JP4751984B2 - DNA vaccine - Google Patents
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Description
本発明は、炎症性サイトカインの産生を調整するポリペプチドの一部または全部を発現するベクターからなるＤＮＡワクチン、前記ＤＮＡワクチンを含有する医薬組成物、およびその医薬組成物を用いた炎症性疾患の予防または治療方法に関する。 The present invention relates to a DNA vaccine comprising a vector expressing part or all of a polypeptide that regulates the production of inflammatory cytokines, a pharmaceutical composition containing the DNA vaccine, and an inflammatory disease using the pharmaceutical composition It relates to a prevention or treatment method.
サイトカインは免疫細胞をはじめとする種々の細胞から産生される生理活性物質である。一つのサイトカインは多様な生理活性を示し、リンパ球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好中球など免疫系の細胞の増強により、抗ウイルス作用や抗腫瘍作用など生体防御に関わることも知られている。さらにサイトカインどうしが相互に作用するという特徴をもち、生体防御の恒常性維持に貢献している。しかしながら、サイトカインは炎症惹起作用を有し、関節リウマチ、自己免疫疾患、アレルギー疾患、劇症肝炎、悪性腫瘍、糖尿病、動脈硬化など様々な疾患の病態形成への関与が指摘されている。これらの疾患の進行に伴って、なかでも炎症性サイトカインといわれるインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）などが誘導され、血液や組織中で検出されるようになる（非特許文献１）。 Cytokines are physiologically active substances produced from various cells including immune cells. One cytokine exhibits various physiological activities, and is also known to be involved in biological defense such as antiviral action and antitumor action by enhancing cells of the immune system such as lymphocytes, macrophages, NK cells, and neutrophils. Furthermore, it has the feature that cytokines interact with each other, and contributes to maintaining homeostasis of biological defense. However, cytokines have an inflammation-inducing action and have been pointed out to be involved in the pathogenesis of various diseases such as rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, allergic diseases, fulminant hepatitis, malignant tumors, diabetes, and arteriosclerosis. As these diseases progress, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor, which are said to be inflammatory cytokines, among others, α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) and the like are induced and detected in blood and tissue (Non-patent Document 1).
一方、抗原感作により活性化したモルモットのリンパ球培養上清中でマクロファージの遊走を抑制する因子として１９６６年に発見（非特許文献２）されたマクロファージ遊走阻止因子（以下、ＭＩＦと略記する）は、その後、異性化酵素活性、酸化還元酵素活性など様々な機能が再発見され、また線虫から脊椎動物まで広く分布することから長く研究されてきた。現在では、ＭＩＦは生体防御に関わるサイトカイン産生に、自然免疫と獲得免疫の両方にわたって関与し、複数の酵素活性（非特許文献３、非特許文献４）を同一分子にもつ特殊なペプチド性の生理活性物質であることが知られている。しかし、これらの酵素活性と免疫との関係を示す報告はまだない。 On the other hand, a macrophage migration inhibitory factor (hereinafter abbreviated as MIF) discovered in 1966 as a factor that suppresses macrophage migration in the lymphocyte culture supernatant of guinea pigs activated by antigen sensitization. Since then, various functions such as isomerase activity and oxidoreductase activity have been rediscovered, and since they are widely distributed from nematodes to vertebrates, they have been studied for a long time. At present, MIF is involved in cytokine production related to biological defense in both innate immunity and acquired immunity, and has a special peptidic physiology having multiple enzyme activities (Non-patent Documents 3 and 4) in the same molecule. It is known to be an active substance. However, there are no reports showing the relationship between these enzyme activities and immunity.
通常サイトカインは刺激誘導により核内のゲノムから遺伝子が転写され発現され、免疫細胞がタンパク質として順次産生する。一方ＭＩＦは、ホルモン様に予め細胞内に蓄えられており、エンドトキシンなどの外部刺激により脳下垂体前葉をはじめとする複数の局所組織から分泌されることを特徴としている。またＭＩＦによって刺激されたマクロファージまたはＴ細胞はグルココルチコイドで抑制されないばかりでなく、グルココルチコイドによって抑制される免疫反応に対抗する生理活性物質であることが報告されている（非特許文献５）。 In general, cytokines are transcribed and expressed from the genome in the nucleus by stimulation induction, and immune cells sequentially produce them as proteins. On the other hand, MIF is stored in cells like hormones in advance and is characterized by being secreted from a plurality of local tissues including the anterior pituitary gland by external stimulation such as endotoxin. In addition, it has been reported that macrophages or T cells stimulated by MIF are not only suppressed by glucocorticoids, but are also physiologically active substances that counter immune responses suppressed by glucocorticoids (Non-patent Document 5).
さらに、ＭＩＦの受容体は細胞表面にあるという報告があるが、必ずしも明確ではない。これに関して、例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、細胞質内のタンパク質であるＪａｂ１と結合することが知られている（非特許文献６）。 Furthermore, although there is a report that the receptor for MIF is on the cell surface, it is not always clear. In this regard, it is known that, for example, it is taken into cells by endocytosis and binds to Jab1, which is a protein in the cytoplasm (Non-patent Document 6).
また最近になって、遺伝子工学技術の進歩によりＤＮＡワクチンが開発されている。ＤＮＡワクチンとしては組み換えプラスミドを用いたものが一般的であり、目的の抗原をコードするＤＮＡを含む組み換えプラスミドを生体内に投与することによって、生体内で当該ＤＮＡによってコードされる抗原性を有するアミノ酸配列が発現し、このアミノ酸配列により免疫反応が生体内で惹起される。しかし、ある特定のプラスミドＤＮＡワクチンを生体に投与しても、喚起される免疫反応の程度は一定ではなく、試験動物の種類、ＤＮＡの種類、並びに接種方法などにより免疫反応の程度は多様であり、ＤＮＡプラスミドがＤＮＡワクチンとして有用であるかどうかを予測することは一般に困難である。そのような中で、例えばインターロイキンー５（ＩＬ−５）をＤＮＡワクチンとして喘息等に用いる試みがなされている（非特許文献７）。 Recently, DNA vaccines have been developed due to advances in genetic engineering technology. A DNA vaccine generally uses a recombinant plasmid, and an amino acid having an antigenicity encoded by the DNA in vivo by administering the recombinant plasmid containing the DNA encoding the target antigen in vivo. A sequence is expressed, and this amino acid sequence induces an immune response in vivo. However, even if a specific plasmid DNA vaccine is administered to a living body, the degree of immune reaction that is elicited is not constant, and the degree of immune reaction varies depending on the type of test animal, the type of DNA, and the inoculation method. It is generally difficult to predict whether a DNA plasmid will be useful as a DNA vaccine. Under such circumstances, for example, attempts have been made to use interleukin-5 (IL-5) as a DNA vaccine for asthma and the like (Non-patent Document 7).
通常細胞表面上の受容体をターゲットに創薬を行っている当業者が、例えば、ＭＩＦを抑制する薬剤を開発するためには、受容体拮抗薬ではなく、直接にＭＩＦに作用する抗体を開発するか、細胞内受容体に結合する物質を探索するしか方法がなかった。実際に、すでにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が開発され、エンドトキシンで誘導された敗血症や劇症肝炎に対して有効であるとの報告がなされている（Bernhagen J, Calandra T, Mitchell RA, et al. MIF is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia. Nature 1993; 365: 756-9. Kobayashi S, Nishihira J, Watanabe S, et al. Prevention of lethal acute hepatic failure by antimacrophage migration inhibitory factor antibody in mice treated with bacille Calmette-Guerin and lipopolysaccharide. Hepatology1999; 29: 1752-9）。さらに、抗体をモデル動物に投与した研究としては、Bernhagenらのリウマチモデル実験が知られている（Bernhagen, J., et. al.: Regulation of the immune response by macrophage migration inhibitory factor: biological and structural features. J. Mol. Med. 76, 151-161 (1998)）。 For example, in order to develop a drug that suppresses MIF, a person skilled in the art who normally develops drugs targeting a receptor on the cell surface develops an antibody that directly acts on MIF, not a receptor antagonist. Or, there was no other way but to search for substances that bind to intracellular receptors. In fact, polyclonal and monoclonal antibodies have already been developed and reported to be effective against endotoxin-induced sepsis and fulminant hepatitis (Bernhagen J, Calandra T, Mitchell RA, et al. MIF Is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia.Nature 1993; 365: 756-9.Kobayashi S, Nishihira J, Watanabe S, et al. Prevention of lethal acute hepatic failure by antimacrophage migration inhibitory factor antibody in mice treated with bacille Calmette -Guerin and lipopolysaccharide. Hepatology 1999; 29: 1752-9). Furthermore, as a study of administering antibodies to model animals, Bernhagen et al.'S rheumatic model experiment is known (Bernhagen, J., et. Al .: Regulation of the immune response by macrophage migration inhibitory factor: biological and structural features J. Mol. Med. 76, 151-161 (1998)).
また一般に炎症性サイトカインに対する中和抗体、特にＴｈ１細胞によって放出されたサイトカインは炎症性であり、これにはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＩＬ−２、およびリンホトキシン（ＬＴ）が含まれる。これらは自己免疫疾患およびＩＦＮガンマの炎症促進活動におけるＴｈ１の活動が慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、およびクローン病などの多数の自己免疫疾患および炎症疾患に対して関係しており、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３といった炎症性サイトカインに対する中和抗体は有効である。ＩＬ−１とＩＬ−６の組み合わせはミエローマにおいて骨破壊に関係することが知られ、サイトカイン中和抗体（Kawano et al, Nature 332, 83, 1988）及びサイトカインレセプター抗体（抗ＩＬ−６Ｒ抗体など）が有効であることが知られている。最近ではさまざまなモノクローナル抗体が作成され、例えば関節リウマチの治療に用いられている。実際に、関節リウマチ患者に対して行われるＴＮＦ−αを標的にした生物学的製剤を用いた抗サイトカイン療法はすでに実用段階にある。サイトカインは特異的な受容体に認識され作用を示すので、サイトカインが標的細胞上の受容体に認識されなければ炎症反応は起きないという観点から、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインに対する可溶性受容体が用いられている。すなわち、可溶性受容体の存在によりサイトカインが本来の受容体に結合できなくなる。しかし、ＭＩＦでは細胞表面に受容体が発見されていないので、この手法が利用できない。また抗ＭＩＦ抗体はＭＩＦ自身がもつ毒性のために抗体を量産することは難しく、抗体医薬品の開発は当分困難と考えられる。 In general, neutralizing antibodies against inflammatory cytokines, particularly cytokines released by Th1 cells, are inflammatory, including interferon gamma (IFNγ), IL-2, and lymphotoxin (LT). These are related to a number of autoimmune diseases and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), and Crohn's disease where Th1 activity in the pro-inflammatory activity of autoimmune disease and IFN-gamma. Neutralizing antibodies against inflammatory cytokines such as IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, and IL-13 are effective. The combination of IL-1 and IL-6 is known to be involved in bone destruction in myeloma, cytokine neutralizing antibodies (Kawano et al, Nature 332, 83, 1988) and cytokine receptor antibodies (such as anti-IL-6R antibodies) Is known to be effective. Recently, various monoclonal antibodies have been prepared and used, for example, for the treatment of rheumatoid arthritis. In fact, anti-cytokine therapy using biological products targeting TNF-α performed for patients with rheumatoid arthritis is already in practical use. Since cytokines are recognized and act by specific receptors, TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL, and IL from the viewpoint that an inflammatory reaction does not occur unless cytokines are recognized by receptors on target cells. -2, soluble receptors for inflammatory cytokines such as IL-6 have been used. That is, the presence of the soluble receptor prevents the cytokine from binding to the original receptor. However, in MIF, since no receptor has been found on the cell surface, this method cannot be used. In addition, anti-MIF antibodies are difficult to mass-produce due to the toxicity of MIF itself, and it is considered difficult to develop antibody drugs for the time being.
潰瘍性大腸炎やクローン病などの非特異的炎症性腸疾患（以下、ＩＢＤと略す）は、原因不明の難治性疾患である。潰瘍性大腸炎は主に大腸の潰瘍形成性炎症性疾患であり、クローン病は肉芽腫性病変で腸管のどの部位にも発生し得る。ＩＢＤの主な治療法は、ステロイド剤やサラゾピリンなどの薬物療法である。特に、ステロイド剤の有効性は確立されているが、投与量や投与法、副作用、薬剤の到達性については問題が残り、検討されてきた。例えば、潰瘍性大腸炎における難治性症例や重症例の場合は、貧血・低タンパク血症を伴い全身状態が悪いうえに、長期間の薬物投与により下痢などの副作用も被っている。したがって、まず炎症の進展を止め、全身状態の改善を図った後に、手術をすることが死亡率の改善に寄与すると考えられ、この様な観点から馬場らによりステロイドの動注療法が試みられるようになった。しかし、上述のステロイド動注療法にも無効例が約３０％と少なからず存在すること、また再投与時の有効率の低下も認められること、また、潰瘍性大腸炎以外の炎症性腸疾患に対しては検討されていなかったことから、八木田らによりＩＢＤを対象に、ステロイドとウリナスタチンの併用動注療法が考案され優秀な成績が報告された(八木田旭邦、他:日本臨床外科医学会雑誌、49:p.590-596、(1988))。また、炎症性腸疾患の病態の形成にサイトカインの関与、なかでも、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８が活動期において高値を示す炎症性腸疾患の治療に、これらサイトカイン産生抑制作用のある薬剤が有効であることが報告されている（八木田旭邦:消化器外科、16:p.1931-1943、(1993)）。しかしながら動脈注射は危険が伴う投与方法であるため、より浸襲性の低い治療方法が求められていた。 Nonspecific inflammatory bowel diseases (hereinafter abbreviated as IBD) such as ulcerative colitis and Crohn's disease are intractable diseases of unknown cause. Ulcerative colitis is primarily an ulcerative inflammatory disease of the large intestine, and Crohn's disease is a granulomatous lesion that can occur anywhere in the intestinal tract. The main treatment for IBD is pharmacotherapy such as steroids and salazopyrine. In particular, the effectiveness of steroids has been established, but problems remain with respect to the dose, administration method, side effects, and drug reachability. For example, intractable cases and severe cases of ulcerative colitis are accompanied by anemia / hypoproteinemia and a poor general condition, and suffer from side effects such as diarrhea due to long-term drug administration. Therefore, it is thought that the first step is to stop the progression of inflammation, improve the general condition, and then perform surgery, which will contribute to the improvement of the mortality rate. Became. However, there are not a few ineffective cases of the steroid arterial infusion therapy mentioned above, about 30%, a decrease in the effective rate upon re-administration, and inflammatory bowel diseases other than ulcerative colitis. As a result, Yakida et al. Proposed a combined arterial infusion therapy of steroid and urinastatin for IBD and reported excellent results (Akikuni Yakita, et al .: Journal of Japanese Society of Clinical Surgical Medicine) 49: p.590-596, (1988)). In addition, cytokines are involved in the formation of pathological conditions of inflammatory bowel disease, and in particular, these cytokine production inhibitory effects are used for the treatment of inflammatory bowel diseases in which TNF-α, IL-6, and IL-8 show high values during the active period. A certain drug has been reported to be effective (Akiho Yakita: Gastroenterological Surgery, 16: p. 1931-1943, (1993)). However, since arterial injection is a dangerous administration method, a less invasive treatment method has been demanded.
関節リウマチでは、ＮＳＡＩＤ等の消炎鎮痛剤やステロイドの投与が対症療法として有効である。また、根治的には炎症性サイトカインに対する中和抗体が有効である。実際に、関節リウマチ患者に対しするＴＮＦ−αを標的にした生物学的製剤を用いた抗サイトカイン療法は、すでに実用段階にある。しかし、治療抗体に対する抗体の生成や副作用の問題が避けられず、重症の患者しか治療対象にできないという欠点があるためより症状が軽い患者を対象にした治療方法の開発が求められていた。 In rheumatoid arthritis, administration of anti-inflammatory analgesics such as NSAID and steroids is effective as symptomatic treatment. Moreover, neutralizing antibodies against inflammatory cytokines are effective radically. In fact, anti-cytokine therapy using biological products targeting TNF-α for rheumatoid arthritis patients is already in practical use. However, the problem of generation of antibodies against therapeutic antibodies and problems of side effects is unavoidable, and there is a drawback that only severe patients can be treated. Therefore, the development of treatment methods for patients with milder symptoms has been demanded.
発明者らはＭＩＦが生体防御反応の最初の段階で役割を果たすゲートキーパーであるという仮説の元に、鋭意自己免疫疾患を含む炎症性疾患の患者の解析研究を進めてきた結果、関節リウマチ患者および潰瘍性大腸炎患者の血液中に存在するＭＩＦに対してその活性を中和する能力をもつ抗体の量が有意に少ないという現象を発見した。そこで、発明者らはＤＮＡワクチンを開発することにより、患者自身に抗体を作らせる治療戦略を考案し、動物実験において有効性を確認することができた。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。 Based on the hypothesis that MIF is a gatekeeper that plays a role in the first stage of the host defense reaction, the inventors have conducted extensive analysis research on patients with inflammatory diseases including autoimmune diseases. As a result, patients with rheumatoid arthritis And the phenomenon that the amount of antibody capable of neutralizing its activity against MIF present in the blood of patients with ulcerative colitis was significantly reduced. Thus, the inventors have devised a treatment strategy that allows patients to make antibodies themselves by developing a DNA vaccine, and have confirmed its effectiveness in animal experiments. The present invention has been completed based on such findings.
本発明は、様々な潜在的な炎症性疾患または炎症を伴う疾患の病態形成に関与が指摘されている炎症性サイトカインの産生を調整する酵素またはペプチド性ホルモンのポリペプチドの一部または全部に対するワクチン、これを含有する医薬組成物を提供し、さらに炎症性疾患または関節リウマチ、クローン病をはじめとする自己免疫疾患を予防または治療する方法を提供する。 The present invention relates to a vaccine against a part or all of a polypeptide of an enzyme or peptidic hormone that regulates the production of inflammatory cytokines that are indicated to be involved in the pathogenesis of various potential inflammatory diseases or diseases involving inflammation The present invention provides a pharmaceutical composition containing the same, and further provides a method for preventing or treating inflammatory diseases or autoimmune diseases including rheumatoid arthritis and Crohn's disease.
すなわち、本発明は、
（１）炎症性サイトカインを誘導または産生するポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むベクターを含有するＤＮＡワクチン；
（２）前記ポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子、腫瘍壊死因子α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２またはインターロイキン−６のいずれか一つ以上である上記（１）記載のＤＮＡワクチン；
（３）前記ポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子由来である上記（２）記載のＤＮＡワクチン；
（４）前記ポリペプチドが酵素である上記（２）記載のＤＮＡワクチン；
（５）前記ベクターがマクロファージ遊走阻止因子由来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子ユニットを含む上記（１）記載のＤＮＡワクチン；
（６）前記遺伝子ユニット中のポリヌクレオチド配列の一部がＴｈエピトープをコードするポリヌクレオチド配列によって置換されている遺伝子ユニットを含む上記（５）記載のＤＮＡワクチン；
（７）前記ベクターが、配列番号：１、２又は３のアミノ酸配列の一部が配列番号：４のアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットを含む上記（５）記載のＤＮＡワクチン；
（８）前記ベクターが、配列番号：１、２又は３のアミノ酸配列の一部が配列番号：４のアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットと、配列番号：１３のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットを含む上記（５）記載のＤＮＡワクチン；
（９）前記ベクターが、配列番号：１、２又は３のアミノ酸配列の一部が配列番号：４のアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子ユニットと、配列番号：１８のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットを含む上記（５）記載のＤＮＡワクチン；
（１０）前記ベクターが、配列番号：１、２又は３のアミノ酸配列の一部が配列番号：２４のアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットと、配列番号：１３又は１８のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子ユニットを含む上記（５）記載のＤＮＡワクチン；
（１１）前記ベクターがプラスミドＤＮＡである上記（１）記載のＤＮＡワクチン；
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のＤＮＡワクチンを含有する医薬組成物；
（１３）炎症性疾患の治療または予防に用いられる上記（１２）記載の医薬組成物；
（１４）前記炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、若年性発症糖尿病、ヴェーゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫ブドウ膜炎、アディソン病、副腎炎、原発性胆汁性肝硬変、グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺疾患、悪性貧血、ルポイド肝炎、脱髄疾患、多発性硬化症、亜急性の皮膚エリテマトーデス、上皮小体低下症、ドレスラー症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、突発性血漿板減少性紫斑病、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、水泡性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、自己免疫性膀胱炎、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰症、レーノー食道運動性障害、強指症、および毛細管拡張症）、成人発症糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、雄性または雌性自己免疫不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死化脈管炎、若年発症関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、ぜん息、再発性流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多型紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、自己免疫慢性活性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性脳脊髄炎、毒性皮膚壊死溶解、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疸性膿皮症、輸血反応、慢性疲労症候群 、線維筋痛、高安動脈炎、川崎病、リウマチ性多筋痛、側頭動脈炎、巨細胞動脈炎、サムター症候群（三徴（鼻ポリープ、好酸球増加症、およびぜん息とも呼ばれる））、ベーチェット病、キャプラン症候群、デング熱、脳筋炎、心内膜炎、筋炎、心内膜線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球増加を伴う筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、心筋症、ワクチン接種後症候群、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、腎細胞ガン腫、イートン−ランバート症候群、及び再発性多発性軟骨炎からなる群より選択される自己免疫障害を発症する徴候を有するか、またはその疾患原因および／または補助因子が潜在することを遺伝的または生化学的に確定できる疾患である上記（１３）記載の医薬組成物；
（１５）前記炎症性疾患が、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−６の発現を伴う上記（１３）記載の医薬組成物；
（１６）前記疾患が、関節リウマチまたは潰瘍性大腸炎である上記（１３）記載の医薬組成物；
（１７）前記治療用組成物が注射剤である上記（１３）記載の医薬組成物；
（１８）上記（１１）記載のＤＮＡワクチンまたは上記（１２）記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することによって有効な抗体価を得ることを特徴とする炎症性疾患の予防または治療方法；などを提供する。
That is, the present invention
(1) a DNA vaccine containing a vector comprising at least one gene unit encoding part or all of a polypeptide that induces or produces inflammatory cytokines;
(2) The DNA according to (1), wherein the polypeptide is any one or more of macrophage migration inhibitory factor, tumor necrosis factor α, interferon-γ, interleukin-1, interleukin-2, and interleukin-6. vaccine;
(3) The DNA vaccine according to (2) above, wherein the polypeptide is derived from a macrophage migration inhibitory factor;
(4) The DNA vaccine according to (2) above, wherein the polypeptide is an enzyme;
(5) The DNA vaccine according to (1) above, wherein the vector comprises a gene unit comprising a polynucleotide sequence encoding a macrophage migration inhibitory factor-derived polypeptide;
(6) The DNA vaccine according to the above (5), comprising a gene unit in which a part of the polynucleotide sequence in the gene unit is replaced by a polynucleotide sequence encoding a Th epitope;
(7) The vector comprising a gene unit having a polynucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 is substituted with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. ) DNA vaccine as described;
(8) The vector includes a gene unit having a polynucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 is replaced by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: The DNA vaccine according to (5) above, comprising a gene unit having 13 polynucleotide sequences;
(9) The vector comprises a gene unit encoding an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 is substituted with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 The DNA vaccine according to (5) above, comprising a gene unit having
(10) The vector includes a gene unit having a polynucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 is substituted with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; The DNA vaccine according to (5) above, comprising a gene unit having 13 or 18 polynucleotide sequences;
(11) The DNA vaccine according to (1) above, wherein the vector is plasmid DNA;
(12) A pharmaceutical composition comprising the DNA vaccine according to any one of (1) to (11);
(13) The pharmaceutical composition according to the above (12), which is used for treatment or prevention of inflammatory diseases;
(14) The inflammatory disease is systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile-onset diabetes, Wegener's granulomatosis, inflammatory bowel disease, polymyositis, dermatomyositis, multiple endocrine insufficiency, Schmidt syndrome, autoimmunity Uveitis, Addison's disease, adrenalitis, primary biliary cirrhosis, Graves' disease, thyroiditis, Hashimoto's thyroiditis, autoimmune thyroid disease, pernicious anemia, lupoid hepatitis, demyelinating disease, multiple sclerosis, subacute skin Lupus erythematosus, hypoparathyroidism, dressler syndrome, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenia, idiopathic plasma plate reducing purpura, hemolytic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pemphigus vulgaris, pemphigus , Bullous pemphigoid, herpes zoster, alopecia areata, autoimmune cystitis, pemphigoid, scleroderma, progressive systemic sclerosis, CREST syndrome (lime , Renault esophageal motility disorder, sclerotia, and telangiectasia), adult-onset diabetes (type II diabetes), male or female autoimmune infertility, ankylosing spondylitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, mixed connective tissue Disease, polyarteritis nodosa, systemic necrotizing vasculitis, juvenile-onset rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, atopic dermatitis, atopic rhinitis, Goodpascher syndrome, Chagas disease, sarcoidosis, rheumatic fever, asthma, recurrent Miscarriage, antiphospholipid syndrome, farmer's lung, polymorphic erythema, post-cardiac syndrome, Cushing syndrome, autoimmune chronic active hepatitis, aviator's lung, allergic encephalomyelitis, toxic skin necrolysis, alopecia, alport syndrome, lung Cystitis, allergic alveolitis, fibrosis alveolitis, interstitial lung disease, erythema nodosum, pyoderma gangrenosum, blood transfusion reaction, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, Takayasu arteritis, river Disease, rheumatoid polymyalgia, temporal arteritis, giant cell arteritis, sumter syndrome (triads (also called nasal polyp, eosinophilia, and asthma)), Behcet's disease, Caplan syndrome, dengue fever, encephalomyelitis , Endocarditis, myositis, endocardial fibrosis, endophthalmitis, endemic erythema, psoriasis, fetal erythroblastosis, fasciitis with eosinophilia, Charman syndrome, Ferti syndrome, filariasis , Ciliitis, chronic ciliitis, allergic ciliitis, Fuchs ciliitis, IgA nephropathy, Henoho-Schönlein purpura, glomerulonephritis, cardiomyopathy, post-vaccination syndrome, Have signs of developing an autoimmune disorder selected from the group consisting of Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma, renal cell carcinoma, Eaton-Lambert syndrome, and relapsing polychondritis or the cause of the disease and And / or the pharmaceutical composition according to the above (13), wherein the disease can be genetically or biochemically confirmed to be latent.
(15) The pharmaceutical composition according to the above (13), wherein the inflammatory disease is accompanied by expression of TNFα, IFN-γ, IL-1, IL-2 or IL-6;
(16) The pharmaceutical composition according to the above (13), wherein the disease is rheumatoid arthritis or ulcerative colitis;
(17) The pharmaceutical composition according to the above (13), wherein the therapeutic composition is an injection;
(18) A method for preventing or treating inflammatory diseases, wherein an effective antibody titer is obtained by administering an effective amount of the DNA vaccine according to (11) or the pharmaceutical composition according to (12) above to a patient. And so on.
本発明のＤＮＡワクチンを投与することにより、ワクチンが対象とするポリペプチドに対する抗体の抗体価を増加させることができるので、本発明のＤＮＡワクチン、これを含有する医薬組成物、およびこれらを用いた方法は、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎などの予防または治療に有用である。 By administering the DNA vaccine of the present invention, the antibody titer of the antibody against the polypeptide targeted by the vaccine can be increased, so the DNA vaccine of the present invention, a pharmaceutical composition containing the same, and these were used. The method is useful for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, ulcerative colitis and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＤＮＡワクチン
本発明の第一の態様では、炎症性サイトカインを誘導または産生するポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むベクターを含有するＤＮＡワクチンが提供される。本発明のＤＮＡワクチンを、ヒトを含む哺乳動物に投与すると、本発明のＤＮＡワクチンの遺伝子ユニットにコードされるポリペプチドが生体内で合成され、これが抗原となって免疫が生じることになる。したがって本発明のＤＮＡワクチンを用いる免疫は、炎症性サイトカインを誘導または産生するポリペプチドに関連する疾患の予防及び治療に有効である。本明細書における「ワクチン」とは、免疫応答を生じうる物質を意味する。したがって「ＤＮＡワクチン」とは、ワクチンのうち免疫応答を生じうる物質がＤＮＡのもの、すなわちワクチンとして作用するＤＮＡを指す。ここで「遺伝子ユニット」とは、ＤＮＡワクチンを構成するために必要な遺伝子配列部分をいい、例えば、抗原となるポリペプチド又はそのポリペプチドが抗原として認識される部位をコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、免疫活性増強作用を持つＴｈエピトープをコードするポリヌクレオチド、約１５〜約５０アミノ酸残基長さのペプチド（米国特許第５，７５９，５５１号）が挙げられる。本発明のＤＮＡワクチンは、そのワクチンの標的、あるいはそのワクチンの活性を増強するために上記遺伝子ユニットをそのベクターＤＮＡ中に１つあるいは複数有することができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. DNA vaccine In the first aspect of the present invention, there is provided a DNA vaccine comprising a vector comprising at least one gene unit encoding part or all of a polypeptide that induces or produces inflammatory cytokines. When the DNA vaccine of the present invention is administered to mammals including humans, a polypeptide encoded by the gene unit of the DNA vaccine of the present invention is synthesized in vivo, and this is used as an antigen to generate immunity. Therefore, immunization using the DNA vaccine of the present invention is effective for the prevention and treatment of diseases associated with polypeptides that induce or produce inflammatory cytokines. As used herein, “vaccine” means a substance that can generate an immune response. Therefore, “DNA vaccine” refers to a substance that can generate an immune response in a vaccine, that is, a DNA that acts as a vaccine. Here, the “gene unit” refers to a gene sequence portion necessary for constructing a DNA vaccine. For example, a polynucleotide that encodes a polypeptide serving as an antigen or a site where the polypeptide is recognized as an antigen, or a polynucleotide thereof. A polynucleotide encoding a signal peptide that promotes the secretion of the peptide, a polynucleotide encoding a Th epitope that enhances immune activity, a peptide having a length of about 15 to about 50 amino acid residues (US Pat. No. 5,759,551) ). The DNA vaccine of the present invention may have one or more gene units in the vector DNA in order to enhance the vaccine target or the vaccine activity.
本発明のＤＮＡワクチンが標的とする炎症性サイトカインとしては、ＭＩＦ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロン−γ（ＩＬγ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）等があげられ、これらを誘導または産生するポリペプチドとしては、ＭＩＦ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロン−γ（ＩＬγ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）などがあげられる。本発明では炎症性サイトカイン誘導性ポリペプチドとしてＭＩＦを選択することが好ましい。また、炎症性サイトカインを誘導または産生する酵素としては、例えば、（例示できる物はありません）、乾癬症状に関係するＭＩＦの遺伝子多型（Donn RP ら J. Invest. Dermatol. 2004 Sep;123(3):484-7）が挙げられる。 Inflammatory cytokines targeted by the DNA vaccine of the present invention include MIF, tumor necrosis factor α (TNFα), interferon-γ (ILγ), interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2) ) And interleukin-6 (IL-6) and the like. Polypeptides that induce or produce these include MIF, tumor necrosis factor α (TNFα), interferon-γ (ILγ), interleukin-1 (IL -1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6) and the like. In the present invention, it is preferable to select MIF as the inflammatory cytokine-inducing polypeptide. In addition, as an enzyme that induces or produces inflammatory cytokines, for example (nothing can be exemplified), MIF gene polymorphism related to psoriasis symptoms (Donn RP et al. J. Invest. Dermatol. 2004 Sep; 123 (3 ): 484-7).
ＭＩＦのアミノ酸配列は、ヒト（ＢＣ０１３９７６；配列番号：１）、マウス（ＢＣ０２４８９５；配列番号：３）、ラット（ＮＭ＿０３１０５１；配列番号：２）などで公知である。本発明ではこれらのうち、特にヒトのＭＩＦが好ましく用いられる。 The amino acid sequence of MIF is known in humans (BC013976; SEQ ID NO: 1), mice (BC024895; SEQ ID NO: 3), rats (NM_031051; SEQ ID NO: 2), and the like. Of these, human MIF is particularly preferably used in the present invention.
本発明でいう「ＭＩＦ由来ペプチド」とは、ヒトＭＩＦ（配列番号：１）に対して、８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上）の相同性を有するペプチドであり、（１）アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例えば、１〜６））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例えば、１〜６個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）アミノ酸配列中の１または２個以上（１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例えば、１〜６個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども包含するものである。 The “MIF-derived peptide” as used in the present invention is 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97% or more) of human MIF (SEQ ID NO: 1). (1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (for example, 1 to 6) in the amino acid sequence. ) Amino acid sequence in which the amino acid has been deleted, (2) 1 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (for example, 1 to 2) in the amino acid sequence 6)) amino acid sequence added, (3) 1 or 2 or more (about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (for example 1 to 2) in the amino acid sequence 6) The amino acid sequence of amino acids are substituted with other amino acids, or (4), such as a peptide comprising an amino acid sequence that is a combination thereof are intended to cover.
本発明のポリペプチドはヒトやその他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また遺伝子工学的に、あるいは市販のペプチド合成機により合成された合成タンパク質であってもよい。 The polypeptide of the present invention is a protein derived from cells of humans or other warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) or any tissue in which those cells are present. It may also be a synthetic protein synthesized by genetic engineering or by a commercially available peptide synthesizer.
上記ポリペプチドをコードする遺伝子はその一部、または全部がＤＮＡワクチンとして用いられる。ここで、「遺伝子の一部」とはワクチンとして投与された場合に、そのポリペプチドに対する抗体が産生されるために必要な領域という意味であり、対象とする遺伝子のうち数個（１〜１０個程度）のアミノ酸からなるペプチド領域、あるいは全ペプチド領域をコードする領域の部分が用いられる。 A part or all of the gene encoding the polypeptide is used as a DNA vaccine. Here, “part of a gene” means a region necessary for the production of an antibody against the polypeptide when administered as a vaccine. Peptide region consisting of about amino acids) or a portion of the region encoding the entire peptide region is used.
ＤＮＡワクチンは具体的には以下のように構築される。 Specifically, the DNA vaccine is constructed as follows.
本発明で用いるＤＮＡは、対象となるタンパク質（例えばヒトＭＩＦ）をコードする塩基配列を生体内で発現できるような状態で保持している。本発明で用いるＤＮＡは、対象となるタンパク質（例えばヒトＭＩＦ）をコードする塩基配列を発現ベクターと連結させて成るＤＮＡである。発現ベクターは好ましくはプラスミドベクターである。発現プラスミドの作製において有用なベクターとしては、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、あるいは各種プロモーターを含むベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。 The DNA used in the present invention holds a base sequence encoding a target protein (for example, human MIF) in a state where it can be expressed in vivo. The DNA used in the present invention is DNA obtained by linking a base sequence encoding a target protein (for example, human MIF) with an expression vector. The expression vector is preferably a plasmid vector. Vectors useful in the preparation of expression plasmids include, but are not limited to, constitutive promoters, inducible promoters, tissue-specific promoters, or vectors containing various promoters.
構成性プロモーターの具体例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力なプロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられる。誘導性あるいは調節性のプロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質誘導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。 Specific examples of constitutive promoters include, for example, viruses such as promoters derived from cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV40), or herpes simplex virus (HSV). Strong promoters. A specific example of the tissue-specific promoter is the muscle β-actin promoter. Examples of the inducible or regulatable promoter include a growth hormone regulatable promoter, a promoter under the control of the lac operon sequence, an antibiotic-inducible promoter, or a zinc-inducible metallothionein promoter.
本発明で用いるベクターは、プロモーター（例えば、上記の構成性または誘導性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことが好ましい。ベクターはさらに、エンハンサー要素、転写あるいはポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０あるいはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来）のスプライシングのためのイントロン配列などのＲＮＡプロセシング配列、発現タンパク質分泌のシグナル配列、あるいはＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激ＤＮＡ配列の２以上のコピーを含んでいてもよい。また、ベクターは、細菌の複製起点配列および／または抗生物質耐性（例えば、カナマイシン）あるいは非抗生物質耐性（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）に用いられ得る選択マーカー用のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。 The vector used in the present invention preferably contains an expression control sequence including a promoter (for example, the constitutive or inducible promoter described above) DNA sequence. Vectors are also known as enhancer elements, RNA processing sequences such as intron sequences for splicing of transcriptional or polyadenylation signals (eg, from SV40 or bovine growth hormone (BGH)), signal sequences for expressed protein secretion, or CpG motifs. It may contain more than one copy of the immunostimulatory DNA sequence being generated. The vector may also include a bacterial origin of replication sequence and / or a DNA sequence for a selectable marker that can be used for antibiotic resistance (eg, kanamycin) or non-antibiotic resistance (eg, β-galactosidase gene). .
本発明で用いるＤＮＡの中には、対象となるタンパク質（例えばヒトＭＩＦ）をコードする塩基配列に加えて、さらにこれとは異なる別の１または２以上の塩基配列を有していてもよい。そのような別の塩基配列の具体例として、Ｔｈエピトープをコードする配列、分泌のためのシグナルペプチド（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）あるいはインターロイキンー５（ＩＬ−５）に由来するシグナルペプチド）をコードする配列等が挙げられる。なお、ＭＩＦは分泌シグナルをもたないので、ＭＩＦをコードする遺伝子ユニットを用いる場合は、シグナルペプチドをコードする遺伝子ユニットを組み合わせて用いると、発現したＭＩＦの分泌を促進することができる。 In addition to the base sequence encoding the protein of interest (for example, human MIF), the DNA used in the present invention may further have one or more different base sequences. Specific examples of such another nucleotide sequence include a sequence encoding a Th epitope, a signal peptide for secretion (for example, a signal peptide derived from tumor necrosis factor (TNF) or interleukin-5 (IL-5)). And the like coding sequence. Since MIF does not have a secretion signal, when a gene unit encoding MIF is used, secretion of expressed MIF can be promoted by using a combination of gene units encoding signal peptides.
Ｔｈエピトープは、Ｈｅｒｔｚらの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３７９２−３７９９（２００１））によれば、この配列を抗原中に含むと免疫寛容を生じるので、例えばヒトＭＩＦ自身をワクチンとして十分に用いることが可能となる。したがって、Ｔｈエピトープをコードする配列を、対象となるポリペプチドの配列の一部（例えば、ループ配列）に置換することが好ましい。このような作用を有するペプチドとして、Ｔｈエピトープのほかに、鶏卵リゾチームの部分配列（Nature, 328 (6129):395-399 (1987)参照）あるいはオブアルブミンの部分配列（J. Immunol. 137 (3):911-915 (1986)参照）等があげられる。これらもまたＴｈエピトープ同様に、本発明のＤＮＡワクチンに用いることができる。 According to a report by Hertz et al. (J. Immunol., 167: 3792-3799 (2001)), a Th epitope causes immunological tolerance when it is contained in an antigen. For example, human MIF itself is sufficiently used as a vaccine. It can be used. Therefore, it is preferable to replace the sequence encoding the Th epitope with a part of the sequence of the polypeptide of interest (for example, a loop sequence). As a peptide having such an action, in addition to the Th epitope, a partial sequence of chicken egg lysozyme (see Nature, 328 (6129): 395-399 (1987)) or a partial sequence of ovalbumin (J. Immunol. 137 (3 ): 911-915 (1986)). These can also be used in the DNA vaccine of the present invention in the same manner as the Th epitope.
また、ベクターとしてプラスミドＤＮＡを用いた場合、対象となるタンパク質（例えばヒトＭＩＦ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、常法により大量に調製することができる。例えば、宿主の細菌を形質転換し、形質転換体を大量に培養し、培養液からアルカリ溶解法などの当業者に周知の技法によりプラスミドＤＮＡを回収することができる。本発明の方法において用いられるＤＮＡは、好ましくは、精製されたプラスミドＤＮＡである。 When plasmid DNA is used as a vector, DNA having a base sequence encoding a target protein (for example, human MIF) can be prepared in a large amount by a conventional method. For example, host bacteria can be transformed, transformants can be cultured in large quantities, and plasmid DNA can be recovered from the culture solution by techniques well known to those skilled in the art, such as alkaline lysis. The DNA used in the method of the present invention is preferably purified plasmid DNA.
２．ＤＮＡワクチンを含有する医薬組成物及びそれを用いる予防・治療方法
本発明のＤＮＡワクチンは、例えば、薬学的に許容される担体またはアジュバンド等と一緒に配合して医薬組成物の形態で提供することができる。したがって、本発明の第２の態様によれば、上記したＤＮＡワクチンを含有する医薬組成物が提供される。また、本発明の第３の態様によれば、上記ＤＮＡワクチンまたは医薬組成物の有効量を患者に投与することによってそのワクチンが標的とするポリペプチドに対する有効な抗体値を得ることを特徴とする炎症性疾患の予防または治療方法が提供される。
2. Pharmaceutical composition containing DNA vaccine and prevention / treatment method using the same The DNA vaccine of the present invention is provided, for example, in the form of a pharmaceutical composition by combining with a pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant. be able to. Therefore, according to the 2nd aspect of this invention, the pharmaceutical composition containing an above-described DNA vaccine is provided. Moreover, according to the third aspect of the present invention, an effective amount of the antibody against the polypeptide targeted by the vaccine is obtained by administering to the patient an effective amount of the above DNA vaccine or pharmaceutical composition. Methods for preventing or treating inflammatory diseases are provided.
本発明で用いる薬学的に許容可能な担体は、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクションするのに適したものである。このような薬学的に許容可能な担体の具体例としては、カチオン性リポソーム、フルオロカーボンエマルジョン、蝸牛状剤（cochleate）、筒状剤（tubule）、金粒子、生体分解性ミクロスフェア、あるいはカチオン性ポリマーなどの公知のトランスフェクション試薬が挙げられる。当業者はこのようなトランスフェクション試薬を用いて、本発明で用いるＤＮＡを適宜処方することができる。 The pharmaceutically acceptable carrier used in the present invention is suitable for transfection of a DNA vaccine into living cells. Specific examples of such pharmaceutically acceptable carriers include cationic liposomes, fluorocarbon emulsions, cochleates, tubules, gold particles, biodegradable microspheres, or cationic polymers. Well-known transfection reagents. Those skilled in the art can appropriately formulate the DNA used in the present invention using such a transfection reagent.
本発明で好適に用いられるリポソームとしては、市販のリポソーム、あるいはカチオン性脂質あるいはカチオン性ポリマーのいずれかを含むリポソームなどが挙げられる。本発明の好ましい態様においては、リポソームは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）あるいはコレステロールなどの中性脂質とカチオン性脂質との混合物を含むリポソームが用いられる。そのようなリポソームの調製方法は当業者に公知である。カチオン性脂質とは異なり、カチオン性ポリマーはエステル結合を有さず、その結果、インビボにおいて高い安定性を有する。カチオン性ポリマー（デンドリマーとも称される）の構造は、鎖状でも環状でもよく、ダイマー、オリゴマーあるいはポリマーの何れでもよい。中性脂質を有さない水溶液中のカチオン性ポリマーもまた、本発明において好ましく用いることができる。 Examples of the liposome suitably used in the present invention include commercially available liposomes and liposomes containing either cationic lipids or cationic polymers. In a preferred embodiment of the present invention, a liposome containing a mixture of a neutral lipid such as dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) or cholesterol and a cationic lipid is used. Methods for preparing such liposomes are known to those skilled in the art. Unlike cationic lipids, cationic polymers do not have ester linkages and as a result have high stability in vivo. The structure of the cationic polymer (also referred to as dendrimer) may be linear or cyclic, and may be any of dimer, oligomer, or polymer. A cationic polymer in an aqueous solution having no neutral lipid can also be preferably used in the present invention.
ホスファチジルセリン、コレステロール、およびカルシウムから成る安定なリン脂質カルシウム沈殿剤である蝸牛状剤は、消化系で存続することができる非毒性および非炎症性トランスフェクション試薬として知られている。また、ポリエステルであるポリ（ラクチド−コ−グリコライド）などのポリマーからなる生体分解性ミクロスフェアを、トランスフェクションのためにＤＮＡをマイクロカプセル化するために用いることができる。筒状剤はらせん状に巻かれた二層の脂質からなり、その縁が合わされてパックされている脂質ベースの微小筒として知られている。筒状剤を用いる場合、ＤＮＡは、動物体内に送達および制御放出を行うための中空中心部に配置することができる。 Cochlear, a stable phospholipid calcium precipitant consisting of phosphatidylserine, cholesterol, and calcium, is known as a non-toxic and non-inflammatory transfection reagent that can persist in the digestive system. Alternatively, biodegradable microspheres made of polymers such as polyester, poly (lactide-co-glycolide), can be used to microencapsulate DNA for transfection. Cylindrical agents are known as lipid-based microcylinders, which are composed of two layers of lipids wound in a spiral and packed together at their edges. When using a tubular agent, the DNA can be placed in the hollow center for delivery and controlled release into the animal body.
本発明の医薬組成物を調製するために用いることができる免疫用アジュバントは当技術分野で周知である。当業者は、医薬組成物を形成するための適切なアジュバントを適宜選択することができる。本発明で用いることができるアジュバントの具体例としては、ＣｐＧアジュバント、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。本発明の医薬組成物は、カプセル剤、懸濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の投与形態で用いることができる。 Immunological adjuvants that can be used to prepare the pharmaceutical compositions of the invention are well known in the art. A person skilled in the art can appropriately select an appropriate adjuvant for forming a pharmaceutical composition. Specific examples of adjuvants that can be used in the present invention include CpG adjuvant and aluminum hydroxide. The pharmaceutical composition of the present invention can be used in any dosage form such as a capsule, suspension, elixir or solution.
単回投与量のワクチンＤＮＡを含む医薬組成物を調製するために担体物質と組み合わせるべきワクチンＤＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方法、用いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現される抗原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活性（免疫原性）、被験者の状態、予防または治療の対象となる疾患を含む多くの要因に依存する。投与すべきＤＮＡの量はまた、薬学的に許容される担体（トランスフェクション試薬）およびアジュバンドの種類および量にも依存する。 The amount of vaccine DNA to be combined with a carrier material to prepare a pharmaceutical composition containing a single dose of vaccine DNA is generally expressed by the route of administration and method of administration, the base sequence used and the type of expression vector. It depends on many factors, including the stability and activity (immunogenicity) of the antigenic protein or peptide, the condition of the subject, the disease to be prevented or treated. The amount of DNA to be administered also depends on the type and amount of pharmaceutically acceptable carrier (transfection reagent) and adjuvant.
本発明のＤＮＡワクチンまたはこれを含有する医薬組成物は、炎症性疾患の予防または治療に用いることができる。炎症性疾患としては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、若年性発症糖尿病、ヴェーゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫ブドウ膜炎、アディソン病、副腎炎、原発性胆汁性肝硬変、グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺疾患、悪性貧血、ルポイド肝炎、脱髄疾患、多発性硬化症、亜急性の皮膚エリテマトーデス、上皮小体低下症、ドレスラー症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、突発性血漿板減少性紫斑病、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、水泡性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、自己免疫性膀胱炎、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰症、レーノー食道運動性障害、強指症、および毛細管拡張症）、成人発症糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、雄性または雌性自己免疫不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死化脈管炎、若年発症関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、ぜん息、再発性流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多型紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、自己免疫慢性活性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性脳脊髄炎、毒性皮膚壊死溶解、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疸性膿皮症、輸血反応、慢性疲労症候群 、線維筋痛、高安動脈炎、川崎病、リウマチ性多筋痛、側頭動脈炎、巨細胞動脈炎、サムター症候群（三徴）、ベーチェット病、キャプラン症候群、デング熱、脳筋炎、心内膜炎、筋炎、心内膜線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球増加を伴う筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、心筋症、ワクチン接種後症候群、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、腎細胞ガン腫、イートン−ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎があげられる。
本発明のＤＮＡワクチン、それを含有する医薬組成物は、特に関節リウマチ、潰瘍性大腸炎などの予防または治療に有用である。
The DNA vaccine of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same can be used for prevention or treatment of inflammatory diseases. Inflammatory diseases include systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile-onset diabetes, Wegener's granulomatosis, inflammatory bowel disease, polymyositis, dermatomyositis, multiple endocrine insufficiency, Schmidt syndrome, autoimmune uveitis , Addison's disease, adrenalitis, primary biliary cirrhosis, Graves' disease, thyroiditis, Hashimoto's thyroiditis, autoimmune thyroid disease, pernicious anemia, lupoid hepatitis, demyelinating disease, multiple sclerosis, subacute cutaneous lupus erythematosus, epithelium Hypothyroidism, dressler syndrome, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenia, idiopathic plasmaplate-sparing purpura, hemolytic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pemphigus vulgaris, pemphigus, blister Pemphigoid, herpes zoster, alopecia areata, autoimmune cystitis, pemphigoid, scleroderma, progressive systemic sclerosis, CREST syndrome No esophageal motility disorder, scleroderma, and telangiectasia), adult-onset diabetes (type II diabetes), male or female autoimmune infertility, ankylosing spondylitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, mixed connective tissue disease Polyarteritis nodosa, systemic necrotizing vasculitis, juvenile onset rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, atopic dermatitis, atopic rhinitis, Goodpasture syndrome, Chagas disease, sarcoidosis, rheumatic fever, asthma, recurrent miscarriage , Antiphospholipid syndrome, farmer's lung, polymorphic erythema, post-operative syndrome, Cushing syndrome, autoimmune chronic active hepatitis, aviator's lung, allergic encephalomyelitis, toxic skin necrolysis, alopecia, Alport syndrome, alveoli Inflammation, allergic alveolitis, fibrosis alveolitis, interstitial lung disease, erythema nodosum, pyoderma gangrenosum, blood transfusion reaction, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, Takayasu arteritis, Kawasaki disease, Equine polymyalgia, temporal arteritis, giant cell arteritis, sumter syndrome (triad), Behcet's disease, Caplan syndrome, dengue fever, encephalomyelitis, endocarditis, myositis, endocardial fibrosis, endophthalmitis , Endemic erythema, psoriasis, fetal erythroblastosis, fasciitis with eosinophilia, Charman's syndrome, Ferti syndrome, filariasis, ciliary inflammation, chronic ciliitis, allergic hair Thyroiditis, Fuchs ciliitis, IgA nephropathy, Henoho-Schönlein purpura, glomerulonephritis, cardiomyopathy, post-vaccination syndrome, Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma, renal cell carcinoma, Eaton-Lambert syndrome, Recurrent polychondritis is included.
The DNA vaccine of the present invention and the pharmaceutical composition containing it are particularly useful for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, ulcerative colitis and the like.
前記ＤＮＡワクチンまたはこれを含有する医薬組成物は、筋肉または皮膚に直接投与することができる。遺伝子銃を使用して本発明のＤＮＡワクチンを投与することもできる。皮下注入、皮内導入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内または吸入投与、経口投与も可能であり、投与経路は特に限定されない。また、追加免疫接種を行うことも可能である。 The DNA vaccine or a pharmaceutical composition containing it can be directly administered to muscle or skin. A DNA gun of the present invention can also be administered using a gene gun. Subcutaneous injection, intradermal introduction, transdermal injection, and other administration methods such as intraperitoneal, intravenous or inhalation administration, and oral administration are also possible, and the administration route is not particularly limited. A booster immunization can also be performed.
本発明のＤＮＡワクチン又は医薬組成物を哺乳動物（患者）に投与する場合、上記疾患（例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）における予防または治療に有効な量で投与されるが、一般的には、１μｇ〜２０００μｇを投与する。
このようにして上記ＤＮＡワクチン又は医薬組成物を患者に有効量投与することによって、その患者において、そのワクチンが標的とするポリペプチドに対する有効な抗体価得ることができる。
When the DNA vaccine or pharmaceutical composition of the present invention is administered to a mammal (patient), it is administered in an amount effective for prevention or treatment in the above diseases (for example, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, etc.). Is administered 1 μg to 2000 μg.
Thus, by administering an effective amount of the DNA vaccine or pharmaceutical composition to a patient, an effective antibody titer against the polypeptide targeted by the vaccine can be obtained in the patient.
以下の比較例および実施例で本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるわけではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following comparative examples and examples, but the present invention is not limited to these examples.
［比較例１］
マウスＭＩＦ発現プラスミドベクターの構築
マウスＭＩＦ ｃＤＮＡは、ＲＡＷ２６４．７細胞より調製した全ＲＮＡを材料として配列番号：６で表されるプライマーＢ−１Ｕおよび配列番号：９で表されるプライマーＸ−３４８Ｌを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅した。ｃＤＮＡの合成反応系は５０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．５ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ｄＮＴＰ、４０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤、０．２μＭ ランダムオリゴヌクレオチド（９残基）、３０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素、２μｇ ＲＮＡからなり、全量で２５μｌとした。反応は４２℃、６０分間行った。ＰＣＲは以下の条件：１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２μＭ プライマーＢ−１Ｕ（配列番号：６）およびＸ−３４８Ｌ（配列番号：９）、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなる全量２５μｌの反応系で、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行い、マウスＭＩＦ ｃＤＮＡ断片を得た。そのｃＤＮＡ断片を精製後、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１の制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位へクローニングし、マウスＭＩＦを発現するプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ（ＤＶ１と称する：配列番号：３２）を得た。
[Comparative Example 1]
Construction of mouse MIF expression plasmid vector Mouse MIF cDNA was prepared by using primer B-1U represented by SEQ ID NO: 6 and primer X-348L represented by SEQ ID NO: 9 using total RNA prepared from RAW264.7 cells as material. Amplified by RT-PCR method. The synthesis reaction system of cDNA was 50 mM Tris hydrochloride (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, 0.5 mM spermidine, 10 mM dithiothreitol, 1 mM dNTP, 40 U RNase inhibitor, 0.2 μM random oligonucleotide (9 Residue), 30 U AMV reverse transcriptase, 2 μg RNA, totaling 25 μl. The reaction was performed at 42 ° C. for 60 minutes. PCR was performed under the following conditions: 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM primer B-1U (SEQ ID NO: 6) and X -348L (SEQ ID NO: 9), a reaction system consisting of 1 mM dNTP, 10 U Taq DNA polymerase in a total volume of 25 μl. A cycle of 72 ° C. for 1 minute was repeated 25 times, and finally an extension reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes to obtain a mouse MIF cDNA fragment. After purification of the cDNA fragment, it was cloned into the restriction enzyme BamHI / XhoI site of the plasmid vector pcDNA3.1 to obtain a plasmid vector pcDNA3.1 / MIF (referred to as DV1: SEQ ID NO: 32) expressing mouse MIF.
ＤＮＡワクチンの作製（１）
ＤＮＡワクチンとして、ここでは破傷風毒素Ｔｈエピトープ（配列番号：４）を持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ２））を作製した。その手順を図１に示す。
プライマーＢ−１Ｕ（配列番号：６）とＥ−９３Ｌ（配列番号：７）、あるいはＥ−１１２Ｕ（配列番号：８）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：９）の組合せで、ＭＩＦ ｃＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は１ｎｇの上記ｃＤＮＡ，１０ｍＭ トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ 塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．５ｍＭ 塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， １０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、ＭＩＦ ｃＤＮＡの断片Ｂ−１／Ｅ−９３およびＥ−１１２／Ｘ−３４８を得た。これらの断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結し、さらに得られた断片を鋳型に、Ｂ−１ＵとＸ−３４８ＬをプライマーとしてＰＣＲを行った。この反応における反応液の組成は、上記で得られた断片のＤＮＡを１ｎｇ使用し、１０ｍＭ トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ 塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．５ｍＭ 塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， １０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、２番目のループを欠損し、かつここをＥｃｏＲＩ部位に置き換えた変異ＭＩＦ ｃＤＮＡを得た。これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。その結果得られた変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦｄ２（ＤＶ０と称する）と命名した。また、このベクターにより発現されるポリペプチドを配列表に配列番号：３３で示す。
Production of DNA vaccine (1)
Here, a mutant MIF expression plasmid vector (pcDNA3.1 / MIF / Ttx (DV2)) having a tetanus toxin Th epitope (SEQ ID NO: 4) was prepared as a DNA vaccine. The procedure is shown in FIG.
Primer B-1U (SEQ ID NO: 6) and E-93L (SEQ ID NO: 7), or a combination of E-112U (SEQ ID NO: 8) and X-348L (SEQ ID NO: 9), using MIF cDNA as a template Each was performed by PCR. The composition of the reaction solution in the reaction was 1 ng of the above cDNA, 10 mM Tris hydrochloride, pH 9.0, 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer, 1 mM dNTP, 10U Taq DNA polymerase, with a final volume of 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. As a result, MIF cDNA fragments B-1 / E-93 and E-112 / X-348 were obtained. These fragments were treated with the restriction enzyme EcoRI, ligated with T4 DNA ligase, and PCR was performed using the obtained fragments as templates and B-1U and X-348L as primers. The composition of the reaction solution in this reaction was such that 1 ng of the fragment DNA obtained above was used, 10 mM Tris hydrochloride, pH 9.0, 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer, 1 mM dNTP, 10 U Taq DNA polymerase, and the final volume was 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. As a result, mutant MIF cDNA was obtained in which the second loop was deleted and replaced with an EcoRI site. This was treated with BamHI and XhoI and inserted into the BamHI / XhoI site of pcDNA3.1. The resulting mutant MIF expression plasmid vector was named pcDNA3.1 / MIFd2 (referred to as DV0). The polypeptide expressed by this vector is represented by SEQ ID NO: 33 in the sequence listing.
一方、破傷風毒素のＴｈエピトープ（配列番号：４）を、ＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、Ｅ−ＴｘＵ（配列番号：１０）およびＥ−ＴｘＬ（配列番号：１１）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ 塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．５ｍＭ 塩化マグネシウム，１μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， 最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。この産物（配列番号：５）をＥｃｏＲＩで処理した後、上記のように調製したＭＩＦ発現ベクターＤＶ０のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、破傷風毒素のＴｈエピトープを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ２と称する））を得た。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３４で示す。 On the other hand, a Th epitope (SEQ ID NO: 4) of tetanus toxin was prepared by a DNA extension reaction. That is, using E-TxU (SEQ ID NO: 10) and E-TxL (SEQ ID NO: 11) as primers / templates and Klenow fragment as an enzyme, 10 mM Tris hydrochloride, pH 9.0, 50 mM potassium chloride, 0. 1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 1 μM of the above primer, 1 mM dNTP, and 25 μl of final solution were subjected to an extension reaction at 37 ° C. for 30 minutes. This product (SEQ ID NO: 5) was treated with EcoRI and then inserted into the EcoRI site of the MIF expression vector DV0 prepared as described above, and a mutated MIF expression plasmid vector (pcDNA3.1 / pcid having the Th epitope of tetanus toxin). MIF / Ttx (referred to as DV2)) was obtained. The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 34 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（２）
ＭＩＦはいわゆる分泌シグナルを持たないタンパク質である。ＭＩＦを積極的に分泌させることでその抗原性が亢進することを期待し、分泌シグナルをそのアミノ末端に融合した。ここでは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌シグナルを用いた。ＴＮＦは一部が膜タンパクとして発現していることが知られており、このシグナル配列によりＭＩＦもその一部が膜型として発現することが予想される。実施例１で作製した変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターであるＤＶ２にＴＮＦの分泌シグナルペプチド（配列番号：１２）をコードするＤＮＡ（配列番号：１３）を導入し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＮＦｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ３と称する）を作製した。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３５で示す。
Production of DNA vaccine (2)
MIF is a protein that does not have a so-called secretion signal. Expecting that the antigenicity is enhanced by actively secreting MIF, a secretion signal was fused to its amino terminus. Here, the secretion signal of tumor necrosis factor (TNF) was used. It is known that a part of TNF is expressed as a membrane protein, and it is expected that a part of MIF is expressed as a membrane type by this signal sequence. A DNA (SEQ ID NO: 13) encoding a TNF secretion signal peptide (SEQ ID NO: 12) was introduced into DV2, which is a mutant MIF expression plasmid vector prepared in Example 1, and pcDNA3.1 / TNFsignal / MIF / Ttx ( (Referred to as DV3). The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 35 in the sequence listing.
ＴＮＦの分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号：１３）を鋳型としプライマーＢ−ＴｓＵ（配列番号：１４）とｓｏｅ−ＴｓＬ（配列番号：１５）、あるいはＤＶ２を鋳型としてｓｏｅ−Ｔｓ−ＭＩＦＵ（配列番号：１６）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：８）の組合せでそれぞれＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は、１ｎｇの上記ｃＤＮＡ，１０ｍＭ トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ 塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．５ｍＭ 塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， １０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。得られた反応物を鋳型とし、プライマーＢ−ＴｓＵ（配列番号：１４）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：８）の組合せでさらにＰＣＲを行った。この反応液の組成は、１ｎｇの上記ｃＤＮＡ，１０ｍＭ トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ 塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．５ｍＭ 塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， １０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。 DNA encoding the TNF secretion signal peptide (SEQ ID NO: 13) as a template and primers B-TsU (SEQ ID NO: 14) and soe-TsL (SEQ ID NO: 15), or DV2 as a template soe-Ts-MIFU ( PCR was performed using a combination of SEQ ID NO: 16) and X-348L (SEQ ID NO: 8). The composition of the reaction solution in the reaction was 1 ng of the above cDNA, 10 mM Tris hydrochloride, pH 9.0, 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer, 1 mM dNTP, 10 U Taq DNA polymerase, and the final volume was 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. Using the obtained reaction product as a template, PCR was further performed with a combination of primer B-TsU (SEQ ID NO: 14) and X-348L (SEQ ID NO: 8). The composition of this reaction solution was 1 ng of the above cDNA, 10 mM Tris hydrochloride, pH 9.0, 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer, 1 mM dNTP. , 10 U Taq DNA polymerase, and the final volume was 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. The obtained fragment was treated with restriction enzymes BamHI / XhoI and inserted into the BamHI / XhoI site of pcDNA3.1.
ＤＮＡワクチンの作製（３）
ＩＬ−５の分泌シグナルペプチド（配列番号：１７）をコードするＤＮＡ（配列番号：１８）を導入し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＩＬ−５ｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ４と称する）を作製した。ＩＬ−５の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡはＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、５ｓＵ（配列番号：１９）および５ｓＬ（配列番号：２０）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１μＭの上記のプライマー、１ｍＭ ｄＮＴＰ、最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。この反応生成物を鋳型とし、プライマーＢ−５ｓＵ（配列番号：２１）とｓｏｅ−５ｓＬ（配列番号：２２）、あるいはＤＶ２を鋳型としてｓｏｅ−５ｓ−ＭＩＦＵ（配列番号：２３）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：８）の組合せでそれぞれＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は、１ｎｇの上記ｃＤＮＡ、１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２μＭの上記のプライマー、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。得られた反応物を鋳型とし、プライマーＢ−５ｓＵ（配列番号：２１）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：８）の組合せでさらにＰＣＲを行った。この反応液の組成は、１ｎｇの上記ｃＤＮＡ、１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ ｄＮＴＰ， １０Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。ここで発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３６で示す。
Production of DNA vaccine (3)
A DNA (SEQ ID NO: 18) encoding a secretion signal peptide (SEQ ID NO: 17) of IL-5 was introduced to prepare pcDNA3.1 / IL-5 signal / MIF / Ttx (referred to as DV4). DNA encoding the secretion signal peptide of IL-5 was prepared by a DNA extension reaction. Specifically, 5sU (SEQ ID NO: 19) and 5sL (SEQ ID NO: 20) were used as primers / templates, Klenow fragment was used as an enzyme, 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton. X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 1 μM of the above primer, 1 mM dNTP, the final solution volume was 25 μl, and an extension reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. Using this reaction product as a template, primers B-5sU (SEQ ID NO: 21) and soe-5sL (SEQ ID NO: 22), or DV2 as a template soe-5s-MIFU (SEQ ID NO: 23) and X-348L ( PCR was performed for each combination of SEQ ID NO: 8). The composition of the reaction solution in the reaction was 1 ng of the above cDNA, 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer. 1 mM dNTP, 10 U Taq DNA polymerase, and the final volume was 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. Using the obtained reaction product as a template, PCR was further performed with a combination of primer B-5sU (SEQ ID NO: 21) and X-348L (SEQ ID NO: 8). The composition of this reaction solution was 1 ng of the above cDNA, 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 μM of the above primer, 1 mM dNTP, 10U Taq DNA polymerase, with a final volume of 25 μl. PCR is (i) 94 ° C · 5 minutes later, (ii) 94 ° C · 10 seconds, 56 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 1 minute cycle repeated 25 times, finally 72 ° C · 5 minutes extension Reaction was performed. The obtained fragment was treated with restriction enzymes BamHI / XhoI and inserted into the BamHI / XhoI site of pcDNA3.1. Here, the peptide obtained from the expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（４）
実施例１で用いたＴｈエピトープと同様の効果を有することが知られているペプチドとして、鶏卵リゾチームあるいはオブアルブミンの部分ペプチドがあげられる。ここではＤＶ２のＴｈエピトープを鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列（配列番号：２４）を有するペプチドをコードするＤＮＡに置換したｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ５と称する）を作製した。
Production of DNA vaccine (4)
Examples of peptides known to have the same effects as the Th epitope used in Example 1 include chicken egg lysozyme or ovalbumin partial peptides. Here, pcDNA3.1 / MIF / HEL (referred to as DV5) was prepared by replacing the Th2 epitope of DV2 with a DNA encoding a peptide having the amino acid sequence from 81 to 95 of chicken egg lysozyme (SEQ ID NO: 24). .
鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列（配列番号：２４）を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片（配列番号：２５）を、以下のオリゴＤＮＡ：プライマーＥ−ＨＬＵ（配列番号：２６）およびプライマーＥ−ＨＬＬ（配列番号：２７）を用いてＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、Ｅ−ＨＬＵ（配列番号：２６）およびＥ−ＨＬＬ（配列番号：２７）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１μＭの上記のプライマー、１ｍＭ ｄＮＴＰ、最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。生成物をＥｃｏＲＩで処理した後、実施例２で調製したＭＩＦ発現ベクター（ＤＶ２）のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ５））を得た。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３７で示す。 A DNA fragment (SEQ ID NO: 25) encoding a peptide having the amino acid sequence from 81st to 95th of chicken egg lysozyme (SEQ ID NO: 24) was converted into the following oligo DNA: primer E-HLU (SEQ ID NO: 26) and It was prepared by a DNA extension reaction using primer E-HLL (SEQ ID NO: 27). That is, using E-HLU (SEQ ID NO: 26) and E-HLL (SEQ ID NO: 27) as primers / templates and Klenow fragment as an enzyme, 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0 1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 1 μM of the above primer, 1 mM dNTP, and final solution volume of 25 μl were subjected to an extension reaction at 37 ° C. for 30 minutes. After the product was treated with EcoRI, the MIF expression vector (DV2) prepared in Example 2 was replaced and inserted into the EcoRI site, and mutant MIF expression having peptides having amino acid sequences from 81 to 95 in hen egg lysozyme. A plasmid vector (pcDNA3.1 / MIF / HEL (DV5)) was obtained. The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 37 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（５）
実施例２で作製したＤＶ３のＴｈエピトープを鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列（配列番号：２４）に置換した変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＴＮＦｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ６と称する）を作製した。
Preparation of DNA vaccine (5)
A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / TNFsignal / MIF / HEL (referred to as DV6) in which the Th epitope of DV3 prepared in Example 2 was replaced with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) from the 81st to the 95th of chicken lysozyme. ) Was produced.
実施例４で作成した鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を同様にＤＶ３のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＴＮＦｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ６）を作製した。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３８で示す。 Similarly, the DNA fragment encoding the peptide having the amino acid sequence of amino acids 81 to 95 of chicken lysozyme prepared in Example 4 was inserted into the EcoRI site of DV3, and the amino acid sequence of 81 to 95 of chicken lysozyme was inserted. A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / TNFsignal / MIF / HEL (DV6) having a peptide having the above was prepared. The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 38 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（６）
実施例４と同様の方法でＤＶ４のＴｈエピトープを鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列（配列番号：２４）を有するペプチドに置換した変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＩＬ−５ｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ７と称する）を作製した。
実施例４で作成した鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を同様にＤＶ４のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、鶏卵リゾチームの８１番目から９５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＩＬ−５ｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＨＥＬ（ＤＶ７）を作製した。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：３９で示す。
Production of DNA vaccine (6)
A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / IL-5signal / in which the Th epitope of DV4 was replaced with a peptide having the amino acid sequence from amino acid positions 81 to 95 of chicken egg lysozyme (SEQ ID NO: 24) in the same manner as in Example 4. MIF / HEL (referred to as DV7) was produced.
Similarly, the DNA fragment encoding the peptide having the amino acid sequence from 81 to 95 of chicken egg lysozyme prepared in Example 4 was inserted into the EcoRI site of DV4, and the amino acid sequence from 81 to 95 of chicken egg lysozyme. A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / IL-5 signal / MIF / HEL (DV7) having a peptide with The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 39 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（７）
ここではオブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列（配列番号：２８）を有するペプチドを持つ変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦに導入したｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ８と称する）を作製した。
Preparation of DNA vaccine (7)
Here, pcDNA3.1 / MIF / OVA (referred to as DV8) introduced into a mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / MIF having a peptide having the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin (SEQ ID NO: 28). Was made.
オブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片（配列番号：２９）を、以下のオリゴＤＮＡ：プライマーＥ−ＯＶＵ（配列番号：３０）およびプライマーＥ−ＯＶＬ（配列番号：３１）を用いてＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、Ｅ−ＯＶＵ（配列番号：３０）およびＥ−ＯＶＬ（配列番号：３１）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１μＭの上記のプライマー、１ｍＭ ｄＮＴＰ、最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。生成物をＥｃｏＲＩで処理した後、実施例２で調製したＭＩＦ発現ベクター（ＤＶ２）のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、オブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ８））を得た。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：４０で示す。 A DNA fragment (SEQ ID NO: 29) encoding a peptide having an amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin was converted into the following oligo DNA: primer E-OVU (SEQ ID NO: 30) and primer E-OVL (sequence). No. 31) was used for the DNA extension reaction. Specifically, E-OVU (SEQ ID NO: 30) and E-OVL (SEQ ID NO: 31) were used as primers / templates, Klenow fragment was used as an enzyme, 10 mM Tris hydrochloride (pH 9.0), 50 mM potassium chloride, 0 1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride, 1 μM of the above primer, 1 mM dNTP, and final solution volume of 25 μl were subjected to an extension reaction at 37 ° C. for 30 minutes. After the product was treated with EcoRI, the MIF expression vector (DV2) prepared in Example 2 was substituted and inserted into the EcoRI site, and mutant MIF expression having a peptide having an amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin. A plasmid vector (pcDNA3.1 / MIF / OVA (DV8)) was obtained. The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 40 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（８）
実施例２で作製したＤＶ３のＴｈエピトープをオブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列（配列番号：２８）を有するペプチドに置換した変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＴＮＦｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ９と称する）を作製した。
Preparation of DNA vaccine (8)
A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / TNFsignal / MIF / OVA in which the Th epitope of DV3 prepared in Example 2 was replaced with a peptide having an amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin (SEQ ID NO: 28) (Referred to as DV9).
実施例７で作成したオブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を同様にＤＶ３のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、オブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＴＮＦｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ９）を作製した。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：４１で示す。 Similarly, the DNA fragment encoding the peptide having the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin prepared in Example 7 was inserted into the EcoRI site of DV3, and the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin was inserted. A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / TNFsignal / MIF / OVA (DV9) having a peptide having the above-described properties was prepared. The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 41 in the sequence listing.
ＤＮＡワクチンの作製（９）
実施例７と同様の方法でＤＶ４のＴｈエピトープをオブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列（配列番号：２８）を有するペプチドに置換した変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＩＬ−５ｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ１０と称する）を作製した。
実施例７で作成したオブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を同様にＤＶ４のＥｃｏＲＩ部位に置換挿入し、オブアルブミンの３２５番目から３３６番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＩＬ−５ｓｉｇｎａｌ／ＭＩＦ／ＯＶＡ（ＤＶ１０）を作製した。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：４２で示す。
Production of DNA vaccine (9)
A mutant MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / IL-5signal / in which the Th4 epitope of DV4 was replaced with a peptide having the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin (SEQ ID NO: 28) in the same manner as in Example 7. MIF / OVA (referred to as DV10) was produced.
Similarly, the DNA fragment encoding the peptide having the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin prepared in Example 7 was inserted into the EcoRI site of DV4, and the amino acid sequence from 325th to 336th of ovalbumin was inserted. A mutated MIF expression plasmid vector pcDNA3.1 / IL-5signal / MIF / OVA (DV10) having a peptide with The peptide obtained from this expression plasmid vector is represented by SEQ ID NO: 42 in the sequence listing.
実施例１〜３において得られたワクチン（ＤＶ１〜ＤＶ４）をそれぞれ６匹からなるマウス群に投与（１００μｇを２カ所に分けて皮下投与、２週おきに６回）し、各群の任意の１匹から２，４、６、８、１０及び１２週間後に血液を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＭＩＦ抗体力価を測定した。抗ＭＩＦ抗体力価の測定は、９６ウエルプレートに固相化した組換えＭＩＦと１ｍＭ ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝生理食塩水を用いて希釈した血漿を反応させて結合抗体を定量することによって行なった。得られた結果を図２に示す。図２に示すように、ＤＶ２〜ＤＶ４のＤＮＡワクチンを使用した場合は、有効な抗体価が得られたことが分かった。 Each of the vaccines (DV1 to DV4) obtained in Examples 1 to 3 was administered to a group of 6 mice (100 μg was subcutaneously administered in 2 places and administered 6 times every 2 weeks). Blood was collected from one animal after 2, 4, 6, 8, 10 and 12 weeks, and anti-MIF antibody titer was measured by ELISA. Anti-MIF antibody titer was measured by reacting recombinant MIF immobilized on a 96-well plate with plasma diluted with phosphate buffered saline containing 1 mM EDTA and quantifying the bound antibody. The obtained results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, it was found that an effective antibody titer was obtained when the DNA vaccines DV2 to DV4 were used.
関節炎の誘導
関節炎の誘導は、Ｋａｗａｂａｔａ等の方法にしたがった（Arthritis and Rheumatism, 50, 660-668, 2004）。すなわち、実施例１で作製したＤＮＡワクチンあるいはコントロールＤＮＡを投与したマウスの腹腔内にＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体のカクテル（５００μｇのＤ１、Ｄ８、Ａ２、およびＦ１０、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を５００μｌのＰＢＳに溶かして投与し、その７２時間後、５０μｇのＬＰＳ／１００μｌのＰＢＳを腹腔内に投与して関節炎を誘導した。
Induction of arthritis Induction of arthritis was according to the method of Kawabata et al. (Arthritis and Rheumatism, 50, 660-668, 2004). That is, 500 μl of a cocktail of monoclonal antibodies against type II collagen (500 μg of D1, D8, A2, and F10, Chondrex, Redmond, WA) was injected into the abdominal cavity of mice administered with the DNA vaccine or control DNA prepared in Example 1. 72 hours later, 50 μg of LPS / 100 μl of PBS was intraperitoneally administered to induce arthritis.
その結果、図３に示すように、コントロールマウス（抗体陰性）では足関節部に典型的な腫脹を認めた（図２−ａ）のに対し、ＭＩＦ／Ｔｈ ＤＮＡワクチン投与群（抗体陽性）ではその発症が顕著に抑制され（図２−ｂ）、同週齢の未処置マウス（図２−ｃ）とほとんど区別が付かなかった。 As a result, as shown in FIG. 3, in the control mice (antibody negative), typical swelling was observed in the ankle joint (FIG. 2-a), whereas in the MIF / Th DNA vaccine administration group (antibody positive). Its onset was remarkably suppressed (FIG. 2-b), and was almost indistinguishable from untreated mice of the same age (FIG. 2-c).
ＤＮＡワクチンの関節炎に対する組織学的格付け
Ｂａｌｂ／ｃマウス（各９匹）を生食、ＭＩＦ ｃＤＮＡコントロール（ＤＶ１）ワクチン、ＭＩＦ−ＯＶＡ（ＤＶ８）ワクチンで６回皮下注射後、抗コラーゲン抗体カクテル関節炎発症操作を行い、１週後屠殺して両手関節・足関節の関節炎に関し滑膜増生、軟骨破壊、パンヌス形成を観察し、組織学的格付けを行った。その結果を図４に示した。その結果、ＭＩＦ−ＯＶＡ（ＤＶ８）ワクチン投与マウスはコントロールワクチン投与マウスに比較して抗コラーゲン抗体カクテル投与による関節炎・関節破壊の程度が有意に低い事が明らかとなった。
Histological rating of DNA vaccine for arthritis Balb / c mice (9 mice each) were slaughtered, MIF cDNA control (DV1) vaccine, MIF-OVA (DV8) vaccine was subcutaneously injected 6 times, and anti-collagen antibody cocktail arthritis onset One week later, the mice were sacrificed and synovial hyperplasia, cartilage destruction, and pannus formation were observed for arthritis of both wrist and ankle joints, and histological rating was performed. The results are shown in FIG. As a result, it was clarified that mice treated with the MIF-OVA (DV8) vaccine had significantly lower levels of arthritis and joint destruction due to administration of the anti-collagen antibody cocktail than mice administered with the control vaccine.
本発明により関節リウマチ、潰瘍性大腸炎などに対して有効なＤＮＡワクチンが提供される。具体的には、ＭＩＦ遺伝子を含有するＤＮＡワクチンを医薬組成物として投与することにより、抗体価を増加し、上記疾患の予防または治療を行うことができる。 The present invention provides a DNA vaccine effective against rheumatoid arthritis, ulcerative colitis and the like. Specifically, by administering a DNA vaccine containing the MIF gene as a pharmaceutical composition, the antibody titer can be increased and the above diseases can be prevented or treated.
［配列番号：４］ 破傷風毒素Ｐ３０のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：５］ 破傷風毒素Ｐ３０の塩基配列を示す。
［配列番号：６］ プライマーＢ−１Ｕの塩基配列を示す。
［配列番号：７］ プライマーＥ−９３Ｌの塩基配列を示す。
［配列番号：８］ プライマーＥ−１１２Ｕの塩基配列を示す。
［配列番号：９］ プライマーＸ−３４８Ｌの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］ プライマーＥ−ＴｘＵの塩基配列を示す。
［配列番号：１１］ プライマーＥ−ＴｘＬの塩基配列を示す。
［配列番号：１２］ ＴＮＦの分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１３］ ＴＮＦの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を示す。
［配列番号：１４］ プライマーＢ−ＴｓＵの塩基配列を示す。
［配列番号：１５］ プライマーｓｏｅ−ＴｓＬの塩基配列を示す。
［配列番号：１６］ プライマーｓｏｅ−Ｔｓ−ＭＩＦＵの塩基配列を示す。
［配列番号：１７］ ＩＬ−５の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１８］ ＩＬ−５の分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を示す。
［配列番号：１９］ プライマー５ｓＵの塩基配列を示す。
［配列番号：２０］ プライマー５ｓＬの塩基配列を示す。
［配列番号：２１］ プライマーＢ−５ｓＵの塩基配列を示す。
［配列番号：２２］ プライマーｓｏｅ−５ｓＬの塩基配列を示す。
［配列番号：２３］ プライマーｓｏｅ−５ｓ−ＭＩＦＵの塩基配列を示す。
［配列番号：２４］ ＨＥＬペプチド（８１−９５）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２５］ ＨＥＬペプチド（８１−９５）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２６］ プライマーＥ−ＨＬＵの塩基配列を示す。
［配列番号：２７］ プライマーＥ−ＨＬＬの塩基配列を示す。
［配列番号：２８］ ＯＶＡペプチド（３２５−３３６）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２９］ ＯＶＡペプチド（３２５−３３６）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３０］ プライマーＥ−ＯＶＵの塩基配列を示す。
［配列番号：３１］ プライマーＥ−ＯＶＬの塩基配列を示す。
[SEQ ID NO: 4] This shows the amino acid sequence of tetanus toxin P30.
[SEQ ID NO: 5] This shows the base sequence of tetanus toxin P30.
[SEQ ID NO: 6] This shows the base sequence of primer B-1U.
[SEQ ID NO: 7] This shows the base sequence of primer E-93L.
[SEQ ID NO: 8] This shows the base sequence of primer E-112U.
[SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of primer X-348L.
[SEQ ID NO: 10] This shows the base sequence of primer E-TxU.
[SEQ ID NO: 11] This shows the base sequence of primer E-TxL.
[SEQ ID NO: 12] This shows the amino acid sequence of TNF secretion signal peptide.
[SEQ ID NO: 13] This shows the base sequence encoding TNF secretory signal peptide.
[SEQ ID NO: 14] This shows the base sequence of primer B-TsU.
[SEQ ID NO: 15] This shows the base sequence of primer soe-TsL.
[SEQ ID NO: 16] This shows the base sequence of primer soe-Ts-MIFU.
[SEQ ID NO: 17] This shows the amino acid sequence of IL-5 secretion signal peptide.
[SEQ ID NO: 18] This shows the base sequence encoding IL-5 secretion signal peptide.
[SEQ ID NO: 19] This shows the base sequence of primer 5sU.
[SEQ ID NO: 20] This shows the base sequence of primer 5sL.
[SEQ ID NO: 21] This shows the base sequence of primer B-5sU.
[SEQ ID NO: 22] This shows the base sequence of primer soe-5sL.
[SEQ ID NO: 23] This shows the base sequence of primer soe-5s-MIFU.
[SEQ ID NO: 24] This shows the amino acid sequence of HEL peptide (81-95).
[SEQ ID NO: 25] This shows the base sequence of DNA encoding HEL peptide (81-95).
[SEQ ID NO: 26] This shows the base sequence of primer E-HLU.
[SEQ ID NO: 27] This shows the base sequence of primer E-HLL.
[SEQ ID NO: 28] This shows the amino acid sequence of OVA peptide (325-336).
[SEQ ID NO: 29] This shows the base sequence of DNA encoding OVA peptide (325-336).
[SEQ ID NO: 30] This shows the base sequence of primer E-OVU.
[SEQ ID NO: 31] This shows the base sequence of primer E-OVL.
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