JP4751387B2 - Methods for detecting molecular surface interactions - Google Patents
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Description
本発明は、固体支持体表面における分子相互作用の検出に関し、より特定すれば、体液のような複雑な媒体に基づく試料中に存在するアナライトと、該アナライトに対する固定化された結合剤との間の相互作用を測定するための方法に関する。 The present invention relates to the detection of molecular interactions at the surface of a solid support, and more particularly, an analyte present in a sample based on a complex medium such as a body fluid, and an immobilized binder to the analyte, Relates to a method for measuring the interaction between.
分子間の相互作用を特徴づけるために、とりわけ生体分子の検出および相互作用を目的とするアッセイとの関連で各種の分析技術が使用されている。例えば、抗体−抗原相互作用は多くの、生物学、免疫学および薬理学を含む分野で基本的な重要性を有している。この関連で多くの分析技術が、抗体のような「リガンド(ligand)」の固体支持体への結合とそれに続く該リガンドと抗原のような「アナライト(analyte)」との接触を包含している。リガンドとアナライトとの接触に続いて、リガンドがアナライトに結合する能力のような相互作用の指標であるいくつかの特性が測定される。相互作用の測定の後、遊離のリガンドを「再生し(regenerate)」、それによりリガンド表面を次の分析測定のために再利用できるようにするためにリガンド−アナライト対の解離を可能なようにすることがしばしば望まれている。 Various analytical techniques have been used to characterize the interactions between molecules, particularly in the context of assays aimed at detecting and interacting with biomolecules. For example, antibody-antigen interactions have fundamental importance in many fields, including biology, immunology and pharmacology. Many analytical techniques in this regard include the binding of a “ligand” such as an antibody to a solid support followed by contacting the ligand with an “analyte” such as an antigen. Yes. Following contact of the ligand with the analyte, several properties that are indicative of the interaction, such as the ability of the ligand to bind to the analyte, are measured. After measurement of the interaction, the free ligand is “regenerated” so that the ligand-analyte pair can be dissociated to allow the ligand surface to be reused for subsequent analytical measurements. Is often desired.
リアルタイムでそうした分子の相互作用をモニターできる分析用センサーシステムはますます関心を集めている。これらのシステムは多くの場合光学的バイオセンサーに基礎をおいており、通常相互作用分析センサーまたは生体特異的(biospecific)相互作用分析センサーと呼ばれている。そうしたバイオセンサーシステムの代表的なものが、ビアコア社(Biacore AB)(ウプサラ、スエーデン)から販売されているビアコア(R)(Biacore(R))計測機器であり、これは試料中の分子と感知表面(sensing surface)上に固定化した分子構造との間の相互作用を検出するために、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いている。ビアコア(R)システムを用いて、標識化を使用せずにリアルタイムで試料中の特定の分子の存在および濃度だけでなく、分子相互作用についての追加の相互作用パラメータ、例えば、会合速度定数および解離速度定数を測定することができる。 Analytical sensor systems that can monitor such molecular interactions in real time are of increasing interest. These systems are often based on optical biosensors and are usually referred to as interaction analysis sensors or biospecific interaction analysis sensors. Sensing Representative of such biosensor system, Biacore (Biacore AB) (Uppsala, Sweden) Biacore sold by (R) (Biacore (R) ) is a measuring device, which is a molecule in a sample Surface plasmon resonance (SPR) is used to detect interactions between molecular structures immobilized on a sensing surface. Using the Biacore (R) system, the presence and concentration of specific molecules in the sample in real time without using labeling, as well as additional interaction parameters for molecular interactions such as association rate constants and dissociation The rate constant can be measured.
しかしアナライトが例えば血漿のような複雑な媒体中に存在する場合は、該測定は、通常血漿中に存在しそして固相表面と相互作用し非特異的な結合を生じさせるアナライト以外の分子種によって著しく妨害されるだろう。このことは、特に低分子量のアナライトに対して通常解釈の難しい測定結果をもたらす。 However, if the analyte is present in a complex medium such as plasma, the measurement is usually a molecule other than the analyte that is present in the plasma and interacts with the solid surface to produce non-specific binding. Will be significantly disturbed by species. This leads to measurement results that are usually difficult to interpret, especially for low molecular weight analytes.
本発明の目的は、アナライトが複雑な媒体中に存在する場合の、アナライトと固相表面との相互作用を検出するに際しての上記の課題を解決することである。 An object of the present invention is to solve the above-described problems in detecting the interaction between an analyte and a solid phase surface when the analyte is present in a complex medium.
上記およびその他の目的および利点は、固体支持体表面と相互作用できる1種またはそれ以上の分子種を含有する複雑な媒体中にアナライトが存在する場合に、固体支持体表面に固定化された結合剤またはリガンドとアナライトとの間の相互作用を測定するための新規な方法により提供される。本発明によれば、モニターされる固体支持体表面が最初にアナライトを含まない複雑な媒体と接触させられ、その後直ちにアナライトを含有する複雑な媒体と接触させられる場合に、固体支持体表面での非特異性結合の測定結果への影響を少なくとも実質的に減少させることができる。複雑な媒体と固体支持体との全ての非特異的な結合は、それによりアナライト含有媒体と表面とが接触する前に少なくとも実質的な程度にまで発生し、そして次に表面で検出された追加の全ての変化は、それゆえに大体においてアナライトとの結合に帰することができる。 These and other objectives and advantages have been immobilized on a solid support surface when the analyte is present in a complex medium containing one or more molecular species that can interact with the solid support surface. Provided by a novel method for measuring the interaction between a binding agent or ligand and an analyte. In accordance with the present invention, a solid support surface when the monitored solid support surface is first contacted with a complex medium containing no analyte and then immediately contacted with a complex medium containing the analyte. The influence of nonspecific binding on the measurement results can be at least substantially reduced. All non-specific binding of the complex medium to the solid support has thereby occurred to at least a substantial extent before contact between the analyte-containing medium and the surface and was then detected at the surface All additional changes can therefore largely be attributed to binding with the analyte.
したがって一つの局面で本発明は、アナライトを含有する液体試料と固体支持体表面とを接触させ、そして該表面での結合事象を検出することによってアナライトと固体支持体表面に固定化された結合剤との相互作用を測定する方法を提供し、ここで試料は、固体支持体表面と相互作用できるアナライト以外の少なくとも1種の分子種を含有する複雑な媒体に基づいており、該方法はアナライトを含有する複雑な媒体と固体支持体表面とを接触させる前に、アナライトを含まない試料媒体と該表面とを接触させることを含むことによって特徴付けられる。 Thus, in one aspect, the present invention is immobilized on an analyte and solid support surface by contacting a liquid sample containing the analyte with the solid support surface and detecting a binding event at the surface. A method for measuring an interaction with a binding agent is provided, wherein the sample is based on a complex medium containing at least one molecular species other than an analyte capable of interacting with a solid support surface, the method Is characterized by comprising contacting the surface with a sample medium that does not contain the analyte before contacting the complex medium containing the analyte with the solid support surface.
他の局面で、本発明は薬物の血漿との結合性向を測定する方法を提供するもので、この方法は、(i)血漿を含有する複雑な媒体中、および(ii)複雑でない媒体中に存在する薬物と該薬物に対する固定化結合剤との結合を測定し、そして血漿含有媒体中の薬物の結合と複雑でない媒体中の薬物の結合とを比較することを含み、ここで血漿含有媒体中の薬物の結合の測定は、上記の第一の方法の局面に従って行われる。 In another aspect, the present invention provides a method for measuring the propensity of a drug to bind to plasma, comprising: (i) in a complex medium containing plasma, and (ii) in a non-complex medium. Measuring the binding of the drug present to the immobilized binding agent to the drug and comparing the binding of the drug in the plasma-containing medium to the binding of the drug in an uncomplicated medium, wherein Measurement of drug binding is performed according to the first method aspect described above.
さらに他の局面では、本発明は分子相互作用を研究するための分析システムを提供し、これは該方法の段階を実施するためのプログラムコード手段を含むコンピューター処理手段を包含する。 In yet another aspect, the present invention provides an analytical system for studying molecular interactions, which includes computer processing means including program code means for performing the steps of the method.
なお他の局面では、本発明は、この方法の段階を実施するための、コンピューター読み取り可能な媒体上に保存された、または電気的もしくは光学的シグナル上で実行される、プログラムコード手段を含むコンピュータープログラム製品を提供する。 In yet another aspect, the present invention relates to a computer comprising program code means stored on a computer readable medium or executed on an electrical or optical signal for performing the steps of the method. Providing program products.
本発明のこれらのおよび他の局面は、添付の図面および続く詳細な説明を参照することで明確になるであろう。 These and other aspects of the invention will be apparent upon reference to the attached drawings and the following detailed description.
前述のように、本発明は、固体支持体表面での結合事象の検出に関連するアッセイまたは研究において複雑な試料媒体の非アナライト成分の非特異的な影響を減少させまたは排除する方法に関している。表面結合相互作用は多くの異なった相互作用分析技術によって特徴付けることができる。最近になって、標識なしのバイオセンサー技術がそのような相互作用分析の強力な道具となってきた。商業的に利用可能なバイオセンサーには、表面プラズモン共鳴(SPR)を基にしリアルタイムでの表面相互作用のモニターを可能にする前述のビアコア(R)システム装置が含まれる。 As mentioned above, the present invention relates to a method for reducing or eliminating the non-specific effects of non-analyte components of complex sample media in assays or studies relating to the detection of binding events on a solid support surface. . Surface binding interactions can be characterized by many different interaction analysis techniques. Recently, label-free biosensor technology has become a powerful tool for such interaction analysis. Commercially available biosensors include the aforementioned Biacore (R) system device that allows monitoring of surface interactions in real time based on surface plasmon resonance (SPR).
SPRの現象は周知であり、異なった屈折率の2つの媒体間の界面における特定の条件下で光が反射するときにSPRが生起し、そして該界面が金属フィルム、典型的には銀または金により被覆されていると言うだけで十分だろう。ビアコア(R)装置ではこの媒体は試料および、微小流体(microfluidic)フローシステムにより試料と接触するセンサーチップのガラスである。この金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。SPRは特定の反射角度で反射光強度の減少を生じさせる。この最小反射光強度の角度は、反射光から反対側(ビアコア(R)システムでは試料側)の表面に近接した屈折率によって変化する。 The phenomenon of SPR is well known, SPR occurs when light is reflected under certain conditions at the interface between two media of different refractive indices, and the interface is a metal film, typically silver or gold It would be enough to say that it is covered by. Biacore (R) This medium is device sample and a glass of a sensor chip in contact with the sample by microfluidic (microfluidic) flow system. This metal film is a thin layer of gold on the chip surface. SPR causes a decrease in reflected light intensity at a specific reflection angle. The angle of the minimum reflected light intensity varies depending on the refractive index close to the surface on the opposite side from the reflected light (the sample side in the via core (R) system).
ビアコア(R)システムの模式図を図1で示した。センサーチップ1は、フローチャネル5を介してアナライト4(例えば抗原)を伴う試料流に曝露された、捕捉分子(リガンド)3、例えば抗体を支持している、金フィルム2を有している。光源7からの単色性p−偏光6は、プリズム8によりこの光が全反射されるガラス/金属界面9にカップルされる。反射光線10の強度は光学検出ユニット11により検出される。
A schematic diagram of the Biacore (R) system is shown in FIG. The sensor chip 1 has a gold film 2 supporting a capture molecule (ligand) 3, eg an antibody, exposed to a sample stream with an analyte 4 (eg antigen) via a
試料中の分子がセンサーチップ表面上の捕捉分子に結合するとき、濃度、そしてそれゆえに表面の変化とSPRの応答の屈折率の変化が検出される。相互作用の経過の間の時間に対する応答のプロッテングにより、該相互作用の進行の定量的測定が提供される。そうしたプロットは通常センサーグラムと呼ばれる。ビアコア(R)システムでは、SPR応答値は共鳴単位(RU)で表される。1RUは最小反射光強度の角度で0.00001°の変化を表し、多くのタンパク質に関してセンサー表面上で約1pg/mm2の濃度の変化におおよそ等しい。アナライトを含有する試料がセンサー表面と接触するとき、センサー表面に結合している捕捉分子(リガンド)は、「結合(association)」と呼ばれる段階で、アナライトと相互作用する。この段階は試料が最初にセンサー表面と接触するようになったとき、センサーグラム上ではRUの増加として示される。反対に、「解離(dissociation)」は試料流が、例えば緩衝液流により置換されたときに通常生じる。この段階はアナライトが表面結合リガンドから解離したときに、センサーグラム上ではゆっくりとしたRUの降下として示される。 As molecules in the sample bind to the capture molecules on the sensor chip surface, the concentration, and hence the change in surface and refractive index of the SPR response, is detected. Plotting the response to time during the course of the interaction provides a quantitative measure of the progress of the interaction. Such a plot is usually called a sensorgram. In the Biacore (R) system, the SPR response value is expressed in resonance units (RU). 1 RU represents a change of 0.00001 ° in angle of minimum reflected light intensity and is roughly equivalent to a concentration change of about 1 pg / mm 2 on the sensor surface for many proteins. When a sample containing an analyte comes into contact with the sensor surface, capture molecules (ligands) bound to the sensor surface interact with the analyte in a stage called “association”. This stage is shown as an increase in RU on the sensorgram when the sample first comes into contact with the sensor surface. Conversely, “dissociation” usually occurs when the sample stream is displaced, for example, by a buffer stream. This stage is shown as a slow RU drop on the sensorgram when the analyte dissociates from the surface-bound ligand.
センサーチップ表面での可逆的相互作用の代表的なセンサーグラム(結合曲線)を図2に示しており、感知表面は試料中のアナライトと相互作用する固定化捕捉分子(例えば抗体)を保持している。縦軸(y−軸)は応答(ここでは共鳴単位RUで)を示し、および横軸(x−軸)は時間(ここでは秒sで)を示している。最初に緩衝液を感知表面上に通してセンサーグラム中でベースライン応答Aを与える。試料注入の間アナライトの結合によるシグナルの増加が観察される。この結合曲線の部分Bは通常「結合相」と呼ばれる。結局は共鳴シグナルがCで平坦になる定常状態条件に達する。試料注入の終了時に試料が緩衝液の連続流で置換されて、そしてシグナルの減少が表面からのアナライトの解離または放出を反映する。この結合曲線の部分Dは、通常、「解離相」と呼ばれる。この結合/解離曲線の形態は、相互作用の反応速度(kinetics)に関する価値ある情報を提供し、そして共鳴シグナルの高さは表面濃度を表す(すなわち、相互作用から来る応答が表面上の質量濃度の変化に関連する)。 A representative sensorgram (binding curve) of the reversible interaction at the sensor chip surface is shown in FIG. 2, where the sensing surface holds immobilized capture molecules (eg, antibodies) that interact with the analyte in the sample. ing. The vertical axis (y-axis) shows the response (here in resonance units RU) and the horizontal axis (x-axis) shows the time (here in seconds s). Initially, a buffer is passed over the sensing surface to provide a baseline response A in the sensorgram. An increase in signal due to analyte binding is observed during sample injection. Part B of this binding curve is usually referred to as the “binding phase”. Eventually a steady state condition is reached where the resonance signal is flat at C. At the end of sample injection, the sample is replaced with a continuous flow of buffer and the decrease in signal reflects the dissociation or release of the analyte from the surface. This portion D of the binding curve is usually called the “dissociation phase”. The form of this binding / dissociation curve provides valuable information about the kinetics of the interaction and the height of the resonance signal represents the surface concentration (ie, the response resulting from the interaction is the mass concentration on the surface Related to changes).
アナライトAと表面結合(固定化)捕捉分子Bとの間の可逆的反応(質量移動は制限されていない)を仮定する(一次反応速度):
アナライトを注入する間のAの表面濃度の変化率は次の等式である:
解離速度は次のように表せる:
親和性は結合定数KA=kass/kdissまたは解離定数KD=kdiss/kassで表す。 Affinity is expressed by the association constant K A = k ass / k diss or the dissociation constant K D = k diss / k ass .
分子相互作用の反応速度の測定のためのより詳しい説明は、例えばKarlsson, R. およびFaelt, A. (1997) Journal of Immunological Methods, 200, 121-133 を参照できる。 For a more detailed description for measuring the kinetics of molecular interactions, see, for example, Karlsson, R. and Faelt, A. (1997) Journal of Immunological Methods, 200, 121-133.
ところで、試料がアナライトの他にセンサー表面と相互作用する可能性のある1種またはそれ以上の分子種をも含む「複雑な媒体(complex medium)」である場合は、そうした分子種の存在により生じる非特異的な結合が該表面での測定を著しく妨害し、特に目的のアナライトが低分子量化合物(通常、分子量が約100〜約1,000、典型的には約500〜約800、である有機化合物を意味し、時には「小分子」とも呼ばれる)である場合に、解釈の難しい結合曲線を与える可能性があることは容易にわかる。 By the way, if the sample is a “complex medium” that includes one or more molecular species that may interact with the sensor surface in addition to the analyte, the presence of such molecular species The resulting non-specific binding significantly interferes with the measurement on the surface, especially when the analyte of interest is a low molecular weight compound (usually an organic having a molecular weight of about 100 to about 1,000, typically about 500 to about 800) It is easy to see that when it is a compound (sometimes called a “small molecule”), it can give binding curves that are difficult to interpret.
本発明によれば、センサー表面上でアナライトが複雑な媒体中に存在する場合に、アナライト含有試料媒体と該表面を接触させる前にアナライトを含まない複雑な試料媒体と接触させれば、たとえ低分子量分子であっても、該アナライトに対する固定化結合剤への結合が成功裡に測定できることが見出された。このように実施することによって、センサー表面に対する非特異的な結合は該表面がアナライトを含まない複雑な媒体と接触したときに主に発生する。次いで試料をセンサー表面と接触させた場合には、この非特異的な結合プロセスは少なくとも実質的に減少しそして試料測定は少なくともずっと少ない程度までしか妨害されないだろうし、同時にそのことは以下の実施例で実証されるだろう。 According to the present invention, when the analyte is present in a complex medium on the sensor surface, the analyte-containing sample medium is brought into contact with the complex sample medium not containing the analyte before contacting the surface. It has been found that the binding of the analyte to the immobilized binder can be measured successfully, even for low molecular weight molecules. By doing so, non-specific binding to the sensor surface occurs primarily when the surface comes into contact with a complex medium that does not contain an analyte. If the sample is then contacted with the sensor surface, this non-specific binding process will be at least substantially reduced and sample measurement will be hindered at least to a much lesser extent, at the same time as the following example Will be demonstrated.
好ましくは、センサー表面はアナライト含有試料媒体と接触した後、再度アナライトを含まない複雑な媒体と接触させられ、該アナライトに対する固定化結合剤からの該アナライトの解離が、結合剤への結合と同じ環境下で生じるようにする。したがって、上記のビアコア(R)システムを参照して、本発明の液体注入順序は、先行技術の方法である<緩衝液>、<アナライト含有試料媒体>、<緩衝液>とは異なって、<アナライトを含まない試料媒体>、<アナライト含有試料媒体>、<アナライトを含まない試料媒体>であるだろう。 Preferably, the sensor surface is contacted with the analyte-containing sample medium and then again contacted with a complex medium that does not contain the analyte, and the dissociation of the analyte from the immobilized binding agent to the analyte is reduced to the binding agent. Occur in the same environment as the combination of. Therefore, referring to the above Biacore (R) system, the liquid injection sequence of the present invention is different from the prior art methods <buffer solution>, <analyte-containing sample medium>, <buffer solution><Analyte-free sample medium>, <Analyte-containing sample medium>, <Analyte-free sample medium>.
試料が基づく複雑な媒体は目的とする1種またはそれ以上のアナライトを含有するような多数の媒体から選択することができる。複雑な媒体の例には脳脊髄液、唾液、母乳、尿、胆汁、血清、血漿、涙液、およびホモジナイズした生検試料のような体液、ならびに細胞培養培地、細胞溶解物、植物粗抽出物、抽出または溶解された食料品、液体食料品、例えば飲料(ミルク、果汁、ビール等)が包含される。 The complex media on which the sample is based can be selected from a number of media that contain one or more analytes of interest. Examples of complex media include body fluids such as cerebrospinal fluid, saliva, breast milk, urine, bile, serum, plasma, tears, and homogenized biopsy samples, and cell culture media, cell lysates, crude plant extracts , Extracted or dissolved foodstuffs, liquid foodstuffs such as beverages (milk, fruit juice, beer, etc.).
分析するべき特定の複雑な媒体に応じて、試験試料は採取した原試料であっても、または適切な希釈剤による原試料の希釈液であってもいい。一般に試料中の複雑な媒体の含量は約1〜約100%(v/v)、通常は約10〜約100%(v/v)であり、特に約30〜約100%(v/v)、例えば約30〜約50%(v/v)である Depending on the particular complex medium to be analyzed, the test sample may be a collected original sample or a dilution of the original sample with a suitable diluent. In general, the content of complex media in the sample is about 1 to about 100% (v / v), usually about 10 to about 100% (v / v), especially about 30 to about 100% (v / v). For example, about 30 to about 50% (v / v)
例えば複雑な試料媒体がヒト血漿または血清に基づく場合は、アナライト含有媒体は薬物を投与した後の患者から採取された血漿または血清に基づくことができ、そして次にアナライトを含まない試料媒体は薬物を投与する前の同じ患者から採取された血漿または血清に基づくことができる。 For example, if the complex sample medium is based on human plasma or serum, the analyte-containing medium can be based on plasma or serum collected from the patient after administering the drug, and then the sample medium that does not contain the analyte Can be based on plasma or serum collected from the same patient prior to drug administration.
したがって本発明の方法は、複雑な媒体中のアナライトと該アナライトに対する固定化結合剤との間の分子相互作用に関する反応速度およびアフィニティー定数(結合定数、解離定数、結合速度定数および解離速度定数が含まれる)の測定に使用できる。もちろん、本発明の方法はまた複雑な媒体中の1種またはそれ以上のアナライトの濃度の測定のためにも使用できる。結合剤支持表面とアナライトを含有する複雑な媒体との接触の前に、および場合によっては後で、該表面とアナライトを含まない複雑な媒体とを接触させることとは別に、反応速度およびアフィニティー定数と同時にアナライト濃度の測定もそれ自体を公知の方法で実施することができる。 Thus, the method of the present invention provides a reaction rate and affinity constant (binding constant, dissociation constant, binding rate constant and dissociation rate constant) for the molecular interaction between an analyte in a complex medium and an immobilized binder for the analyte. Can be used for measurement. Of course, the method of the present invention can also be used to determine the concentration of one or more analytes in a complex medium. Apart from contacting the binder-supporting surface with the complex medium containing the analyte, and possibly after, contacting the surface with the complex medium without the analyte, the reaction rate and Simultaneously with the affinity constant, the analyte concentration can be measured by a known method.
本発明の変法において、該方法は各種の薬物の血漿結合性向(例えば、アフィニティー)を比較するために使用される。より特定すれば、薬物の固定化受容体に対する結合が特に上記の結合曲線の形態において、固定化受容体を有する表面と(i)緩衝液に溶解した薬物、および(ii)血漿を加えた緩衝液に溶解した薬物とを接触させることによって測定され、そして次に結合レベル、または好ましくは結合曲線が比較される。薬物が血漿に結合する場合、それにより得られた血漿存在下での固定化受容体に対する結合は、緩衝液中にのみ存在する薬物と比較して実質的に減少しているだろう。一つの薬物濃度での測定が多くの場合に十分であろう。 In a variation of the invention, the method is used to compare the plasma binding propensity (eg, affinity) of various drugs. More specifically, the binding of the drug to the immobilized receptor, particularly in the form of the binding curve described above, (i) a buffer with the immobilized receptor, (i) a drug dissolved in a buffer, and (ii) a buffer plus plasma. It is measured by contacting the drug dissolved in the liquid and then the binding level, or preferably the binding curve, is compared. If the drug binds to plasma, the resulting binding to the immobilized receptor in the presence of plasma will be substantially reduced compared to the drug present only in the buffer. Measurements at one drug concentration will often be sufficient.
上記の方法がビアコア(R)システムのいくつかの局面で実施される一方、本発明は、他の多くの固体支持体表面での結合相互作用を検出するための技術、例えば、放射能標識、発色団、蛍光団、散乱光のためのマーカー、電気化学的活性マーカー(例えば、電位差測定法に基づく電界効果トランジスタ)、電場活性マーカー(電気伝導放出)(electro-stimulated emission)、磁気活性マーカー、熱活性マーカー、化学発光部分または遷移金属のような標識に依存する技術、ならびに、いわゆる無標識検出システムと関連して使用できることが理解される。しかしながら、特に化学センサーまたはバイオセンサー技術を基にする場合には、リアルタイム検出システムが好ましい。 While the above method is implemented in several aspects of the Biacore (R) system, the present invention provides techniques for detecting binding interactions on many other solid support surfaces, such as radiolabels, Chromophore, fluorophore, marker for scattered light, electrochemical activity marker (eg, field effect transistor based on potentiometry), electro-stimulated emission, magnetic activity marker, It will be appreciated that it can be used in connection with techniques that rely on labels such as thermoactive markers, chemiluminescent moieties or transition metals, as well as so-called label-free detection systems. However, real-time detection systems are preferred, especially when based on chemical sensor or biosensor technology.
バイオセンサーは、固体の物理化学的トランスデューサと直接に結合するか、またはトランスデューサと結合している可動性担体ビーズ/粒子による分子認識のための構成成分(例えば固定化抗体を伴った層)を用いる装置として、広義に定義されている。そうしたセンサーは典型的には無標識技術、例えば、質量変化、屈折率または固定化層の厚さの検出に基づいているが、またある種の標識化に依存するセンサーも存在する。典型的なセンサー検出技術には、それには限定されないが、質量検出方法、例えば、光学的、熱−光学的および圧電的または音響波的(例えば、表面弾性波(SAW)および水晶振動子微量平衡(QCM)を含む)方法;ならびに、電気化学方法、例えば、電位差測定、電気伝導度測定、電流測定およびキャパシタンス/インピーダンス方法が包含される。光学的測定方法に関しての代表的な方法は、質量表面濃度を検出する方法、例えば、外部および内部反射方法の両方を含む反射光学方法であり、これは角度、波長、偏光または位相分解(phase resolved)であってよく、例えばエバネセント波(ellipsometry wave)偏光解析法およびエバネセント波分光法(EWS、または内部反射分光法)であり、これらはいずれも表面プラズモン共鳴(SPR)を介したエバネセント場の増強を含めることができ、ブルースター(Brewster)屈折角計測法、臨界屈折角計測法、漏れ全反射(FTR)、散乱増強標識を含むことができる散乱全内部反射(STIR)、光導波路センサー;外部反射イメージング、エバネセント波を基にしたイメージング、例えば、臨界角度分解イネージング、ブルースター角度分解イメージング、SPR角度分解イメージング等が挙げられる。さらに、測光的およびイメージング/顕微鏡法「それ自体」または反射方法と組み合わせた、例えば表面増感ラマン分光法(SERS)、表面増感共鳴ラマン分光法(SERRS)、エバネセント波蛍光発光法(TIRF)および燐光発光法、ならびに導波路干渉計、導波路漏れモード分光法、反射干渉分光法(RIfS)、透過型干渉法、ホログラフィー分光法、および原子間力顕微鏡法(AFR)を挙げることができる。 Biosensors either directly couple to solid physicochemical transducers or use components for molecular recognition by mobile carrier beads / particles coupled to the transducer (eg, layers with immobilized antibodies) As a device, it is defined in a broad sense. Such sensors are typically based on label-free techniques, such as detection of mass change, refractive index or immobilization layer thickness, but there are also sensors that rely on some type of labeling. Typical sensor detection techniques include, but are not limited to, mass detection methods such as optical, thermo-optical and piezoelectric or acoustic (eg surface acoustic waves (SAW) and quartz crystal microbalances). (Including QCM); and electrochemical methods such as potentiometry, electrical conductivity measurement, current measurement and capacitance / impedance methods. Typical methods for optical measurement methods are those that detect mass surface concentration, eg, reflective optical methods that include both external and internal reflection methods, which include angle, wavelength, polarization, or phase resolved. Evanescent wave ellipsometry and evanescent wave spectroscopy (EWS, or internal reflection spectroscopy), both of which enhance the evanescent field via surface plasmon resonance (SPR) Brewster refraction angle measurement method, critical refraction angle measurement method, leaky total reflection (FTR), scattering total internal reflection (STIR), which can include scattering enhancement labels, optical waveguide sensor; external Reflection imaging, imaging based on evanescent waves, eg critical angle-resolved averaging, Brewster angle-resolved imaging, SPR angle Solution imaging etc. are mentioned. In addition, in combination with photometric and imaging / microscopy “self” or reflection methods, eg surface-sensitized Raman spectroscopy (SERS), surface-sensitized resonance Raman spectroscopy (SERRS), evanescent wave fluorescence (TIRF) And phosphorescence emission methods, as well as waveguide interferometers, waveguide leakage mode spectroscopy, reflection interference spectroscopy (RIfS), transmission interferometry, holography spectroscopy, and atomic force microscopy (AFR).
現在市販されているものは、特にSPRを基にしたバイセンサーシステムである。そうしたSPRバイオセンサーの例には上記のビアコア(R)機器が含まれる。ビアコア(R)機器の技術的側面およびSPRの現象に関する詳細な議論は、米国特許5,313,264で見出すことができるだろう。バイオセンサー感知表面のためのマトリクス被覆に関するより詳細な情報は、例えば、米国特許5,242,828および5,436,161で与えられる。さらに、ビアコア(R)機器に関連するバイオセンサーチップの技術的側面の詳細な議論は米国特許5,492,840で見出される。上記の米国特許の全開示は参照により本願に組み入れられる。 What is currently on the market is a bisensor system, especially based on SPR. Examples of so the SPR biosensor includes the above Biacore (R) instrument. Biacore (R) A detailed behavior of the technical aspects and SPR instruments discussion will be found in U.S. Patent 5,313,264. More detailed information regarding matrix coatings for biosensor sensing surfaces is given, for example, in US Pat. Nos. 5,242,828 and 5,436,161. Furthermore, detailed discussion of the technical aspects of the biosensor chips associated with Biacore (R) instrument is found in U.S. Patent 5,492,840. The entire disclosures of the above US patents are incorporated herein by reference.
本発明の方法をフローセル中、例えば上記のビアコア(R)機器で使用されているタイプで実施することが多くの場合便利だろう。本発明で使用できる他のフローセルもまた当業者には周知であり、本願では記載する必要はない。 In a flow cell the method of the present invention, for example, it is often would conveniently be carried out in type used in the above Biacore (R) instrument. Other flow cells that can be used in the present invention are also well known to those skilled in the art and need not be described herein.
本願で用いられる「固体支持体」という表現は広く解釈されるべきであり、そして1種またはそれ以上の結合剤を固定化でき、そしてそれらの分子相互作用が選択された特定の検出システムで検出できるあらゆる固体(柔軟なまたは硬い)基質を意味している。基質は生物学的、非生物学的、有機、無機またはそれらの混合物であることができ、そして円盤状、球状、円状等のあらゆる都合の良い形状を有する、粒子、紐、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、切片、フィルム、プレート、スライド等の形態をとることができる。基質表面はあらゆる二次元的構造を有することができ、そして例えば段状、稜線状、こぶ状、段丘状等が含まれ、材料の層の表面は基質の残余の表面とは違ってもいい。 As used herein, the expression “solid support” should be interpreted broadly and one or more binding agents can be immobilized and their molecular interactions detected by a selected detection system. It means any solid (soft or hard) substrate that can be made. The substrate can be biological, non-biological, organic, inorganic or mixtures thereof and has any convenient shape such as disc, sphere, circle, particle, string, precipitate, gel , Sheets, tubes, spheres, containers, capillaries, pads, sections, films, plates, slides and the like. The substrate surface can have any two-dimensional structure and includes, for example, steps, ridges, bumps, terraces, etc., and the surface of the layer of material may be different from the remaining surface of the substrate.
以下の実施例において、本発明の種々の局面を説明のためにより特定して非限定的に開示する。 In the following examples, various aspects of the present invention are disclosed more specifically and non-limitingly for purposes of illustration.
この実施例は、唾液含有緩衝液中のヨーフェノキシ酸(α−エチル−3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨードヒドロ−桂皮酸)と固定化ヒト血清アルブミン(HSA)との相互作用を測定するための、本発明方法の使用を説明するものである。ヨーフェノキシ酸はHASと結合するがIgGとは結合しないことが知られており、したがって参照として使用される。唾液成分はHASとIgGの両方に非特異的に結合する。 This example demonstrates the interaction between iophenoxy acid (α-ethyl-3-hydroxy-2,4,6-triiodohydro-cinnamic acid) and immobilized human serum albumin (HSA) in a saliva-containing buffer. 1 illustrates the use of the method of the invention to measure. Iofenoxy acid is known to bind HAS but not IgG and is therefore used as a reference. Salivary components bind nonspecifically to both HAS and IgG.
計測機器
ビアコア(R)3000機器(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)を用いた。この機器は金表面での表面プラズモン共鳴(SPR)検出に基づいており、試料および移動用緩衝液を4つの個別に検出されるフローセル(Fc1〜Fc4と表示された)を通して1つずつまたは連続して通過させるための微小流体(micro-fluidic)システムを用いている。センサーチップは、共有結合したカルボキシメチル修飾デキストラン重合体ハイドロゲルを伴う金被覆表面を有するシリーズCM5認定等級(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)を用いた。この機器からの出力は、検出器の応答(「共鳴単位」、RU、で測定された)を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。1000 RUの増加は、センサー表面上での約1ng/mm2の質量増加に対応する。
Measuring equipment Biacore (R) 3000 equipment (Biacore, Uppsala, Sweden) was used. The instrument is based on surface plasmon resonance (SPR) detection on the gold surface, and samples and transfer buffers are passed one by one or continuously through four individually detected flow cells (labeled Fc1 to Fc4). A micro-fluidic system is used. The sensor chip was a series CM5 certified grade (Biacore, Uppsala, Sweden) having a gold coated surface with a covalently bound carboxymethyl modified dextran polymer hydrogel. The output from this instrument is a “sensorgram” plotting the detector response (measured in “resonance units”, RU) as a function of time. An increase of 1000 RU corresponds to a mass increase of about 1 ng / mm 2 on the sensor surface.
2つの液体、AおよびBを、<液体A><液体B><液体A>の順で注入するプロトタイプのTRIINJECT コマンドを用いた(Andersson, Karl, 等 (1999) PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 37, 494-498)。 A prototype TRIINJECT command was used to inject two liquids, A and B, in the order <liquid A> <liquid B> <liquid A> (Andersson, Karl, et al. (1999) PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 37, 494-498).
センサーチップの固定化
ビアコア(R)3000機器の3個のフローチャネル、Fc1、Fc2およびFc3、を用いた。抗ミオグロビンIgG(自家作成試薬)およびヒト血清アルブミン(HSA)(シグマ・アルドリッチ社、ミズリー、米国)をアミン・カプリングキット(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)を用いて、製造者の指示書に従って固定化した。移動用緩衝液(running buffer)は10 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)であった。センサーチップは以下のように固定化した:
Fc1: ブランク
Fc2: 約8600 RU IgG(参照用)
Fc3: 約11000 RU ヒト血清アルブミン(HSA)
Fc4: 約9000 RU ヒト血清アルブミン(HSA)
Three flow channels, Fc1, Fc2 and Fc3, of the immobilized via core (R) 3000 device of the sensor chip were used. Immobilization of anti-myoglobin IgG (self-made reagent) and human serum albumin (HSA) (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) using amine coupling kit (Biacore, Uppsala, Sweden) according to the manufacturer's instructions did. The running buffer was 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 (Biacore, Uppsala, Sweden). The sensor chip was immobilized as follows:
Fc1: Blank
Fc2: Approximately 8600 RU IgG (for reference)
Fc3: Approximately 11000 RU human serum albumin (HSA)
Fc4: Approximately 9000 RU human serum albumin (HSA)
センサーグラムがFc1からFc4を記録している間、Fc2およびFc3を記録するセンサーグラムのみを分析に使用した。 While sensorgrams recorded Fc1 to Fc4, only sensorgrams recording Fc2 and Fc3 were used for analysis.
唾液のIgGおよびHASに対する非特異的な結合の測定
以下の2つの緩衝液を調製した:
HBS1%:1%DMSO(リーデル・デ・ハーエン(Riedel de Haen)、ゼールツ、ドイツ)を含有するHBS-EP(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)。
HBSS1%:1%DMSO(リーデル・デ・ハーエン)および30%唾液(健常人男性から供与)を含有するHBS-EP(ビアコア社)。
Measurement of non-specific binding of saliva to IgG and HAS The following two buffers were prepared:
HBS-EP (Biacore, Uppsala, Sweden) containing 1% HBS : 1% DMSO (Riedel de Haen, Seels, Germany).
HBSS 1 % : HBS-EP (Biacore) containing 1% DMSO (Ridel de Haen) and 30% saliva (provided by healthy men).
ビアコア(R)3000機器のトリインジェクト(triinject)コマンドを用いて、HBS1%である液体A、およびHBS1%またはHBSS1%のいずれかである液体Bを連続的にフローセル1から3(Fc1、Fc2、Fc3)上に注入した。すなわち、注入順序は、それぞれ<HBS1%> <HBS1%> <HBS1%>、および<HBS1%> <HBSS1%> <HBS1%>であった。準備および洗浄段階の間に用いる、移動用緩衝液はHBS-EP(ビアコア社、ウプサラ、スエーデン)であった。HSA表面(Fc3)について得られたセンサーグラムを図3にオーバーレイ・プロットとして示す。図中でAで示された点線はトリインジェクト中の液体BがHBSS1%である場合のセンサーグラムを示し、そして図中でBで示された実線はトリインジェクト中の液体BがHBS1%である場合のセンサーグラムを示している。 Biacore (R) 3000 using a tri inject (triinject) command device, the liquid A is HBS1%, and HBS1% or HBSS1% of liquid B is either a continuous flow cell 1 3 (Fc1, Fc2 Fc3). That is, the injection order was <HBS 1%><HBS1%><HBS1%> and <HBS 1%><HBSS1%><HBS1%>, respectively. The transfer buffer used during the preparation and washing steps was HBS-EP (Biacore, Uppsala, Sweden). The resulting sensorgram for the HSA surface (Fc3) is shown as an overlay plot in FIG. The dotted line indicated by A in the figure shows the sensorgram when the liquid B in the triinjection is HBSS 1%, and the solid line indicated by B in the figure is the liquid B in the triinjection 1% HBS. The sensorgram is shown for.
図3中の区分10の間、機器は移動用緩衝液で注入の準備をする。区分11および13はトリインジェクト中で、この場合HBS1%中での<液体A>である。区分12は実際の試料の注入で、すなわちトリインジェクト中で<液体B>である。12A はHBSS1% に対応し、そして12BはHBS1%に対応する。区分14は移動用緩衝液による洗浄である。 各区分移動でのセンサーグラムの応答レベル(RU)の急激なシフトは、それぞれの液体のバルクでの屈折率の差異を反映しており、各区分の間の応答レベルの、より緩和な変化は特異的または非特異的な相互作用に対応している。区分12Aと12Bとを比較したとき、区分12Aは12Bより著しくより大きな勾配を有しており、このことは12A中の唾液成分が表面に結合したことを示している。
During
同様な実験で、HBSS1%の試料注入はHBSS1%中に「埋め込まれ」た、すなわち<液体A>および<液体B>は両方ともHBSS1%であった。2つのそうした注入からのセンサーグラムを、図4でオーバーレイ・プロットとして示し(図3中のようにフローセル3からのシグナル)、区分21から23は図3の区分11から13に対応している。図4に示されたように、急速な非特異的成分の結合による区分21中の早期の大きな浮動(drift)が存在する。区分21から22への移動の時点で、この浮動は減少する。特に、区分22の間の浮動は区分12の間のものより低く、このことは表面が試料を注入したときに既に非特異的成分により予備のインキュベーションをされてる場合、シグナルは同程度まで非特異的結合に影響されないことを示している。
In a similar experiment, a sample injection of 1% HBSS was “embedded” in 1% HBSS, ie <Liquid A> and <Liquid B> were both 1% HBSS. Sensorgrams from two such injections are shown as overlay plots in FIG. 4 (signal from
30%唾液中のヨーフェノキシ酸とHASとの相互作用の測定
HBSS1%中での50μM ヨーフェノキシ酸(シグマ・アルドリッチ社、ミズリー、米国)を<液体B>として、およびHBSS1%を<液体A>として用い、そしてトリインジェクト注入をFc1、Fc2およびFc3上でシリーズに行った。検出はFc3(HSA-表面)およびFc2(IgG-表面)で行った。Fc3から得られたセンサーグラムは参照のFc2のセンサーグラムを差し引くことによって「補正」された。得られた参照の差し引きセンサーグラム(Fc3-Fc2)を図5でオーバーレイ・プロットとして示す。図中でEで示された実線はトリインジェクト中の液体BがHBSS1%中の50μM ヨーフェノキシ酸である場合のセンサーグラムを示し、そして図中でFで示された点線はトリインジェクト中の液体BがHBSS1%である場合のセンサーグラムを示している。
Measurement of interaction between iophenoxy acid and HAS in 30% saliva
50 μM iofenoxy acid (Sigma Aldrich, Missley, USA) in 1% HBSS was used as <Liquid B> and 1% HBSS as <Liquid A>, and triinjection was performed on Fc1, Fc2 and Fc3 Went to the series. Detection was performed with Fc3 (HSA-surface) and Fc2 (IgG-surface). The sensorgram obtained from Fc3 was “corrected” by subtracting the reference Fc2 sensorgram. The resulting reference subtraction sensorgram (Fc3-Fc2) is shown as an overlay plot in FIG. The solid line indicated by E in the figure shows the sensorgram when the liquid B in the triinjection is 50 μM iophenoxy acid in 1% HBSS, and the dotted line indicated by F in the figure is in the triinjection. The sensorgram when the liquid B of HBSS is 1% is shown.
図5において、区分31、32Fおよび33はHBSS1%であり、そして区分32EはHBSS1%中の50μM ヨーフェノキシ酸である。区分31〜33の間の勾配はHSA(Fc3)に対してより、低い速度でIgG(Fc2)に非特異的に結合する唾液成分によるものである。しかし、非特異的結合の影響はヨーフェノキシ酸を区分32で注入したときには安定している。区分32Eおよび32Fからわかるようにヨーフェノキシ酸の結合は容易に定量化できる。
In FIG. 5,
IgGとHASとの間の非特異的結合の差異を補正するために、緩衝液注入からのセンサーグラム(図5中のF)はヨーフェノキシ酸注入からのセンサーグラム(図5中のE)から差し引くことができる。ヨーフェノキシ酸のHSAへの結合は、HBSS1%で3回そしてHBS1%中で3回、特徴付けられ、そしてこのようにして補正されて得られたセンサーグラムが図6に示される。唾液含有緩衝液のセンサーグラムが点線(D)で示され、一方純粋な緩衝液のセンサーグラムが実線(C)で示される。図6に示されるように、センサーグラムD(唾液含有緩衝液)はセンサーグラムC(純粋な緩衝液)と合致し、このことはこの方法が複雑なマトリクス中での分子相互作用を特徴付けるときに好都合であることを示している。 To correct for non-specific binding differences between IgG and HAS, the sensorgram from the buffer injection (F in FIG. 5) is derived from the sensorgram from the iophenoxy acid injection (E in FIG. 5). Can be deducted. The binding of iophenoxy acid to HSA was characterized 3 times with 1% HBSS and 3 times with 1% HBS, and the sensorgram obtained in this way is shown in FIG. The sensorgram of saliva-containing buffer is shown by the dotted line (D), while the sensorgram of pure buffer is shown by the solid line (C). As shown in FIG. 6, sensorgram D (saliva-containing buffer) is consistent with sensorgram C (pure buffer), as this method characterizes molecular interactions in complex matrices. It shows that it is convenient.
したがって、表面を試料と接触させる前にHSAおよびIgG表面を非特異的に結合する唾液成分で予備インキュベーションすることにより、ヨーフェノキシ酸の相互作用の測定を妨害する可能性のある試料媒体からの非特異的結合が最小化される。そのために、本発明の方法は特に小分子が複雑な試料媒体中のリガンドにいかに結合するかを測定する場合の、可能性のある非特異的結合の影響を最小化するために適している。 Therefore, pre-incubation with saliva components that non-specifically bind the HSA and IgG surfaces prior to contacting the surface with the sample will prevent non-determination from sample media that may interfere with the measurement of iophenoxy acid interaction. Specific binding is minimized. To that end, the method of the present invention is particularly suitable for minimizing potential non-specific binding effects when measuring how small molecules bind to ligands in complex sample media.
本発明は、上記の本発明の特定の実施態様に限定されないが、しかし本発明の範囲は付随する請求の範囲により確立されることを理解するべきである。 The invention is not limited to the specific embodiments of the invention described above, but it is to be understood that the scope of the invention is established by the appended claims.
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