JP4744264B2 - Reference material for urine sediment analyzer. - Google Patents
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Description
本発明は、尿中有形成分分析装置の精度管理などに用いられる標準物質に関する。
The present invention relates to a standard substance used for quality control of a urine particle analyzer .
血液や尿などの検体に含まれる粒子を分析する装置として、検体中の被測定粒子を色素で染色し、染色した被測定粒子に光を照射して個々の被測定粒子から発せられる蛍光や散乱光などの光学的情報を測定し、その光学的情報に基づいて被測定粒子を分類・計数する粒子分析装置が知られている。 As a device for analyzing particles contained in specimens such as blood and urine, the particles to be measured in the specimen are stained with a dye, and the stained particles to be measured are irradiated with light to emit fluorescence and scattering emitted from the individual particles to be measured 2. Description of the Related Art Particle analyzers that measure optical information such as light and classify / count particles to be measured based on the optical information are known.
このような粒子分析装置を用いた分析において、常に正確な測定結果を得るためには、粒子分析装置の精度管理を実施する必要がある。すなわち、精度管理用の標準物質を粒子分析装置で測定し、得られた測定値の正確性及び精密性を確認し、正確な測定値が得られない場合には、粒子分析装置を較正して標準物質の測定値が所定の範囲に入るようにしなければならない。特に、色素を用いて粒子を染色処理する機構を含む粒子分析装置の場合、その染色機構の正確度や精密度が測定結果に大きく影響を及ぼすことから、精度管理が重要である。 In the analysis using such a particle analyzer, in order to always obtain an accurate measurement result, it is necessary to carry out accuracy management of the particle analyzer. In other words, a standard material for quality control is measured with a particle analyzer, and the accuracy and precision of the obtained measurement values are confirmed. If an accurate measurement value cannot be obtained, the particle analyzer is calibrated. The measured value of the reference material must be within the specified range. In particular, in the case of a particle analyzer including a mechanism for staining particles using a dye, the accuracy control is important because the accuracy and precision of the staining mechanism greatly affect the measurement results.
上述した標準物質には、粒子径などの特性が被測定粒子と類似した標準粒子が含まれる。このような標準粒子としては、例えば、ラテックス粒子が挙げられる。ラテックス粒子は、比較的、均一な粒子径を有する粒子を得やすく、安定性が良好なことから標準粒子として非常に有用な粒子である。しかし、ラテックス粒子は疎水性の粒子であり、一般に水溶性色素で染色することができない。ゆえに、ラテックス粒子を標準粒子として用いて、粒子分析装置の染色機構の異常を検出することはできない。 The standard material described above includes standard particles having characteristics such as particle diameter similar to those of the particles to be measured. Examples of such standard particles include latex particles. Latex particles are very useful particles as standard particles because it is relatively easy to obtain particles having a uniform particle size and stability is good. However, latex particles are hydrophobic particles and generally cannot be dyed with a water-soluble dye. Therefore, it is impossible to detect abnormalities in the staining mechanism of the particle analyzer using latex particles as standard particles.
特許文献１には、尿と染色液とを混合して測定用試料を調製し、調製した測定用試料をフローセルに流し、フローセルを流れる粒子の静止画像を撮像して尿中の粒子を分析する粒子分析装置において使用される標準物質が記載されている。この標準物質に含まれる標準粒子は、色素が結合可能な官能基を表面に有しており、その官能基と色素イオンが結合することにより標準粒子が染色される。 In Patent Document 1, urine and staining solution are mixed to prepare a measurement sample, the prepared measurement sample is flowed into a flow cell, and a still image of particles flowing through the flow cell is taken to analyze particles in urine. Reference materials used in particle analyzers are described. The standard particles contained in this standard substance have a functional group to which a dye can bind on the surface, and the standard particles are stained by bonding the functional group and the dye ion.
しかし、特許文献１には、標準粒子としてラテックス粒子を用いる場合、ラテックス粒子の表面に凹凸がないことから、粒子の表面に結合できる官能基の量に制限があり、染色濃度が高まらず、染色に時間がかかる欠点があると記載されている。 However, in Patent Document 1, when latex particles are used as standard particles, there are no irregularities on the surface of the latex particles, so there is a limit to the amount of functional groups that can be bonded to the surface of the particles, the dyeing concentration does not increase, and the dyeing It has been described that there is a drawback that takes time.
本発明の目的は、赤血球と同程度に染色可能で、且つラテックス粒子を用いた、赤血球用標準粒子を含有する、尿中有形成分分析装置用標準物質を提供することである。
An object of the present invention is to provide a standard material for a urine sediment analyzer, which contains standard particles for erythrocytes, which can be stained to the same extent as erythrocytes and which use latex particles .
上記の課題に鑑み本発明は、尿に含まれる被測定粒子に対して水溶性色素による染色処理を施し、染色された被測定粒子を分析する尿中有形成分分析装置に用いられる標準物質であって、実質的に水溶性色素により染色されない粒子を水溶性ポリマーで被覆した赤血球用標準粒子を含み、該赤血球用標準粒子が前記染色処理により赤血球と同程度に染色されることを特徴とする尿中有形成分分析装置用標準物質を提供する。
In view of the above-mentioned problems, the present invention is a standard substance used in a urine particle analyzer for analyzing particles stained by subjecting the particles to be measured contained in urine to a staining treatment with a water-soluble dye. there are, comprise substantially red blood standard particles for the particles not stained was covered with a water-soluble polymer by a water-soluble dye, characterized in that said erythrocytes for standard particles are stained to the same extent as the red blood cells by the staining process Provide a reference material for urine sediment analyzer .
本発明の尿中有形成分分析装置用標準物質に含まれる赤血球用標準粒子は、表面が水溶性ポリマーで被覆されている。このように粒子の表面を水溶性ポリマーで被覆することにより、ラテックス粒子のような実質的に水溶性色素により染色されない粒子であっても水溶性色素により染色可能となり、尿中有形成分分析装置の精度管理において、赤血球と同程度に染色可能な赤血球用標準粒子として使用することができる。
The surface of the standard particle for erythrocytes contained in the standard material for urine sediment analyzer of the present invention is coated with a water-soluble polymer. By coating in this manner the surface of the particles with a water-soluble polymer, substantially even particle unstained by water-soluble dye allows dyeing a water-soluble dye, urinary particle analyzer, such as latex particles in quality control of, it can be used as a dyeable erythrocytes for standard particles to the same extent as erythrocytes.
本発明の標準物質は、実質的に水溶性色素により染色されない粒子の表面を水溶性ポリマーで被覆した赤血球用標準粒子を含有する。ここで、実質的に水溶性色素により染色されない粒子とは、水溶性色素により染色されない又は染色されるがその染色性が低い粒子のことをいい、通常このような粒子は、尿中有形成分分析装置の精度管理において、赤血球と同程度に染色される赤血球用標準粒子として使用することができない。しかし、水溶性ポリマーで粒子の表面を被覆することにより、水溶性色素による染色が可能な粒子となり、赤血球と同程度に染色される赤血球用標準粒子として使用することが可能になる。この詳細については不明であるが、おそらく粒子を被覆している水溶性ポリマーの水酸基と水溶性色素が結合することにより粒子が染色されると考えられる。
The standard substance of the present invention contains standard particles for erythrocytes in which the surface of particles that are not stained with a water-soluble dye is coated with a water-soluble polymer. Here, the particles that are not substantially dyed with a water-soluble dye are particles that are not dyed or dyed with a water-soluble dye but have low dyeability. Usually, such particles are formed in urine. in quality control of the analyzer it can not be used as a red blood cell for standard particles stained to the same extent as erythrocytes. However, by coating the surface of the particles with a water-soluble polymer, it is capable of staining by water-soluble dye particles, it is possible to use as red blood cells for standard particles stained to the same extent as erythrocytes. Although the details are unknown, it is presumed that the particles are likely to be dyed by bonding of the hydroxyl groups of the water-soluble polymer covering the particles and the water-soluble dye.
実質的に色素により染色されない粒子としては、例えばラテックス粒子が挙げられる。なお、尿中有形成分分析装置の精度管理において赤血球用標準粒子として使用される粒子は、染色性だけでなく、大きさや形状などの特性が赤血球と類似するように設計されたものを用いることが好ましい。比較的均一な粒子径を有する粒子を得やすい、安定性が良好といった特徴から、ラテックス粒子は標準粒子として非常に有用な粒子である。また、ラテックス粒子は溶液中で自然凝集を起こす場合がある。しかし、ラテックス粒子の表面を水溶性ポリマーで被覆することにより、溶液中での自然凝集を抑制することができる。
Examples of the particles that are not substantially dyed with a dye include latex particles. In addition, the particle used as the standard particle for erythrocytes in the accuracy control of the urine particle analyzer should be designed so that not only the stainability but also characteristics such as size and shape are similar to those of erythrocytes. Is preferred. Latex particles are very useful particles as standard particles because they are easy to obtain particles having a relatively uniform particle size and have good stability. In addition, latex particles may spontaneously aggregate in the solution. However, by coating the surface of the latex particles with a water-soluble polymer, natural aggregation in the solution can be suppressed.
粒子を被覆している水溶性ポリマーとしては、特に限定されないが、合成の水溶性ポリマーが好ましい。また、合成の水溶性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、この中でもPVAが特に好ましい。 The water-soluble polymer that coats the particles is not particularly limited, but a synthetic water-soluble polymer is preferable. Examples of the synthetic water-soluble polymer include polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, etc. Among them, PVA is particularly preferable.
水溶性ポリマーで粒子の表面を被覆する方法としては、特に限定されず公知の被覆方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、粒子を緩衝液等に懸濁して粒子懸濁液とし、粉末状の水溶性ポリマーを粒子懸濁液に攪拌しながら直接添加して粒子の表面を被覆する方法、又は、水溶性ポリマーを緩衝液等に溶解もしくは懸濁して溶液又は懸濁液とし、これら溶液又は懸濁液を前記粒子懸濁液と攪拌しながら混合して粒子の表面を被覆する方法などが挙げられる。さらに、前記水溶性ポリマーの溶液又は懸濁液と前記粒子懸濁液を混合した混合液に超音波を印加することによって水溶性ポリマーで粒子の表面を被覆する方法が挙げられる。 A method for coating the surface of the particles with the water-soluble polymer is not particularly limited, and a known coating method can be used. As such a method, for example, the particles are suspended in a buffer solution or the like to form a particle suspension, and a powdered water-soluble polymer is directly added to the particle suspension while stirring to coat the surface of the particles. Alternatively, a method in which a water-soluble polymer is dissolved or suspended in a buffer solution or the like to form a solution or suspension, and the solution or suspension is mixed with the particle suspension while stirring to coat the surface of the particles. Is mentioned. Furthermore, the method of coat | covering the particle | grain surface with water-soluble polymer by applying an ultrasonic wave to the liquid mixture which mixed the solution or suspension of the said water-soluble polymer and the said particle | grain suspension is mentioned.
なお、水溶性ポリマーによる被覆の程度は特に限定されず、例えば水溶性ポリマーが粒子の表面を完全に被覆していてもよいし、部分的に被覆していてもよい。要するに、被覆方法を適宜選択したり、使用する水溶性ポリマーの量を適宜調節するなどして、水溶性ポリマーによる被覆の程度を調節し、最終的に、実質的に水溶性色素により染色されない粒子に赤血球と同程度の染色性を持たせることができればよい。
The degree of coating with the water-soluble polymer is not particularly limited. For example, the water-soluble polymer may completely cover the surface of the particle or may partially cover the particle. In short, particles that are not substantially dyed with a water-soluble dye are finally adjusted by adjusting the degree of coating with a water-soluble polymer by appropriately selecting a coating method or appropriately adjusting the amount of water-soluble polymer to be used. It is only necessary to have a staining property similar to that of red blood cells .
本発明の標準物質は、このようにして得られた赤血球用標準粒子を含有するものである。標準物質の具体的な様態としては、上述した赤血球用標準粒子を水や緩衝液などの適当な溶媒に懸濁した懸濁液が挙げられる。 The standard substance of the present invention contains the erythrocyte standard particles thus obtained. A specific embodiment of the standard substance includes a suspension obtained by suspending the above-mentioned erythrocyte standard particles in an appropriate solvent such as water or a buffer solution.
標準物質は、さらに粒子凝集防止剤を含有してもよい。粒子凝集防止剤としては、界面活性剤、BSA、塩などが挙げられる。また、尿を検体として用いる場合、尿の屈折率が高いので、標準物質の屈折率を調整するために屈折率調整剤を含有してもよい。屈折率調整剤としては、例えば、糖類、尿素、グリコール類、グリセリンなどが挙げられ、その中でもグリセリンが好ましい。その他にも、防腐剤などを含有しても良い。また、標準物質は、大きさ、染色性、素材などの特性が異なる複数の標準粒子を含有してもよい。 The standard substance may further contain a particle aggregation inhibitor. Examples of the particle aggregation preventing agent include surfactants, BSA, salts and the like. Further, when urine is used as a specimen, since the refractive index of urine is high, a refractive index adjusting agent may be contained in order to adjust the refractive index of the standard substance. Examples of the refractive index adjuster include saccharides, urea, glycols, glycerin and the like, and among them, glycerin is preferable. In addition, you may contain antiseptic | preservative etc. The standard substance may contain a plurality of standard particles having different characteristics such as size, dyeability, and material.
上述した標準物質は、尿中の粒子を分析する尿中有形成分分析装置の精度管理や較正に使用される。標準物質が適用される尿中有形成分分析装置としては、尿を水溶性色素によって染色して測定用試料を調製する試料調製機構を備え、調製された測定用試料をフローサイトメータに供給して、フローサイトメータを通過する測定用試料中の粒子に光を照射し、染色された粒子からの光学的情報を検出器で検出して分析を行う尿中有形成分(尿沈渣)分析装置が挙げられる。
Above standards are urine analyzing particles in urine are used quality control and calibration of tangible component analyzer. The urine sediment analyzer to which a standard substance is applied has a sample preparation mechanism that prepares a measurement sample by staining urine with a water-soluble dye, and supplies the prepared measurement sample to a flow cytometer. Te, light is irradiated to the particles in the measurement sample passing through the flow cytometer, optical information detector detecting the line cormorants in urine analysis solid components from stained particles (urine sediment) analysis Apparatus.
ここで、尿中の粒子としては赤血球や白血球などの血球成分、上皮細胞や円柱といった細胞が挙げられる。さらに、局所感染や全身感染などにより、尿中に細菌、真菌、原虫、寄生虫などの微生物が含まれる場合があり、これら微生物も粒子として挙げられる。その他にも、尿中に化学成分、医薬品や遊離の脂肪からなる結晶が含まれる場合があり、これらも粒子として挙げられる。
Here, examples of particles in urine include blood cell components such as red blood cells and white blood cells, and cells such as epithelial cells and cylinders. Furthermore, due to local infection and systemic infection, bacteria in the urine, may contain microbial fungi, protozoa, etc. parasites, these microorganisms may also be mentioned as a grain terminal. Besides, it may contain chemical components in urine, consisting of pharmaceuticals and free fat crystals, and as this Ramotsubu child.
また、水溶性色素は、上述した尿中有形成分分析装置において被測定粒子の染色に用いられる水溶性の色素であれば特に限定されない。例えば、水溶性の蛍光色素が挙げられる。特に、尿中有形成分(尿沈渣)分析装置において、尿中の有形成分を染色するために用いられる蛍光色素としては、以下の式で表される縮合ベンゼン誘導体を用いることができる。 The water-soluble dye is not particularly limited as long as it is a water-soluble dye used for staining the particles to be measured in the urine particle analyzer . For example, water-soluble fluorescent dyes can be mentioned. In particular, in a urine sediment (urine sediment) analyzer, a condensed benzene derivative represented by the following formula can be used as a fluorescent dye used to stain the urine sediment.
上記式中、Aは−O−，−S−又は−C（CH3）2−を表し、Rは炭素数が１〜３の低級アルキル基を表し、Xはハロゲンを表し、Yは−CH＝又は−NH−を表し、mは1又は2を表し、nは0又は1を表し、Bは下記式を表す。なお、下記式中、AとRは上記と同義である。 In the above formula, A represents —O—, —S— or —C (CH 3 ) 2 —, R represents a lower alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, X represents halogen, and Y represents —CH. = Or -NH-, m represents 1 or 2, n represents 0 or 1, and B represents the following formula. In the following formulae, A and R are as defined above.
上記の式で表される蛍光色素の具体例としては、以下の式で表されるNK-529、NK-136、NK-1533（いずれも日本感光色素研究所株式会社製）などが挙げられる。 Specific examples of the fluorescent dye represented by the above formula include NK-529, NK-136, and NK-1533 (all manufactured by Nippon Photosensitive Dye Research Laboratories) represented by the following formula.
なお、尿中有形成分分析装置では、赤血球の溶血を防ぐために、赤血球の細胞膜に損傷を与えない条件下で分析が行われる。また、上述した蛍光色素は、血球成分や細胞などの核酸成分を強く染色する色素である。ゆえに、尿中有形成分分析装置の分析において、核酸を有していない赤血球が上述した蛍光色素で染色されるのは、その細胞膜のみということになる。一方、本発明の標準物質に含まれる標準粒子は、実質的に水溶性色素により染色されない粒子を水溶性ポリマーで被覆することによって染色可能となった粒子であり、色素により染色される部分は被覆した水溶性ポリマーである。以上のことから、実質的に水溶性色素により染色されない粒子を水溶性ポリマーで被覆した標準粒子は、特に、尿中有形成分分析装置の精度管理における赤血球用標準粒子として有用である。 In the urine sediment analyzer, analysis is performed under conditions that do not damage the cell membrane of red blood cells in order to prevent hemolysis of red blood cells. The fluorescent dye described above is a dye that strongly stains nucleic acid components such as blood cell components and cells. Therefore, in the analysis of the urine particle analyzer, it is only the cell membrane that stains red blood cells that do not have nucleic acids with the above-described fluorescent dye. On the other hand, the standard particles contained in the standard substance of the present invention are particles that can be dyed by coating particles that are not dyed with a water-soluble dye with a water-soluble polymer. Water-soluble polymer. From the above, standard particles obtained by coating particles that are not stained with a water-soluble dye with a water-soluble polymer are particularly useful as standard particles for erythrocytes in the accuracy control of a urine sediment analyzer.
なお、赤血球に対応する標準粒子としては、赤血球と同程度の大きさを有する粒子が好ましく、平均粒径3〜20μm、好ましくは5〜10μmのものが好適である。 The standard particles corresponding to erythrocytes are preferably particles having the same size as erythrocytes, and those having an average particle diameter of 3 to 20 μm, preferably 5 to 10 μm are suitable.
以下、本実施形態の標準物質が適用される尿中有形成分分析装置について説明する。この尿中有形成分分析装置は、尿中に含まれる粒子として、白血球、赤血球、上皮細胞及び円柱を測定可能である。測定には、試薬として希釈液と染色液を用いる。
The following describes the urinary particle analyzer reference material that apply to the present embodiment. This urine particle analyzer can measure leukocytes, erythrocytes, epithelial cells and columns as particles contained in urine. In the measurement, a diluent and a staining solution are used as reagents.
図1は、尿中有形成分分析装置の外観を示したものである。この尿中有形成分分析装置は、装置本体1と、レーザ電源2と、空圧源3とを備えている。装置本体1は、電源スイッチ4と、生体試料である尿を収容した試料容器を移送して自動的に吸引部5に供給するための搬送ユニット6と、尿を試料容器から吸引するための吸引部5と、吸引部5による尿の吸引を開始させるためのスタートスイッチ7と、使用者からの操作指示の入力を受け付けるとともに、尿の分析結果などの情報を表示するタッチパネル式液晶ディスプレイ8とを備えている。
FIG. 1 shows the appearance of the urine particle analyzer. This urine particle analyzer includes a device main body 1, a laser power source 2, and an air pressure source 3. The apparatus main body 1 includes a power switch 4, a
装置本体1は、図2に示すように試料調整部11、検出部41及び解析部56を備えている。試験管14に収容された試料（尿）がシリンジポンプ15の動作により吸引ピペット16から吸引される。吸引された試料はサンプリングバルブ17によって定量され、反応チャンバ18にそれぞれ分配供給される。つまり、元となる同一の試料から反応チャンバ18それぞれに所定量の試料が分注される。希釈液を収容した容器20及び染色液を収容した容器21は、反応チャンバ18に接続され、それぞれシリンジポンプ22および23によりチューブを介して希釈液及び染色液が反応チャンバ18に所定量供給され、測定用試料が調製される。
The apparatus main body 1 includes a sample adjustment unit 11, a
検出部41は、測定用試料に含まれる各粒子から蛍光や散乱光といった光学的情報を検出するためのものであり、フローサイトメータによって構成される。フローサイトメータは、測定用試料を流すためのフローセル42、フローセル42を流れる測定用試料にレーザ光を照射する光源47、測定用試料中の粒子から発せられた側方蛍光を受光するフォトマルチプライヤチューブ49、前方散乱光を受光するフォトダイオード52を有する。
The
フローサイトメータの詳細を図3に示す。図2に示されるように反応チャンバ18及び19はフローセル42と接続されている。測定用試料を流すためのフローセル42は、レーザ光が照射される部分であり、内部流路が細く絞られているオリフィス部43、測定用試料をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル44、シース液供給口45、廃液口46を有する。レーザ光源47は、波長633nmのレーザ光を出射する赤色半導体レーザ光源である。検出部41は、レーザ光源47から照射されたレーザ光をフローセル42へ集光するコンデンサレンズ48、レーザ光を照射された測定用試料中の粒子から発せられた前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード49、フォトダイオード49へ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ50とピンホール51、レーザ光を照射された測定用試料の粒子から発せられた蛍光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ52、フォトマルチプライヤチューブ52へ蛍光を集光するためのコレクタレンズ53、フィルタ54、ピンホール55、フォトダイオード47やフォトマルチプライヤチューブ52から出力された電気信号を増幅し、前方散乱光信号及び蛍光信号として解析部56へ出力するアンプ57、58を有する。フローセル42に測定用試料が流されると、測定用試料中に含まれる粒子がレーザ光源47によるレーザ光の照射領域を横切る度に、蛍光や散乱光が生じる。フォトマルチプライヤチューブ52によって側方蛍光が、フォトダイオード49によって前方散乱光が、それぞれ受光・光電変換され、側方蛍光信号や前方散乱光信号といった光検出信号として解析部56に出力される。
The details of the flow cytometer are shown in Fig. 3. As shown in FIG. 2, the
図3の解析部56は、検出部41で検出された粒子毎の光検出信号を増幅したり、ノイズを除去する回路や、 CPU、ROM、RAMなどからなるコンピューターによって構成されている。解析部56は、検出部41で検出された粒子毎の光検出信号を解析し、二次元分布図を作成して、測定用試料中に含まれる粒子を計数する。光検出信号のパルスのピークレベルから信号強度が得られる。蛍光信号の強度は、測定試料中の各粒子から検出された蛍光の強度を示し、蛍光色素による染色度合いを反映するパラメータとなる。前方散乱光の強度は、測定試料中の各粒子から検出された前方散乱光の強度を示し、粒子の大きさを反映するパラメータとなる。これらのパラメータを組み合わせ、二次元分布図を作成する。二次元分布図上に出現する粒子は、測定試料中に含まれる各粒子のそれぞれの出現位置に応じて設定される領域内に出現した粒子のプロットを計数して測定結果を得る。
The analysis unit 56 in FIG. 3 is configured by a computer that amplifies the photodetection signal for each particle detected by the
次に、上述した尿中有形成分分析装置を用いて標準物質を測定した測定例を示す。なお、ここで用いた標準物質は、表面がPVAで被覆されたラテックス粒子を標準粒子として含有する。また、ラテックス粒子は、赤血球に相当する大きさ（平均粒子径7.1μm）のものを用いた。 Next, a measurement example in which a standard substance is measured using the urine particle analyzer described above will be shown. The standard substance used here contains latex particles whose surfaces are coated with PVA as standard particles. In addition, latex particles having a size corresponding to erythrocytes (average particle diameter of 7.1 μm) were used.
測定で使用する試薬類は以下の通りである。 The reagents used in the measurement are as follows.
（ラテックス粒子懸濁液の調製）
平均粒子径が7.1μmのラテックス粒子を含むDYNOSPHERES（JSR社）250μLを1%PVA溶液（PVA 0.5gを精製水 50mLに溶解したもの）1mLに懸濁した。この懸濁液に超音波処理（50mW、30秒×2回）を施し、懸濁液中のラテックス粒子をPVAで被覆した。この懸濁液に緩衝液Aを適量加えて洗浄し、12000rpmで遠心して上清を除去した。この洗浄工程を2回繰り返した後、緩衝液A12mLを添加してラテックス粒子懸濁液1を調製した。また、前記1%PVA溶液の代わりに6%PVA溶液（PVA 3gを精製水 50mLに溶解したもの）を用いて、同様の方法によりラテックス粒子懸濁液2を調製した。さらに、比較のために、前記1%PVA溶液の代わりに精製水を用いて、同様の方法によりラテックス粒子懸濁液3を調製した。
(Preparation of latex particle suspension)
250 μL of DYNOSPHERES (JSR) containing latex particles having an average particle size of 7.1 μm was suspended in 1 mL of 1% PVA solution (0.5 g of PVA dissolved in 50 mL of purified water). This suspension was subjected to ultrasonic treatment (50 mW, 30 seconds × 2 times), and latex particles in the suspension were coated with PVA. An appropriate amount of Buffer A was added to the suspension for washing, and the supernatant was removed by centrifugation at 12000 rpm. After repeating this washing step twice, 12 mL of Buffer A was added to prepare Latex Particle Suspension 1. A latex particle suspension 2 was prepared in the same manner using a 6% PVA solution (3% PVA dissolved in 50 mL of purified water) instead of the 1% PVA solution. For comparison, latex particle suspension 3 was prepared in the same manner using purified water instead of the 1% PVA solution.
（緩衝液Aの調製）
精製水1Lに、塩化ナトリウム 1.95%、防腐剤 0.08g、酢酸 0.035g、グリセリン 9.0gを添加して、緩衝液を調製した。なお、緩衝液Aでは、屈折率調整剤としてグリセリンを含有する。
(Preparation of buffer A)
A buffer solution was prepared by adding 1.95% sodium chloride, 0.08 g of preservative, 0.035 g of acetic acid, and 9.0 g of glycerin to 1 L of purified water. Note that the buffer A contains glycerin as a refractive index adjusting agent.
（希釈液の調製）
精製水を1Lに、HEPES 50mM、EDTA−3K 0.40%、2−フェノキシエタノール 0.75%、プロピオン酸ナトリウム 0.6%、水酸化ナトリウム 0.052%、トミサイドS 350ppm、プロキセルGX-L 350ppmを添加して希釈液を調製した。
(Preparation of diluted solution)
Prepare a diluted solution by adding HEPES 50 mM, EDTA-3K 0.40%, 2-phenoxyethanol 0.75%, sodium propionate 0.6%, sodium hydroxide 0.052%, Tomicide S 350 ppm, Proxel GX-L 350 ppm to 1 L of purified water. did.
（染色液の調製）
蛍光色素であるNK-529（日本感光色素研究所株式会社製）を240ppm、NK-136（日本感光色素研究所株式会社製）を25.2ppmとなるようエチレングリコールに溶解させたものを染色液とした。
(Preparation of staining solution)
NK-529 (manufactured by Nippon Sensitive Dye Research Co., Ltd.), a fluorescent dye, is dissolved in ethylene glycol so that 240 ppm and NK-136 (manufactured by Nippon Sensitive Dye Research Co., Ltd.) are 25.2 ppm. did.
上述した尿中有形成分分析装置及び試薬類を用いた測定により得られた結果を図4〜6に示した。図4〜6は、縦軸に前方散乱光強度（Fsc）を、横軸に蛍光強度(Fl)をとった二次元分布図である。図4は精製水を用いて調製したラテックス粒子懸濁液3を測定して得られた二次元分布図であり、図5は1％PVA溶液を用いて調製したラテックス粒子懸濁液1を測定して得られた二次元分布図であり、図6は6％PVA溶液を用いて調製したラテックス粒子懸濁液2を測定して得られた二次元分布図である。 The results obtained by the measurement using the above-described urine sediment analyzer and reagents are shown in FIGS. 4 to 6 are two-dimensional distribution diagrams in which the vertical axis represents the forward scattered light intensity (Fsc) and the horizontal axis represents the fluorescence intensity (Fl). Fig. 4 is a two-dimensional distribution diagram obtained by measuring latex particle suspension 3 prepared using purified water, and Fig. 5 shows latex particle suspension 1 prepared using 1% PVA solution. FIG. 6 is a two-dimensional distribution diagram obtained by measuring latex particle suspension 2 prepared using a 6% PVA solution.
図4〜6の結果より、PVAで被覆していないラテックス粒子（図4）よりも、PVAで被覆したラテックス粒子（図5、6）の方が蛍光強度の高い位置に出現することがわかった。これより、ラテックス粒子をPVAで被覆することにより、染色可能になることがわかった。図5及び図6の結果より、被覆処理に用いたPVAの濃度が高いほどラテックス粒子の染色性が向上することがわかった。これより、被覆処理に用いるPVAの濃度（量）を調節することで、ラテックス粒子の染色性を調節できることがわかった。 From the results shown in Figs. 4-6, it was found that latex particles coated with PVA (Figs. 5 and 6) appeared at higher fluorescence intensity than latex particles not coated with PVA (Fig. 4). . From this, it was found that the latex particles can be dyed by coating with PVA. From the results of FIGS. 5 and 6, it was found that the higher the concentration of PVA used for the coating treatment, the better the dyeability of latex particles. From this, it was found that the dyeability of latex particles can be adjusted by adjusting the concentration (amount) of PVA used for the coating treatment.
また、図4では、各粒子の前方散乱光強度にばらつきが見られた。これは、一部のラテックス粒子が自然凝集により凝集し、その凝集したラテックス粒子が凝集していないラテックス粒子よりも高い前方散乱光強度を示すからである。これに比べて、図5及び図6では、各粒子の前方散乱光強度にばらつきが見られなかったこれより、ラテックス粒子をPVAで被覆することにより、ラテックス粒子の自然凝集を防止できることがわかった。 Further, in FIG. 4, there was variation in the forward scattered light intensity of each particle. This is because some latex particles aggregate due to natural aggregation, and the aggregated latex particles exhibit higher forward scattered light intensity than latex particles that do not aggregate. Compared to this, in FIG. 5 and FIG. 6, there was no variation in the intensity of forward scattered light of each particle. From this, it was found that the latex particles can be prevented from spontaneous aggregation by coating with PVA. .
本例では赤血球用の標準粒子として、平均粒子径7.1μmのラテックス粒子を用いた。尿を検体として装置を用いて測定すると、通常尿中の赤血球は図4〜6で示した領域Rに出現する。図4では、領域R以外のところにおいても粒子の出現が見られたが、図5及び図6では、ほぼすべての粒子が領域R内に出現していた。これより、PVAで被覆したラテックス粒子は赤血球の標準粒子として使用できることがわかった。 In this example, latex particles having an average particle diameter of 7.1 μm were used as standard particles for erythrocytes. When urine is measured using a device as a specimen, urine red blood cells usually appear in region R shown in FIGS. In FIG. 4, the appearance of particles was observed in places other than the region R, but in FIG. 5 and FIG. 6, almost all particles appeared in the region R. From this, it was found that latex particles coated with PVA can be used as standard particles of erythrocytes.
Claims (7)
ラテックス粒子を水溶性ポリマーで被覆した赤血球用標準粒子を含み、該赤血球用標準粒子が前記染色処理により赤血球と同程度に染色されることを特徴とする尿中有形成分分析装置用標準物質。 It is a standard substance used in a urine sediment analyzer that performs a staining process with a water-soluble dye on particles to be measured contained in urine , and analyzes the stained particles to be measured.
Include erythrocytes standard particles for coating the latex particles with a water-soluble polymer, a standard material for concrete components analyzer urine, characterized in that the red blood cells for standard particles are stained to the same extent as the red blood cells by the staining process.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004150832A (en) * | 2002-10-28 | 2004-05-27 | Sysmex Corp | Standard particle suspension for flow cytometer |
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|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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