polystyrene substrate sequentially by electron beam irradiation, the thickness of one layer and two layers is reduced while changing the intensity of the UV excimer laser. To expose the hydrophilic region and the cell adhesion region. By this method, it is possible to expose a cell-adhesive region that is sufficiently wide for one cell size (about 5 to 40 micrometers square). Repeating this operation, 500 to 100,000 / cm 2 A cell array can be prepared at a density of (Fig. 3).
[0014]
Cells are attached to the high-density cell array substrate thus obtained by the following method, and a medium is attached independently for each hydrophilic polymer coating region. First, cell attachment to the high-density cell array substrate may be performed by dispersing predetermined cells in a sufficient amount of medium to cover the entire substrate and allowing to stand as usual. The dispersed cells settle and adhere only to the cell-adherent areas. Next, if the excessive medium is gently sucked, the medium can be left independently for each hydrophilic polymer coating region. At that time, a method of further sucking and reattaching a minute droplet of the medium to each cell using an ink jet printer head may be used.
The chemical substance (for example, drug, poison, etc.) is automatically injected into the medium containing each cell of the high-density cell array at an arbitrary concentration. For example, an automatic chemical substance obtained by remodeling an ink jet printer head as shown in FIG. This can be done by using an automatic injection device (nanodispenser) with a dilution function. According to this device, an automatic dilution circuit consisting of a chemical substance storage tank, a dilution medium storage tank, a micropump and a microvalve is connected to the printer head flow path, and the pump, valve and head are controlled by a computer, and the drug can be arbitrarily Can be output at different concentrations. The amount of liquid to be output has already been realized as the output of droplets on the order of 2 to several tens of picoliters. This is placed immediately above the cell array placed on the computer-controlled XY stage, and the cell array is injected while moving the position.
[0015]
By combining the high-density cell array substrate and the automatic injection apparatus with an existing confocal laser scanning microscope, a computer-controlled XY stage, and a fluorescence analyzer for detecting cell viability and cell activity, an assay system is obtained. Can be established.
[0016]
The technique of the present invention will be specifically described below. As the cell array support, it is inexpensive and transparent, and therefore plasma-treated polystyrene suitable for optical microscope observation can be used. On top of this, a stimulus-responsive polymer, a hydrophilic polymer that forms a hydrophilic region necessary for holding a medium per cell, and a medium isolated per cell are necessary. A hydrophobic polymer that forms a hydrophobic region is laminated and immobilized covalently. The fixing of each layer is performed by first irradiating an electron beam after developing the lowermost monomer, and is completed by repeating this. By ablating this to an arbitrary size and shape using a UV laser, the area covered with the cell-adhesive polymer has a high density (1 cm). 2 A substrate arranged with 500 to 100,000 cells) is prepared.
In addition, by using a nanodispenser with an automatic dilution function obtained by remodeling an ink jet printer head, it is possible to automatically inject a drug at an arbitrary concentration into a medium containing each cell. Throughput is achieved within 1 minute without washing the flow path per 500-100,000 cells. The washing is performed every time the dilution series is changed, that is, every change of the drug, but can be performed at 10 to 60 seconds per washing.
For detection of the cell reaction, an existing confocal laser scanning microscope is used, and the XY stage is replaced with a computer-controlled one. It is also possible to quantitatively detect all proteins expressed in one cell by connecting with TOF-SIMS. For example, 10,000 cells each of cancer cells and normal cells are seeded on a single cell array, and after a drug is allowed to act, a fluorescent substance that detects cell viability and cell activity is used to detect various types of drugs. Concentration-dependent cancer cell killing ability and cytotoxicity can be assayed simultaneously on a single cell array. As a result, an ultra-multi-sample cell assay automation system can be constructed at low cost.
In addition, this system can be used not only for screening anticancer drugs in clinical settings but also for new drug development and environmental assessment.
Furthermore, according to the technique of the present invention, genes are introduced into cells arranged at high density in an array, and only the cells expressing the genes are selectively recovered from the array substrate, or the cellular activity against chemical substances is measured. Only cells exhibiting a specific reactivity can be selectively recovered from the array substrate. The collected cells can be proliferated and used as a tissue, or used as a cell medicine or a medical device.
[0017]
In the present invention, human and animal cells are cultured for drugs / toxins that act on humans, but there is no report on a culture system that can be used to separate and culture a medium from one cell to a small number of cells using these cells.
In addition, in the present invention, a nanodispenser with an automatic dilution function is provided for the purpose of fully automating an ultra-multiple analyte assay, and nanometers with such accuracy that realize a micrometer spatial control and a nanoliter droplet volume are provided. There are no reports on dispensers. All reports on micro-dispensers with modified inkjet printer heads are several orders of magnitude larger. By combining the latest head and the XY stage, it has become possible to produce the nano-dispenser of the present invention.
In the present invention, a high-density cell array substrate in which 500 to 100,000 cells are cultured in a single cell in which a culture medium is completely separated is combined with a nanodispenser with an automatic dilution function, whereby 500 to 500 on a single preparation. It is possible to achieve 100,000 different culture conditions and perform rapid ultra-multispecimen evaluation of drugs and toxicants, and these points are not found at all in the prior art. In addition, the present invention is a unique technique that is unparalleled in the world in that it enables ultra-multi-sample simultaneous measurement that can cope with new drug development and environmental assessment that require high-speed processing of a huge amount of information.
In the present invention, for the purpose of being actually used by a doctor at a clinical site, the maximum focus is placed on one of the purposes as simple and low running cost.
As described above, the present invention is very original, and has great industrial applicability far beyond the level of conventional basic research.
[0018]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
Examples 1-5
Poly-N-isopropylacrylamide was used as the cell adhesion polymer, polyacrylamide was used as the hydrophilic polymer, and polydimethylsiloxane was used as the strongly hydrophobic polymer. Table 1 shows the monomer and polymer solution concentrations used to make each layer. Using these solutions, each layer was prepared by the following method. First, in order to create a cell-adhesive polymer-coated region, an isopropyl alcohol solution of N-isopropylacrylamide monomer having a concentration shown in Table 1 was added at 0.01 ml / cm. 2 The ratio was applied on a polystyrene support. This was irradiated with an electron beam having an intensity of 0.25 MGy, and the support surface was coated with poly-N-isopropylacrylamide. After the irradiation, the substrate was sufficiently washed with water and dried to obtain a substrate having a poly-N-isopropylacrylamide layer. Table 2 shows the poly-N-isopropylacrylamide coating amount on the substrate. Next, in order to create a non-cell-adherent hydrophilic polymer-coated region on this, an isopropyl alcohol solution of acrylamide monomer having a concentration shown in Table 1 was added at 0.01 ml / cm. 2 The ratio was applied on the substrate. This was irradiated with an electron beam having the same intensity as in the above method, and then washed and dried to obtain a substrate having a polyacrylamide layer on the poly-N-isopropylacrylamide layer. Table 2 shows the polyacrylamide coating amount on the substrate. Further, in order to create a cell-adherent strongly hydrophobic polymer-coated region on this, an ethanol solution of polydimethylsiloxane having a concentration shown in Table 1 was added at 0.01 ml / cm. 2 The ratio was applied on the substrate. This was irradiated with an electron beam having the same intensity as in the above method, and then washed and dried to obtain a substrate having a polydimethylsiloxane layer on the substrate. Table 2 shows the amount of polydimethylsiloxane coating on the substrate.
The obtained substrate was placed on a computer-controlled XY stage, and was cut using an ArF excimer laser (pulse laser with a wavelength of 193 nm, L5910 manufactured by Hamamatsu Photonics) so that each layer appeared on the substrate surface. At that time, in order to expose the polyacrylamide layer, 0.1 J / cm 2 The intensity of laser was used. Furthermore, in order to expose a square poly-N-isopropylacrylamide layer of about 30 μm at the center, an additional 0.1 J / cm 2 The surface was shaved with an intense laser. Repeat these operations at 10,000 locations / cm 2 The poly-N-isopropylacrylamide layer was exposed. A reflection laser confocal microscope revealed that the scraped surface was very flat and the edge was sharp, and as a result of ablation, the thickness of each layer was about 30 nm. Further, when elemental analysis of the substrate surface was performed by ESCA, the presence of Si element was not observed when the polyacrylamide layer was formed, and the concentration of N element in the poly-N-isopropylacrylamide layer was poly-N- Since it was consistent with isopropylacrylamide, it was confirmed that each layer was exposed as the surface of the substrate by the operation of this example.
Next, a wall is provided on the obtained substrate through silicone rubber, and 5% fetal calf serum (FCS), 10% is provided therein. -8 M dexamethasone, 10 -7 10 Williams E medium containing M insulin, 10 mM nicotinamide, and 10 ng / ml epidermal growth factor (FGF) was used as the medium. Five Rat primary liver parenchymal cells dispersed at a concentration of cells / ml were seeded. By allowing to stand at 37 ° C. for 3 hours in a 5% carbon dioxide atmosphere, one rat primary hepatocyte adhered to each poly-N-isopropylacrylamide layer. As an example, the appearance of hepatocytes on the high-density cell array substrate of Example 1 is shown in FIG. The cells recognized the cell adhesion polymer region and adhered selectively.
Next, the medium on the substrate is gently sucked, and 10 picoliters of 0 to 4.5 mM dichlorobenzene in the above medium is dispersed in each hydrophilic polymer coating region by a microdispenser with a modified ink jet printer head. (10 types per 0.5 mM. The concentration was changed for each of the 1000 hydrophilic polymer-coated regions) was attached at 37 ° C. After 10 minutes, the cells in the medium in which 2.5 mM or more of dichlorobenzene was dispersed were morphologically different.
Thereafter, the entire substrate was thoroughly washed with the above medium, and finally the medium was gently sucked again so that the medium remained only in each hydrophilic polymer-coated region. It was cooled at 20 ° C. for 15 minutes as it was, and the cells that were about to be detached from the substrate surface could be detached and collected using a syringe depending on the dichlorobenzene dispersion concentration.
[0019]
[Comparative Examples 1-4]
A high-density cell array substrate was obtained by the same production method as in Examples 1 to 5 except that the solution concentrations shown in Table 1 were used. Thereafter, cells were seeded by the same operation, and an attempt was made to leave the medium only in the hydrophilic polymer-coated region. Table 2 shows the coating amount of the obtained substrate. If the coating amount of the hydrophilic polymer was small, it was difficult to maintain the medium. On the other hand, when the amount is too large, the unevenness of the water-containing polymer layer becomes prominent, and the field of view deteriorates during observation under a microscope, which is not suitable as a substrate. If the coating amount of the strongly hydrophobic polymer was small, it was difficult to repel the medium. On the other hand, if the amount is too large, the unevenness of the polymer layer becomes prominent, and the field of view deteriorates during observation under a microscope, which is not suitable as a substrate.
[0020]
[Table 1]
[Table 2]
[Example 6]
In order to create a cell-adhesive polymer-coated region, a high density was obtained by the same production method as in Example 1, except that a dioxane solution of a phenol resin having 20 wt% 1,2-naphthoquinonediazide-4-sulfonic acid in the side chain was used. A cell array substrate was obtained. The coating amount of the polymer on the obtained substrate was 1.1 μg / cm. 2 Met. Thereafter, cells were seeded in the same manner, and assayed with dichlorobenzene. The cells were detached and collected by irradiating each hydrophilic polymer coated region with UV light for 5 minutes. According to this method, light was collected in each hydrophilic polymer-coated region, and it was confirmed that cells in one hydrophilic polymer-coated region could be selectively detached and collected.
[0023]
【The invention's effect】
By optimizing the type and concentration of the drug used (for example, anticancer drug) by the high-density cell array substrate of the present invention and the assay system using the same, side effects of the drug are greatly reduced, It is possible to greatly improve the drug treatment results of the disease. This is expected to greatly contribute to the medical economy by improving the prognosis of patients and reducing the recurrence rate.
In addition, this technology can be used for drug development, environmental assessment, and basic life science research, and is an extremely effective technology.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a high-density cell array substrate of the present invention.
FIG. 2 is a process diagram showing one method for producing a high-density cell array substrate of the present invention.
FIG. 3A is a diagram showing a part of a cell and a medium placed on a high-density cell array substrate.
(B) is a figure which shows an example of the high-density cell array substrate of this invention.
FIG. 4 is a diagram illustrating an assay method for multi-sample cells using the inkjet printer of the present invention.
FIG. 5 is a view of hepatocytes arranged on the surface of the high-density cell array substrate of the present invention.
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