JP4742258B2 - Firefly luciferase gene functioning in chloroplast and real-time monitoring of chloroplast gene expression using it - Google Patents
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Description
本発明は、葉緑体遺伝子発現のリアルタイムレポーターとして用いることが可能な新規核酸及び当該核酸を組み込んだ形質転換体に関する。 The present invention relates to a novel nucleic acid that can be used as a real-time reporter of chloroplast gene expression and a transformant incorporating the nucleic acid.
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の産物は基質を外部から加えると、その発現量に応じた生物発光を発する。しかも、生きたままの細胞で発光させることができるので、系時的な遺伝子発現量の変化をリアルタイムに知ることができる。また、測定の準備作業は非常に簡便(基質を与えるのみ)であるので大規模測定も可能である。そのためホタルルシフェラーゼ遺伝子は遺伝子発現量を調べるレポーター遺伝子として幅広い生物種に応用されてきた。(Sherf, B. A., and Wood, K. V. 1994, Promega Notes 49:14-21) The product of the firefly luciferase gene emits bioluminescence according to its expression level when a substrate is added from the outside. Moreover, since it is possible to emit light in living cells, changes in gene expression over time can be known in real time. In addition, since the measurement preparation work is very simple (only substrate is given), large-scale measurement is possible. Therefore, the firefly luciferase gene has been applied to a wide range of species as a reporter gene for examining the gene expression level. (Sherf, B. A., and Wood, K. V. 1994, Promega Notes 49: 14-21)
概日時計はほぼ全ての細胞が持つ分子装置であり、外界の昼夜の環境変化に適応するため、多岐にわたる細胞内の生命現象を調節している。葉緑体のゲノムにコードされた遺伝子も概日時計による制御を受ける。その結果、葉緑体の重要な機能である光合成は昼に盛んになり、夜には休息するといった概日リズムを示す。
しかし、概日時計がどのように葉緑体ゲノムを調節しているかは全くわかっていない。そのもっとも大きな要因はホタルルシフェラーゼの様な有効なリアルタイムレポーター遺伝子が存在しないことである。モデル植物であるクラミドモナスを含め、葉緑体ゲノムはATに富む配列であるケースが多い。そのため既存のルシフェラーゼ遺伝子が機能しにくい。 However, it is not known at all how the circadian clock regulates the chloroplast genome. The biggest factor is the absence of an effective real-time reporter gene like firefly luciferase. The chloroplast genome is often an AT-rich sequence, including the model plant Chlamydomonas. Therefore, the existing luciferase gene is difficult to function.
そこで、本発明は、葉緑体で機能するホタルルシフェラーゼ遺伝子の提供、及び当該遺伝子を利用した、種々の測定を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a firefly luciferase gene that functions in chloroplasts and to provide various measurements using the gene.
上記目的を達成するために、発明者らは、葉緑体におけるコドンの使用頻度に着目し、鋭意研究した結果、本発明の核酸及び当該核酸を組み込んだ形質転換体を見出すに至った。 In order to achieve the above object, the inventors focused on the frequency of codon usage in chloroplasts and, as a result of intensive research, have found the nucleic acid of the present invention and a transformant incorporating the nucleic acid.
本発明の核酸は、以下の(a)又は(b)からなることを特徴とする。すなわち、
(a)配列表の配列番号1に示す、塩基配列番号1-1653で示される塩基配列からなる核酸。
(b)塩基配列番号1-1653の塩基配列の中で、既存のルシフェラーゼ遺伝子と比較して、葉緑体ゲノムにおいて使用頻度が低いコドンに係る塩基配列が置換されている核酸。
The nucleic acid of the present invention comprises the following (a) or (b). That is,
(a) A nucleic acid having the base sequence represented by base sequence number 1-1653 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(b) A nucleic acid in which a base sequence related to a codon that is used less frequently in the chloroplast genome than the existing luciferase gene in the base sequence of base sequence number 1-1653 is substituted.
本発明の核酸の好ましい実施態様において、前記葉緑体ゲノムにおいて使用頻度が低いコドンが、配列表の配列番号1-1653の塩基配列の中で、184〜186、342〜344、427〜429、562〜564、757〜759、821〜823、955〜957、988〜990、1008〜1010、1024〜1026、1375〜1377、1588〜1590、及び1615〜1617からなる群から選択されることを特徴とする。 In a preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention, the codon that is less frequently used in the chloroplast genome is 184 to 186, 342 to 344, 427 to 429, among the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 1653 in the Sequence Listing. 562-564, 757-759, 821-823, 955-957, 988-990, 1008-1010, 1024-1026, 1375-1377, 1588-1590, and 1615-1617 And
本発明の形質転換体は、請求項1〜3項のいずれか1項に記載の核酸を組み込んだことを特徴とする。 The transformant of the present invention is characterized by incorporating the nucleic acid according to any one of claims 1 to 3.
本発明の遺伝子の発現を測定する方法は、請求項1〜3項のいずれか1項に記載の核酸をレポータ遺伝子として葉緑体ゲノムへ組み込むことによって遺伝子の発現を測定することを特徴とする。 The method for measuring gene expression of the present invention comprises measuring the gene expression by incorporating the nucleic acid according to any one of claims 1 to 3 into a chloroplast genome as a reporter gene. .
また、本発明の概日リズムの測定方法は、請求項1〜3項のいずれか1項に記載の核酸を、葉緑体遺伝子psbDのプロモータと5’非翻訳領域の下流へレポータ遺伝子として接続し、概日リズムを測定することを特徴とする。 The circadian rhythm measurement method of the present invention comprises connecting the nucleic acid according to any one of claims 1 to 3 as a reporter gene downstream of a promoter of the chloroplast gene psbD and a 5 ′ untranslated region. The circadian rhythm is measured.
また、本発明のレポーターベクターは、請求項1〜3項のいずれか1項に記載の核酸を、レポータ遺伝子として組み込んだことを特徴とする。 The reporter vector of the present invention is characterized by incorporating the nucleic acid according to any one of claims 1 to 3 as a reporter gene.
また、本発明の合成遺伝子の合成方法は、合成遺伝子を宿主又は細胞小器官において発現させるために、前記宿主又は細胞小器官において使用されるコドンの使用頻度が、他のコドンと比較して高いコドンを使用して、遺伝子を合成することを特徴とする。 In the method for synthesizing a synthetic gene of the present invention, since the synthetic gene is expressed in a host or organelle, the frequency of use of the codon used in the host or organelle is higher than that of other codons. It is characterized by synthesizing genes using codons.
また、本発明の合成遺伝子の合成方法の好ましい実施態様において、前記宿主又は細胞小器官において出現頻度が、1000分の1以下(であるコドンを置換して遺伝子を合成することを特徴とする。ただし、1つのアミノ酸をコードするコドンの内もっと使用頻度の高いものがこの数値以下になるものは例外とする。 In a preferred embodiment of the method for synthesizing a synthetic gene of the present invention, the gene is synthesized by substituting a codon whose appearance frequency is 1/1000 or less (in the host or organelle). Exceptions are those in which more frequently used codons encoding one amino acid are less than this number.
本発明の核酸によれば、葉緑体ゲノムで使用される頻度が高いコドンを使用しているので、効率よくルシフェラーゼ遺伝子が発現し、概日リズムなど葉緑体遺伝子の発現の様子を観察することが可能となるという有利な効果を有する。 According to the nucleic acid of the present invention, since a codon frequently used in the chloroplast genome is used, the luciferase gene is efficiently expressed, and the expression state of the chloroplast gene such as circadian rhythm is observed. It has the advantageous effect that it becomes possible.
また、本発明の遺伝子の合成方法によれば、コドンの使用頻度を最適化した形で所望の器官へ組み込み、発現させることが容易な所望の合成遺伝子を合成することが可能であるという有利な効果を有する。 Further, according to the gene synthesis method of the present invention, it is possible to synthesize a desired synthetic gene that can be easily incorporated into a desired organ and expressed in an optimized form of codon usage. Has an effect.
本発明の核酸は、以下の(a)又は(b)、すなわち、
(a)配列表の配列番号1に示す、塩基配列番号1-1653で示される塩基配列からなる核酸、
(b)塩基配列番号1-1653の塩基配列の中で、既存のルシフェラーゼ遺伝子と比較して、葉緑体ゲノムにおいて使用頻度が低いコドンに係る塩基配列が置換されている核酸、からなることを特徴とする。配列表の配列番号1に示す塩基配列から成る核酸は、葉緑体においても発現し得るように最適化された合成遺伝子である。
The nucleic acid of the present invention has the following (a) or (b):
(a) a nucleic acid comprising the base sequence represented by base sequence number 1-1653 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(b) consisting of a nucleic acid having a base sequence associated with a codon that is less frequently used in the chloroplast genome than the existing luciferase gene, among the base sequences of base sequence numbers 1 to 1653 Features. The nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is a synthetic gene optimized so that it can be expressed in chloroplasts.
また、本発明の核酸は、塩基配列番号1-1653の塩基配列の中で、既存のルシフェラーゼ遺伝子と比較して、葉緑体ゲノムにおいて使用頻度が低いコドンに係る塩基配列が置換されている核酸、からなることを特徴とする。本発明の核酸は、既存のホタルルシフェラーゼ遺伝子と葉緑体ゲノムのコドンの使用頻度とが異なる場合に、葉緑体においてもルシフェラーゼタンパク質を発現し得るように最適化される。上記葉緑体のような核外の器官において使用頻度が低いコドンを適切に置換した核酸によって、外来遺伝子を発現させることが可能となる。 Further, the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid in which the base sequence related to a codon that is used less frequently in the chloroplast genome than the existing luciferase gene in the base sequence of base sequence number 1-1653 is substituted. It is characterized by comprising. The nucleic acid of the present invention is optimized so that luciferase protein can be expressed also in chloroplasts when the frequency of codon usage in the existing firefly luciferase gene and chloroplast genome is different. A foreign gene can be expressed by a nucleic acid in which a codon that is less frequently used in an extranuclear organ such as the chloroplast is appropriately substituted.
好ましい実施態様において、前記葉緑体において使用頻度が低いコドンが、配列表の配列番号1-1653の塩基配列の中で、184〜186、342〜344、427〜429、562〜564、757〜759、821〜823、955〜957、988〜990、1008〜1010、1024〜1026、1375〜1377、1588〜1590、及び1615〜1617からなる群から選択される(図9において赤いアンダーラインで示した部分)。これらのコドンは、既存のルシフェラーゼ遺伝子と比較して使用頻度が低く、本発明者らはこれらの使用頻度の違いが外来遺伝子のスムーズな発現を妨げているのではないかと推測した結果、これらのコドンを含め、使用頻度の低いコドンを、外来遺伝子を発現させたい器官において使用頻度が高いコドンと置換することによって、目的のタンパク質をコードする合成遺伝子を構築することを試みたものである。 In a preferred embodiment, codons that are not frequently used in the chloroplast are 184 to 186, 342 to 344, 427 to 429, 562 to 564, 757 to 759, 821 to 823, 955 to 957, 988 to 990, 1008 to 1010, 1024 to 1026, 1375 to 1377, 1588 to 1590, and 1615 to 1617 (shown with a red underline in FIG. 9) Part). These codons are less frequently used than existing luciferase genes, and the present inventors have speculated that the difference in these use frequencies may prevent smooth expression of foreign genes. This is an attempt to construct a synthetic gene encoding a target protein by replacing codons including codons that are not frequently used with codons that are frequently used in an organ in which a foreign gene is to be expressed.
また、葉緑体においては、既存のルシフェラーゼ遺伝子と比較してコドンの使用頻度と異なっている場合があり、外来遺伝子の発現を非常に困難なものとしている。本発明の核酸によれば、コドンを最適化しているので、外来遺伝子を発現させることが可能であり、ひいては、例えば、大規模かつ高精度の遺伝子発現測定に必要不可欠なリアルタイム測定用のレポータ遺伝子を提供することも可能である。 In chloroplasts, codon usage may be different from that of existing luciferase genes, making expression of foreign genes very difficult. According to the nucleic acid of the present invention, since the codon is optimized, it is possible to express a foreign gene, and thus, for example, a reporter gene for real-time measurement that is indispensable for large-scale and high-precision gene expression measurement. Can also be provided.
また、本発明の形質転換体は、請求項1〜3項のいずれか1項に記載の核酸を組み込んだことを特徴とする。本発明の形質転換体は、上記本発明の核酸を常法により、適当なプロモーターと接続して、遺伝子移入することにより得ることができる。 Moreover, the transformant of the present invention is characterized by incorporating the nucleic acid according to any one of claims 1 to 3. The transformant of the present invention can be obtained by gene transfer by connecting the nucleic acid of the present invention to an appropriate promoter by a conventional method.
次に、本発明の核酸の利用方法について説明すると以下のようである。まず、本発明の遺伝子の発現を測定する方法は、上述の本発明の核酸をレポータ遺伝子として葉緑体ゲノムへ組み込むことによって遺伝子の発現を測定することを特徴とする。本発明の「核酸」については上述の説明をそのまま適用することができる。本発明の核酸は、葉緑体においても発現し得るように、最適化されているので、これをリポータ遺伝子として利用し、任意の遺伝子の発現の様子を観察することができる。例えば、好適には、上述の本発明の核酸を、葉緑体遺伝子psbDのプロモータと5’非翻訳領域の下流へレポータ遺伝子として接続し、遺伝子発現の概日リズムを測定することができる。本発明の核酸を利用することによって、簡便に、かつ同時に多検体のリズムを検定できる実験系を構築することができる。それによって、研究速度の劇的な加速をもたらすことができる。 Next, the method for using the nucleic acid of the present invention will be described as follows. First, the method for measuring the expression of the gene of the present invention is characterized by measuring the expression of the gene by incorporating the above-described nucleic acid of the present invention into a chloroplast genome as a reporter gene. The above description can be applied as it is to the “nucleic acid” of the present invention. Since the nucleic acid of the present invention is optimized so that it can be expressed in chloroplasts, it can be used as a reporter gene to observe the expression of an arbitrary gene. For example, preferably, the above-described nucleic acid of the present invention can be connected as a reporter gene downstream of the promoter of the chloroplast gene psbD and the 5 'untranslated region, and the circadian rhythm of gene expression can be measured. By using the nucleic acid of the present invention, it is possible to construct an experimental system that can easily and simultaneously test the rhythm of multiple samples. This can lead to dramatic acceleration of research speed.
また、本発明のレポーターベクターは、上述の本発明の核酸を、レポータ遺伝子として組み込んだことを特徴とする。当該カセットは、常法の遺伝子移入法、例えば、相同組換えなどによってオルガネラの所望のターゲッティングサイトへ遺伝子移入することができる。 The reporter vector of the present invention is characterized by incorporating the above-described nucleic acid of the present invention as a reporter gene. The cassette can be transferred to a desired organelle targeting site by a conventional gene transfer method such as homologous recombination.
次に、本発明の合成遺伝子の合成方法について説明する。本発明の合成方法は、合成遺伝子を発現させるために、宿主又は細胞小器官において使用頻度の高いコドンに置き換えて遺伝子を合成することを特徴とする。当該合成方法によれば、前記宿主又は細胞小器官において発現困難な外来遺伝子を、的確に発現し得る遺伝子を合成することができる。また、好ましい実施態様において、前記宿主又は細胞小器官において出現頻度が、1000分の25以下、より好ましくは、1000分の1以下であるコドンを置換して遺伝子を合成する。ただし、1つのアミノ酸をコードするコドンの内もっと使用頻度の高いものがこの数値以下になるのものは例外とする。 Next, a method for synthesizing the synthetic gene of the present invention will be described. The synthesis method of the present invention is characterized in that in order to express a synthetic gene, the gene is synthesized by replacing it with a codon frequently used in a host or organelle. According to the synthesis method, it is possible to synthesize a gene that can accurately express a foreign gene that is difficult to express in the host or organelle. In a preferred embodiment, a gene is synthesized by substituting a codon having an appearance frequency of 25/1000 or less, more preferably 1/1000 or less in the host or organelle. Exceptions are those in which more frequently used codons encoding one amino acid are less than this number.
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明は、これら実施例に限定して解釈される意図ではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated using an Example, this invention is not the intention limited to these Examples and interpreted.
まず、本発明者らは、真核藻類の一つであるクラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)について着目した。当該クラミドモナスは、単細胞生物でその細胞内にただ一つの葉緑体を持つ。このシンプルさ故、葉緑体の研究をリードするモデル生物として広く利用されてきた。また、明確な概日リズムを持つため、概日リズムの研究にも適している。 First, the present inventors paid attention to Chlamydomonas reinhardtii, which is one of eukaryotic algae. The Chlamydomonas is a unicellular organism with only one chloroplast in the cell. Because of this simplicity, it has been widely used as a model organism that leads chloroplast research. It also has a clear circadian rhythm and is suitable for circadian rhythm research.
そこで本発明者らは、改変型ホタルルシフェラーゼ遺伝子(LUC+)のコドン使用頻度をクラミドモナスの葉緑体ゲノムに最適化した人工合成遺伝子LUC+ cp(LUC+ gene for Chlamydomonas chloroplast)を作製し、それを利用したレポーターベクターを葉緑体ゲノムに移入した。そして、得られた形質転換体を用いて葉緑体ゲノムの遺伝子発現リズムを生物発光としてリアルタイムモニタリングすることに成功した。 Therefore, the present inventors produced an artificial synthetic gene LUC + cp (LUC + gene for Chlamydomonas chloroplast) in which the codon usage frequency of the modified firefly luciferase gene (LUC + ) is optimized for Chlamydomonas chloroplast genome. The reporter vector using was transferred into the chloroplast genome. Using the obtained transformant, we succeeded in real-time monitoring of the gene expression rhythm of the chloroplast genome as bioluminescence.
材料と方法
クラミドモナスの株と培養、大腸菌の菌株と培養
クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)野生株2137mt+(CC-1021)は、皆川純博士(北海道大学)より分譲して頂き、これを使用した。クラミドモナスの培養は、Tris-acetate phosphate(TAP)液体培地または1.5% 寒天(INA AGAR BA70; INA Foods, Nagano, Japan)を含むTAP固体培地(Harris、 1989)を用いて、通常は24℃、連続明、30μE/m2sec、白色蛍光灯下で行った。液体培養の場合は、180rpmで旋回培養を行った。
Materials and methods
Strains and cultures of Chlamydomonas strains and Escherichia coli strains and cultured Chlamydomonas reinhardtii wild strain 2137mt + (CC-1021) were purchased from Dr. Jun Minagawa (Hokkaido University) and used. Chlamydomonas culture is usually performed continuously at 24 ° C using Tris-acetate phosphate (TAP) liquid medium or TAP solid medium (Harris, 1989) containing 1.5% agar (INA AGAR BA70; INA Foods, Nagano, Japan). Bright, 30 μE / m 2 sec, performed under white fluorescent lamp. In the case of liquid culture, swirl culture was performed at 180 rpm.
大腸菌の菌株は、DH5α(Takara, Kusatsu, Japan)とXL10Gold(Stratagene Japan, Tokyo, Japan)を使用した。大腸菌の培養は、LB培地(Sambrookら、1989)を用いて行い、必要に応じてそれぞれ最終濃度50μg/ml アンピシリン、25μg/ml クロラムフェニコール、100μg/ml スペクチノマイシンを培地に添加した。 As strains of Escherichia coli, DH5α (Takara, Kusatsu, Japan) and XL10 Gold (Stratagene Japan, Tokyo, Japan) were used. E. coli was cultured using LB medium (Sambrook et al., 1989), and final concentrations of 50 μg / ml ampicillin, 25 μg / ml chloramphenicol, and 100 μg / ml spectinomycin were added to the medium as needed.
DNAの操作、塩基配列の決定と解析
プラスミドDNAの抽出、DNAの制限酵素による消化、平滑化、ライゲーション、polymerase chain reaction(PCR)などの操作は、Sambrookらの記述(Sambrookら、1989)に従って行った。DNAの塩基配列の決定は、ABI373S自動シークエンサーシステム(Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan)とPRISM Dye-Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Japan)とを用いて、メーカーのマニュアルに従って行った。決定した塩基配列は、塩基配列解析ソフトであるAnalysis(Applied Biosystems Japan)、AutoAssembler(Applied Biosystems Japan)、GENETYX-MAC(GENETYX Corp., Tokyo, Japan)およびGENETYX-WIN(GENETYX Corp.)を用いて解析した。PCRクローニングによって得たDNA断片やベクターのコンストラクションの各過程では、全て塩基配列の確認を行った。
DNA manipulation, base sequence determination and analysis Plasmid DNA extraction, DNA restriction enzyme digestion, blunting, ligation, polymerase chain reaction (PCR), etc. are performed according to the description of Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). It was. The DNA base sequence was determined using an ABI373S automatic sequencer system (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan) and PRISM Dye-Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) according to the manufacturer's manual. The determined base sequence is analyzed using base sequence analysis software Analysis (Applied Biosystems Japan), AutoAssembler (Applied Biosystems Japan), GENETYX-MAC (GENETYX Corp., Tokyo, Japan) and GENETYX-WIN (GENETYX Corp.). Analyzed. In each process of DNA fragment and vector construction obtained by PCR cloning, the base sequence was confirmed.
プラスミドDNA
<LUC+cp遺伝子の人工合成>
クラミドモナスの葉緑体ゲノムのコドン使用頻度に最適化した人工合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子LUC+ cpの合成はStemmerらの方法によって行った。クラミドモナスのコドン使用頻度は、かずさDNA研究所のデーターベースCodon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)を利用して調査した。
Plasmid DNA
<Artificial synthesis of LUC + cp gene>
The artificially synthesized firefly luciferase gene LUC + cp optimized for the codon usage of Chlamydomonas chloroplast genome was synthesized by the method of Stemmer et al. The codon usage frequency of Chlamydomonas was investigated using the database Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/) of Kazusa DNA Research Institute.
<葉緑体ターゲッティングベクター(pCTS2XX)の作製>
葉緑体ゲノムのstuI断片(6.3kb; GenBank/DDBJ/EMBL accession no. BK000554のヌクレオチド75838〜82122)をプラスミドベクターpUC118(TAKARA)にクローニングし、ポリリンカー(5’-cccgggatccactagtcgacgcatgcagatctaggcctgca-3’)をPstI site (BK000554の79351)に挿入した。ポリリンカー部位に選択マーカーaadA発現カセットを挿入した。このマーカーがゲノムに挿入されると、抗生物質スペクチノマイシンやストレプトマイシンに対する耐性を持つ。
<Preparation of chloroplast targeting vector (pCTS2XX)>
The stuI fragment of the chloroplast genome (6.3 kb; nucleotides 75838 to 82122 of GenBank / DDBJ / EMBL accession no. BK000554) was cloned into the plasmid vector pUC118 (TAKARA) and the polylinker (5'-cccgggatccactagtcgacgcatgcagatctaggcctgca-3 ') was I inserted it at site (79351 of BK000554). A selection marker aadA expression cassette was inserted into the polylinker site. When this marker is inserted into the genome, it is resistant to the antibiotics spectinomycin and streptomycin.
<生物発光リズム発振カセットの作製>
人工合成したLUC+cp遺伝子の翻訳領域をpCR2.1-TOPO (Invitrogen)にクローニングしpCR2.1-TOPO/LUC+cpを作製した。人工合成の際、5’末端にはNdeI siteを、3’末端にはXbaI siteを付加した。葉緑体遺伝子psbDのプロモーター及び5’非翻訳領域(BK000554の175630−176055)はプライマーpsbD-F1とpsbD-R1を用いたPCRで増幅した。それをpT7Blue-T (Novagen)にクローニングしpT7BT/PpsbDを作製した。葉緑体遺伝子atpBの3’ターミネター領域(BK000554の159952−160185)はプライマーatpB-F1MとatpB-R1Mを用いたPCRで増幅、pT7Blue-TにクローニングしpT7BT/TatpBを作製した。
<Production of bioluminescent rhythm oscillation cassette>
The translation region of the artificially synthesized LUC + cp gene was cloned into pCR2.1-TOPO (Invitrogen) to prepare pCR2.1-TOPO / LUC + cp. During the artificial synthesis, an NdeI site was added to the 5 ′ end and an XbaI site was added to the 3 ′ end. The promoter of the chloroplast gene psbD and the 5 ′ untranslated region (175630-176055 of BK000554) were amplified by PCR using primers psbD-F1 and psbD-R1. It was cloned into pT7Blue-T (Novagen) to prepare pT7BT / P psbD . The 3 ′ terminator region (1590005-160185 of BK000554) of the chloroplast gene atpB was amplified by PCR using primers atpB-F1M and atpB-R1M, and cloned into pT7Blue-T to prepare pT7BT / TatpB .
pT7BT/PpsbDの0.43kb SmaI-XbaI断片をHincII/XbaI消化した pT7BT/TatpBに挿入しpT7BT/PpsbD::TatpBを作製した。pCR2.1-TOPO/LUC+cpの1.66kb NdeI-XbaI断片をNdeI/XbaI消化したpT7BT/PpsbD::TatpBに挿入し、生物発光リズム発振カセットを持つベクターpT7BT/PpsbD::LUC+cp::TatpBを作製した。 Insert the 0.43kb SmaI-XbaI fragment of pT7BT / P psbD to HincII / XbaI digested pT7BT / T atpB to prepare a pT7BT / P psbD :: T atpB. pCR2.1-TOPO / LUC + cp 1.66 kb NdeI-XbaI fragment inserted into NdeI / XbaI digested pT7BT / P psbD :: T atpB , vector pT7BT / P psbD :: LUC + cp :: T atpB was prepared.
使用したプライマー
psbD-F1: 5'-tatgaaattaaatggatatt-3'
psbD-R1: 5'-catatggtgtatctccaaaa-3'
atpB-F1M: 5'-gcttctagaaaagctgcttcattaaaataa-3'
atpB-R1M: 5'-tcccgggacgtttcctttagttttttgctg-3'
※アンダーラインは後のクローニングのステップを容易にするために付加した制限酵素サイトを示す。
Primers used
psbD-F1: 5'-tatgaaattaaatggatatt-3 '
psbD-R1: 5'- catatg gtgtatctccaaaa-3 '
atpB-F1M: 5'-gct tctaga aaagctgcttcattaaaataa-3 '
atpB-R1M: 5'-t cccggg acgtttcctttagttttttgctg-3 '
* Underline indicates restriction enzyme sites added to facilitate subsequent cloning steps.
<レポーターベクターpCTS208の作製>
BamHIでpT7BT/PpsbD::LUC+cp::TatpBから切り出した生物発光リズム発振カセットを葉緑体ターゲッティングベクターのポリリンカー部位にあるBglII siteに挿入した。この際、選択マーカーaadA発現カセットと反対方向に挿入した。このベクターがゲノムに挿入されるとスペクチノマイシン/ストレプトマイシン耐性と生物発光リズムを発振する能力を持つ。
<Preparation of reporter vector pCTS208>
The bioluminescence rhythm oscillation cassette excised from pT7BT / P psbD :: LUC + cp :: T atpB with BamHI was inserted into the BglII site at the polylinker site of the chloroplast targeting vector. At this time, it was inserted in the opposite direction to the selection marker aadA expression cassette. When this vector is inserted into the genome, it has the ability to oscillate spectinomycin / streptomycin resistance and bioluminescence rhythm.
クラミドモナス葉緑体ゲノムへの遺伝子移入
クラミドモナス葉緑体ゲノムへの遺伝子移入は、Finerらの記述(Finerら、1992)に従って、パーティクルインフローガン(皆川純博士によって作製)を用いたバイオリスティック形質転換法で行った。ベクターDNAを葉緑体へ導入するための担体には、タングステン粒子(BIO-RAD M-17; BIO-RAD Japan, Tokyo, Japan)を使用した。形質転換体の選択はスペクチノマイシン耐性遺伝子であるaadA遺伝子を選択マーカーとして、最終濃度50μg/ml スペクチノマイシン硫酸塩(BIOMOL, U.S.A.)を加えたTAP固体培地上で行った。出現した形質転換体のコロニーは、最終濃度100μg/ml スペクチノマイシンを含むTAP固体培地で3回の植え継ぎを行い形質転換体のホモプラズミック化を進行させた後、実験に用いた。形質転換体は100μg/ml スペクチノマイシンを含むTAP固体培地で維持した。
Introducing Chlamydomonas Chloroplast Genome Introducing Chlamydomonas chloroplast genome, biolistic transformation method using particle inflow gun (produced by Dr. Jun Minagawa) according to the description of Finer et al. (Finer et al., 1992). I went there. Tungsten particles (BIO-RAD M-17; BIO-RAD Japan, Tokyo, Japan) were used as carriers for introducing vector DNA into chloroplasts. Transformants were selected on a TAP solid medium supplemented with a final concentration of 50 μg / ml spectinomycin sulfate (BIOMOL, USA) using the aadA gene, which is a spectinomycin resistance gene, as a selection marker. The colonies of the transformants that appeared were used for experiments after three times of passage in a TAP solid medium containing a final concentration of 100 μg / ml spectinomycin to promote homoplasmic transformation of the transformants. Transformants were maintained in TAP solid medium containing 100 μg / ml spectinomycin.
サザンブロット解析
クラミドモナスのゲノミックDNAの抽出はRochaixの方法に従って行った(Rochaix, 1980)。サザンブロット解析のプローブには、PCRで得られたDNA断片(78658〜79007, GenBank accession No. BK000554)を用いた。
Southern Blot Analysis Chlamydomonas genomic DNA was extracted according to the method of Rochaix (Rochaix, 1980). A DNA fragment (78658 to 79007, GenBank accession No. BK000554) obtained by PCR was used as a probe for Southern blot analysis.
クラミドモナス発光レポーター株の生物発光測定
葉緑体ゲノムへ発光レポーター遺伝子を遺伝子移入した形質転換体の生物発光測定は、以下の手順で行った。まず、クラミドモナス形質転換体をTAPおよびHSM固体培地に播種し、24℃、連続明、30μmol/m2sec、白色蛍光灯下で5日間培養し、コロニーを形成させた。形成したコロニーを培地ごと内径6mmのガラス管で切り出し、これを96穴マイクロプレートのウェルに静置した。各ウェルにTAP培地に溶解した1mM D-Luciferin K-saltを25μl投与してから(最終濃度150mM;BIOSYNTH, Naperville, IL)、プレートをプレートシール(Plate Seal T, Sanplatec Corp., Osaka, Japan)でシールした。そして、12時間明期/12時間暗期(明期には30μmol/m2sec、白色蛍光灯を点灯)の明暗周期を1回与えて概日リズムの同調を行った後、連続明(30μmol/m2sec)また連続暗で60分ごとに生物発光を測定した。クロロフィルの遅延蛍光を減衰させるため、測定の直前に3.5分間の暗処理を行った。生物発光量の測定は、当研究室で開発した生物試料の生物発光測定装置(石浦、岡本、小内、古澤、特願2003-384577)を用いて行った。生物発光のリアルタイムモニタリングと測定結果の解析は、解析プログラムであるRAP(特願2003-061203)を用いて行った。
Bioluminescence measurement of Chlamydomonas luminescence reporter strain Bioluminescence measurement of the transformant in which the luminescence reporter gene was transferred into the chloroplast genome was performed according to the following procedure. First, the Chlamydomonas transformant was inoculated on a TAP and HSM solid medium, and cultured at 24 ° C., continuous light, 30 μmol / m 2 sec under a white fluorescent lamp for 5 days to form colonies. The formed colony was cut out together with the medium with a glass tube having an inner diameter of 6 mm, and this was left in a well of a 96-well microplate. Administer 25 μl of 1 mM D-Luciferin K-salt dissolved in TAP medium to each well (final concentration 150 mM; BIOSYNTH, Naperville, IL), then plate seal (Plate Seal T, Sanplatec Corp., Osaka, Japan) Sealed with. Then, after synchronizing the circadian rhythm by giving a light / dark cycle of 12 hours light period / 12 hours dark period (30 μmol / m 2 sec in the light period, white fluorescent lamp turned on) once, continuous light (30 μmol / m 2 sec) Bioluminescence was measured every 60 minutes in continuous darkness. In order to attenuate the delayed fluorescence of chlorophyll, a dark treatment for 3.5 minutes was performed immediately before the measurement. The amount of bioluminescence was measured using the bioluminescence measuring device (Ishiura, Okamoto, Kouchi, Furusawa, Japanese Patent Application 2003-384577) developed in our laboratory. Real-time monitoring of bioluminescence and analysis of measurement results were performed using the analysis program RAP (Japanese Patent Application 2003-061203).
結果
葉緑体ゲノムにおけるターゲッティングサイトの開発
クラミドモナス葉緑体においては、外部から移入した相同遺伝子はゲノム中の相同領域と組換えを起こす、いわゆる相同組換が起こる(Rochaixら、1998)。したがって、相同組換を利用することで、葉緑体ゲノムの特定の部位に遺伝子を組み込むこと(遺伝子ターゲッティング)が可能である。この相同組換えを利用した遺伝子移入によって、発光レポーター遺伝子を組み込む際には、葉緑体ゲノム上の遺伝子発現に影響を与える可能性の低い領域(ターゲッティングサイト)に選択マーカー遺伝子と発光レポーター遺伝子を組み込むことが重要である。そこで、葉緑体遺伝子マップ上で遺伝子の転写終結領域と他の遺伝子の転写終結領域とが向き合う領域を検索した。その結果から、psbT遺伝子とpsbN遺伝子との間の領域が適当であると判断し、その領域をターゲッティングサイト2(cTS2)と命名した(図1)。
result
Development of targeting sites in the chloroplast genome In Chlamydomonas chloroplasts , homologous genes transferred from outside undergo recombination with the homologous regions in the genome, so-called homologous recombination occurs (Rochaix et al., 1998). Therefore, by using homologous recombination, it is possible to incorporate a gene into a specific site of the chloroplast genome (gene targeting). When incorporating a luminescent reporter gene by gene transfer using this homologous recombination, a selection marker gene and a luminescent reporter gene are placed in a region (targeting site) that is unlikely to affect gene expression on the chloroplast genome. It is important to incorporate. Therefore, the region where the transcription termination region of the gene and the transcription termination region of another gene face each other was searched on the chloroplast gene map. From the results, it was determined that the region between the psbT gene and the psbN gene was appropriate, and the region was named targeting site 2 (cTS2) (FIG. 1).
人工合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子LUC + cp の人工合成
クラミドモナスの葉緑体ゲノムにおけるコドン使用頻度は極めて特異であり、外来遺伝子の発現が極めて難しい原因となっている。例えば、一般的に使用されている発光レポーター遺伝子の一つであるホタルルシフェラーゼ遺伝子のコドン使用頻度は、クラミドモナスの葉緑体ゲノムのコドン使用頻度と大きく異なっている。そこで、葉緑体ゲノムのコドン使用頻度に最適化した人工合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子、LUC+ cp(LUC+ gene for Chlamydomonas chloroplast)を完全合成した。LUC+ cpから翻訳される蛋白質のアミノ酸配列はLUC+遺伝子から翻訳される蛋白質と全く同じになるように設計を行った。人工合成遺伝子の作製方法は図2に、LUC+ cp遺伝子の塩基配列は図3に、人工合成に用いた合成オリゴヌクレオチドの一覧は表1に示した。LUC+ cp遺伝子の人工合成に用いたオリゴヌクレオチドの名前、配列を示した。
The frequency of codon usage of the artificially synthesized firefly luciferase gene LUC + cp in the chloroplast genome of the artificially synthesized Chlamydomonas is extremely unique, which makes it difficult to express foreign genes. For example, the codon usage of the firefly luciferase gene, which is one of the commonly used luminescent reporter genes, is significantly different from the codon usage of the Chlamydomonas chloroplast genome. Therefore, an artificially synthesized firefly luciferase gene, LUC + cp (LUC + gene for Chlamydomonas chloroplast), optimized for codon usage in the chloroplast genome was completely synthesized. The amino acid sequence of the protein translated from LUC + cp was designed to be exactly the same as the protein translated from the LUC + gene. The method for preparing the artificially synthesized gene is shown in FIG. 2, the nucleotide sequence of the LUC + cp gene is shown in FIG. 3, and the list of synthetic oligonucleotides used for the artificial synthesis is shown in Table 1. The name and sequence of the oligonucleotide used for the artificial synthesis of the LUC + cp gene are shown.
人工合成遺伝子LUC + cp を用いた葉緑体発光レポーター株の作製
クラミドモナス葉緑体遺伝子であるpsbDは光化学系IのD2蛋白質をコードし、mRNAレベルが日周変動していることが知られている(Rochaixら、1998)。そこで、クラミドモナス葉緑体ゲノムに最適化した人工合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子LUC+ cpをpsbD遺伝子のプロモーター領域(PpsbD)と接続して発光レポーター遺伝子カセットPpsbD::LUC+ cpを作製した。PpsbD::LUC+ cp遺伝子カセット及び選択マーカー遺伝子カセットPpsbA::aadAをcTS2ターゲッティングベクターへ組み込んでpCTS208を作製した。pCTS208の構造は図4Aに示した。
Production of Chloroplast Luminescent Reporter Strains Using Artificial Synthetic Gene LUC + cp psbD, a Chlamydomonas chloroplast gene, encodes photosystem I D2 protein and is known to have diurnal mRNA levels (Rochaix et al., 1998). Therefore, an artificially synthesized firefly luciferase gene LUC + cp optimized for the Chlamydomonas chloroplast genome was connected to the promoter region (P psbD ) of the psbD gene to produce a luminescent reporter gene cassette P psbD :: LUC + cp . The p psbD :: LUC + cp gene cassette and the selectable marker gene cassette P psbA :: aadA were incorporated into a cTS2 targeting vector to prepare pCTS208. The structure of pCTS208 is shown in FIG. 4A.
pCTS208をバイオリスティック法によってクラミドモナス葉緑体上のcTS2へ遺伝子移入し、psbD::LUC+cp株を作製した。クラミドモナスの葉緑体ゲノムはおよそ80コピーあり、それら全てが形質転換型になったことを確かめるため、制限酵素で消化したゲノミックDNAのサザンブロット解析を行った。その結果、psbD::LUC+cp株の葉緑体ゲノミックDNAは、ほぼ全コピー形質転換型になっていた。(図4B,C) pCTS208 was transferred to cTS2 on Chlamydomonas chloroplasts by biolistic method to prepare psbD :: LUC + cp strain. There were approximately 80 copies of Chlamydomonas chloroplast genome, and in order to confirm that all of them were transformed, Southern blot analysis of genomic DNA digested with restriction enzymes was performed. As a result, the chloroplast genomic DNA of the psbD :: LUC + cp strain was almost all copy-transformed. (Fig. 4B, C)
葉緑体発光レポーター株の生物発光リズムの測定
完成したpsbD::LUC+cp株の生物発光を連続明条件下で測定した結果、20時間以上にわたり有意な発光が観察された。一方、野生株では有意な発光は全く検出できなかった。
Measurement of Bioluminescence Rhythm of Chloroplast Luminescent Reporter Strain As a result of measuring the bioluminescence of the completed psbD :: LUC + cp strain under continuous bright conditions, significant luminescence was observed over 20 hours. On the other hand, no significant luminescence was detected in the wild strain.
次にpsbD::LUC+cp株の生物発光が概日リズムであるかどうかを検証した。概日リズムは以下の3つの現象で定義されている。1:恒常条件下でおよそ24時間周期の変動(リズム)が継続する。2:そのリズムは明暗周期でリセットされる。3:そのリズムの周期には温度補償性がある。 Next, we examined whether the bioluminescence of psbD :: LUC + cp strain is circadian rhythm. The circadian rhythm is defined by the following three phenomena. 1: A fluctuation (rhythm) of a period of about 24 hours continues under a constant condition. 2: The rhythm is reset in the light / dark cycle. 3: The rhythm cycle has temperature compensation.
まず1の点を検証するため、明暗周期を与えた後、恒常条件下でpsbD::LUC+cp株の生物発光を測定した。その結果、恒常条件下で5日間にわたり生物発光リズムが観察された(図5、6)。リズムの周期は、連続明条件下で23.7±0.6 h (n=47,TAP培地)、24.8±0.6 h (n=44,HSM培地)であった(図5)。連続暗条件下では23.5±0.3 h (n=34,TAP培地)、24.1±0.2 h (n=33,HSM培地)であった(図6)。 First, in order to verify one point, after giving a light-dark cycle, the bioluminescence of the psbD :: LUC + cp strain was measured under constant conditions. As a result, a bioluminescence rhythm was observed over 5 days under constant conditions (FIGS. 5 and 6). The rhythm cycle was 23.7 ± 0.6 h (n = 47, TAP medium) and 24.8 ± 0.6 h (n = 44, HSM medium) under continuous light conditions (FIG. 5). Under continuous dark conditions, they were 23.5 ± 0.3 h (n = 34, TAP medium) and 24.1 ± 0.2 h (n = 33, HSM medium) (FIG. 6).
次に2の点を検証するため、同一条件で培養した細胞に対し、半日(12時間)ずらした明暗周期を与えた後、連続明条件下で生物発光を測定した。その結果、観察された生物発光の位相は、予想通り明暗周期に同調し、約半日ずれたリズムを示した(図7)。 Next, in order to verify the point 2, bioluminescence was measured under continuous light conditions after giving a light / dark cycle shifted by half a day (12 hours) to cells cultured under the same conditions. As a result, the observed phase of bioluminescence synchronized with the light-dark cycle as expected, and showed a rhythm shifted by about half a day (FIG. 7).
最後に3の点の検証として、温度の変化に伴う生物発光リズムの周期の変化を調べた。さまざまな温度条件下で測定した結果、このリズムの周期は23.7±0.6 h (n=47,24℃)、23.1±0.8 h (n=34,19℃)、22.4±0.4 h (n=41,14℃)であった(図8)。周期の逆数を反応速度として計算した温度係数Q10は0.95であった。通常の化学的反応を含む生物学的過程のQ10は2〜3であり、0.95という値は温度変化の影響を非常に受けにくいことを意味する。 Finally, as a verification of point 3, the change in the cycle of the bioluminescence rhythm accompanying the change in temperature was examined. As a result of measurement under various temperature conditions, the period of this rhythm is 23.7 ± 0.6 h (n = 47,24 ° C), 23.1 ± 0.8 h (n = 34,19 ° C), 22.4 ± 0.4 h (n = 41, 14 ° C.) (FIG. 8). Temperature coefficient Q 10 obtained by calculating the inverse of the period as the reaction rate was 0.95. For biological processes involving normal chemical reactions, Q 10 is 2-3, and a value of 0.95 means that it is very insensitive to temperature changes.
以上の実験結果から、psbD::LUC+cp株の生物発光リズムは、1:恒常条件下で継続し、2:明暗周期でリセットされ、3:周期が温度補償されていた。よって、このリズムは概日リズムであると結論した。 From the above experimental results, the bioluminescence rhythm of the psbD :: LUC + cp strain was 1: continued under a constant condition, 2: reset with a light / dark cycle, and 3: the cycle was temperature compensated. Therefore, we concluded that this rhythm is a circadian rhythm.
考察
本実施例では、クラミドモナスの葉緑体ゲノムにおける発光レポーター系の開発を試みた。葉緑体ゲノムのコドン使用頻度に最適化したLUC+ cp遺伝子の人工合成を行い、これを発光レポーター遺伝子として使用することでpsbD::LUC+cp株の生物発光リズムのリアルタイム測定に成功した(図5〜8)。この生物発光リズムは、概日リズムの3つの条件を満たしていた。すなわち、恒常条件下において、約24時間周期の明確なリズムを示し(図5,6)、明暗周期でリセットされ(図7)、リズムの周期は温度補償されていた(図8)。したがって、psbD::LUC+cp株の生物発光リズムは概日リズムであると結論した。本研究で成功した葉緑体ゲノムにおける概日リズムのリアルタイムモニタリングは世界初である。今後この成果により、概日時計がいかにして葉緑体ゲノムをコントロールするかというメカニズムが解明されると期待される。
Discussion In this example, an attempt was made to develop a luminescent reporter system in the chloroplast genome of Chlamydomonas. We succeeded in real-time measurement of bioluminescence rhythm of psbD :: LUC + cp strain by artificially synthesizing LUC + cp gene optimized for codon usage of chloroplast genome and using it as luminescent reporter gene ( Figures 5-8). This bioluminescence rhythm met three conditions of circadian rhythm. That is, under constant conditions, it showed a clear rhythm with a period of about 24 hours (FIGS. 5 and 6), reset with a light-dark cycle (FIG. 7), and the rhythm cycle was temperature compensated (FIG. 8). Therefore, it was concluded that the bioluminescence rhythm of psbD :: LUC + cp strain was circadian rhythm. This is the world's first real-time monitoring of circadian rhythm in the chloroplast genome. This result is expected to elucidate the mechanism by which the circadian clock controls the chloroplast genome.
引用文献
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生物に発光遺伝子を組み込んで生きたままの細胞で遺伝子発現の変動を連続的に測定する生物発光リアルタイム測定法(図1A)は、任意の鍵遺伝子の発現制御に関与する突然変異体の網羅的分離に極めて有効な実験法であり、ポストゲノム時代の網羅的ゲノム機能解析の切札である。本発明によれば、葉緑体ゲノムにおいてこのような解析が可能である。 The bioluminescence real-time measurement method (Fig. 1A), which continuously measures gene expression fluctuations in living cells after incorporating a luminescent gene into an organism, comprehensively covers mutants involved in controlling the expression of any key gene. It is an extremely effective experimental method for separation, and is a trump card for comprehensive genome function analysis in the post-genome era. According to the present invention, such analysis is possible in the chloroplast genome.
Claims (5)
(a)配列表の配列番号1に示す、塩基配列番号1-1653で示される塩基配列からなる核酸。 The following (a) or Ranaru nucleic acid.
(a) A nucleic acid having the base sequence represented by base sequence number 1-1653 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing .
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