JP4741205B2 - Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same - Google Patents
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本発明は、金属ポルフィリン錯体包埋リポソームに関し、更に詳細には、生体内において抗癌剤あるいは抗酸化剤として作用する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームおよびその製造方法に関する。 The present invention relates to a metalloporphyrin complex-embedded liposome, and more particularly to a metalloporphyrin complex-embedded liposome that acts as an anticancer agent or antioxidant in vivo and a method for producing the same.
一般に、生体内で生成される数々の活性酸素種は炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、癌、糖尿病等多くの病態に関与しているといわれているが、通常生体では、これらの活性酸素種に対し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ等のラジカル消去酵素を備えてバランスを保っている。 In general, many reactive oxygen species generated in vivo are said to be involved in many pathological conditions such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, cancer, diabetes, etc. On the other hand, a radical scavenging enzyme such as superoxide dismutase (SOD) or catalase is provided to maintain a balance.
しかしながら、生体内の癌細胞においてはスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２ −・）が多量に存在していることが知られており、これらの酵素活性の低下していることが伺える。 However, it is known that a large amount of superoxide anion radicals (O 2 − ·) are present in cancer cells in vivo, and it can be seen that these enzyme activities are reduced.
一方、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の疾病でも、その原因は、ＳＯＤ、カタラーゼ等のラジカル消去酵素のバランスが崩れ、Ｏ２ −・などの活性種が増加したことによるものとされている。 On the other hand, even in diseases such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, diabetes, etc., the cause is attributed to the loss of the balance of radical scavenging enzymes such as SOD and catalase and the increase of active species such as O 2 −. ing.
ところで、金属ポルフィリン錯体は高いＳＯＤ活性を示すことが報告されているので、このものを生体内に投与することにより、Ｏ２ −・を初めとする活性酸素種を有効に消去させ、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることが予想される。 By the way, since it is reported that a metal porphyrin complex shows high SOD activity, by administering this in vivo, reactive oxygen species including O 2 − . It is expected to protect the living body from the in vivo damage caused.
しかし、金属ポルフィリン錯体を単独で生体内に投与することは、安全性や効果の点から問題も多く、現在まで医薬として利用するに至っていないのが実情である。 However, the administration of a metalloporphyrin complex alone in a living body has many problems from the viewpoint of safety and effectiveness, and the fact is that it has not been used as a medicine until now.
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、金属ポルフィリン錯体を安全に生体内に投与することができ、しかも金属ポルフィリン錯体の有するＳＯＤ活性を発揮させることのできる手段を提供することをその課題とするものである。 The present invention has been made in view of these points, and provides a means capable of safely administering a metalloporphyrin complex into a living body and exhibiting the SOD activity possessed by the metalloporphyrin complex. That is the subject.
また、現在臨床的に用いられておりながら、副作用が大きな問題となっているシスプラチン（ＣＤＤＰ）やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）等の抗癌剤に代わる、癌細胞にのみ選択的に効果を示す抗癌剤や、活性酸素種が関連するといわれる、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の癌以外の疾患を治療する抗酸化剤の提供もその課題とする。 In addition to anticancer agents such as cisplatin (CDDP) and mitomycin C (MMC), which are currently used clinically but have serious side effects, anticancer agents that are selectively effective only against cancer cells, and activity Another object of the present invention is to provide an antioxidant for treating diseases other than cancer such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, diabetes and the like, which are said to be associated with oxygen species.
本発明者らは、癌細胞内に存在しているＯ２ −・をターゲットとし、金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性作用を利用してこの濃度を低下させる手段について、種々検討した結果、金属ポルフィリン錯体をリポソームに埋設することにより、優れたＳＯＤ活性を有したまま安全に体内に投与可能であり、しかも血液中滞留も可能であることを見出し、本発明を完成した。 As a result of various studies on means for reducing this concentration by utilizing the SOD activity of the metalloporphyrin complex, the present inventors have targeted the O 2 − · existing in cancer cells. It was found that by embedding in liposomes, it can be safely administered into the body while having excellent SOD activity, and can be retained in blood, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームである。 That is, the present invention provides a metalloporphyrin complex-embedded liposome containing a cationized cationic metalloporphyrin complex and a lipid having liposome-forming ability, wherein the cationized cationic metalloporphyrin complex is an anionic surfactant. The cationized cationic metalloporphyrin complex part is present on the surface of the liposome or the hydrophilic part of the lipid, and the alkyl side chain of the anionic surfactant is present on the lipid. It is a metalloporphyrin complex-embedded liposome embedded in a hydrophobic part .
また、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとリポソーム形成能を有する脂質とを混合し、超音波処理することにより、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを製造することを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋リポソームの製造方法である。 In the present invention, a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant are reacted to form an ion complex, and then the ion complex and a lipid capable of forming a liposome are mixed and subjected to ultrasonic treatment. Thus, the cationized cationic metalloporphyrin complex exists in a state of forming an ion complex with the anionic surfactant, and the cationized cationic metalloporphyrin complex portion is hydrophilic on the surface of the liposome or the lipid. A method for producing a metalloporphyrin complex-embedded liposome, characterized in that a metalloporphyrin complex-embedded liposome in which the alkyl side chain of the anionic surfactant is embedded in the hydrophobic part of the lipid It is.
更に本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを有効成分として含有する医薬である。 Furthermore, the present invention provides a metalloporphyrin complex-embedded liposome containing a cationized cationic metalloporphyrin complex and a lipid having liposome-forming ability, wherein the cationized cationic metalloporphyrin complex comprises an anionic surfactant and an ion. The cationized cationic metalloporphyrin complex part is present in the form of a complex and is present on the surface of the liposome or the hydrophilic part of the lipid, and the alkyl side chain of the anionic surfactant is hydrophobic in the lipid. It is a medicament containing, as an active ingredient, a metalloporphyrin complex-embedded liposome embedded in the sex part .
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２ −・）をターゲットとし、これを確実に低減させることができるものである。 The metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention targets the superoxide anion radical (O 2 − ·) and can reliably reduce this.
従って、癌細胞中のＯ２ −・を低下させて癌の治癒に優れた効果を奏することができ、しかもその効果は選択的であるので、副作用のない新たな抗癌剤として利用可能なものである。 Therefore, O 2 − · in the cancer cells can be reduced to exert an excellent effect on cancer healing, and since the effect is selective, it can be used as a new anticancer agent having no side effects. .
また、本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、ＳＯＤ活性を有し、血液中滞留も可能であるという抗酸化剤として優れた効果を有するので、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることができるものである。 In addition, the metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention has an excellent effect as an anti-oxidant that has SOD activity and can stay in the blood, thus protecting the living body from in vivo damage caused by active oxygen. It is something that can be done.
本明細書中において、「金属ポルフィリン包埋リポソーム」とは、金属ポルフィリン錯体が、リポソームを構成する脂質中に組み込まれ、その一部がリポソーム膜外に出ているか、あるいは全くリポソーム膜内に包含されているものを意味する。 In the present specification, the “metal porphyrin-embedded liposome” means that a metal porphyrin complex is incorporated in a lipid constituting the liposome, and a part of it is outside the liposome membrane or entirely contained in the liposome membrane. Means what is being.
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックスと、リポソーム形成能を有する脂質とを含有するものである。 The metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention contains an ion complex formed by a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant and a lipid having liposome-forming ability.
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム（以下、単に「Ｐｒ包埋リポソーム」ということがある）の構成成分であるカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックス（以下、単に「イオンコンプレックス」という）は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体に界面活性剤を反応させることにより調製される。 An ion complex formed from a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant which are constituents of the metal porphyrin complex-embedded liposome of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “Pr-embedded liposome”) Simply referred to as “ion complex”) is prepared by reacting a cationized cationic metalloporphyrin complex with a surfactant.
このイオンコンプレックスを形成する成分の一つであるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体は、置換基としてカチオン性窒素原子を有する基を有するものであり、例えば、次の式（Ｉ）（II）または（III）で表すものを挙げることができる。
（式中、Ｒ１ないしＲ４は、Ｎ-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、-アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を示し、Ｒ１１ないしＲ１６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ１７ないしＲ１８は、Ｎ-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ-アルキルイミダゾリル基を示し、Ｒ２１ないしＲ２６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ２７ないしＲ２８は、アルキルアンモニオフェニル基を示す） (Wherein R 1 to R 4 represent a group selected from an N-lower alkylpyridyl group, an alkylammoniophenyl group, and an -alkylimidazolyl group, and R 11 to R 16 represent a lower alkyl group or a lower alkoxy group. , R 17 to R 18 represent an N-lower alkylpyridyl group, an alkylammoniophenyl group, or an N-alkylimidazolyl group, R 21 to R 26 represent a lower alkyl group or a lower alkoxy group, R 27 to R 28, Represents an alkylammoniophenyl group)
より具体的には、上記（Ｉ）式において、基Ｒ１-Ｒ４がメチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ２ＭＰｙＰ）、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭＰｙＰ）；基Ｒ１-Ｒ４がエチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-エチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-エチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-エチルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がプロピルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-プロピルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-プロピルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-プロピルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がブチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ブチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-ブチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ブチルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がメチルアンモニオフェニル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がメチルイミダゾリル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルイミダゾリル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルイミダゾリル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルイミダゾリル）ポルフィリン等が挙げられる。 More specifically, in the above formula (I), the group R 1 -R 4 is a methylpyridyl group, 5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin (T2MPyP), 5,10, 15,20-tetrakis (3-methylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin (T4MPyP); the group R 1 -R 4 is an ethylpyridyl group 15,20-tetrakis (2-ethylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-ethylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-ethylpyridyl) porphyrin; group R 1 5,10,15,20-tetrakis (2-propylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-propylpyridyl), wherein —R 4 is a propylpyridyl group ) Porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-propylpyridyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (2-butylpyridyl) porphyrin, wherein the group R 1 -R 4 is a butylpyridyl group, 5,10,15,20-tetrakis (3-butylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-butylpyridyl) porphyrin; group 5 wherein R 1 -R 4 is a methylammoniophenyl group , 10,15,20-tetrakis (2-methylammoniophenyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-methylammoniophenyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methyl) Ammoniophenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (2-methylimidazolyl) porphy where the group R 1 -R 4 is a methylimidazolyl group Examples include phosphorus, 5,10,15,20-tetrakis (3-methylimidazolyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methylimidazolyl) porphyrin, and the like.
また、上式（II）式において、基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］（ＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がアンモニオフェニルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（アンモニオフェニルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルイミダゾリルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルイミダゾリルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がメトキシ、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジメトキシ-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１-Ｒ１６がメチル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサメチル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１-Ｒ１６がエチル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサエチル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］等が挙げられる。 In the above formula (II), the groups R 11 , R 12 , R 14 and R 16 are methyl, the groups R 13 and R 15 are vinyl, and the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,3 , 5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin] (PPIX-DMPyAm); group R 11 , R 12 , R 14 , R 16 is methyl, group R 13, R 15 is a vinyl, group R 17, R 18 is ammonio phenyl, [1,3,5,8- tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (ammonio phenyl amide ethyl) Porphyrin]; [1,3,5,8-tetramethyl, wherein the groups R 11 , R 12 , R 14 , R 16 are methyl, the groups R 13 , R 15 are vinyl, the groups R 17 , R 18 are methylimidazolyl -2,4-Divinyl-6,7-di (methylimidazolyl) Midoechiru) porphyrin]; groups R 11, R 12, R 14 , R 16 is a methyl, group R 13, R 15 is methoxy, group R 17, R 18 is methyl pyridyl, [1,3,5,8- Tetramethyl-2,4-dimethoxy-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin]; the group R 11 -R 16 is methyl, the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,2,3 , 4,5,8-hexamethyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin]; the group R 11 -R 16 is ethyl, the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,2,3 , 4,5,8-hexaethyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin].
更に、上式（III）式において、基Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２６がメチル、基Ｒ２３、Ｒ２５がビニル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２６がメチル、基Ｒ２３、Ｒ２５がメトキシ、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジメトキシ-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１-Ｒ２６がメチル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサメチル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１-Ｒ２６がエチル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサエチル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］等が挙げられる。 Further, in the above formula (III), the groups R 21 , R 22 , R 24 and R 26 are methyl, the groups R 23 and R 25 are vinyl, and the groups R 27 and R 28 are methylammonio, [1, 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin]; group R 21 , R 22 , R 24 , R 26 is methyl, group R 23 , R [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-dimethoxy-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin], wherein 25 is methoxy and the groups R 27 and R 28 are methylammonio; [1,2,3,4,5,8-hexamethyl-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin, wherein the group R 21 -R 26 is methyl and the group R 27 , R 28 is methylammonio ]; group R 21 -R 26 are ethyl, group R 27, 28 is a methyl ammonio, [1,2,3,4,5,8- Hekisaechiru 6,7-di (methyl ammonio carbonyl ethyl) porphyrin], and the like.
これらのカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体に配位する金属としては、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等が好ましい。 Metals coordinated with these cationized cationic porphyrin complexes include iron (Fe), manganese (Mn), cobalt (Co), copper (Cu), molybdenum (Mo), chromium (Cr), and iridium (Ir). Etc. are preferred.
上記のうち、金属が配位した式（Ｉ）で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、K. Kalyanasundaram, Inorg. Chem., 23, 2453(1984)、 A. D. Adler et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 32, 2443(1970)、 T, Yonetani et al., J. Biol. Chem., 245, 2988(1970)、 P. Hambright, Inorg. Chem., 15, 2314(1976)等に記載の方法に準じて行うことができる。 Among the above, the synthesis of the cationized cationic porphyrin complex represented by the formula (I) coordinated with metal is described in K. Kalyanasundaram, Inorg. Chem., 23, 2453 (1984), AD Adler et al., J Inorg. Nucl. Chem., 32, 2443 (1970), T, Yonetani et al., J. Biol. Chem., 245, 2988 (1970), P. Hambright, Inorg. Chem., 15, 2314 (1976 ) And the like.
また、金属が配位した式（II）および（III）で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young, and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等に記載の方法に準じて行うことができる。 In addition, the synthesis of the cationized cationic porphyrin complex represented by the formulas (II) and (III) coordinated with metal was performed by E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young, and CK Chang, Chem. Lett., 1984, 991, etc.
なお、上記した金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の化学構造を示せば下の化（３）：ＭＴ２ＭＰｙＰの化学構造式および化（４）：ＭＴ４ＭＰｙＰの化学構造式のとおりである。
一方、イオンコンプレックスを形成する別の成分の一つであるアニオン系界面活性剤としては、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩が好ましく、その例としては、ラウリン酸（ＬＡＳ）、ミリスチン酸（ＭＡＳ）、パルミチン酸（ＰＡＳ）、ステアリン酸（ＳＡＳ）、オレイン酸（ＯＡＳ）等の脂肪酸のアルカリ金属塩や、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸（ＳＴＳ）、ヘキサデシル硫酸（ＳＨＳ）、オクタデシル硫酸（ＳＯＳ）等のアルキル硫酸のアルカリ金属塩挙げることができる。なお、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム等が好ましい。 On the other hand, the anionic surfactant that is one of the other components forming the ion complex is preferably an alkali metal salt of a fatty acid or an alkali metal salt of an alkyl sulfate. Examples thereof include lauric acid (LAS), Alkali metal salts of fatty acids such as myristic acid (MAS), palmitic acid (PAS), stearic acid (SAS), oleic acid (OAS), dodecyl sulfate (SDS), tetradecyl sulfate (STS), hexadecyl sulfate (SHS), Mention may be made of alkali metal salts of alkyl sulfates such as octadecyl sulfate (SOS). In addition, as an alkali metal salt of fatty acid or an alkali metal salt of alkylsulfuric acid, sodium, potassium and the like are preferable.
このイオンコンプレックスを形成するには、適当な溶媒中でカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を混合すれば良く、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤との配合比は、それらのモル比で、１：１ないし１：２０程度とすれば良い。 In order to form this ion complex, a cationized cationic metal porphyrin complex and an anionic surfactant may be mixed in an appropriate solvent, and the mixing ratio of the cationized cationic metal porphyrin complex and the anionic surfactant May be about 1: 1 to 1:20 in terms of their molar ratio.
このようにして形成されたイオンコンプレックスは、リポソーム形成能を有する脂質（以下、「脂質類」という）と混合し、リポソームを形成させるための常法によりＰｒ包埋リポソームとすることができる。 The ion complex thus formed can be mixed with a lipid having the ability to form liposomes (hereinafter referred to as “lipids”) to form Pr-embedded liposomes by a conventional method for forming liposomes.
脂質類としては、大豆レシチン（ＳＢＬ）、卵黄レシチン（ＥＹＬ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、モノオレオイル-モノアルキル-ホスファチジルコリン（ＭＯＭＡＰＣ）等を単独で含むリン脂質あるいはこれを主成分とし他の成分も含む基質（以下、「混合リン脂質」ということがある）。を挙げることができる。 Examples of lipids include soybean lecithin (SBL), egg yolk lecithin (EYL), dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine ( DOPC), monooleoyl-monoalkyl-phosphatidylcholine (MOMAPC) or the like alone or a substrate containing this as a main component and also containing other components (hereinafter sometimes referred to as “mixed phospholipid”). Can be mentioned.
混合リン脂質の調製にあたり、リン脂質と混合することのできる成分としては、オレイン酸（ＯＡＳ）等の脂肪酸、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）、Ｔｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）等の界面活性剤等を挙げることができる。 In preparing the mixed phospholipid, components that can be mixed with the phospholipid include fatty acids such as oleic acid (OAS), dimethylditetradecylammonium bromide (DTDAB), Tween-61 (TW61), Tween-80 (TW80). ) And the like.
特に、ＤＭＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等のリン脂質、ＤＴＤＡＢ、ジメチルジヘキサデシルアンモニウムブロミド（ＤＨＤＡＢ）等のカチオン性界面活性剤、ＯＡＳ、ＳＡＳ等のアニオン性界面活性剤、ＴＷ６１、ＴＷ８０等のノニオン性界面活性剤を成分とする混合脂質系より得られるリポソームは、ｐＨ感受性リポソームとなる。そして、例えばこのリポソームが癌細胞内に取り込まれると、癌細胞内が低ｐＨであるため、このリポソーム集合体の崩壊が生じ、抗癌剤のより効果的な徐放が促される。このようなｐＨ感受性リポソームにイオンコンプレックスを包埋した系（Ｐｒ包埋／ｐＨ感受性リポソーム）も合成できる。 In particular, phospholipids such as DMPC and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cationic surfactants such as DTDAB and dimethyldihexadecylammonium bromide (DHDAB), anionic surfactants such as OAS and SAS, TW61, TW80 and the like Liposomes obtained from a mixed lipid system containing a nonionic surfactant as a component are pH-sensitive liposomes. For example, when the liposome is taken into the cancer cell, the inside of the cancer cell has a low pH, so that the liposome aggregate is collapsed, and more effective sustained release of the anticancer agent is promoted. A system in which an ion complex is embedded in such a pH sensitive liposome (Pr embedded / pH sensitive liposome) can also be synthesized.
また、混合リン脂質として、リン脂質に周知のコレステロール（Ｃｈｏｌ）等を加えたものや、リン脂質にポリエチレングリコールまたはその誘導体を加えたものを挙げることができる。 Examples of mixed phospholipids include those obtained by adding well-known cholesterol (Chol) and the like to phospholipids, and those obtained by adding polyethylene glycol or a derivative thereof to phospholipids.
上記イオンコンプレックスと脂質類からＰｒ包埋リポソーム形成させるには、まず、これら成分を適当な溶媒中に取り、これを十分混合させることが必要である。 In order to form Pr-embedded liposomes from the ion complex and lipids, it is necessary to first take these components in a suitable solvent and mix them sufficiently.
リポソーム形成に当たっての、イオンコンプレックスと脂質類の使用量は、イオンコンプレックス１モルに対し、脂質類を１０から５００モル、特に５０から３００モルとすることが好ましい。 The amount of the ion complex and lipid used for forming the liposome is preferably 10 to 500 moles, particularly 50 to 300 moles, per mole of the ion complex.
リポソームの形成は、既に公知の方法により行うことができ、例えば、上記両成分を揮発性溶媒中に溶解、混合した後、揮発性溶媒のみを揮散、除去し、次いでこれに適当な水性溶媒、例えば、精製水、生理食塩水等を加え、激しく攪拌したり、超音波処理すことによりＰｒ包埋リポソームとすることができる。 The liposome can be formed by a known method. For example, after dissolving and mixing both the above components in a volatile solvent, only the volatile solvent is volatilized and removed, and then an appropriate aqueous solvent, For example, Pr-embedded liposomes can be obtained by adding purified water, physiological saline, or the like, and stirring vigorously or sonicating.
なお、必要により、水性溶媒に代えて医薬的に有効な成分を溶解した溶液や、ある種の培地等を使用することができ、これらを内包したＰｒ包埋リポソームを得ることもできる。 If necessary, a solution in which a pharmaceutically effective ingredient is dissolved instead of an aqueous solvent, a certain type of medium, or the like can be used, and Pr-embedded liposomes containing these can also be obtained.
かくして得られたＰｒ包埋リポソームは、後記のようにその構造解析を蛍光スペクトルや動的光散乱測定等を用いて行った結果、図１に示すように、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分はリポソームの表面または脂質等の親水部に存在し、界面活性剤のアルキル側鎖は脂質の疎水性部に埋め込まれていることが示された。 The Pr-embedded liposome thus obtained was subjected to structural analysis using a fluorescence spectrum, dynamic light scattering measurement, etc. as described below. As shown in FIG. 1, the cationized cationic metal porphyrin complex portion was It was shown that the alkyl side chain of the surfactant was embedded in the hydrophobic part of the lipid, which was present on the surface of the liposome or in the hydrophilic part such as the lipid.
また、リポソームの粒径は１００ｎｍ以下であり、体内に取り込まれた際、細胞に到達可能な大きさであることがわかった。 Moreover, the particle size of the liposome was 100 nm or less, and it was found that it was a size that could reach the cells when taken into the body.
更に、後記するように、Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験を行った結果、当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体を投与した場合に比べ、Ｐｒ包埋リポソームを使用した場合の効果が優れており、この効果は、現在抗癌剤として使用されているシスプラチン（ＣＤＤＰ）やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）より格段に高いことが示された。 Furthermore, as will be described later, as a result of the anti-cancer property test of Pr-embedded liposomes, Pr-embedded liposomes were used as compared with the case where a simple cationized cationic metalloporphyrin complex as a raw material of the liposomes was administered. It was shown that this effect is much higher than cisplatin (CDDP) and mitomycin C (MMC) currently used as anticancer agents.
更にまた、Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性を評価したところ、このものは当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体と同等のＳＯＤ活性を示すことがわかり、血中滞留型のＳＯＤ化合物になり得ることがわかった。 Furthermore, when the SOD activity of the Pr-embedded liposome was evaluated, it was found that this shows an SOD activity equivalent to that of the simple cationized cationic metalloporphyrin complex that is the raw material of the liposome. It turns out that it can be a compound.
以上のように、本発明のＰｒ包埋リポソームは、優れた抗癌作用を有するものであり、癌治療の分野において抗癌剤として使用可能なものである。 As described above, the Pr-embedded liposome of the present invention has an excellent anticancer activity and can be used as an anticancer agent in the field of cancer treatment.
従って、癌患者にこのＰｒ包埋リポソームを直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。 Therefore, the cancer of the patient can be treated by administering this Pr-embedded liposome directly, intravenously, subcutaneously, etc. to the cancer patient.
同様、本発明のＰｒ包埋リポソームは、優れた抗酸化作用を有し、活性酸素のもたらす生体内障害、例えば、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病から生体を守ることができる。 Similarly, the Pr-embedded liposome of the present invention has an excellent antioxidant action and can protect the living body from in vivo damage caused by active oxygen such as inflammatory disease, neurological disease, arteriosclerosis, and diabetes.
従って、このものを炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿患者に、直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。 Therefore, by administering this to a patient with inflammatory disease, neurological disease, arteriosclerosis or diabetes by direct administration, intravenous administration, subcutaneous administration, etc., the cancer of the patient can be treated.
以下に、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these examples.
実 施 例 １
鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌを１００℃まで攪拌・加熱後、２-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌ（０.１５８ｍｏｌ）を加えた。その後、ピロール １２ｍｌ（０.１７３ｍｏｌ）を注射器で少しずつ滴下し、１００℃で１時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic type I、クロロホルム）を行い、生成物である５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.１ｇ、収率４.４％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.８２（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、７.７２〜９.１４（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.８７（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１８、５１３、５４４、５８６、６４５
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下でジメチルホルムアミド １５０ｍｌに上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン ０.２ｇ（３.２×１０−４ｍｏｌ）を加えて溶解させ、さらに、鉄 ０.２ｇと４８％臭化水素酸 ５ｍｌより得た臭化鉄（ＦｅＢｒ２）を加えて４時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。
抽出、カラムカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、前駆体の鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量０.２１ｇ、収率９４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
４０８、５１２、５６６
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）ジメチルホルムアミド ３０ｍｌ中に、上記（２）で得た鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］ ０.１ｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル ６ｍｌとを加え、１３０℃で５時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、目的物質であるＦｅＴ２ＭＰｙＰを得た（収率９１％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４０８、５８４
元素分析（％）：
Ｆｏｕｎｄ. Ｃ７５.１１、Ｈ３.９７、Ｎ１７.６６、Ｃ／Ｎ４.２５
Ｃａｌｃｄ. Ｃ７７.５８、Ｈ４.２４、Ｎ１８.１２、Ｃ／Ｎ４.２８
（４）工程（１）において、２-ピリジルカルボキシアルデヒドを４-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にして鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＭＴ４ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）も上記に準じて合成できる。
Example 1
Synthesis of iron [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (FeT2MPyP):
(1) After stirring and heating 500 ml of propionic acid to 100 ° C., 15 ml (0.158 mol) of 2-pyridylcarboxaldehyde was added. Thereafter, 12 ml (0.173 mol) of pyrrole was added dropwise little by little with a syringe, and the mixture was refluxed at 100 ° C. for 1 hour for cyclization condensation. After the reaction, the mixture was allowed to cool to room temperature, and the solvent was distilled off. Neutralization, washing and column chromatography (alumina basic type I, chloroform) were performed to obtain 5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin as a product (yield 1.1 g, yield 4). .4%).
1 H-NMR δ H (CDCl 3 , ppm):
-2.82 (pyrrole NH H, 2H), 7.72-9.14 (pyridine H, 16H), 8.87 (pyrrole H, 8H)
UV-vis λ max (chloroform, nm):
418, 513, 544, 586, 645
FAB-Mass (m / z):
619, 620
(2) Next, 0.2 g (3.2 × 10 −4 ) of 5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin obtained in (1) above was added to 150 ml of dimethylformamide under an argon (Ar) atmosphere. mol) was added and dissolved, and iron bromide (FeBr 2 ) obtained from 0.2 g of iron and 5 ml of 48% hydrobromic acid was added and refluxed for 4 hours. After the reaction, the mixture was allowed to cool to room temperature, and the solvent was distilled off.
Extraction and column column chromatography (alumina basic type I, methanol) were performed to obtain precursor iron [5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin] (yield 0.21 g, yield 94%). ).
UV-vis λ max (methanol, nm):
408, 512, 566
FAB-Mass (m / z):
672
(3) In 30 ml of dimethylformamide, 0.1 g of iron [5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin] obtained in (2) above and 6 ml of methyl p-toluenesulfonate are added. Reflux at 5 ° C. for 5 hours. After refluxing, the mixture was allowed to cool to room temperature and the solvent was distilled off. Extraction and column chromatography (alumina basic type I, methanol) were performed to obtain the target substance FeT2MPyP (yield 91%).
UV-vis λ max (water, nm):
408, 584
Elemental analysis (%):
Found. C75.11, H3.97, N17.66, C / N4.25
Calcd. C77.58, H4.24, N18.12, C / N4.28
(4) Iron [5,10,15,20-tetrakis (step (1)) is the same as steps (1) to (3) except that 2-pyridylcarboxaldehyde is changed to 4-pyridylcarboxaldehyde. 4-methylpyridyl) porphyrin] (FeMT4MPyP) was obtained. Other metals [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) and other metals [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) It can be synthesized according to the above.
実 施 例 ２
鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］ ５００ｍｇ（８.１×１０−４ｍｏｌ）を含むテトラハイドロフラン／トリエチルアミン溶液（１０：１）１１０ｍｌを冷却し、これにクロロギ酸エチル ０.３３ｍｌ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えて９０分間反応させた。さらに、４-アミノピリジン ０.２０ｇ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えてさらに１時間反応させ、その後室温で１晩放置した。
溶媒を留去した後、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／水（９／１）］、再結晶により精製し、前駆体である鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］を得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８５、５９６、６４３
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７６７
（２）次に、上記の前駆体 ３０ｍｇ（３.９×１０−５ｍｏｌ）およびｐ-トルエンスルホン酸メチル ０.７５ｍｌをジメチルホルムアミド ２０ｍｌ中に溶解させて還流（１３０℃、５時間）した。室温まで冷却し、その後溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー［酸性アルミナ、メタノール］で精製し、目的物質であるＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８１、５７９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７９７
（３）工程（１）の鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］に代え、他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］を使用し、工程（１）および工程（２）と同様にして他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）を合成することができる。
Example 2
Synthesis of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridylamidoethyl)] porphyrin] (FePPIX-DMPyAm):
(1) Tetrahydro containing 500 mg (8.1 × 10 −4 mol) of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] 110 ml of a furan / triethylamine solution (10: 1) was cooled, and 0.33 ml (2.0 × 10 −3 mol) of ethyl chloroformate was added thereto and reacted for 90 minutes. Further, 0.20 g (2.0 × 10 −3 mol) of 4-aminopyridine was added, and the mixture was further reacted for 1 hour, and then left overnight at room temperature.
After the solvent was distilled off, column chromatography [silica gel, methanol / water (9/1)] and purification by recrystallization were carried out, and the precursor iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4] -Divinyl-6,7- (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin] was obtained (yield 30 mg).
UV-vis λ max (methanol, nm):
398, 485, 596, 643
FAB-Mass (m / z):
767
(2) Next, 30 mg (3.9 × 10 −5 mol) of the above precursor and 0.75 ml of methyl p-toluenesulfonate were dissolved in 20 ml of dimethylformamide and refluxed (130 ° C., 5 hours). After cooling to room temperature, the solvent was distilled off. Purification by column chromatography [acidic alumina, methanol] gave the target substance FePPIX-DMPyAm (yield 30 mg).
UV-vis λ max (methanol, nm):
398, 481, 579
FAB-Mass (m / z):
797
(3) Instead of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] in step (1), other metals [[1, 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] in the same manner as in steps (1) and (2) [[1 , 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridamidoethyl)] porphyrin] (MPPIX-DMPyAm) can be synthesized.
実 施 例 ３
マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌ中に４-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌを加えて加温し、１００℃になった後にピロール１２ｍｌを加えて１時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、クロロホルム）等で生成し、紫色結晶として５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.６８ｇ、収率７.０８％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.９（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、８.２〜９.１（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.９（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１７、５１３、５４６、５８９、６４１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン １００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 １００ｍｌを、アルゴン（Ａｒ）置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ３７０ｍｇを加えて、Ａｒ下で３時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、抽出、減圧乾燥等を行い、マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量８１.８ｍｇ、収率７５.２％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４７７、５７９、６１１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）次に、上記のマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］ ２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル １２ｍｌとを反応させた（１２０℃、５時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー［（１）酸性アルミナおよび（２）塩基性アルミナ、メタノール］を行い、目的物質であるＭｎＴ４ＭＰｙＰを得た（収量１５３ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４６２、５５９、６３６
（４）工程（１）において、４-ピリジルカルボキシアルデヒドを２-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にしてマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）も上記と同様にして合成できる。
Example 3
Synthesis of manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MnT4MPyP):
(1) 15 ml of 4-pyridylcarboxaldehyde was added to 500 ml of propionic acid and heated. After reaching 100 ° C., 12 ml of pyrrole was added and refluxed for 1 hour. After the reaction, the mixture was allowed to cool, evaporated, neutralized and washed. Then, it produced | generated by column chromatography (basic alumina, chloroform) etc., and 5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin was obtained as a purple crystal (yield 1.68 g, yield 7.08%). ).
1 H-NMR δ H (CDCl 3 , ppm):
-2.9 (pyrrole NH H, 2H), 8.2-9.1 (pyridine H, 16H), 8.9 (pyrrole H, 8H)
UV-vis λ max (chloroform, nm):
417, 513, 546, 589, 641
FAB-Mass (m / z):
619, 620
(2) Next, 100 ml of a dimethylformamide solution containing 100 mg of 5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin obtained in (1) above was substituted with argon (Ar), and then manganese acetate / tetrahydrate 370 mg of Japanese product was added and refluxed under Ar for 3 hours. After the reaction, cooling, evaporation, extraction, drying under reduced pressure and the like were performed to obtain manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin] (yield 81.8 mg, yield 75.2%). ).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
477, 579, 611
FAB-Mass (m / z):
672
(3) Next, 200 mg of the above manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin] was reacted with 12 ml of methyl p-toluenesulfonate (120 ° C., 5 hours). After the reaction, the mixture was allowed to cool, extracted, etc., and subjected to column chromatography [(1) acidic alumina and (2) basic alumina, methanol] to obtain MnT4MPyP as the target substance (yield 153 mg).
UV-vis λ max (water, nm):
462, 559, 636
(4) Manganese [5,10,15,20-tetrakis (4) in the same manner as in steps (1) to (3) except that 4-pyridylcarboxaldehyde is changed to 2-pyridylcarboxaldehyde in step (1). 2-methylpyridyl) porphyrin] (MnT2MPyP) was obtained. Other metals [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) and other metals [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) It can be synthesized in the same manner as above.
実 施 例 ４
マンガン［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）ＥＣ法［例えば、 E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等］に基づき、１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン（プロトホルフィリンＩＸ） １ｇとクロロギ酸エチル ２ｍｌをテトラヒドロフラン／トリエチルアミン（２５０／３ｍｌ）中、０℃で１時間反応させ、酸クロライド体を得た。
この酸クロライド体と４-アミノピリジン １.６８ｇを同一条件で２時間反応させ、さらに、室温で終夜反応させた。反応後、エバポレーション、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／クロロホルム（１／９）］を行い、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.４６９g、収率６８.４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４０７、５０６、５４２、５７５、６２９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７１５
（２）次に、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン ２００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 ２００ｍｌをＡｒ置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ６８６ｍｇを加えて、Ａｒ下で６時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、洗浄、減圧乾燥等を行い、マンガン［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.１０６ｍｇ、収率４５.７％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
３８７、４６５、５５７、６２１
（３）更に、上記のマンガン錯体２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチルを９ｍｌとを反応させた（１４０℃、６時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー（酸性アルミナ、メタノール）を行い、目的物質であるＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ［収量８０.５ｍｇ、収率３７.５％］を得た。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
３８９、４６７、５５６、６２２
Example 4
Synthesis of Manganese [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridylamidoethyl)] porphyrin] (MnPPIX-DMPyAm):
(1) 1,3,5,8-tetramethyl based on EC method [for example, E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and CK Chang, Chem. Lett., 1984, 991 etc.] -2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin (protoporphyrin IX) and 2 ml of ethyl chloroformate in tetrahydrofuran / triethylamine (250/3 ml) at 0 ° C. for 1 hour, A chloride body was obtained.
This acid chloride and 1.68 g of 4-aminopyridine were reacted under the same conditions for 2 hours, and further reacted at room temperature overnight. After the reaction, evaporation and column chromatography [silica gel, methanol / chloroform (1/9)] were performed to obtain [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4- Pyridylamidoethyl)] porphyrin was obtained (yield 0.469 g, yield 68.4%).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
407, 506, 542, 575, 629
FAB-Mass (m / z):
715
(2) Next, 200 ml of a dimethylformamide solution containing 200 mg of [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin was substituted with Ar. , 686 mg of manganese acetate tetrahydrate was added and refluxed under Ar for 6 hours. After the reaction, it is allowed to cool, evaporate, wash, and dry under reduced pressure to produce manganese [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin. (Yield 0.106 mg, Yield 45.7%).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
387, 465, 557, 621
(3) Further, 200 mg of the above manganese complex was reacted with 9 ml of methyl p-toluenesulfonate (140 ° C., 6 hours). After the reaction, the mixture was allowed to cool, extracted, etc., and subjected to column chromatography (acidic alumina, methanol) to obtain the target substance MnPPIX-DMPyAm [yield: 80.5 mg, yield: 37.5%].
UV-vis λ max (water, nm):
389, 467, 556, 622
実 施 例 ５
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その１）：
試験管に、実施例２で得たＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ １μｍｏｌおよび脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ） ２００μｍｏｌを取り、更に少量のメタノールを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 １０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（室温、１ｈｒ）および濾過滅菌（０.２２μｍφ）を行い、ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品１）を得た。
同様、実施例４で得たＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍとＤＭＰＣを用い、ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品２）を得た。
Example 5
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 1):
In a test tube, 1 μmol of FePPIX-DMPyAm obtained in Example 2 and 200 μmol of dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) as a lipid were taken, and further mixed with a small amount of methanol. After the solvent was distilled off to form a thin film, 10 ml of physiological saline was added thereto and subjected to ultrasonic treatment (under Ar, in an ice bath, 30 W, 30 min, probe type ultrasonic irradiation device). After sonication, standing (room temperature, 1 hr) and filter sterilization (0.22 μmφ) were performed to obtain DMPC liposomes (Product 1 of the present invention) embedded with FePPIX-DMPyAm.
Similarly, using the MnPPIX-DMPyAm and DMPC obtained in Example 4, DMPC liposomes (Product 2 of the present invention) embedded with MnPPIX-DMPyAm were obtained.
実 施 例 ６
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その２）：
（１）カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体であり、実施例１で得られたＦｅＴ２ＭＰｙＰ１.４ｍｇ（１μｍｏｌ）と、界面活性剤であるＳＡＳ０.３ｍｇ（１μｍｏｌ）を試験管に取り、これに溶媒としてメタノール５ｍｌを加えて混合し、イオンコンプレックス１（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ）を調製した。
また、上記のＳＡＳ １μｍｏｌに代え、ＳＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）およびＯＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）を用い、それぞれイオンコンプレックス２（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）およびイオンコンプレックス３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ）を得た。
同様に、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体として、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（モル比１：１）、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（モル比１：１）を用い、界面活性剤として、ＳＡＳ、ＯＡＳを用い、表１に示すようなイオンコンプレックス４-１４を調製した。
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 2):
(1) Cationic cationic metalloporphyrin complex, FeT2MPyP 1.4 mg (1 μmol) obtained in Example 1 and surfactant SAS 0.3 mg (1 μmol) were placed in a test tube, and methanol was used as the solvent. 5 ml was added and mixed to prepare Ion Complex 1 (FeT2MPyP + 1SAS).
Also, instead of the above SAS 1 μmol, 1.2 mg (4 μmol) of SAS and 1.2 mg (4 μmol) of OAS were used to obtain ion complex 2 (FeT2MPyP + 4SAS) and ion complex 3 (FeT2MPyP + 4OAS), respectively.
Similarly, FeT4MPyP, MnT2MPyP, MnT4MPyP, FeT2MPyP + MnT2MPyP (molar ratio 1: 1), FeT4MPyP + MnT4MPyP (molar ratio 1: 1) are used as the cationized cationic metal porphyrin complex, and SAS and OAS are used as the surfactant. Ion complex 4-14 as shown in 1 was prepared.
（２）次に、試験管に上記のイオンコンプレックス１（１μｍｏｌ）と、脂質であるＤＭＰＣ ０.１３５ｇ（２００μｍｏｌ）を取り、溶媒として少量のクロロホルムを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 １０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（室温、１ｈｒ）および濾過滅菌（０.２２μｍφ）し、Ｐｒ包埋リポソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム；本発明品３）を得た。
同様、イオンコンプレックス２とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス４とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス５とＤＭＰＣを用い、Ｐｒ包埋リポソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品４；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品５；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品６）を得た。
また、イオンコンプレックス４と卵黄レシチン（ＥＹＬ）より、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソーム（本発明品７）を得た。
(2) Next, the above-mentioned ion complex 1 (1 μmol) and 0.135 g (200 μmol) of DMPC as a lipid were taken in a test tube and mixed using a small amount of chloroform as a solvent. After the solvent was distilled off to form a thin film, 10 ml of physiological saline was added thereto and subjected to ultrasonic treatment (under Ar, in an ice bath, 30 W, 30 min, probe type ultrasonic irradiation device). After sonication, it was allowed to stand (room temperature, 1 hr) and sterilized by filtration (0.22 μmφ) to obtain Pr-embedded liposomes (FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes; product 3 of the present invention).
Similarly, Pr-embedded liposome (FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome / present product 4; MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome / present product 5; MnT4MPyP + 4SAS) using ion complex 2 and DMPC, ion complex 4 and DMPC, ion complex 5 and DMPC An embedded DMPC liposome / product of the present invention 6) was obtained.
Further, from the ion complex 4 and egg yolk lecithin (EYL), MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome (product of the present invention 7) was obtained.
実 施 例 ７
Ｐｒ包埋／ｐＨ感受性リポソームの合成：
（１）ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、オレイン酸（ＯＡＳ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）、Ｔｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）等を用い、表２に示す混合脂質Ａ〜Ｄを調製した。
Synthesis of Pr embedded / pH sensitive liposomes:
(1) Mixed lipid A shown in Table 2 using dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dimethylditetradecylammonium bromide (DTDAB), oleic acid (OAS), Tween-61 (TW61), Tween-80 (TW80), etc. -D was prepared.
（２）表２に示す混合脂質ＡないしＤ、２０２μｍｏｌと、実施例６で得たイオンコンプレックス１ １μｍｏｌとを用い、ｐＨ感受性Ｐｒ包埋リポソーム（本発明品８〜１１）を実施例６（２）と同様にして調製した。 (2) Using the mixed lipids A to D shown in Table 2, 202 μmol, and 11 μmol of the ion complex 1 obtained in Example 6, pH-sensitive Pr-embedded liposomes (Products 8 to 11 of the present invention) were prepared in Example 6 (2). ).
実 施 例 ８
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その４）：
表１に示すイオンコンプレックス３ １μｍｏｌと、 表２に示す脂質Ａ、ＢおよびＤ ２００μｍｏｌを、表３に示す組み合わせて用い、以下実施例６（２）と同様にしてｐＨ感受性Ｐｒ包埋リポソーム（本発明品１２〜１４）調製した。
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 4):
Using 1 μmol of ion complex 3 shown in Table 1 and 200 μmol of lipids A, B, and D shown in Table 2 in combination shown in Table 3, the pH-sensitive Pr-embedded liposome (this is the same as in Example 6 (2)) Inventions 12-14) Prepared.
実 施 例 ９
Ｐｒ包埋リポソームの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察：
Ｐｒ包埋リポソームの形態、粒径等を評価するため、凍結割断レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察（ＪＥＯＬ、ＪＥＭ-１２００ＥＸ）を行った。実施例６で得たＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）のＴＥＭ観察より、粒径が１００ｎｍ以下の二分子膜小胞体であるリポソームが形成されていることがわかり、さらに、精査すると２０〜３０ｎｍ程度および５０〜６０ｎｍｍｉｎ程度の平均粒径といった２つの粒径分布を有する二分子膜小胞体（リポソーム）が観測された。
Example 9
Observation of Pr-embedded liposome by transmission electron microscope (TEM):
In order to evaluate the morphology, particle size, and the like of Pr-embedded liposomes, transmission electron microscope (TEM) observation (JEOL, JEM-1200EX) was performed by a freeze-fracture replica method. From the TEM observation of the FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome (product 4 of the present invention) obtained in Example 6, it was found that a liposome that is a bilayer vesicle having a particle size of 100 nm or less was formed. Bilayer vesicles (liposomes) having two particle size distributions of about ˜30 nm and an average particle size of about 50 to 60 nm min were observed.
実 施 例 １０
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームの粒径および粒径分布を測定するため動的光散乱測定（ Nicomp 370、Particle Sizing System）を行った。例えば、実施例９に従い合成したＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）の動的光散乱測定より、体積分布では平均粒径２４.６ｎｍのものが６１.２％、５８.４ｎｍのものが３８.８％の２種類存在していた（数分布では平均粒径２３.２ｎｍのものが９４.５％、５２.５ｎｍのものが５.５％）。この結果はＴＥＭ観察による粒径分布の結果と対応した。
また、実施例５ないし６で合成したＰｒ包埋リポソームの動的光散乱測定結果を表４に示す。
Dynamic light scattering measurement of Pr-embedded liposome (Part 1):
Dynamic light scattering measurement (Nicomp 370, Particle Sizing System) was performed to measure the particle size and particle size distribution of Pr-embedded liposomes. For example, from dynamic light scattering measurement of FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (Product 4 of the present invention) synthesized according to Example 9, the volume distribution shows that the average particle diameter is 24.6 nm is 61.2%, and 58.4 nm. There were two types of 38.8% (in the number distribution, those with an average particle diameter of 23.2 nm were 94.5% and those with 52.5 nm were 5.5%). This result corresponded to the result of particle size distribution by TEM observation.
Table 4 shows the results of dynamic light scattering measurement of the Pr-embedded liposomes synthesized in Examples 5 to 6.
表４より、どのＰｒ包埋リポソームの平均粒径も１００ｎｍ以下であり、体内に投与した場合毛細血管内皮を越えて目的の細胞に到達可能であることが明らかとなった。 Table 4 shows that the average particle size of any Pr-embedded liposome is 100 nm or less, and that when administered into the body, it is possible to reach the target cell beyond the capillary endothelium.
実 施 例 １１
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その２）：
実施例１０と同様にして、実施例６に従い合成したＭｎＴ４ＭＰｙＰ-１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品６）について動的光散乱測定を行った。
この結果、本発明品５の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.８％で、残りは平均粒径１７３ｎｍのものが０.２％程度）、本発明品６の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.７％で、残りは平均粒径１７１ｎｍのものが０.３％程度）であり、いずれもその平均粒径１００ｎｍ以下であって生体内投与しても問題の無い大きさであった。
Example 11
Dynamic light scattering measurement of Pr-embedded liposome (Part 2):
In the same manner as in Example 10, dynamic light scattering measurement was performed on MnT4MPyP-1SAS embedded DMPC liposomes (product 5 of the present invention) and MnT4MPyP-4SAS embedded DMPC liposomes (product 6 of the present invention) synthesized according to Example 6. .
As a result, the average particle size of the product 5 of the present invention is 29 nm (distribution ratio is 99.8%, the rest is about 0.2% when the average particle size is 173 nm), and the average particle size of the product 6 of the present invention is 29 nm ( The distribution ratio is 99.7%, and the rest is about 0.3% with an average particle size of 171 nm), both of which have an average particle size of 100 nm or less and can be administered in vivo. there were.
実 施 例 １２
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定：
（１）Ｐｒ包埋リポソームにおいて、包埋したポルフィリン錯体がリポソーム内のどの位置に存在しているかを評価するため、Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣ）を行った。
この測定においては、金属ポルフィリン錯体は一般に蛍光消光するため、金属ポルフィリン錯体に代え、金属挿入を行っていないカチオン化カチオン性金属フリーポルフィリン錯体（以下、「金属フリー錯体」という）を実施例１、２等に準じて合成し、これを蛍光プローブとして用いた。また、金属フリー錯体包埋リポソームの合成は実施例５〜６に準じて行った。（以下、金属フリー錯体の略号としては、Ｍの代わりにカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体の略号中のＭを、Ｈ２に代えて示す。例えば、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）の金属フリー錯体はＨ２Ｔ２ＭＰｙＰと、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の金属フリー体ではＨ２Ｔ４ＭＰｙＰと示す。）
上記のようにして、調製したカチオン化カチオン性金属フリー錯体包埋リポソーム、例えば、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＨ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ 含有各種溶液におけるＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトル測定（励起波長４５６ｎｍ、測定波長範囲５００〜８００ｎｍ）を行ったところ、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム水溶液では６４２ｎｍにピークを有する蛍光スペクトル（６４２ｎｍでの相対蛍光強度４３％）が得られ、メタノール（４７％）、エタノール（５４％）、プロパノール（５４％）、ブタノール（５５％）、エチレングリコール（６３％）等の各種溶媒中でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルも同様のスペクトル波形および強度であった。しかし、水でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは６４２ｎｍ付近のピークがブロードし、強度も大きく低下した（１１％）。
これより、リポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。また、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの結果も同様であった。
一方、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは、６５０ｎｍ付近にピークを示し、そのピーク強度は水およびメタノール中でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光強度の中間であった（蛍光強度 水＜包埋リポソーム溶液＜メタノール）。これより、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液のＨ２Ｔ４ＭＰｙＰは水環境に存在するものよりもやや非極性な（やや疎水的な）環境に存在すると判断される。
（２）次に、リポソームの二分子膜親水部付近に存在して二分子膜の極性、流動性等の指標となる蛍光プローブである８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を用いた蛍光スペクトル測定を行った。まず、メタノール、メタノール／クロロホルムおよびＡＮＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ポルフィリン錯体は包埋されていない）溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルは、どれも４８５ｎｍ（励起波長３８５ｎｍ）にピークを示す類似のスペクトルとなった。次に、ポルフィリン錯体とＡＮＳを一緒に包埋したＤＭＰＣリポソーム溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルを測定したところ、４８５ｎｍではなく４５０および５００ｎｍの２つのピークを示し、これら２つのピーク蛍光強度も４８５ｎｍでのそれに比べて減少した。この付近にポルフィリン錯体のＳｏｒｅｔ帯の吸収ピークが存在することより、ＡＮＳとポルフィリン錯体の相互作用が生じたと考えられ、ポルフィリン錯体はＡＮＳ近傍に存在すると考えられる。これらのことよりリポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
Example 12
Measurement of fluorescence spectrum of Pr-embedded liposome:
(1) In Pr-embedded liposomes, the fluorescence spectrum of Pr-embedded liposomes was measured (Shimadzu Corporation, RF-5300PC) in order to evaluate where the embedded porphyrin complex is present in the liposomes.
In this measurement, since a metal porphyrin complex generally quenches fluorescence, a cationized cationic metal free porphyrin complex (hereinafter referred to as “metal free complex”) in which metal insertion is not performed is used in Example 1, instead of metal porphyrin complex. It was synthesized according to 2 etc. and used as a fluorescent probe. Moreover, the synthesis | combination of the metal free complex embedding liposome was performed according to Examples 5-6. (Hereinafter, the abbreviation for the metal-free complex, the M in the abbreviation of cationic cationic metalloporphyrin complex instead of M, shown in place of the H 2. For example, metal [5,10,15,20-tetrakis ( The metal-free complex of 2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) is H 2 T2MPyP and the metal-free complex of metal [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) is H 2 T4MPyP. .)
Measurement of fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP (excitation wavelength 456 nm, measurement wavelength) in various solutions containing cationized cationic metal-free complex-embedded liposomes prepared as described above, for example, H 2 T2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes and H 2 T2MPyP + 4SAS range 500 to 800 nm) was carried out, the relative fluorescence intensity 43% in the fluorescence spectrum (642nm with a peak at 642nm in H 2 T2MPyP + 4SAS embedded DMPC liposome solution) is obtained, methanol (47%), ethanol (54% ), Propanol (54%), butanol (55%), ethylene glycol (63%), and the like, and the fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP in the various solvents had the same spectrum waveform and intensity. However, in the fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP in water, the peak around 642 nm was broadened, and the intensity was greatly reduced (11%).
From this, it is considered that H 2 T2MPyP embedded in the liposome exists in a polar environment similar to the above-mentioned alcohols and exists in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer membrane. The results of H 2 T2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and H 2 T2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposomes were also the same.
On the other hand, the fluorescence spectrum of H 2 T4MPyP in the H 2 T4MPyP-4SAS-embedded DMPC liposome solution showed a peak near 650 nm, and the peak intensity was intermediate between the fluorescence intensity of H 2 T4MPyP in water and methanol. (Fluorescence intensity water <embedded liposome solution <methanol). From this, H 2 T4MPyP of H 2 T4MPyP-4SAS embedded DMPC liposome solution somewhat non-polar than those present in the water environment (somewhat hydrophobic) is determined to be present in the environment.
(2) Next, 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS), which is a fluorescent probe that is present in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer membrane of the liposome and serves as an indicator of the polarity and fluidity of the bilayer membrane, was used. Fluorescence spectrum measurement was performed. First, the fluorescence spectrum of ANS in methanol, methanol / chloroform, and ANS-embedded DMPC liposome (no porphyrin complex is embedded) solution is a similar spectrum with a peak at 485 nm (excitation wavelength: 385 nm). It was. Next, when the fluorescence spectrum of ANS in a DMPC liposome solution embedded with a porphyrin complex and ANS was measured, it showed two peaks at 450 and 500 nm instead of 485 nm, and these two peak fluorescence intensities were also at 485 nm. Decreased compared to that of. Since there is an absorption peak in the Soret band of the porphyrin complex in the vicinity, it is considered that the interaction between the ANS and the porphyrin complex has occurred, and the porphyrin complex is believed to exist in the vicinity of the ANS. From these facts, it is considered that H 2 T2MPyP embedded in the liposome exists in a polar environment similar to the above alcohols and exists in the vicinity of the hydrophilic part of the bilayer membrane.
実 施 例 １３
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その１）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在する８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ、５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜の相転移温度（Ｔｃ＝２３℃）付近で蛍光偏光度の減少がみられた。これに対し、ＡＮＳを含有した本発明品３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、上記のブランクと同様にＴｃ付近で蛍光偏光度の減少が見られたが、その減少の度合いは小さいものであった。この度合いの低下はＦｅＴ２ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。また、ｐＨ感受性ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでの結果も同様であった。
Example 13
Measurement of fluorescence depolarization of Pr-embedded liposome (Part 1):
Fluorescence depolarization measurement in Pr-embedded liposomes using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS, 50 μM) present in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer as a fluorescent probe (Shimadzu Corporation, RF-5300PC and RF-540) Polarization measurement accessory for / 5000; measurement temperature range 5 to 45 ° C., excitation wave 385 nm, fluorescence wavelength 510 nm).
Regarding the relationship between the temperature and the degree of polarization of the fluorescence depolarization measurement of DMPC liposomes (blanks) containing ANS, a decrease in the degree of fluorescence polarization was observed near the phase transition temperature (Tc = 23 ° C.) of the DMPC liposome bilayer membrane. In contrast, in the temperature-polarization degree relationship of fluorescence depolarization measurement of the product 3 of the present invention containing ANS (FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome), a decrease in the degree of fluorescence polarization was observed in the vicinity of Tc as in the above blank. However, the degree of decrease was small. This decrease in the degree is based on the interaction between the ion complex of FeT2MPyP and SAS and DMPC, and confirms that the ion complex exists in the DMPC liposome bilayer membrane. Moreover, the results with the pH-sensitive FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposome were also the same.
実 施 例 １４
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その２）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在するＡＮＳ（５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係（逆シグモイダル曲線）より、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜のゲル-液晶相転移温度（Ｔｃ）は約２３℃となった。ＡＮＳを含有した本発明品５（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係は、上記のブランクに比べやや低温側に移行し、縦軸の偏光度もゲル領域で減少した。これらのことは、ＭｎＴ４ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣとの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
Example 14
Measurement of fluorescence depolarization of Pr-embedded liposome (Part 2):
Fluorescence depolarization measurement in Pr-embedded liposomes using ANS (50 μM) present in the vicinity of the hydrophilic part of the bilayer as a fluorescent probe (Shimadzu Corporation, polarization measurement accessory for RF-5300PC and RF-540 / 5000; measurement temperature) (Range 5 to 45 ° C., excitation wave 385 nm, fluorescence wavelength 510 nm).
From the temperature-polarization degree relationship (inverse sigmoidal curve) of fluorescence depolarization measurement of DMPC liposome (blank) containing ANS, the gel-liquid crystal phase transition temperature (Tc) of DMPC liposome bilayer was about 23 ° C. . The relationship between the temperature and the degree of polarization of the fluorescence depolarization measurement of the product 5 of the present invention containing ANS (MnT4MPyP + 1SAS embedded DMPC liposome) is slightly lower than that of the blank, and the degree of polarization on the vertical axis is also in the gel region. Diminished. These facts are based on the interaction between the ion complex of MnT4MPyP and SAS and DMPC, and support that the ion complex exists in the DMPC liposome bilayer membrane.
実 施 例 １５
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その１）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム系（本発明品４、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、参照試料としては、対応するカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）を用いた。また、細胞としては、マウス肺ガン癌細胞［Lewis Lung Carcinoma(LLC)、理研ジーンバンク）を用いた。
試験は、１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地で、マウス肺ガン癌細胞を培養し、次いで細胞数計測および細胞濃度調製を行った細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加え（１００μｌ／ｗｅｌｌ、細胞数１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、二酸化炭素インキュベーター（ＣＯ２５％）内で２４時間培養した。ウェルプレート内の培地を除去後、予め調製しておいた各濃度の試料溶液を添加し（１００ｌ／ｗｅｌｌ、試料濃度０〜１００μＭ）、さらにＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。
濾過滅菌したアラマー・ブルー溶液を、１０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、さらに５時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定（測定波長５７０ｎｍおよび参照波長６００ｎｍ）を行った。
この結果、図２のように本発明のＰｒ包埋リポソーム（リポソーム系）はカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系に比べてより良い抗癌特性を示した。
Example 15
Anticancer property test of Pr-embedded liposome (Part 1):
The anticancer properties of the Pr-embedded liposomes of the present invention were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method.
As a test sample, FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome system (product of the present invention 4, FeT2MPyP concentration 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) and as a reference sample, a corresponding cationized cationic metal porphyrin complex (FeT2MPyP) And an ion complex system (FeT2MPyP + 4SAS) was used. As the cells, mouse lung cancer cancer cells [Lewis Lung Carcinoma (LLC), Riken Genebank) were used.
In the test, mouse lung cancer cancer cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS, and then the cell suspension obtained by counting the number of cells and adjusting the cell concentration was added to each well of a 96-well plate (100 μl / well, cell number 1 × 10 4 cells / well), and cultured in a carbon dioxide incubator (CO 2 5%) for 24 hours. After removing the medium in the well plate, a sample solution of each concentration prepared in advance was added (100 l / well, sample concentration 0 to 100 μM), and further incubated in a CO 2 incubator for 24 hours.
The filter sterilized Alamar Blue solution was added at 10 μl / well and further incubated for 5 hours. Thereafter, absorbance measurement (measurement wavelength: 570 nm and reference wavelength: 600 nm) was performed using a microplate reader.
As a result, as shown in FIG. 2, the Pr-embedded liposome of the present invention (liposome system) exhibited better anticancer properties than the cationized cationic metalloporphyrin complex (FeT2MPyP) and the ion complex system.
実 施 例 １６
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その２）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
本試験の試験試料としては、各種のＰｒ包埋リポソーム（金属ポルフィリン錯体濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を用い、参照試料としては、上記Ｐｒ包埋リポソームの成分である金属ポルフィリン錯体（濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）およびリポソーム（濃度、２５００、５０００、１００００、２００００μＭ）を用いた。（どちらもＰｒ包埋リポソームの濃度に対応させた。）
また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）等を用いた。実施例１５と同様に試験したところ、次のような結果が得られた。
まず、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ２ＭＰｙＰを用いた系での結果は、図３および図４に示されるが、図３からは、参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、イオンコンプレックスであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ並びに公知の抗癌剤であるＣＤＤＰおよびＭＭＣのどれもが、添加濃度の増大と共にＬＬＣの細胞生存率の低下が見られ、特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度２５μＭ以上におけるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳのＬＬＣ細胞生存率はＣＤＤＰおよびＭＭＣのそれらに比べ低くかった示される。一方図４からは、試験試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品３）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）が高い殺細胞作用を有し、これは参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳイオンコンプレックス、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳイオンコンプレックス、ＣＤＤＰおよびＭＭＣよりも優れたものであった。
Example 16
Anti-cancer property test of Pr-embedded liposome (Part 2):
The anticancer properties of the Pr-embedded liposome of the present invention were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method as in Example 15.
As a test sample of this test, various Pr-embedded liposomes (metal porphyrin complex concentrations 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) were used, and as a reference sample, metal porphyrin, which is a component of the Pr-embedded liposome, was used. Complexes (concentration 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) and liposomes (concentration 2500, 5000, 10,000, 20000 μM) were used. (Both corresponded to the concentration of Pr-embedded liposomes.)
Further, as comparative samples, cisplatin (CDDP, concentrations 0, 10, 20, 40, 80 μM) and mitomycin C (MCC, concentrations 0, 7.5, 15, 30, 60 μM), which are currently used anticancer agents, etc. Was used. When tested in the same manner as in Example 15, the following results were obtained.
First, the results in the system using FeT2MPyP as the metal porphyrin complex are shown in FIG. 3 and FIG. 4. From FIG. 3, the reference samples are FeT2MPyP, the ion complexes are FeT2MPyP + 1SAS and FeT2MPyP + 4SAS, and known anticancer agents. All of CDDP and MMC showed a decrease in LLC cell viability with increasing loading concentration. In particular, the FeT2MPyP, FeT2MPyP + 1SAS, and FeT2MPyP + 4SAS LLC cell viabilities were lower than those of CDDP and MMC at FeT2MPyP concentrations of 25 μM or higher. It was shown. On the other hand, FIG. 4 shows that the test samples FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes (product 3 of the present invention) and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (product 4 of the present invention) have a high cell killing action, which is the reference sample FeT2MPyP + 1SAS It was superior to the complex, FeT2MPyP + 4SAS ion complex, CDDP and MMC.
これら、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのどちらでも、添加濃度の増大と共にＬＬＣ細胞生存率の低下が見られ、添加濃度２５μＭ以上で細胞生存率０％となっていた。
このように、Ｐｒ包埋リポソームであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームは、金属ポルフィリンのイオンコンプレックス、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体および現在使用されている抗癌剤と比べ、最も効果的な抗癌特性を示している（例えば、添加濃度５０μＭにおいて抗癌特性は現在使用されている抗癌剤＜イオンコンプレックス＜カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体＜Ｐｒ包埋リポソームの順に増大している）。これより、Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤であるといえる。
In both of these FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes, the LLC cell viability decreased with increasing addition concentration, and the cell viability was 0% at the addition concentration of 25 μM or more.
Thus, the Pr-embedded liposomes, FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, are the most effective compared to metal porphyrin ion complexes, cationized cationic metal porphyrin complexes and currently used anticancer agents. It shows anticancer properties (for example, at an added concentration of 50 μM, anticancer properties increase in the order of currently used anticancer agent <ion complex <cationized cationic metalloporphyrin complex <Pr embedded liposome). Thus, it can be said that Pr-embedded liposomes are excellent anticancer agents.
実 施 例 １７
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その３）：
ｐＨ感受性のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ｐＨ感受性であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質４リポソーム（本発明品１４）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）（濃度：０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）を用いた。
この結果を図５に示すが、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームが最も効果的な抗癌特性を示し、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームがこれに次ぐものであった（例えば、添加濃度１２.５μＭにおいて抗癌特性はＣＤＤＰおよびＭＭＣ＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの順に増大している）。
特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでは、１２.５μＭといった低濃度添加でも細胞生存率がほぼ０％となっていることから、本発明のカチオン化カチオン性Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤として利用可能であることが見い出された。
Example 17
Anticancer property test of Pr-embedded liposome (Part 3):
The anticancer properties of pH-sensitive Pr-embedded liposomes were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method as in Example 15.
As test samples, pH-sensitive FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid 4 liposome (product 14 of the present invention) and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome (product 4 of the present invention) (concentration: 0, 12.5, 25, 50, 100 μM). As comparative samples, cisplatin (CDDP, concentrations 0, 10, 20, 40, 80 μM) and mitomycin C (MCC, concentrations 0, 7.5, 15, 30, 60 μM), which are currently used anticancer agents, are used. Was used.
The results are shown in FIG. 5, where FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposomes showed the most effective anticancer properties, followed by FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (for example, at an added concentration of 12.5 μM). The cancer characteristics increase in the order of CDDP and MMC <FeT2MPyP + 4SAS embedded DMPC liposomes <FeT2MPyP + 4OAS embedded mixed lipid D liposomes).
In particular, the FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposome has a cell viability of almost 0% even when added at a low concentration of 12.5 μM. Therefore, the cationized cationic Pr-embedded liposome of the present invention is used as an excellent anticancer agent. It was found to be possible.
実 施 例 １８
金属ポルフィリン錯体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の相互作用：
一般に、大過剰の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下において、低分子の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、Ｈ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易いことが報告されている［ R. F. Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979）］。ここで、低分子系金属ポルフィリンであるＭｎＴ４ＭＰｙＰ、リポソーム（高分子）系であるＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびマンガン［５,１０,１５,２０-テトラ（３-フリル）ポルフィリン］［ＭｎＴ３ＦｕＰ］包埋ＤＭＰＣリポソーム１）（比較品）とＨ２Ｏ２の相互作用をＵＶ-ｖｉｓ測定より検討した。すなわち、Ｈ２Ｏ２との相互作用および分解に基づくポルフィリン錯体Ｓｏｒｅｔ帯吸収ピーク（４６３ｎｍ）の減衰曲線測定およびその減衰曲線からの半減期（ｔ１／２）の算出より評価した。なお、参考として銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ-ＳＯＤ）の結果も合わせて示す。なお、Ｈ２Ｏ２濃度は金属ポルフィリン錯体濃度に対して大過剰の１０００倍とした。 これらの結果を表５に示す。
１）疎水性マンガンポルフィリン錯体が、ＤＭＰＣリポソームの二分子膜疎水部（二分子膜内部）に包埋されたもの。
Interaction of metalloporphyrin complex with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ):
In general, in the presence of a large excess of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), a low-molecular metal porphyrin complex is exposed to a porphyrin ring, and thus interacts with H 2 O 2 frequently, so that it can be easily decomposed. [RF Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979)]. Here, MnT4MPyP, which is a low molecular metal porphyrin, MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome (product 5 of the present invention) and manganese [5,10,15,20-tetra (3-furyl) porphyrin] which is a liposome (polymer) system The interaction between [MnT3FuP] -embedded DMPC liposome 1) (comparative product) and H 2 O 2 was examined by UV-vis measurement. That was evaluated from calculation of the attenuation curve measurement and half-life from the decay curves of the H 2 O 2 and porphyrin complex Soret band absorption peak based on the interaction and degradation of (463nm) (t 1/2). For reference, the results of copper / zinc superoxide dismutase (Cu / Zn-SOD) are also shown. Incidentally, H 2 O 2 concentration was 1000-fold of a large excess relative to the metal porphyrin complex concentration. These results are shown in Table 5.
1) A structure in which a hydrophobic manganese porphyrin complex is embedded in a bimolecular hydrophobic portion (inside the bimolecular membrane) of a DMPC liposome.
これより、ｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ-ＳＯＤ＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＝ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム＜ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームの順に増加した。ＭｎＴ４ＭＰｙＰは低分子系のためポルフィリン環が露出してＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易く、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームは高分子系のためポルフィリン環が露出しておらずＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用しないので分解し難い。しかしながら、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２はほぼＭｎＴ４ＭＰｙＰのそれに類似し、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２の１／１０であった。これは、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜中のＭｎＴ４ＭＰｙＰおよびＭｎＴ３ＦｕＰの包埋部位が異なるためと考えられ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰはリポソーム二分子膜中の親水部（または表層近傍）に、および、ＭｎＴ３ＦｕＰはその疎水部に存在するためと考えられる。この結果は、実施例１２および１４の結果と対応している。また、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ-ＳＯＤのそれに比べて大きく、Ｃｕ／Ｚｎ-ＳＯＤに比べてＨ２Ｏ２耐性を有することも示唆された。 From this, t1 / 2 increased in the order of Cu / Zn-SOD <MnT4MPyP = MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome <MnT3FuP-embedded DMPC liposome. Since MnT4MPyP is a low molecular weight system, the porphyrin ring is exposed and interacts with H 2 O 2 frequently, so it is easily decomposed. Since the MnT3FuP-embedded DMPC liposome is a polymer system, the porphyrin ring is not exposed and H 2 O Since it does not interact with 2 frequently, it is difficult to decompose. However, the t 1/2 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes was almost similar to that of MnT4MPyP and was 1/10 of t 1/2 of MnT3FuP-embedded DMPC liposomes. This is thought to be due to the different embedding sites of MnT4MPyP and MnT3FuP in the DMPC liposome bilayer membrane. MnT4MPyP is present in the hydrophilic part (or near the surface layer) in the liposome bilayer membrane and MnT3FuP is present in the hydrophobic part. It is thought to do. This result corresponds to the result of Examples 12 and 14. Moreover, t 1/2 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome was larger than that of Cu / Zn—SOD, suggesting that it has H 2 O 2 resistance compared to Cu / Zn—SOD.
実 施 例 １９
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をマッコード、フライドビッチらおよびバトラーらのチトクロームｃ法により評価した［(1) J. M. Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969) および (2) J. Butler, W. H. Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)］。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で０〜１０００μＭのＰｒ包埋リポソーム溶液（Ａ溶液）を５水準以上調製した。次に、０.３ｍＭキサンチン水溶液、６０μＭチトクロームｃ水溶液およびｐＨ７.８、３０ｍＭリン酸緩衝水溶液を各２０ｍｌ取り、さらに、純水２４ｍｌを加えて混合溶液（Ｂ溶液）を得た。このＢ溶液 ２.１ｍｌにＡ溶液 ０.３ｍｌと純水 ０.２ｍｌを加えて放置（２５℃、１０ｍｉｎ）した。放置後の混合溶液に７μｇ／ｍｌカタラーゼ水溶液 ０.１ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）水溶液 ０.３ｍｌをすばやく混合して５５０ｎｍ（フェロチトクロームｃ生成に基づく吸収ピーク）におけるＵＶ-ｖｉｓの経時測定を行った（最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体０〜１００μＭ、キサンチン０.０５ｍＭ、ＸＯＤ２.５Ｕ／ｍｌ、チトクロームｃ１０μＭおよびカタラーゼ０.２３μｇ／ｍｌである。）。また、Ｐｒ包埋リポソーム無添加系（ブランク）でも同様に測定した。これらＵＶ-ｖｉｓの経時測定における「時間-５５０ｎｍでの吸光度」の関係よりＰｒ包埋リポソーム無添加系および添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度（ｖｉおよびｖｏ）を求め、さらに、下式から阻害率（ＩＣ）を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-ＩＣ」の関係よりＩＣ＝５０％おける金属ポルフィリン濃度（ＩＣ５０）を求めてこれをＳＯＤ活性の指標とした（ＩＣ５０が小さいほど高いＳＯＤ活性を示す）。なお、参照として対応するイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
阻害率（ＩＣ）＝１-（ｖｉ／ｖｏ）
ｖｏ：Ｐｒ包埋リポソーム無添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
ｖｉ：Ｐｒ包埋リポソーム添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
表６に各種金属ポルフィリン錯体系のＩＣ５０を示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのＩＣ５０はフライドビッチらの文献値を示した［ I. Batinic-Haberle, L. Benov, and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)］。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 1):
Pr-embedded liposomes were evaluated for SOD activity (ie, O 2 − .erasing activity) by the cytochrome c method of McCord, Friedbich et al. And Butler et al. [(1) JM Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. , 244, 6049 (1969) and (2) J. Butler, WH Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)]. Specifically, it was performed as follows. Five levels or more of Pr-embedded liposome solution (A solution) having a metalloporphyrin concentration of 0 to 1000 μM was prepared. Next, 20 ml each of 0.3 mM xanthine aqueous solution, 60 μM cytochrome c aqueous solution and pH 7.8, 30 mM phosphate buffer aqueous solution was taken, and 24 ml of pure water was further added to obtain a mixed solution (B solution). To 2.1 ml of this solution B, 0.3 ml of solution A and 0.2 ml of pure water were added and allowed to stand (25 ° C., 10 min). 7-g / ml catalase aqueous solution 0.1 ml and 25 U / ml xanthine oxidase (XOD) aqueous solution 0.3 ml were quickly mixed with the mixed solution after standing, and UV-vis time-lapse measurement at 550 nm (absorption peak based on ferrocytochrome c formation) (The concentration of each component of the final test solution is 0-100 μM metalloporphyrin complex, 0.05 mM xanthine, 2.5 U / ml XOD, 10 μM cytochrome c and 0.23 μg catalase). Moreover, it measured similarly also in Pr embedding liposome additive-free system (blank). The rate of ferrocytochrome c formation (vi and vo) in the Pr-embedded liposome-free and added systems was determined from the relationship of “time-absorbance at 550 nm” in the UV-vis time-lapse measurement. The rate (IC) was calculated, and finally the metal porphyrin concentration (IC 50 ) at IC = 50% was determined from the relationship of “metal porphyrin complex concentration−IC”, and this was used as an index of SOD activity (IC 50 Smaller indicates higher SOD activity). In addition, SOD activity was similarly evaluated about the ion complex (MnT4MPyP + 1SAS etc.) corresponding as a reference.
Inhibition rate (IC) = 1- (vi / vo)
vo: Ferrocytochrome c production rate in Pr-free embedded liposome addition system vi: Ferrocytochrome c production rate in Pr-embedded liposome addition system Table 6 shows IC 50 of various metalloporphyrin complex systems. Incidentally, IC 50 of MnT4MPyP showed literature fried Bitch et al [I. Batinic-Haberle, L. Benov , and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)].
この結果より、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのＩＣ５０は低分子系［ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（文献値）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ］のそれらと類似となり、効果的なＳＯＤ活性を示していた。 From these results, the IC 50 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes were similar to those of low molecular systems [MnT4MPyP (document value) and MnT4MPyP + 1SAS], and showed effective SOD activity.
実 施 例 ２０
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その２）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をリレイ（Ｒｉｌｅｙ）らのストップドフロー法により評価した［ D. P. Riley, W. L. Rivers, and R. H. Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)］。具体的には下記のように行った。３６℃において,Ｏ２ −・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のＰｒ包埋リポソームを含む６０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液（ｐＨ８.１）を急速混合し、Ｏ２ −・に基づく２４５ｎｍの吸光度の減衰（Ｏ２ −・消失反応の減衰曲線）を経時的に測定した。この減衰曲線より「ｌｎ（吸光度）-時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-見かけの速度定数」関係の傾きよりＯ２ −・消失反応の速度定数（ｋｃａｔ）を求めた。 なお、参照としてイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
表７に各種金属ポルフィリン錯体系のｋｃａｔを示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔはオオセ、カワカミらの文献値で示した［ T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 (2001)］。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 2):
SOD activity (ie, O 2 − .erasing activity) of Pr-embedded liposomes was evaluated by the stopped flow method of Riley et al. [DP Riley, WL Rivers, and RH Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)]. Specifically, it was performed as follows. At 36 ° C., a dimethyl sulfoxide solution containing potassium superoxide as a source of O 2 − · and a 60 mM HEPES / HEPESNa buffer solution (pH 8.1) containing Pr-embedded liposomes of various concentrations were rapidly mixed to obtain O 2 − · Absorbance decay at 245 nm based on (O 2 −. Extinction curve of disappearance reaction) was measured over time. From this attenuation curve, a relationship of “ln (absorbance) -time” was obtained, and an apparent rate constant was calculated from the slope of this relationship. Finally, the rate constant (k cat ) of the O 2 − disappearance reaction was determined from the slope of the relationship “metal porphyrin complex concentration−apparent rate constant”. In addition, SOD activity was similarly evaluated about the ion complex (MnT4MPyP + 1SAS etc.) as a reference.
Table 7 shows k cat of various metalloporphyrin complex systems. The k cat of MnT4MPyP is shown in the literature values of Ose and Kawakami et al. [T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 ( 2001)].
この結果、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソームのｋｃａｔは低分子系［ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（文献値）、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ］のそれらと近く、効果的なＳＯＤ活性を示していた。 As a result, the k cat of the MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, and MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome is close to those of the low molecular systems [MnT4MPyP (literature value), MnT4MPyP + 1SAS and MnT4MPyP + 4SAS], and is effective. It was.
実 施 例 ２１
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その３）：
Ｐｒ包埋リポソームを代表とする各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の比較を行った。試料としてＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系）、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰを用い、チトクロームｃ法およびストップドフロー法より評価した。なお、試料調製および測定は実施例１９および２０と同様である。
表８に各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の指標であるｋｃａｔおよびＩＣ５０を示す。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 3):
The SOD activity of various metalloporphyrin complexes represented by Pr-embedded liposomes was compared. MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes (MnT4MPyP / liposome system), MnT3FuP-embedded DMPC liposomes (MnT3FuP / liposome system) and MnT4MPyP were used as samples and evaluated by the cytochrome c method and the stopped flow method. The sample preparation and measurement are the same as in Examples 19 and 20.
Table 8 shows k cat and IC 50 which are indicators of SOD activity of various metalloporphyrin complexes.
ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔおよびＩＣ５０は表６および同表で示した文献値と一致し、本評価の妥当性を示している。さらに、ｋｃａｔはＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰの順に増加、かつ、ＩＣ５０はｋｃａｔはＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系＞ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系＞ＭｎＴ４ＭＰｙＰの順に減少しており、これら２つの評価法は対応している。また、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系のｋｃａｔおよびＩＣ５０がＭｎＴ４ＭＰｙＰのそれらに類似し、ＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系のそれらに類似しないという結果は、実施例１６、１７および１８の結果に対応している。いづれにせよ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソーム等）は、効果的なＳＯＤ活性を示し、有効な抗酸化剤となりうることを示している。 The k cat and IC 50 of MnT4MPyP agree with the literature values shown in Table 6 and the table, indicating the validity of this evaluation. Further, k cat is MnT3FuP / liposome system <increased MnT4MPyP / liposome system <in order of MnT4MPyP, and, IC 50 is k cat is MnT3FuP / liposome system> MnT4MPyP / liposome system> has decreased in the order of MnT4MPyP, these two evaluation The law is compliant. Also, the results that the k cat and IC 50 of the MnT4MPyP / liposome system are similar to those of the MnT4MPyP and not similar to those of the MnT3FuP / liposome system correspond to the results of Examples 16, 17 and 18. In any case, the MnT4MPyP / liposome system (MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome, etc.) shows effective SOD activity and can be an effective antioxidant. .
Claims (15)
で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。 The cationized cationic metalloporphyrin complex has the following formula (I), (II) or (III)
The metal porphyrin complex-embedded liposome according to claim 1, wherein
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