JP4741205B2 - Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same - Google Patents
Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP4741205B2 JP4741205B2 JP2004200163A JP2004200163A JP4741205B2 JP 4741205 B2 JP4741205 B2 JP 4741205B2 JP 2004200163 A JP2004200163 A JP 2004200163A JP 2004200163 A JP2004200163 A JP 2004200163A JP 4741205 B2 JP4741205 B2 JP 4741205B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- embedded
- complex
- porphyrin
- lipid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
本発明は、金属ポルフィリン錯体包埋リポソームに関し、更に詳細には、生体内において抗癌剤あるいは抗酸化剤として作用する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームおよびその製造方法に関する。 The present invention relates to a metalloporphyrin complex-embedded liposome, and more particularly to a metalloporphyrin complex-embedded liposome that acts as an anticancer agent or antioxidant in vivo and a method for producing the same.
一般に、生体内で生成される数々の活性酸素種は炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、癌、糖尿病等多くの病態に関与しているといわれているが、通常生体では、これらの活性酸素種に対し、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ等のラジカル消去酵素を備えてバランスを保っている。 In general, many reactive oxygen species generated in vivo are said to be involved in many pathological conditions such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, cancer, diabetes, etc. On the other hand, a radical scavenging enzyme such as superoxide dismutase (SOD) or catalase is provided to maintain a balance.
しかしながら、生体内の癌細胞においてはスーパーオキシドアニオンラジカル(O2 −・)が多量に存在していることが知られており、これらの酵素活性の低下していることが伺える。 However, it is known that a large amount of superoxide anion radicals (O 2 − ·) are present in cancer cells in vivo, and it can be seen that these enzyme activities are reduced.
一方、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の疾病でも、その原因は、SOD、カタラーゼ等のラジカル消去酵素のバランスが崩れ、O2 −・などの活性種が増加したことによるものとされている。 On the other hand, even in diseases such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, diabetes, etc., the cause is attributed to the loss of the balance of radical scavenging enzymes such as SOD and catalase and the increase of active species such as O 2 −. ing.
ところで、金属ポルフィリン錯体は高いSOD活性を示すことが報告されているので、このものを生体内に投与することにより、O2 −・を初めとする活性酸素種を有効に消去させ、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることが予想される。 By the way, since it is reported that a metal porphyrin complex shows high SOD activity, by administering this in vivo, reactive oxygen species including O 2 − . It is expected to protect the living body from the in vivo damage caused.
しかし、金属ポルフィリン錯体を単独で生体内に投与することは、安全性や効果の点から問題も多く、現在まで医薬として利用するに至っていないのが実情である。 However, the administration of a metalloporphyrin complex alone in a living body has many problems from the viewpoint of safety and effectiveness, and the fact is that it has not been used as a medicine until now.
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、金属ポルフィリン錯体を安全に生体内に投与することができ、しかも金属ポルフィリン錯体の有するSOD活性を発揮させることのできる手段を提供することをその課題とするものである。 The present invention has been made in view of these points, and provides a means capable of safely administering a metalloporphyrin complex into a living body and exhibiting the SOD activity possessed by the metalloporphyrin complex. That is the subject.
また、現在臨床的に用いられておりながら、副作用が大きな問題となっているシスプラチン(CDDP)やマイトマイシンC(MMC)等の抗癌剤に代わる、癌細胞にのみ選択的に効果を示す抗癌剤や、活性酸素種が関連するといわれる、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の癌以外の疾患を治療する抗酸化剤の提供もその課題とする。 In addition to anticancer agents such as cisplatin (CDDP) and mitomycin C (MMC), which are currently used clinically but have serious side effects, anticancer agents that are selectively effective only against cancer cells, and activity Another object of the present invention is to provide an antioxidant for treating diseases other than cancer such as inflammatory diseases, neurological diseases, arteriosclerosis, diabetes and the like, which are said to be associated with oxygen species.
本発明者らは、癌細胞内に存在しているO2 −・をターゲットとし、金属ポルフィリン錯体のSOD活性作用を利用してこの濃度を低下させる手段について、種々検討した結果、金属ポルフィリン錯体をリポソームに埋設することにより、優れたSOD活性を有したまま安全に体内に投与可能であり、しかも血液中滞留も可能であることを見出し、本発明を完成した。 As a result of various studies on means for reducing this concentration by utilizing the SOD activity of the metalloporphyrin complex, the present inventors have targeted the O 2 − · existing in cancer cells. It was found that by embedding in liposomes, it can be safely administered into the body while having excellent SOD activity, and can be retained in blood, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームである。 That is, the present invention provides a metalloporphyrin complex-embedded liposome containing a cationized cationic metalloporphyrin complex and a lipid having liposome-forming ability, wherein the cationized cationic metalloporphyrin complex is an anionic surfactant. The cationized cationic metalloporphyrin complex part is present on the surface of the liposome or the hydrophilic part of the lipid, and the alkyl side chain of the anionic surfactant is present on the lipid. It is a metalloporphyrin complex-embedded liposome embedded in a hydrophobic part .
また、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとリポソーム形成能を有する脂質とを混合し、超音波処理することにより、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを製造することを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋リポソームの製造方法である。 In the present invention, a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant are reacted to form an ion complex, and then the ion complex and a lipid capable of forming a liposome are mixed and subjected to ultrasonic treatment. Thus, the cationized cationic metalloporphyrin complex exists in a state of forming an ion complex with the anionic surfactant, and the cationized cationic metalloporphyrin complex portion is hydrophilic on the surface of the liposome or the lipid. A method for producing a metalloporphyrin complex-embedded liposome, characterized in that a metalloporphyrin complex-embedded liposome in which the alkyl side chain of the anionic surfactant is embedded in the hydrophobic part of the lipid It is.
更に本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを有効成分として含有する医薬である。 Furthermore, the present invention provides a metalloporphyrin complex-embedded liposome containing a cationized cationic metalloporphyrin complex and a lipid having liposome-forming ability, wherein the cationized cationic metalloporphyrin complex comprises an anionic surfactant and an ion. The cationized cationic metalloporphyrin complex part is present in the form of a complex and is present on the surface of the liposome or the hydrophilic part of the lipid, and the alkyl side chain of the anionic surfactant is hydrophobic in the lipid. It is a medicament containing, as an active ingredient, a metalloporphyrin complex-embedded liposome embedded in the sex part .
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2 −・)をターゲットとし、これを確実に低減させることができるものである。 The metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention targets the superoxide anion radical (O 2 − ·) and can reliably reduce this.
従って、癌細胞中のO2 −・を低下させて癌の治癒に優れた効果を奏することができ、しかもその効果は選択的であるので、副作用のない新たな抗癌剤として利用可能なものである。 Therefore, O 2 − · in the cancer cells can be reduced to exert an excellent effect on cancer healing, and since the effect is selective, it can be used as a new anticancer agent having no side effects. .
また、本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、SOD活性を有し、血液中滞留も可能であるという抗酸化剤として優れた効果を有するので、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることができるものである。 In addition, the metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention has an excellent effect as an anti-oxidant that has SOD activity and can stay in the blood, thus protecting the living body from in vivo damage caused by active oxygen. It is something that can be done.
本明細書中において、「金属ポルフィリン包埋リポソーム」とは、金属ポルフィリン錯体が、リポソームを構成する脂質中に組み込まれ、その一部がリポソーム膜外に出ているか、あるいは全くリポソーム膜内に包含されているものを意味する。 In the present specification, the “metal porphyrin-embedded liposome” means that a metal porphyrin complex is incorporated in a lipid constituting the liposome, and a part of it is outside the liposome membrane or entirely contained in the liposome membrane. Means what is being.
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックスと、リポソーム形成能を有する脂質とを含有するものである。 The metalloporphyrin complex-embedded liposome of the present invention contains an ion complex formed by a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant and a lipid having liposome-forming ability.
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム(以下、単に「Pr包埋リポソーム」ということがある)の構成成分であるカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックス(以下、単に「イオンコンプレックス」という)は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体に界面活性剤を反応させることにより調製される。 An ion complex formed from a cationized cationic metalloporphyrin complex and an anionic surfactant which are constituents of the metal porphyrin complex-embedded liposome of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “Pr-embedded liposome”) Simply referred to as “ion complex”) is prepared by reacting a cationized cationic metalloporphyrin complex with a surfactant.
このイオンコンプレックスを形成する成分の一つであるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体は、置換基としてカチオン性窒素原子を有する基を有するものであり、例えば、次の式(I)(II)または(III)で表すものを挙げることができる。
(式中、R1ないしR4は、N-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、-アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を示し、R11ないしR16は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、R17ないしR18は、N-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、N-アルキルイミダゾリル基を示し、R21ないしR26は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、R27ないしR28は、アルキルアンモニオフェニル基を示す) (Wherein R 1 to R 4 represent a group selected from an N-lower alkylpyridyl group, an alkylammoniophenyl group, and an -alkylimidazolyl group, and R 11 to R 16 represent a lower alkyl group or a lower alkoxy group. , R 17 to R 18 represent an N-lower alkylpyridyl group, an alkylammoniophenyl group, or an N-alkylimidazolyl group, R 21 to R 26 represent a lower alkyl group or a lower alkoxy group, R 27 to R 28, Represents an alkylammoniophenyl group)
より具体的には、上記(I)式において、基R1-R4がメチルピリジル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン(T2MPyP)、5,10,15,20-テトラキス(3-メチルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン(T4MPyP);基R1-R4がエチルピリジル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-エチルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(3-エチルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-エチルピリジル)ポルフィリン;基R1-R4がプロピルピリジル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-プロピルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(3-プロピルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-プロピルピリジル)ポルフィリン;基R1-R4がブチルピリジル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-ブチルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(3-ブチルピリジル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-ブチルピリジル)ポルフィリン;基R1-R4がメチルアンモニオフェニル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-メチルアンモニオフェニル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(3-メチルアンモニオフェニル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-メチルアンモニオフェニル)ポルフィリン;基R1-R4がメチルイミダゾリル基である、5,10,15,20-テトラキス(2-メチルイミダゾリル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(3-メチルイミダゾリル)ポルフィリン、5,10,15,20-テトラキス(4-メチルイミダゾリル)ポルフィリン等が挙げられる。 More specifically, in the above formula (I), the group R 1 -R 4 is a methylpyridyl group, 5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin (T2MPyP), 5,10, 15,20-tetrakis (3-methylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin (T4MPyP); the group R 1 -R 4 is an ethylpyridyl group 15,20-tetrakis (2-ethylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-ethylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-ethylpyridyl) porphyrin; group R 1 5,10,15,20-tetrakis (2-propylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-propylpyridyl), wherein —R 4 is a propylpyridyl group ) Porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-propylpyridyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (2-butylpyridyl) porphyrin, wherein the group R 1 -R 4 is a butylpyridyl group, 5,10,15,20-tetrakis (3-butylpyridyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-butylpyridyl) porphyrin; group 5 wherein R 1 -R 4 is a methylammoniophenyl group , 10,15,20-tetrakis (2-methylammoniophenyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (3-methylammoniophenyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methyl) Ammoniophenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (2-methylimidazolyl) porphy where the group R 1 -R 4 is a methylimidazolyl group Examples include phosphorus, 5,10,15,20-tetrakis (3-methylimidazolyl) porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis (4-methylimidazolyl) porphyrin, and the like.
また、上式(II)式において、基R11、R12、R14、R16がメチル、基R13、R15がビニル、基R17、R18がメチルピリジルである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(メチルピリジルアミドエチル)ポルフィリン](PPIX-DMPyAm);基R11、R12、R14、R16がメチル、基R13、R15がビニル、基R17、R18がアンモニオフェニルである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(アンモニオフェニルアミドエチル)ポルフィリン];基R11、R12、R14、R16がメチル、基R13、R15がビニル、基R17、R18がメチルイミダゾリルである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(メチルイミダゾリルアミドエチル)ポルフィリン];基R11、R12、R14、R16がメチル、基R13、R15がメトキシ、基R17、R18がメチルピリジルである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジメトキシ-6,7-ジ(メチルピリジルアミドエチル)ポルフィリン];基R11-R16がメチル、基R17、R18がメチルピリジルである、[1,2,3,4,5,8-ヘキサメチル-6,7-ジ(メチルピリジルアミドエチル)ポルフィリン];基R11-R16がエチル、基R17、R18がメチルピリジルである、[1,2,3,4,5,8-ヘキサエチル-6,7-ジ(メチルピリジルアミドエチル)ポルフィリン]等が挙げられる。 In the above formula (II), the groups R 11 , R 12 , R 14 and R 16 are methyl, the groups R 13 and R 15 are vinyl, and the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,3 , 5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin] (PPIX-DMPyAm); group R 11 , R 12 , R 14 , R 16 is methyl, group R 13, R 15 is a vinyl, group R 17, R 18 is ammonio phenyl, [1,3,5,8- tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (ammonio phenyl amide ethyl) Porphyrin]; [1,3,5,8-tetramethyl, wherein the groups R 11 , R 12 , R 14 , R 16 are methyl, the groups R 13 , R 15 are vinyl, the groups R 17 , R 18 are methylimidazolyl -2,4-Divinyl-6,7-di (methylimidazolyl) Midoechiru) porphyrin]; groups R 11, R 12, R 14 , R 16 is a methyl, group R 13, R 15 is methoxy, group R 17, R 18 is methyl pyridyl, [1,3,5,8- Tetramethyl-2,4-dimethoxy-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin]; the group R 11 -R 16 is methyl, the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,2,3 , 4,5,8-hexamethyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin]; the group R 11 -R 16 is ethyl, the groups R 17 and R 18 are methylpyridyl, [1,2,3 , 4,5,8-hexaethyl-6,7-di (methylpyridylamidoethyl) porphyrin].
更に、上式(III)式において、基R21、R22、R24、R26がメチル、基R23、R25がビニル、基R27、R28がメチルアンモニオである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(メチルアンモニオカルボニルエチル)ポルフィリン];基R21、R22、R24、R26がメチル、基R23、R25がメトキシ、基R27、R28がメチルアンモニオである、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジメトキシ-6,7-ジ(メチルアンモニオカルボニルエチル)ポルフィリン];基R21-R26がメチル、基R27、R28がメチルアンモニオである、[1,2,3,4,5,8-ヘキサメチル-6,7-ジ(メチルアンモニオカルボニルエチル)ポルフィリン];基R21-R26がエチル、基R27、R28がメチルアンモニオである、[1,2,3,4,5,8-ヘキサエチル-6,7-ジ(メチルアンモニオカルボニルエチル)ポルフィリン]等が挙げられる。 Further, in the above formula (III), the groups R 21 , R 22 , R 24 and R 26 are methyl, the groups R 23 and R 25 are vinyl, and the groups R 27 and R 28 are methylammonio, [1, 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin]; group R 21 , R 22 , R 24 , R 26 is methyl, group R 23 , R [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-dimethoxy-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin], wherein 25 is methoxy and the groups R 27 and R 28 are methylammonio; [1,2,3,4,5,8-hexamethyl-6,7-di (methylammoniocarbonylethyl) porphyrin, wherein the group R 21 -R 26 is methyl and the group R 27 , R 28 is methylammonio ]; group R 21 -R 26 are ethyl, group R 27, 28 is a methyl ammonio, [1,2,3,4,5,8- Hekisaechiru 6,7-di (methyl ammonio carbonyl ethyl) porphyrin], and the like.
これらのカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体に配位する金属としては、鉄(Fe)、マンガン(Mn)、コバルト(Co)、銅(Cu)、モリブデン(Mo)、クロム(Cr)、イリジウム(Ir)等が好ましい。 Metals coordinated with these cationized cationic porphyrin complexes include iron (Fe), manganese (Mn), cobalt (Co), copper (Cu), molybdenum (Mo), chromium (Cr), and iridium (Ir). Etc. are preferred.
上記のうち、金属が配位した式(I)で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、K. Kalyanasundaram, Inorg. Chem., 23, 2453(1984)、 A. D. Adler et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 32, 2443(1970)、 T, Yonetani et al., J. Biol. Chem., 245, 2988(1970)、 P. Hambright, Inorg. Chem., 15, 2314(1976)等に記載の方法に準じて行うことができる。 Among the above, the synthesis of the cationized cationic porphyrin complex represented by the formula (I) coordinated with metal is described in K. Kalyanasundaram, Inorg. Chem., 23, 2453 (1984), AD Adler et al., J Inorg. Nucl. Chem., 32, 2443 (1970), T, Yonetani et al., J. Biol. Chem., 245, 2988 (1970), P. Hambright, Inorg. Chem., 15, 2314 (1976 ) And the like.
また、金属が配位した式(II)および(III)で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young, and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等に記載の方法に準じて行うことができる。 In addition, the synthesis of the cationized cationic porphyrin complex represented by the formulas (II) and (III) coordinated with metal was performed by E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young, and CK Chang, Chem. Lett., 1984, 991, etc.
なお、上記した金属[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](MT2MPyP)および金属[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](MT4MPyP)の化学構造を示せば下の化(3):MT2MPyPの化学構造式および化(4):MT4MPyPの化学構造式のとおりである。
一方、イオンコンプレックスを形成する別の成分の一つであるアニオン系界面活性剤としては、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩が好ましく、その例としては、ラウリン酸(LAS)、ミリスチン酸(MAS)、パルミチン酸(PAS)、ステアリン酸(SAS)、オレイン酸(OAS)等の脂肪酸のアルカリ金属塩や、ドデシル硫酸(SDS)、テトラデシル硫酸(STS)、ヘキサデシル硫酸(SHS)、オクタデシル硫酸(SOS)等のアルキル硫酸のアルカリ金属塩挙げることができる。なお、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム等が好ましい。 On the other hand, the anionic surfactant that is one of the other components forming the ion complex is preferably an alkali metal salt of a fatty acid or an alkali metal salt of an alkyl sulfate. Examples thereof include lauric acid (LAS), Alkali metal salts of fatty acids such as myristic acid (MAS), palmitic acid (PAS), stearic acid (SAS), oleic acid (OAS), dodecyl sulfate (SDS), tetradecyl sulfate (STS), hexadecyl sulfate (SHS), Mention may be made of alkali metal salts of alkyl sulfates such as octadecyl sulfate (SOS). In addition, as an alkali metal salt of fatty acid or an alkali metal salt of alkylsulfuric acid, sodium, potassium and the like are preferable.
このイオンコンプレックスを形成するには、適当な溶媒中でカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を混合すれば良く、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤との配合比は、それらのモル比で、1:1ないし1:20程度とすれば良い。 In order to form this ion complex, a cationized cationic metal porphyrin complex and an anionic surfactant may be mixed in an appropriate solvent, and the mixing ratio of the cationized cationic metal porphyrin complex and the anionic surfactant May be about 1: 1 to 1:20 in terms of their molar ratio.
このようにして形成されたイオンコンプレックスは、リポソーム形成能を有する脂質(以下、「脂質類」という)と混合し、リポソームを形成させるための常法によりPr包埋リポソームとすることができる。 The ion complex thus formed can be mixed with a lipid having the ability to form liposomes (hereinafter referred to as “lipids”) to form Pr-embedded liposomes by a conventional method for forming liposomes.
脂質類としては、大豆レシチン(SBL)、卵黄レシチン(EYL)、ジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、モノオレオイル-モノアルキル-ホスファチジルコリン(MOMAPC)等を単独で含むリン脂質あるいはこれを主成分とし他の成分も含む基質(以下、「混合リン脂質」ということがある)。を挙げることができる。 Examples of lipids include soybean lecithin (SBL), egg yolk lecithin (EYL), dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine ( DOPC), monooleoyl-monoalkyl-phosphatidylcholine (MOMAPC) or the like alone or a substrate containing this as a main component and also containing other components (hereinafter sometimes referred to as “mixed phospholipid”). Can be mentioned.
混合リン脂質の調製にあたり、リン脂質と混合することのできる成分としては、オレイン酸(OAS)等の脂肪酸、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド(DTDAB)、Tween-61(TW61)、Tween-80(TW80)等の界面活性剤等を挙げることができる。 In preparing the mixed phospholipid, components that can be mixed with the phospholipid include fatty acids such as oleic acid (OAS), dimethylditetradecylammonium bromide (DTDAB), Tween-61 (TW61), Tween-80 (TW80). ) And the like.
特に、DMPC、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)等のリン脂質、DTDAB、ジメチルジヘキサデシルアンモニウムブロミド(DHDAB)等のカチオン性界面活性剤、OAS、SAS等のアニオン性界面活性剤、TW61、TW80等のノニオン性界面活性剤を成分とする混合脂質系より得られるリポソームは、pH感受性リポソームとなる。そして、例えばこのリポソームが癌細胞内に取り込まれると、癌細胞内が低pHであるため、このリポソーム集合体の崩壊が生じ、抗癌剤のより効果的な徐放が促される。このようなpH感受性リポソームにイオンコンプレックスを包埋した系(Pr包埋/pH感受性リポソーム)も合成できる。 In particular, phospholipids such as DMPC and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cationic surfactants such as DTDAB and dimethyldihexadecylammonium bromide (DHDAB), anionic surfactants such as OAS and SAS, TW61, TW80 and the like Liposomes obtained from a mixed lipid system containing a nonionic surfactant as a component are pH-sensitive liposomes. For example, when the liposome is taken into the cancer cell, the inside of the cancer cell has a low pH, so that the liposome aggregate is collapsed, and more effective sustained release of the anticancer agent is promoted. A system in which an ion complex is embedded in such a pH sensitive liposome (Pr embedded / pH sensitive liposome) can also be synthesized.
また、混合リン脂質として、リン脂質に周知のコレステロール(Chol)等を加えたものや、リン脂質にポリエチレングリコールまたはその誘導体を加えたものを挙げることができる。 Examples of mixed phospholipids include those obtained by adding well-known cholesterol (Chol) and the like to phospholipids, and those obtained by adding polyethylene glycol or a derivative thereof to phospholipids.
上記イオンコンプレックスと脂質類からPr包埋リポソーム形成させるには、まず、これら成分を適当な溶媒中に取り、これを十分混合させることが必要である。 In order to form Pr-embedded liposomes from the ion complex and lipids, it is necessary to first take these components in a suitable solvent and mix them sufficiently.
リポソーム形成に当たっての、イオンコンプレックスと脂質類の使用量は、イオンコンプレックス1モルに対し、脂質類を10から500モル、特に50から300モルとすることが好ましい。 The amount of the ion complex and lipid used for forming the liposome is preferably 10 to 500 moles, particularly 50 to 300 moles, per mole of the ion complex.
リポソームの形成は、既に公知の方法により行うことができ、例えば、上記両成分を揮発性溶媒中に溶解、混合した後、揮発性溶媒のみを揮散、除去し、次いでこれに適当な水性溶媒、例えば、精製水、生理食塩水等を加え、激しく攪拌したり、超音波処理すことによりPr包埋リポソームとすることができる。 The liposome can be formed by a known method. For example, after dissolving and mixing both the above components in a volatile solvent, only the volatile solvent is volatilized and removed, and then an appropriate aqueous solvent, For example, Pr-embedded liposomes can be obtained by adding purified water, physiological saline, or the like, and stirring vigorously or sonicating.
なお、必要により、水性溶媒に代えて医薬的に有効な成分を溶解した溶液や、ある種の培地等を使用することができ、これらを内包したPr包埋リポソームを得ることもできる。 If necessary, a solution in which a pharmaceutically effective ingredient is dissolved instead of an aqueous solvent, a certain type of medium, or the like can be used, and Pr-embedded liposomes containing these can also be obtained.
かくして得られたPr包埋リポソームは、後記のようにその構造解析を蛍光スペクトルや動的光散乱測定等を用いて行った結果、図1に示すように、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分はリポソームの表面または脂質等の親水部に存在し、界面活性剤のアルキル側鎖は脂質の疎水性部に埋め込まれていることが示された。 The Pr-embedded liposome thus obtained was subjected to structural analysis using a fluorescence spectrum, dynamic light scattering measurement, etc. as described below. As shown in FIG. 1, the cationized cationic metal porphyrin complex portion was It was shown that the alkyl side chain of the surfactant was embedded in the hydrophobic part of the lipid, which was present on the surface of the liposome or in the hydrophilic part such as the lipid.
また、リポソームの粒径は100nm以下であり、体内に取り込まれた際、細胞に到達可能な大きさであることがわかった。 Moreover, the particle size of the liposome was 100 nm or less, and it was found that it was a size that could reach the cells when taken into the body.
更に、後記するように、Pr包埋リポソームの抗癌特性試験を行った結果、当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体を投与した場合に比べ、Pr包埋リポソームを使用した場合の効果が優れており、この効果は、現在抗癌剤として使用されているシスプラチン(CDDP)やマイトマイシンC(MMC)より格段に高いことが示された。 Furthermore, as will be described later, as a result of the anti-cancer property test of Pr-embedded liposomes, Pr-embedded liposomes were used as compared with the case where a simple cationized cationic metalloporphyrin complex as a raw material of the liposomes was administered. It was shown that this effect is much higher than cisplatin (CDDP) and mitomycin C (MMC) currently used as anticancer agents.
更にまた、Pr包埋リポソームのSOD活性を評価したところ、このものは当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体と同等のSOD活性を示すことがわかり、血中滞留型のSOD化合物になり得ることがわかった。 Furthermore, when the SOD activity of the Pr-embedded liposome was evaluated, it was found that this shows an SOD activity equivalent to that of the simple cationized cationic metalloporphyrin complex that is the raw material of the liposome. It turns out that it can be a compound.
以上のように、本発明のPr包埋リポソームは、優れた抗癌作用を有するものであり、癌治療の分野において抗癌剤として使用可能なものである。 As described above, the Pr-embedded liposome of the present invention has an excellent anticancer activity and can be used as an anticancer agent in the field of cancer treatment.
従って、癌患者にこのPr包埋リポソームを直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。 Therefore, the cancer of the patient can be treated by administering this Pr-embedded liposome directly, intravenously, subcutaneously, etc. to the cancer patient.
同様、本発明のPr包埋リポソームは、優れた抗酸化作用を有し、活性酸素のもたらす生体内障害、例えば、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病から生体を守ることができる。 Similarly, the Pr-embedded liposome of the present invention has an excellent antioxidant action and can protect the living body from in vivo damage caused by active oxygen such as inflammatory disease, neurological disease, arteriosclerosis, and diabetes.
従って、このものを炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿患者に、直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。 Therefore, by administering this to a patient with inflammatory disease, neurological disease, arteriosclerosis or diabetes by direct administration, intravenous administration, subcutaneous administration, etc., the cancer of the patient can be treated.
以下に、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these examples.
実 施 例 1
鉄[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](FeT2MPyP)の合成:
(1)プロピオン酸 500mlを100℃まで攪拌・加熱後、2-ピリジルカルボキシアルデヒド 15ml(0.158mol)を加えた。その後、ピロール 12ml(0.173mol)を注射器で少しずつ滴下し、100℃で1時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー(アルミナ basic type I、クロロホルム)を行い、生成物である5,10,15,20-テトラキス(2-ピリジル)ポルフィリンを得た(収量1.1g、収率4.4%)。
1H-NMR δH(CDCl3、ppm):
-2.82(ピロールNHのH、2H)、7.72〜9.14(ピリジンのH、16H)、8.87(ピロールのH、8H)
UV-vis λmax(クロロホルム、nm):
418、513、544、586、645
FAB-Mass(m/z):
619、620
(2)次に、アルゴン(Ar)雰囲気下でジメチルホルムアミド 150mlに上記(1)で得た5,10,15,20-テトラキス(2-ピリジル)ポルフィリン 0.2g(3.2×10−4mol)を加えて溶解させ、さらに、鉄 0.2gと48%臭化水素酸 5mlより得た臭化鉄(FeBr2)を加えて4時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。
抽出、カラムカラムクロマトグラフィー(アルミナ basic typeI、メタノール)を行い、前駆体の鉄[5,10,15,20-テトラキス(2-ピリジル)ポルフィリン]を得た(収量0.21g、収率94%)。
UV-vis λmax(メタノール、nm):
408、512、566
FAB-Mass(m/z):
672
(3)ジメチルホルムアミド 30ml中に、上記(2)で得た鉄[5,10,15,20-テトラキス(2-ピリジル)ポルフィリン] 0.1gとp-トルエンスルホン酸メチル 6mlとを加え、130℃で5時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー(アルミナ basic typeI、メタノール)を行い、目的物質であるFeT2MPyPを得た(収率91%)。
UV-vis λmax(水、nm):
408、584
元素分析(%):
Found. C75.11、H3.97、N17.66、C/N4.25
Calcd. C77.58、H4.24、N18.12、C/N4.28
(4)工程(1)において、2-ピリジルカルボキシアルデヒドを4-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記(1)工程ないし(3)工程と同様にして鉄[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](FeMT4MPyP)を得た。他の金属[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](MT2MPyP)および他の金属[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](MT4MPyP)も上記に準じて合成できる。
Example 1
Synthesis of iron [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (FeT2MPyP):
(1) After stirring and heating 500 ml of propionic acid to 100 ° C., 15 ml (0.158 mol) of 2-pyridylcarboxaldehyde was added. Thereafter, 12 ml (0.173 mol) of pyrrole was added dropwise little by little with a syringe, and the mixture was refluxed at 100 ° C. for 1 hour for cyclization condensation. After the reaction, the mixture was allowed to cool to room temperature, and the solvent was distilled off. Neutralization, washing and column chromatography (alumina basic type I, chloroform) were performed to obtain 5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin as a product (yield 1.1 g, yield 4). .4%).
1 H-NMR δ H (CDCl 3 , ppm):
-2.82 (pyrrole NH H, 2H), 7.72-9.14 (pyridine H, 16H), 8.87 (pyrrole H, 8H)
UV-vis λ max (chloroform, nm):
418, 513, 544, 586, 645
FAB-Mass (m / z):
619, 620
(2) Next, 0.2 g (3.2 × 10 −4 ) of 5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin obtained in (1) above was added to 150 ml of dimethylformamide under an argon (Ar) atmosphere. mol) was added and dissolved, and iron bromide (FeBr 2 ) obtained from 0.2 g of iron and 5 ml of 48% hydrobromic acid was added and refluxed for 4 hours. After the reaction, the mixture was allowed to cool to room temperature, and the solvent was distilled off.
Extraction and column column chromatography (alumina basic type I, methanol) were performed to obtain precursor iron [5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin] (yield 0.21 g, yield 94%). ).
UV-vis λ max (methanol, nm):
408, 512, 566
FAB-Mass (m / z):
672
(3) In 30 ml of dimethylformamide, 0.1 g of iron [5,10,15,20-tetrakis (2-pyridyl) porphyrin] obtained in (2) above and 6 ml of methyl p-toluenesulfonate are added. Reflux at 5 ° C. for 5 hours. After refluxing, the mixture was allowed to cool to room temperature and the solvent was distilled off. Extraction and column chromatography (alumina basic type I, methanol) were performed to obtain the target substance FeT2MPyP (yield 91%).
UV-vis λ max (water, nm):
408, 584
Elemental analysis (%):
Found. C75.11, H3.97, N17.66, C / N4.25
Calcd. C77.58, H4.24, N18.12, C / N4.28
(4) Iron [5,10,15,20-tetrakis (step (1)) is the same as steps (1) to (3) except that 2-pyridylcarboxaldehyde is changed to 4-pyridylcarboxaldehyde. 4-methylpyridyl) porphyrin] (FeMT4MPyP) was obtained. Other metals [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) and other metals [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) It can be synthesized according to the above.
実 施 例 2
鉄[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-メチルピリジルアミドエチル)]ポルフィリン](FePPIX-DMPyAm)の合成:
(1)鉄[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(カルボキシルエチル)]ポルフィリン] 500mg(8.1×10−4mol)を含むテトラハイドロフラン/トリエチルアミン溶液(10:1)110mlを冷却し、これにクロロギ酸エチル 0.33ml(2.0×10−3mol)を加えて90分間反応させた。さらに、4-アミノピリジン 0.20g(2.0×10−3mol)を加えてさらに1時間反応させ、その後室温で1晩放置した。
溶媒を留去した後、カラムクロマトグラフィー[シリカゲル、メタノール/水(9/1)]、再結晶により精製し、前駆体である鉄[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-(4-ピリジルアミドエチル)]ポルフィリン]を得た(収量30mg)。
UV-vis λmax(メタノール、nm):
398、485、596、643
FAB-Mass(m/z):
767
(2)次に、上記の前駆体 30mg(3.9×10−5mol)およびp-トルエンスルホン酸メチル 0.75mlをジメチルホルムアミド 20ml中に溶解させて還流(130℃、5時間)した。室温まで冷却し、その後溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー[酸性アルミナ、メタノール]で精製し、目的物質であるFePPIX-DMPyAmを得た(収量30mg)。
UV-vis λmax(メタノール、nm):
398、481、579
FAB-Mass(m/z):
797
(3)工程(1)の鉄[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(カルボキシルエチル)]ポルフィリン]に代え、他の金属[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(カルボキシルエチル)]ポルフィリン]を使用し、工程(1)および工程(2)と同様にして他の金属[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-メチルピリジルアミドエチル)]ポルフィリン](MPPIX-DMPyAm)を合成することができる。
Example 2
Synthesis of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridylamidoethyl)] porphyrin] (FePPIX-DMPyAm):
(1) Tetrahydro containing 500 mg (8.1 × 10 −4 mol) of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] 110 ml of a furan / triethylamine solution (10: 1) was cooled, and 0.33 ml (2.0 × 10 −3 mol) of ethyl chloroformate was added thereto and reacted for 90 minutes. Further, 0.20 g (2.0 × 10 −3 mol) of 4-aminopyridine was added, and the mixture was further reacted for 1 hour, and then left overnight at room temperature.
After the solvent was distilled off, column chromatography [silica gel, methanol / water (9/1)] and purification by recrystallization were carried out, and the precursor iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4] -Divinyl-6,7- (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin] was obtained (yield 30 mg).
UV-vis λ max (methanol, nm):
398, 485, 596, 643
FAB-Mass (m / z):
767
(2) Next, 30 mg (3.9 × 10 −5 mol) of the above precursor and 0.75 ml of methyl p-toluenesulfonate were dissolved in 20 ml of dimethylformamide and refluxed (130 ° C., 5 hours). After cooling to room temperature, the solvent was distilled off. Purification by column chromatography [acidic alumina, methanol] gave the target substance FePPIX-DMPyAm (yield 30 mg).
UV-vis λ max (methanol, nm):
398, 481, 579
FAB-Mass (m / z):
797
(3) Instead of iron [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] in step (1), other metals [[1, 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin] in the same manner as in steps (1) and (2) [[1 , 3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridamidoethyl)] porphyrin] (MPPIX-DMPyAm) can be synthesized.
実 施 例 3
マンガン[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](MnT4MPyP)の合成:
(1)プロピオン酸 500ml中に4-ピリジルカルボキシアルデヒド 15mlを加えて加温し、100℃になった後にピロール12mlを加えて1時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー(塩基性アルミナ、クロロホルム)等で生成し、紫色結晶として5,10,15,20-テトラキス(4-ピリジル)ポルフィリンを得た(収量1.68g、収率7.08%)。
1H-NMR δH(CDCl3、ppm):
-2.9(ピロールNHのH、2H)、8.2〜9.1(ピリジンのH、16H)、8.9(ピロールのH、8H)
UV-vis λmax(クロロホルム、nm):
417、513、546、589、641
FAB-Mass(m/z):
619、620
(2)次に、上記(1)で得た5,10,15,20-テトラキス(4-ピリジル)ポルフィリン 100mgを含むジメチルホルムアミド溶液 100mlを、アルゴン(Ar)置換した後、酢酸マンガン・四水和物 370mgを加えて、Ar下で3時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、抽出、減圧乾燥等を行い、マンガン[5,10,15,20-テトラキス(4-ピリジル)ポルフィリン]を得た(収量81.8mg、収率75.2%)。
UV-vis λmax(クロロホルム、nm):
477、579、611
FAB-Mass(m/z):
672
(3)次に、上記のマンガン[5,10,15,20-テトラキス(4-ピリジル)ポルフィリン] 200mgとp-トルエンスルホン酸メチル 12mlとを反応させた(120℃、5時間)。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー[(1)酸性アルミナおよび(2)塩基性アルミナ、メタノール]を行い、目的物質であるMnT4MPyPを得た(収量153mg)。
UV-vis λmax(水、nm):
462、559、636
(4)工程(1)において、4-ピリジルカルボキシアルデヒドを2-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記(1)工程ないし(3)工程と同様にしてマンガン[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](MnT2MPyP)を得た。他の金属[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](MT4MPyP)および他の金属[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](MT2MPyP)も上記と同様にして合成できる。
Example 3
Synthesis of manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MnT4MPyP):
(1) 15 ml of 4-pyridylcarboxaldehyde was added to 500 ml of propionic acid and heated. After reaching 100 ° C., 12 ml of pyrrole was added and refluxed for 1 hour. After the reaction, the mixture was allowed to cool, evaporated, neutralized and washed. Then, it produced | generated by column chromatography (basic alumina, chloroform) etc., and 5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin was obtained as a purple crystal (yield 1.68 g, yield 7.08%). ).
1 H-NMR δ H (CDCl 3 , ppm):
-2.9 (pyrrole NH H, 2H), 8.2-9.1 (pyridine H, 16H), 8.9 (pyrrole H, 8H)
UV-vis λ max (chloroform, nm):
417, 513, 546, 589, 641
FAB-Mass (m / z):
619, 620
(2) Next, 100 ml of a dimethylformamide solution containing 100 mg of 5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin obtained in (1) above was substituted with argon (Ar), and then manganese acetate / tetrahydrate 370 mg of Japanese product was added and refluxed under Ar for 3 hours. After the reaction, cooling, evaporation, extraction, drying under reduced pressure and the like were performed to obtain manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin] (yield 81.8 mg, yield 75.2%). ).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
477, 579, 611
FAB-Mass (m / z):
672
(3) Next, 200 mg of the above manganese [5,10,15,20-tetrakis (4-pyridyl) porphyrin] was reacted with 12 ml of methyl p-toluenesulfonate (120 ° C., 5 hours). After the reaction, the mixture was allowed to cool, extracted, etc., and subjected to column chromatography [(1) acidic alumina and (2) basic alumina, methanol] to obtain MnT4MPyP as the target substance (yield 153 mg).
UV-vis λ max (water, nm):
462, 559, 636
(4) Manganese [5,10,15,20-tetrakis (4) in the same manner as in steps (1) to (3) except that 4-pyridylcarboxaldehyde is changed to 2-pyridylcarboxaldehyde in step (1). 2-methylpyridyl) porphyrin] (MnT2MPyP) was obtained. Other metals [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) and other metals [5,10,15,20-tetrakis (2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) It can be synthesized in the same manner as above.
実 施 例 4
マンガン[[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-メチルピリジルアミドエチル)]ポルフィリン](MnPPIX-DMPyAm)の合成:
(1)EC法[例えば、 E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等]に基づき、1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(カルボキシルエチル)]ポルフィリン(プロトホルフィリンIX) 1gとクロロギ酸エチル 2mlをテトラヒドロフラン/トリエチルアミン(250/3ml)中、0℃で1時間反応させ、酸クロライド体を得た。
この酸クロライド体と4-アミノピリジン 1.68gを同一条件で2時間反応させ、さらに、室温で終夜反応させた。反応後、エバポレーション、カラムクロマトグラフィー[シリカゲル、メタノール/クロロホルム(1/9)]を行い、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-ピリジルアミドエチル)]ポルフィリンを得た(収量0.469g、収率68.4%)。
UV-vis λmax(クロロホルム、nm):
407、506、542、575、629
FAB-Mass(m/z):
715
(2)次に、[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-ピリジルアミドエチル)]ポルフィリン 200mgを含むジメチルホルムアミド溶液 200mlをAr置換した後、酢酸マンガン・四水和物 686mgを加えて、Ar下で6時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、洗浄、減圧乾燥等を行い、マンガン[1,3,5,8-テトラメチル-2,4-ジビニル-6,7-ジ(4-ピリジルアミドエチル)]ポルフィリンを得た(収量0.106mg、収率45.7%)。
UV-vis λmax(クロロホルム、nm):
387、465、557、621
(3)更に、上記のマンガン錯体200mgとp-トルエンスルホン酸メチルを9mlとを反応させた(140℃、6時間)。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー(酸性アルミナ、メタノール)を行い、目的物質であるMnPPIX-DMPyAm[収量80.5mg、収率37.5%]を得た。
UV-vis λmax(水、nm):
389、467、556、622
Example 4
Synthesis of Manganese [[1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-methylpyridylamidoethyl)] porphyrin] (MnPPIX-DMPyAm):
(1) 1,3,5,8-tetramethyl based on EC method [for example, E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and CK Chang, Chem. Lett., 1984, 991 etc.] -2,4-divinyl-6,7-di (carboxylethyl)] porphyrin (protoporphyrin IX) and 2 ml of ethyl chloroformate in tetrahydrofuran / triethylamine (250/3 ml) at 0 ° C. for 1 hour, A chloride body was obtained.
This acid chloride and 1.68 g of 4-aminopyridine were reacted under the same conditions for 2 hours, and further reacted at room temperature overnight. After the reaction, evaporation and column chromatography [silica gel, methanol / chloroform (1/9)] were performed to obtain [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4- Pyridylamidoethyl)] porphyrin was obtained (yield 0.469 g, yield 68.4%).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
407, 506, 542, 575, 629
FAB-Mass (m / z):
715
(2) Next, 200 ml of a dimethylformamide solution containing 200 mg of [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin was substituted with Ar. , 686 mg of manganese acetate tetrahydrate was added and refluxed under Ar for 6 hours. After the reaction, it is allowed to cool, evaporate, wash, and dry under reduced pressure to produce manganese [1,3,5,8-tetramethyl-2,4-divinyl-6,7-di (4-pyridylamidoethyl)] porphyrin. (Yield 0.106 mg, Yield 45.7%).
UV-vis λ max (chloroform, nm):
387, 465, 557, 621
(3) Further, 200 mg of the above manganese complex was reacted with 9 ml of methyl p-toluenesulfonate (140 ° C., 6 hours). After the reaction, the mixture was allowed to cool, extracted, etc., and subjected to column chromatography (acidic alumina, methanol) to obtain the target substance MnPPIX-DMPyAm [yield: 80.5 mg, yield: 37.5%].
UV-vis λ max (water, nm):
389, 467, 556, 622
実 施 例 5
Pr包埋リポソームの合成(その1):
試験管に、実施例2で得たFePPIX-DMPyAm 1μmolおよび脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC) 200μmolを取り、更に少量のメタノールを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 10ml加え、超音波処理(Ar下、氷浴中、30W、30min、プローブ型超音波照射装置)を行った。超音波処理後、静置(室温、1hr)および濾過滅菌(0.22μmφ)を行い、FePPIX-DMPyAmを包埋したDMPCリポソーム(本発明品1)を得た。
同様、実施例4で得たMnPPIX-DMPyAmとDMPCを用い、MnPPIX-DMPyAmを包埋したDMPCリポソーム(本発明品2)を得た。
Example 5
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 1):
In a test tube, 1 μmol of FePPIX-DMPyAm obtained in Example 2 and 200 μmol of dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) as a lipid were taken, and further mixed with a small amount of methanol. After the solvent was distilled off to form a thin film, 10 ml of physiological saline was added thereto and subjected to ultrasonic treatment (under Ar, in an ice bath, 30 W, 30 min, probe type ultrasonic irradiation device). After sonication, standing (room temperature, 1 hr) and filter sterilization (0.22 μmφ) were performed to obtain DMPC liposomes (Product 1 of the present invention) embedded with FePPIX-DMPyAm.
Similarly, using the MnPPIX-DMPyAm and DMPC obtained in Example 4, DMPC liposomes (Product 2 of the present invention) embedded with MnPPIX-DMPyAm were obtained.
実 施 例 6
Pr包埋リポソームの合成(その2):
(1)カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体であり、実施例1で得られたFeT2MPyP1.4mg(1μmol)と、界面活性剤であるSAS0.3mg(1μmol)を試験管に取り、これに溶媒としてメタノール5mlを加えて混合し、イオンコンプレックス1(FeT2MPyP+1SAS)を調製した。
また、上記のSAS 1μmolに代え、SAS 1.2mg(4μmol)およびOAS 1.2mg(4μmol)を用い、それぞれイオンコンプレックス2(FeT2MPyP+4SAS)およびイオンコンプレックス3(FeT2MPyP+4OAS)を得た。
同様に、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体として、FeT4MPyP、MnT2MPyP、MnT4MPyP、FeT2MPyP+MnT2MPyP(モル比1:1)、FeT4MPyP+MnT4MPyP(モル比1:1)を用い、界面活性剤として、SAS、OASを用い、表1に示すようなイオンコンプレックス4-14を調製した。
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 2):
(1) Cationic cationic metalloporphyrin complex, FeT2MPyP 1.4 mg (1 μmol) obtained in Example 1 and surfactant SAS 0.3 mg (1 μmol) were placed in a test tube, and methanol was used as the solvent. 5 ml was added and mixed to prepare Ion Complex 1 (FeT2MPyP + 1SAS).
Also, instead of the above SAS 1 μmol, 1.2 mg (4 μmol) of SAS and 1.2 mg (4 μmol) of OAS were used to obtain ion complex 2 (FeT2MPyP + 4SAS) and ion complex 3 (FeT2MPyP + 4OAS), respectively.
Similarly, FeT4MPyP, MnT2MPyP, MnT4MPyP, FeT2MPyP + MnT2MPyP (molar ratio 1: 1), FeT4MPyP + MnT4MPyP (molar ratio 1: 1) are used as the cationized cationic metal porphyrin complex, and SAS and OAS are used as the surfactant. Ion complex 4-14 as shown in 1 was prepared.
(2)次に、試験管に上記のイオンコンプレックス1(1μmol)と、脂質であるDMPC 0.135g(200μmol)を取り、溶媒として少量のクロロホルムを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 10ml加え、超音波処理(Ar下、氷浴中、30W、30min、プローブ型超音波照射装置)を行った。超音波処理後、静置(室温、1hr)および濾過滅菌(0.22μmφ)し、Pr包埋リポソーム(FeT2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム;本発明品3)を得た。
同様、イオンコンプレックス2とDMPC、イオンコンプレックス4とDMPC、イオンコンプレックス5とDMPCを用い、Pr包埋リポソーム(FeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム/本発明品4;MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム/本発明品5;MnT4MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム/本発明品6)を得た。
また、イオンコンプレックス4と卵黄レシチン(EYL)より、MnT4MPyP+1SAS包埋EYLリポソーム(本発明品7)を得た。
(2) Next, the above-mentioned ion complex 1 (1 μmol) and 0.135 g (200 μmol) of DMPC as a lipid were taken in a test tube and mixed using a small amount of chloroform as a solvent. After the solvent was distilled off to form a thin film, 10 ml of physiological saline was added thereto and subjected to ultrasonic treatment (under Ar, in an ice bath, 30 W, 30 min, probe type ultrasonic irradiation device). After sonication, it was allowed to stand (room temperature, 1 hr) and sterilized by filtration (0.22 μmφ) to obtain Pr-embedded liposomes (FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes; product 3 of the present invention).
Similarly, Pr-embedded liposome (FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome / present product 4; MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome / present product 5; MnT4MPyP + 4SAS) using ion complex 2 and DMPC, ion complex 4 and DMPC, ion complex 5 and DMPC An embedded DMPC liposome / product of the present invention 6) was obtained.
Further, from the ion complex 4 and egg yolk lecithin (EYL), MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome (product of the present invention 7) was obtained.
実 施 例 7
Pr包埋/pH感受性リポソームの合成:
(1)ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド(DTDAB)、オレイン酸(OAS)、Tween-61(TW61)、Tween-80(TW80)等を用い、表2に示す混合脂質A〜Dを調製した。
Synthesis of Pr embedded / pH sensitive liposomes:
(1) Mixed lipid A shown in Table 2 using dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dimethylditetradecylammonium bromide (DTDAB), oleic acid (OAS), Tween-61 (TW61), Tween-80 (TW80), etc. -D was prepared.
(2)表2に示す混合脂質AないしD、202μmolと、実施例6で得たイオンコンプレックス1 1μmolとを用い、pH感受性Pr包埋リポソーム(本発明品8〜11)を実施例6(2)と同様にして調製した。 (2) Using the mixed lipids A to D shown in Table 2, 202 μmol, and 11 μmol of the ion complex 1 obtained in Example 6, pH-sensitive Pr-embedded liposomes (Products 8 to 11 of the present invention) were prepared in Example 6 (2). ).
実 施 例 8
Pr包埋リポソームの合成(その4):
表1に示すイオンコンプレックス3 1μmolと、 表2に示す脂質A、BおよびD 200μmolを、表3に示す組み合わせて用い、以下実施例6(2)と同様にしてpH感受性Pr包埋リポソーム(本発明品12〜14)調製した。
Synthesis of Pr-embedded liposome (Part 4):
Using 1 μmol of ion complex 3 shown in Table 1 and 200 μmol of lipids A, B, and D shown in Table 2 in combination shown in Table 3, the pH-sensitive Pr-embedded liposome (this is the same as in Example 6 (2)) Inventions 12-14) Prepared.
実 施 例 9
Pr包埋リポソームの透過型電子顕微鏡(TEM)観察:
Pr包埋リポソームの形態、粒径等を評価するため、凍結割断レプリカ法による透過型電子顕微鏡(TEM)観察(JEOL、JEM-1200EX)を行った。実施例6で得たFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品4)のTEM観察より、粒径が100nm以下の二分子膜小胞体であるリポソームが形成されていることがわかり、さらに、精査すると20〜30nm程度および50〜60nmmin程度の平均粒径といった2つの粒径分布を有する二分子膜小胞体(リポソーム)が観測された。
Example 9
Observation of Pr-embedded liposome by transmission electron microscope (TEM):
In order to evaluate the morphology, particle size, and the like of Pr-embedded liposomes, transmission electron microscope (TEM) observation (JEOL, JEM-1200EX) was performed by a freeze-fracture replica method. From the TEM observation of the FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome (product 4 of the present invention) obtained in Example 6, it was found that a liposome that is a bilayer vesicle having a particle size of 100 nm or less was formed. Bilayer vesicles (liposomes) having two particle size distributions of about ˜30 nm and an average particle size of about 50 to 60 nm min were observed.
実 施 例 10
Pr包埋リポソームの動的光散乱測定(その1):
Pr包埋リポソームの粒径および粒径分布を測定するため動的光散乱測定( Nicomp 370、Particle Sizing System)を行った。例えば、実施例9に従い合成したFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品4)の動的光散乱測定より、体積分布では平均粒径24.6nmのものが61.2%、58.4nmのものが38.8%の2種類存在していた(数分布では平均粒径23.2nmのものが94.5%、52.5nmのものが5.5%)。この結果はTEM観察による粒径分布の結果と対応した。
また、実施例5ないし6で合成したPr包埋リポソームの動的光散乱測定結果を表4に示す。
Dynamic light scattering measurement of Pr-embedded liposome (Part 1):
Dynamic light scattering measurement (Nicomp 370, Particle Sizing System) was performed to measure the particle size and particle size distribution of Pr-embedded liposomes. For example, from dynamic light scattering measurement of FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (Product 4 of the present invention) synthesized according to Example 9, the volume distribution shows that the average particle diameter is 24.6 nm is 61.2%, and 58.4 nm. There were two types of 38.8% (in the number distribution, those with an average particle diameter of 23.2 nm were 94.5% and those with 52.5 nm were 5.5%). This result corresponded to the result of particle size distribution by TEM observation.
Table 4 shows the results of dynamic light scattering measurement of the Pr-embedded liposomes synthesized in Examples 5 to 6.
表4より、どのPr包埋リポソームの平均粒径も100nm以下であり、体内に投与した場合毛細血管内皮を越えて目的の細胞に到達可能であることが明らかとなった。 Table 4 shows that the average particle size of any Pr-embedded liposome is 100 nm or less, and that when administered into the body, it is possible to reach the target cell beyond the capillary endothelium.
実 施 例 11
Pr包埋リポソームの動的光散乱測定(その2):
実施例10と同様にして、実施例6に従い合成したMnT4MPyP-1SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品5)およびMnT4MPyP-4SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品6)について動的光散乱測定を行った。
この結果、本発明品5の平均粒径は29nm(分布割合が99.8%で、残りは平均粒径173nmのものが0.2%程度)、本発明品6の平均粒径は29nm(分布割合が99.7%で、残りは平均粒径171nmのものが0.3%程度)であり、いずれもその平均粒径100nm以下であって生体内投与しても問題の無い大きさであった。
Example 11
Dynamic light scattering measurement of Pr-embedded liposome (Part 2):
In the same manner as in Example 10, dynamic light scattering measurement was performed on MnT4MPyP-1SAS embedded DMPC liposomes (product 5 of the present invention) and MnT4MPyP-4SAS embedded DMPC liposomes (product 6 of the present invention) synthesized according to Example 6. .
As a result, the average particle size of the product 5 of the present invention is 29 nm (distribution ratio is 99.8%, the rest is about 0.2% when the average particle size is 173 nm), and the average particle size of the product 6 of the present invention is 29 nm ( The distribution ratio is 99.7%, and the rest is about 0.3% with an average particle size of 171 nm), both of which have an average particle size of 100 nm or less and can be administered in vivo. there were.
実 施 例 12
Pr包埋リポソームの蛍光スペクトル測定:
(1)Pr包埋リポソームにおいて、包埋したポルフィリン錯体がリポソーム内のどの位置に存在しているかを評価するため、Pr包埋リポソームの蛍光スペクトル測定(島津製作所、RF-5300PC)を行った。
この測定においては、金属ポルフィリン錯体は一般に蛍光消光するため、金属ポルフィリン錯体に代え、金属挿入を行っていないカチオン化カチオン性金属フリーポルフィリン錯体(以下、「金属フリー錯体」という)を実施例1、2等に準じて合成し、これを蛍光プローブとして用いた。また、金属フリー錯体包埋リポソームの合成は実施例5〜6に準じて行った。(以下、金属フリー錯体の略号としては、Mの代わりにカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体の略号中のMを、H2に代えて示す。例えば、金属[5,10,15,20-テトラキス(2-メチルピリジル)ポルフィリン](MT2MPyP)の金属フリー錯体はH2T2MPyPと、金属[5,10,15,20-テトラキス(4-メチルピリジル)ポルフィリン](MT4MPyP)の金属フリー体ではH2T4MPyPと示す。)
上記のようにして、調製したカチオン化カチオン性金属フリー錯体包埋リポソーム、例えば、H2T2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームおよびH2T2MPyP+4SAS 含有各種溶液におけるH2T2MPyPの蛍光スペクトル測定(励起波長456nm、測定波長範囲500〜800nm)を行ったところ、H2T2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム水溶液では642nmにピークを有する蛍光スペクトル(642nmでの相対蛍光強度43%)が得られ、メタノール(47%)、エタノール(54%)、プロパノール(54%)、ブタノール(55%)、エチレングリコール(63%)等の各種溶媒中でのH2T2MPyPの蛍光スペクトルも同様のスペクトル波形および強度であった。しかし、水でのH2T2MPyPの蛍光スペクトルは642nm付近のピークがブロードし、強度も大きく低下した(11%)。
これより、リポソームに包埋されたH2T2MPyPは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。また、H2T2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム、H2T2MPyP+4OAS包埋混合脂質Dリポソームの結果も同様であった。
一方、H2T4MPyP-4SAS包埋DMPCリポソーム溶液でのH2T4MPyPの蛍光スペクトルは、650nm付近にピークを示し、そのピーク強度は水およびメタノール中でのH2T4MPyPの蛍光強度の中間であった(蛍光強度 水<包埋リポソーム溶液<メタノール)。これより、H2T4MPyP-4SAS包埋DMPCリポソーム溶液のH2T4MPyPは水環境に存在するものよりもやや非極性な(やや疎水的な)環境に存在すると判断される。
(2)次に、リポソームの二分子膜親水部付近に存在して二分子膜の極性、流動性等の指標となる蛍光プローブである8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)を用いた蛍光スペクトル測定を行った。まず、メタノール、メタノール/クロロホルムおよびANS包埋DMPCリポソーム(ポルフィリン錯体は包埋されていない)溶液中でのANSの蛍光スペクトルは、どれも485nm(励起波長385nm)にピークを示す類似のスペクトルとなった。次に、ポルフィリン錯体とANSを一緒に包埋したDMPCリポソーム溶液中でのANSの蛍光スペクトルを測定したところ、485nmではなく450および500nmの2つのピークを示し、これら2つのピーク蛍光強度も485nmでのそれに比べて減少した。この付近にポルフィリン錯体のSoret帯の吸収ピークが存在することより、ANSとポルフィリン錯体の相互作用が生じたと考えられ、ポルフィリン錯体はANS近傍に存在すると考えられる。これらのことよりリポソームに包埋されたH2T2MPyPは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
Example 12
Measurement of fluorescence spectrum of Pr-embedded liposome:
(1) In Pr-embedded liposomes, the fluorescence spectrum of Pr-embedded liposomes was measured (Shimadzu Corporation, RF-5300PC) in order to evaluate where the embedded porphyrin complex is present in the liposomes.
In this measurement, since a metal porphyrin complex generally quenches fluorescence, a cationized cationic metal free porphyrin complex (hereinafter referred to as “metal free complex”) in which metal insertion is not performed is used in Example 1, instead of metal porphyrin complex. It was synthesized according to 2 etc. and used as a fluorescent probe. Moreover, the synthesis | combination of the metal free complex embedding liposome was performed according to Examples 5-6. (Hereinafter, the abbreviation for the metal-free complex, the M in the abbreviation of cationic cationic metalloporphyrin complex instead of M, shown in place of the H 2. For example, metal [5,10,15,20-tetrakis ( The metal-free complex of 2-methylpyridyl) porphyrin] (MT2MPyP) is H 2 T2MPyP and the metal-free complex of metal [5,10,15,20-tetrakis (4-methylpyridyl) porphyrin] (MT4MPyP) is H 2 T4MPyP. .)
Measurement of fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP (excitation wavelength 456 nm, measurement wavelength) in various solutions containing cationized cationic metal-free complex-embedded liposomes prepared as described above, for example, H 2 T2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes and H 2 T2MPyP + 4SAS range 500 to 800 nm) was carried out, the relative fluorescence intensity 43% in the fluorescence spectrum (642nm with a peak at 642nm in H 2 T2MPyP + 4SAS embedded DMPC liposome solution) is obtained, methanol (47%), ethanol (54% ), Propanol (54%), butanol (55%), ethylene glycol (63%), and the like, and the fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP in the various solvents had the same spectrum waveform and intensity. However, in the fluorescence spectrum of H 2 T2MPyP in water, the peak around 642 nm was broadened, and the intensity was greatly reduced (11%).
From this, it is considered that H 2 T2MPyP embedded in the liposome exists in a polar environment similar to the above-mentioned alcohols and exists in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer membrane. The results of H 2 T2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and H 2 T2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposomes were also the same.
On the other hand, the fluorescence spectrum of H 2 T4MPyP in the H 2 T4MPyP-4SAS-embedded DMPC liposome solution showed a peak near 650 nm, and the peak intensity was intermediate between the fluorescence intensity of H 2 T4MPyP in water and methanol. (Fluorescence intensity water <embedded liposome solution <methanol). From this, H 2 T4MPyP of H 2 T4MPyP-4SAS embedded DMPC liposome solution somewhat non-polar than those present in the water environment (somewhat hydrophobic) is determined to be present in the environment.
(2) Next, 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS), which is a fluorescent probe that is present in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer membrane of the liposome and serves as an indicator of the polarity and fluidity of the bilayer membrane, was used. Fluorescence spectrum measurement was performed. First, the fluorescence spectrum of ANS in methanol, methanol / chloroform, and ANS-embedded DMPC liposome (no porphyrin complex is embedded) solution is a similar spectrum with a peak at 485 nm (excitation wavelength: 385 nm). It was. Next, when the fluorescence spectrum of ANS in a DMPC liposome solution embedded with a porphyrin complex and ANS was measured, it showed two peaks at 450 and 500 nm instead of 485 nm, and these two peak fluorescence intensities were also at 485 nm. Decreased compared to that of. Since there is an absorption peak in the Soret band of the porphyrin complex in the vicinity, it is considered that the interaction between the ANS and the porphyrin complex has occurred, and the porphyrin complex is believed to exist in the vicinity of the ANS. From these facts, it is considered that H 2 T2MPyP embedded in the liposome exists in a polar environment similar to the above alcohols and exists in the vicinity of the hydrophilic part of the bilayer membrane.
実 施 例 13
Pr包埋リポソームの蛍光偏光解消測定(その1):
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在する8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS、50μM)を用いたPr包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定(島津製作所、RF-5300PCおよびRF-540/5000用偏光測定付属装置;測定温度範囲5〜45℃、励起波385nm、蛍光波長510nm)を行った。
ANSを含有したDMPCリポソーム(ブランク) の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、DMPCリポソーム二分子膜の相転移温度(Tc=23℃)付近で蛍光偏光度の減少がみられた。これに対し、ANSを含有した本発明品3(FeT2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム)の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、上記のブランクと同様にTc付近で蛍光偏光度の減少が見られたが、その減少の度合いは小さいものであった。この度合いの低下はFeT2MPyPとSASのイオンコンプレックスとDMPCの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがDMPCリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。また、pH感受性FeT2MPyP+4OAS包埋混合脂質Dリポソームでの結果も同様であった。
Example 13
Measurement of fluorescence depolarization of Pr-embedded liposome (Part 1):
Fluorescence depolarization measurement in Pr-embedded liposomes using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS, 50 μM) present in the vicinity of the hydrophilic portion of the bilayer as a fluorescent probe (Shimadzu Corporation, RF-5300PC and RF-540) Polarization measurement accessory for / 5000; measurement temperature range 5 to 45 ° C., excitation wave 385 nm, fluorescence wavelength 510 nm).
Regarding the relationship between the temperature and the degree of polarization of the fluorescence depolarization measurement of DMPC liposomes (blanks) containing ANS, a decrease in the degree of fluorescence polarization was observed near the phase transition temperature (Tc = 23 ° C.) of the DMPC liposome bilayer membrane. In contrast, in the temperature-polarization degree relationship of fluorescence depolarization measurement of the product 3 of the present invention containing ANS (FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome), a decrease in the degree of fluorescence polarization was observed in the vicinity of Tc as in the above blank. However, the degree of decrease was small. This decrease in the degree is based on the interaction between the ion complex of FeT2MPyP and SAS and DMPC, and confirms that the ion complex exists in the DMPC liposome bilayer membrane. Moreover, the results with the pH-sensitive FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposome were also the same.
実 施 例 14
Pr包埋リポソームの蛍光偏光解消測定(その2):
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在するANS(50μM)を用いたPr包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定(島津製作所、RF-5300PCおよびRF-540/5000用偏光測定付属装置;測定温度範囲5〜45℃、励起波385nm、蛍光波長510nm)を行った。
ANSを含有したDMPCリポソーム(ブランク) の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係(逆シグモイダル曲線)より、DMPCリポソーム二分子膜のゲル-液晶相転移温度(Tc)は約23℃となった。ANSを含有した本発明品5(MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム)の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係は、上記のブランクに比べやや低温側に移行し、縦軸の偏光度もゲル領域で減少した。これらのことは、MnT4MPyPとSASのイオンコンプレックスとDMPCとの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがDMPCリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
Example 14
Measurement of fluorescence depolarization of Pr-embedded liposome (Part 2):
Fluorescence depolarization measurement in Pr-embedded liposomes using ANS (50 μM) present in the vicinity of the hydrophilic part of the bilayer as a fluorescent probe (Shimadzu Corporation, polarization measurement accessory for RF-5300PC and RF-540 / 5000; measurement temperature) (Range 5 to 45 ° C., excitation wave 385 nm, fluorescence wavelength 510 nm).
From the temperature-polarization degree relationship (inverse sigmoidal curve) of fluorescence depolarization measurement of DMPC liposome (blank) containing ANS, the gel-liquid crystal phase transition temperature (Tc) of DMPC liposome bilayer was about 23 ° C. . The relationship between the temperature and the degree of polarization of the fluorescence depolarization measurement of the product 5 of the present invention containing ANS (MnT4MPyP + 1SAS embedded DMPC liposome) is slightly lower than that of the blank, and the degree of polarization on the vertical axis is also in the gel region. Diminished. These facts are based on the interaction between the ion complex of MnT4MPyP and SAS and DMPC, and support that the ion complex exists in the DMPC liposome bilayer membrane.
実 施 例 15
Pr包埋リポソームの抗癌特性試験(その1):
本発明のPr包埋リポソームの抗癌特性を、アラマー・ブルー(Alamar Blue )法を用いた殺細胞試験(細胞死試験)により調べた。
試験試料としては、FeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム系(本発明品4、FeT2MPyP濃度0、12.5、25、50、100μM)を、参照試料としては、対応するカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体(FeT2MPyP)およびイオンコンプレックス系(FeT2MPyP+4SAS)を用いた。また、細胞としては、マウス肺ガン癌細胞[Lewis Lung Carcinoma(LLC)、理研ジーンバンク)を用いた。
試験は、10%のFBSを加えたDMEM培地で、マウス肺ガン癌細胞を培養し、次いで細胞数計測および細胞濃度調製を行った細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに加え(100μl/well、細胞数1×104cell/well)、二酸化炭素インキュベーター(CO25%)内で24時間培養した。ウェルプレート内の培地を除去後、予め調製しておいた各濃度の試料溶液を添加し(100l/well、試料濃度0〜100μM)、さらにCO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。
濾過滅菌したアラマー・ブルー溶液を、10μl/wellで添加し、さらに5時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定(測定波長570nmおよび参照波長600nm)を行った。
この結果、図2のように本発明のPr包埋リポソーム(リポソーム系)はカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体(FeT2MPyP)およびイオンコンプレックス系に比べてより良い抗癌特性を示した。
Example 15
Anticancer property test of Pr-embedded liposome (Part 1):
The anticancer properties of the Pr-embedded liposomes of the present invention were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method.
As a test sample, FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome system (product of the present invention 4, FeT2MPyP concentration 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) and as a reference sample, a corresponding cationized cationic metal porphyrin complex (FeT2MPyP) And an ion complex system (FeT2MPyP + 4SAS) was used. As the cells, mouse lung cancer cancer cells [Lewis Lung Carcinoma (LLC), Riken Genebank) were used.
In the test, mouse lung cancer cancer cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS, and then the cell suspension obtained by counting the number of cells and adjusting the cell concentration was added to each well of a 96-well plate (100 μl / well, cell number 1 × 10 4 cells / well), and cultured in a carbon dioxide incubator (CO 2 5%) for 24 hours. After removing the medium in the well plate, a sample solution of each concentration prepared in advance was added (100 l / well, sample concentration 0 to 100 μM), and further incubated in a CO 2 incubator for 24 hours.
The filter sterilized Alamar Blue solution was added at 10 μl / well and further incubated for 5 hours. Thereafter, absorbance measurement (measurement wavelength: 570 nm and reference wavelength: 600 nm) was performed using a microplate reader.
As a result, as shown in FIG. 2, the Pr-embedded liposome of the present invention (liposome system) exhibited better anticancer properties than the cationized cationic metalloporphyrin complex (FeT2MPyP) and the ion complex system.
実 施 例 16
Pr包埋リポソームの抗癌特性試験(その2):
本発明のPr包埋リポソームの抗癌特性を、実施例15と同様、アラマー・ブルー(Alamar Blue )法を用いた殺細胞試験(細胞死試験)により調べた。
本試験の試験試料としては、各種のPr包埋リポソーム(金属ポルフィリン錯体濃度0、12.5、25、50、100μM)を用い、参照試料としては、上記Pr包埋リポソームの成分である金属ポルフィリン錯体(濃度0、12.5、25、50、100μM)およびリポソーム(濃度、2500、5000、10000、20000μM)を用いた。(どちらもPr包埋リポソームの濃度に対応させた。)
また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン(CDDP、濃度0、10、20、40、80μM)およびマイトマイシンC(MCC、濃度0、7.5、15、30、60μM)等を用いた。実施例15と同様に試験したところ、次のような結果が得られた。
まず、金属ポルフィリン錯体としてFeT2MPyPを用いた系での結果は、図3および図4に示されるが、図3からは、参照試料であるFeT2MPyP、イオンコンプレックスであるFeT2MPyP+1SASおよびFeT2MPyP+4SAS並びに公知の抗癌剤であるCDDPおよびMMCのどれもが、添加濃度の増大と共にLLCの細胞生存率の低下が見られ、特に、FeT2MPyP濃度25μM以上におけるFeT2MPyP、FeT2MPyP+1SASおよびFeT2MPyP+4SASのLLC細胞生存率はCDDPおよびMMCのそれらに比べ低くかった示される。一方図4からは、試験試料であるFeT2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品3)およびFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品4)が高い殺細胞作用を有し、これは参照試料であるFeT2MPyP+1SASイオンコンプレックス、FeT2MPyP+4SASイオンコンプレックス、CDDPおよびMMCよりも優れたものであった。
Example 16
Anti-cancer property test of Pr-embedded liposome (Part 2):
The anticancer properties of the Pr-embedded liposome of the present invention were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method as in Example 15.
As a test sample of this test, various Pr-embedded liposomes (metal porphyrin complex concentrations 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) were used, and as a reference sample, metal porphyrin, which is a component of the Pr-embedded liposome, was used. Complexes (concentration 0, 12.5, 25, 50, 100 μM) and liposomes (concentration 2500, 5000, 10,000, 20000 μM) were used. (Both corresponded to the concentration of Pr-embedded liposomes.)
Further, as comparative samples, cisplatin (CDDP, concentrations 0, 10, 20, 40, 80 μM) and mitomycin C (MCC, concentrations 0, 7.5, 15, 30, 60 μM), which are currently used anticancer agents, etc. Was used. When tested in the same manner as in Example 15, the following results were obtained.
First, the results in the system using FeT2MPyP as the metal porphyrin complex are shown in FIG. 3 and FIG. 4. From FIG. 3, the reference samples are FeT2MPyP, the ion complexes are FeT2MPyP + 1SAS and FeT2MPyP + 4SAS, and known anticancer agents. All of CDDP and MMC showed a decrease in LLC cell viability with increasing loading concentration. In particular, the FeT2MPyP, FeT2MPyP + 1SAS, and FeT2MPyP + 4SAS LLC cell viabilities were lower than those of CDDP and MMC at FeT2MPyP concentrations of 25 μM or higher. It was shown. On the other hand, FIG. 4 shows that the test samples FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes (product 3 of the present invention) and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (product 4 of the present invention) have a high cell killing action, which is the reference sample FeT2MPyP + 1SAS It was superior to the complex, FeT2MPyP + 4SAS ion complex, CDDP and MMC.
これら、FeT2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソームおよびFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームのどちらでも、添加濃度の増大と共にLLC細胞生存率の低下が見られ、添加濃度25μM以上で細胞生存率0%となっていた。
このように、Pr包埋リポソームであるFeT2MPyP+1SAS包埋DMPCリポソームおよびFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームは、金属ポルフィリンのイオンコンプレックス、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体および現在使用されている抗癌剤と比べ、最も効果的な抗癌特性を示している(例えば、添加濃度50μMにおいて抗癌特性は現在使用されている抗癌剤<イオンコンプレックス<カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体<Pr包埋リポソームの順に増大している)。これより、Pr包埋リポソームは優れた抗癌剤であるといえる。
In both of these FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes, the LLC cell viability decreased with increasing addition concentration, and the cell viability was 0% at the addition concentration of 25 μM or more.
Thus, the Pr-embedded liposomes, FeT2MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, are the most effective compared to metal porphyrin ion complexes, cationized cationic metal porphyrin complexes and currently used anticancer agents. It shows anticancer properties (for example, at an added concentration of 50 μM, anticancer properties increase in the order of currently used anticancer agent <ion complex <cationized cationic metalloporphyrin complex <Pr embedded liposome). Thus, it can be said that Pr-embedded liposomes are excellent anticancer agents.
実 施 例 17
Pr包埋リポソームの抗癌特性試験(その3):
pH感受性のPr包埋リポソームの抗癌特性を、実施例15と同様、アラマー・ブルー(Alamar Blue )法を用いた殺細胞試験(細胞死試験)により調べた。
試験試料としては、pH感受性であるFeT2MPyP+4OAS包埋混合脂質4リポソーム(本発明品14)およびFeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品4)(濃度:0、12.5、25、50、100μM)を、また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン(CDDP、濃度0、10、20、40、80μM)およびマイトマイシンC(MCC、濃度0、7.5、15、30、60μM)を用いた。
この結果を図5に示すが、FeT2MPyP+4OAS包埋混合脂質Dリポソームが最も効果的な抗癌特性を示し、FeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームがこれに次ぐものであった(例えば、添加濃度12.5μMにおいて抗癌特性はCDDPおよびMMC<FeT2MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム<FeT2MPyP+4OAS包埋混合脂質Dリポソームの順に増大している)。
特に、FeT2MPyP+4OAS包埋混合脂質Dリポソームでは、12.5μMといった低濃度添加でも細胞生存率がほぼ0%となっていることから、本発明のカチオン化カチオン性Pr包埋リポソームは優れた抗癌剤として利用可能であることが見い出された。
Example 17
Anticancer property test of Pr-embedded liposome (Part 3):
The anticancer properties of pH-sensitive Pr-embedded liposomes were examined by a cell killing test (cell death test) using the Alamar Blue method as in Example 15.
As test samples, pH-sensitive FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid 4 liposome (product 14 of the present invention) and FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome (product 4 of the present invention) (concentration: 0, 12.5, 25, 50, 100 μM). As comparative samples, cisplatin (CDDP, concentrations 0, 10, 20, 40, 80 μM) and mitomycin C (MCC, concentrations 0, 7.5, 15, 30, 60 μM), which are currently used anticancer agents, are used. Was used.
The results are shown in FIG. 5, where FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposomes showed the most effective anticancer properties, followed by FeT2MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes (for example, at an added concentration of 12.5 μM). The cancer characteristics increase in the order of CDDP and MMC <FeT2MPyP + 4SAS embedded DMPC liposomes <FeT2MPyP + 4OAS embedded mixed lipid D liposomes).
In particular, the FeT2MPyP + 4OAS-embedded mixed lipid D liposome has a cell viability of almost 0% even when added at a low concentration of 12.5 μM. Therefore, the cationized cationic Pr-embedded liposome of the present invention is used as an excellent anticancer agent. It was found to be possible.
実 施 例 18
金属ポルフィリン錯体と過酸化水素(H2O2)の相互作用:
一般に、大過剰の過酸化水素(H2O2)存在下において、低分子の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、H2O2と頻度高く相互作用するので分解し易いことが報告されている[ R. F. Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979)]。ここで、低分子系金属ポルフィリンであるMnT4MPyP、リポソーム(高分子)系であるMnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム(本発明品5)およびマンガン[5,10,15,20-テトラ(3-フリル)ポルフィリン][MnT3FuP]包埋DMPCリポソーム1)(比較品)とH2O2の相互作用をUV-vis測定より検討した。すなわち、H2O2との相互作用および分解に基づくポルフィリン錯体Soret帯吸収ピーク(463nm)の減衰曲線測定およびその減衰曲線からの半減期(t1/2)の算出より評価した。なお、参考として銅/亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn-SOD)の結果も合わせて示す。なお、H2O2濃度は金属ポルフィリン錯体濃度に対して大過剰の1000倍とした。 これらの結果を表5に示す。
1)疎水性マンガンポルフィリン錯体が、DMPCリポソームの二分子膜疎水部(二分子膜内部)に包埋されたもの。
Interaction of metalloporphyrin complex with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ):
In general, in the presence of a large excess of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), a low-molecular metal porphyrin complex is exposed to a porphyrin ring, and thus interacts with H 2 O 2 frequently, so that it can be easily decomposed. [RF Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979)]. Here, MnT4MPyP, which is a low molecular metal porphyrin, MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome (product 5 of the present invention) and manganese [5,10,15,20-tetra (3-furyl) porphyrin] which is a liposome (polymer) system The interaction between [MnT3FuP] -embedded DMPC liposome 1) (comparative product) and H 2 O 2 was examined by UV-vis measurement. That was evaluated from calculation of the attenuation curve measurement and half-life from the decay curves of the H 2 O 2 and porphyrin complex Soret band absorption peak based on the interaction and degradation of (463nm) (t 1/2). For reference, the results of copper / zinc superoxide dismutase (Cu / Zn-SOD) are also shown. Incidentally, H 2 O 2 concentration was 1000-fold of a large excess relative to the metal porphyrin complex concentration. These results are shown in Table 5.
1) A structure in which a hydrophobic manganese porphyrin complex is embedded in a bimolecular hydrophobic portion (inside the bimolecular membrane) of a DMPC liposome.
これより、t1/2はCu/Zn-SOD<MnT4MPyP=MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム<MnT3FuP包埋DMPCリポソームの順に増加した。MnT4MPyPは低分子系のためポルフィリン環が露出してH2O2と頻度高く相互作用するので分解し易く、MnT3FuP包埋DMPCリポソームは高分子系のためポルフィリン環が露出しておらずH2O2と頻度高く相互作用しないので分解し難い。しかしながら、MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソームのt1/2はほぼMnT4MPyPのそれに類似し、MnT3FuP包埋DMPCリポソームのt1/2の1/10であった。これは、DMPCリポソーム二分子膜中のMnT4MPyPおよびMnT3FuPの包埋部位が異なるためと考えられ、MnT4MPyPはリポソーム二分子膜中の親水部(または表層近傍)に、および、MnT3FuPはその疎水部に存在するためと考えられる。この結果は、実施例12および14の結果と対応している。また、MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソームのt1/2はCu/Zn-SODのそれに比べて大きく、Cu/Zn-SODに比べてH2O2耐性を有することも示唆された。 From this, t1 / 2 increased in the order of Cu / Zn-SOD <MnT4MPyP = MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome <MnT3FuP-embedded DMPC liposome. Since MnT4MPyP is a low molecular weight system, the porphyrin ring is exposed and interacts with H 2 O 2 frequently, so it is easily decomposed. Since the MnT3FuP-embedded DMPC liposome is a polymer system, the porphyrin ring is not exposed and H 2 O Since it does not interact with 2 frequently, it is difficult to decompose. However, the t 1/2 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes was almost similar to that of MnT4MPyP and was 1/10 of t 1/2 of MnT3FuP-embedded DMPC liposomes. This is thought to be due to the different embedding sites of MnT4MPyP and MnT3FuP in the DMPC liposome bilayer membrane. MnT4MPyP is present in the hydrophilic part (or near the surface layer) in the liposome bilayer membrane and MnT3FuP is present in the hydrophobic part. It is thought to do. This result corresponds to the result of Examples 12 and 14. Moreover, t 1/2 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome was larger than that of Cu / Zn—SOD, suggesting that it has H 2 O 2 resistance compared to Cu / Zn—SOD.
実 施 例 19
Pr包埋リポソームのSOD活性評価(その1):
Pr包埋リポソームのSOD活性(すなわち、O2 −・消去活性)をマッコード、フライドビッチらおよびバトラーらのチトクロームc法により評価した[(1) J. M. Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969) および (2) J. Butler, W. H. Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)]。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で0〜1000μMのPr包埋リポソーム溶液(A溶液)を5水準以上調製した。次に、0.3mMキサンチン水溶液、60μMチトクロームc水溶液およびpH7.8、30mMリン酸緩衝水溶液を各20ml取り、さらに、純水24mlを加えて混合溶液(B溶液)を得た。このB溶液 2.1mlにA溶液 0.3mlと純水 0.2mlを加えて放置(25℃、10min)した。放置後の混合溶液に7μg/mlカタラーゼ水溶液 0.1ml、25U/mlキサンチンオキシダーゼ(XOD)水溶液 0.3mlをすばやく混合して550nm(フェロチトクロームc生成に基づく吸収ピーク)におけるUV-visの経時測定を行った(最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体0〜100μM、キサンチン0.05mM、XOD2.5U/ml、チトクロームc10μMおよびカタラーゼ0.23μg/mlである。)。また、Pr包埋リポソーム無添加系(ブランク)でも同様に測定した。これらUV-visの経時測定における「時間-550nmでの吸光度」の関係よりPr包埋リポソーム無添加系および添加系でのフェロチトクロームc生成速度(viおよびvo)を求め、さらに、下式から阻害率(IC)を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-IC」の関係よりIC=50%おける金属ポルフィリン濃度(IC50)を求めてこれをSOD活性の指標とした(IC50が小さいほど高いSOD活性を示す)。なお、参照として対応するイオンコンプレックス(MnT4MPyP+1SAS等)についても同様にSOD活性を評価した。
阻害率(IC)=1-(vi/vo)
vo:Pr包埋リポソーム無添加系でのフェロチトクロームc生成速度
vi:Pr包埋リポソーム添加系でのフェロチトクロームc生成速度
表6に各種金属ポルフィリン錯体系のIC50を示す。なお、MnT4MPyPのIC50はフライドビッチらの文献値を示した[ I. Batinic-Haberle, L. Benov, and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)]。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 1):
Pr-embedded liposomes were evaluated for SOD activity (ie, O 2 − .erasing activity) by the cytochrome c method of McCord, Friedbich et al. And Butler et al. [(1) JM Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. , 244, 6049 (1969) and (2) J. Butler, WH Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)]. Specifically, it was performed as follows. Five levels or more of Pr-embedded liposome solution (A solution) having a metalloporphyrin concentration of 0 to 1000 μM was prepared. Next, 20 ml each of 0.3 mM xanthine aqueous solution, 60 μM cytochrome c aqueous solution and pH 7.8, 30 mM phosphate buffer aqueous solution was taken, and 24 ml of pure water was further added to obtain a mixed solution (B solution). To 2.1 ml of this solution B, 0.3 ml of solution A and 0.2 ml of pure water were added and allowed to stand (25 ° C., 10 min). 7-g / ml catalase aqueous solution 0.1 ml and 25 U / ml xanthine oxidase (XOD) aqueous solution 0.3 ml were quickly mixed with the mixed solution after standing, and UV-vis time-lapse measurement at 550 nm (absorption peak based on ferrocytochrome c formation) (The concentration of each component of the final test solution is 0-100 μM metalloporphyrin complex, 0.05 mM xanthine, 2.5 U / ml XOD, 10 μM cytochrome c and 0.23 μg catalase). Moreover, it measured similarly also in Pr embedding liposome additive-free system (blank). The rate of ferrocytochrome c formation (vi and vo) in the Pr-embedded liposome-free and added systems was determined from the relationship of “time-absorbance at 550 nm” in the UV-vis time-lapse measurement. The rate (IC) was calculated, and finally the metal porphyrin concentration (IC 50 ) at IC = 50% was determined from the relationship of “metal porphyrin complex concentration−IC”, and this was used as an index of SOD activity (IC 50 Smaller indicates higher SOD activity). In addition, SOD activity was similarly evaluated about the ion complex (MnT4MPyP + 1SAS etc.) corresponding as a reference.
Inhibition rate (IC) = 1- (vi / vo)
vo: Ferrocytochrome c production rate in Pr-free embedded liposome addition system vi: Ferrocytochrome c production rate in Pr-embedded liposome addition system Table 6 shows IC 50 of various metalloporphyrin complex systems. Incidentally, IC 50 of MnT4MPyP showed literature fried Bitch et al [I. Batinic-Haberle, L. Benov , and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)].
この結果より、MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソームおよびMnT4MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームのIC50は低分子系[MnT4MPyP(文献値)およびMnT4MPyP+1SAS]のそれらと類似となり、効果的なSOD活性を示していた。 From these results, the IC 50 of MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes and MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposomes were similar to those of low molecular systems [MnT4MPyP (document value) and MnT4MPyP + 1SAS], and showed effective SOD activity.
実 施 例 20
Pr包埋リポソームのSOD活性評価(その2):
Pr包埋リポソームのSOD活性(すなわち、O2 −・消去活性)をリレイ(Riley)らのストップドフロー法により評価した[ D. P. Riley, W. L. Rivers, and R. H. Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)]。具体的には下記のように行った。36℃において,O2 −・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のPr包埋リポソームを含む60mMHEPES/HEPESNa緩衝溶液(pH8.1)を急速混合し、O2 −・に基づく245nmの吸光度の減衰(O2 −・消失反応の減衰曲線)を経時的に測定した。この減衰曲線より「ln(吸光度)-時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-見かけの速度定数」関係の傾きよりO2 −・消失反応の速度定数(kcat)を求めた。 なお、参照としてイオンコンプレックス(MnT4MPyP+1SAS等)についても同様にSOD活性を評価した。
表7に各種金属ポルフィリン錯体系のkcatを示す。なお、MnT4MPyPのkcatはオオセ、カワカミらの文献値で示した[ T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 (2001)]。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 2):
SOD activity (ie, O 2 − .erasing activity) of Pr-embedded liposomes was evaluated by the stopped flow method of Riley et al. [DP Riley, WL Rivers, and RH Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)]. Specifically, it was performed as follows. At 36 ° C., a dimethyl sulfoxide solution containing potassium superoxide as a source of O 2 − · and a 60 mM HEPES / HEPESNa buffer solution (pH 8.1) containing Pr-embedded liposomes of various concentrations were rapidly mixed to obtain O 2 − · Absorbance decay at 245 nm based on (O 2 −. Extinction curve of disappearance reaction) was measured over time. From this attenuation curve, a relationship of “ln (absorbance) -time” was obtained, and an apparent rate constant was calculated from the slope of this relationship. Finally, the rate constant (k cat ) of the O 2 − disappearance reaction was determined from the slope of the relationship “metal porphyrin complex concentration−apparent rate constant”. In addition, SOD activity was similarly evaluated about the ion complex (MnT4MPyP + 1SAS etc.) as a reference.
Table 7 shows k cat of various metalloporphyrin complex systems. The k cat of MnT4MPyP is shown in the literature values of Ose and Kawakami et al. [T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 ( 2001)].
この結果、MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム、MnT4MPyP+4SAS包埋DMPCリポソームおよびMnT4MPyP+1SAS包埋EYLリポソームのkcatは低分子系[MnT4MPyP(文献値)、MnT4MPyP+1SASおよびMnT4MPyP+4SAS]のそれらと近く、効果的なSOD活性を示していた。 As a result, the k cat of the MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, and MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome is close to those of the low molecular systems [MnT4MPyP (literature value), MnT4MPyP + 1SAS and MnT4MPyP + 4SAS], and is effective. It was.
実 施 例 21
Pr包埋リポソームのSOD活性評価(その3):
Pr包埋リポソームを代表とする各種金属ポルフィリン錯体のSOD活性の比較を行った。試料としてMnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム(MnT4MPyP/リポソーム系)、MnT3FuP包埋DMPCリポソーム(MnT3FuP/リポソーム系)およびMnT4MPyPを用い、チトクロームc法およびストップドフロー法より評価した。なお、試料調製および測定は実施例19および20と同様である。
表8に各種金属ポルフィリン錯体のSOD活性の指標であるkcatおよびIC50を示す。
Evaluation of SOD activity of Pr-embedded liposome (Part 3):
The SOD activity of various metalloporphyrin complexes represented by Pr-embedded liposomes was compared. MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposomes (MnT4MPyP / liposome system), MnT3FuP-embedded DMPC liposomes (MnT3FuP / liposome system) and MnT4MPyP were used as samples and evaluated by the cytochrome c method and the stopped flow method. The sample preparation and measurement are the same as in Examples 19 and 20.
Table 8 shows k cat and IC 50 which are indicators of SOD activity of various metalloporphyrin complexes.
MnT4MPyPのkcatおよびIC50は表6および同表で示した文献値と一致し、本評価の妥当性を示している。さらに、kcatはMnT3FuP/リポソーム系<MnT4MPyP/リポソーム系<MnT4MPyPの順に増加、かつ、IC50はkcatはMnT3FuP/リポソーム系>MnT4MPyP/リポソーム系>MnT4MPyPの順に減少しており、これら2つの評価法は対応している。また、MnT4MPyP/リポソーム系のkcatおよびIC50がMnT4MPyPのそれらに類似し、MnT3FuP/リポソーム系のそれらに類似しないという結果は、実施例16、17および18の結果に対応している。いづれにせよ、MnT4MPyP/リポソーム系(MnT4MPyP+1SAS包埋DMPCリポソーム、MnT4MPyP+4SAS包埋DMPCリポソーム、MnT4MPyP+1SAS包埋EYLリポソーム等)は、効果的なSOD活性を示し、有効な抗酸化剤となりうることを示している。 The k cat and IC 50 of MnT4MPyP agree with the literature values shown in Table 6 and the table, indicating the validity of this evaluation. Further, k cat is MnT3FuP / liposome system <increased MnT4MPyP / liposome system <in order of MnT4MPyP, and, IC 50 is k cat is MnT3FuP / liposome system> MnT4MPyP / liposome system> has decreased in the order of MnT4MPyP, these two evaluation The law is compliant. Also, the results that the k cat and IC 50 of the MnT4MPyP / liposome system are similar to those of the MnT4MPyP and not similar to those of the MnT3FuP / liposome system correspond to the results of Examples 16, 17 and 18. In any case, the MnT4MPyP / liposome system (MnT4MPyP + 1SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 4SAS-embedded DMPC liposome, MnT4MPyP + 1SAS-embedded EYL liposome, etc.) shows effective SOD activity and can be an effective antioxidant. .
Claims (15)
で表されるものであることを特徴とする請求項1に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。 The cationized cationic metalloporphyrin complex has the following formula (I), (II) or (III)
The metal porphyrin complex-embedded liposome according to claim 1, wherein
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004200163A JP4741205B2 (en) | 2003-07-07 | 2004-07-07 | Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003193138 | 2003-07-07 | ||
JP2003193138 | 2003-07-07 | ||
JP2003193139 | 2003-07-07 | ||
JP2003193139 | 2003-07-07 | ||
JP2004200163A JP4741205B2 (en) | 2003-07-07 | 2004-07-07 | Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005041869A JP2005041869A (en) | 2005-02-17 |
JP4741205B2 true JP4741205B2 (en) | 2011-08-03 |
Family
ID=34279520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004200163A Expired - Fee Related JP4741205B2 (en) | 2003-07-07 | 2004-07-07 | Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4741205B2 (en) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA200601630A1 (en) * | 2004-03-04 | 2007-02-27 | Макото Юаса | NIOSOMA HAVING MATHALOPORPHYRINE COMPLEX IMPLEMENTED IN IT, THE METHOD OF ITS PREPARATION AND THE MEDICINE USING |
JP2010208955A (en) * | 2009-03-06 | 2010-09-24 | Makoto Yuasa | Disease treatment drug |
CN103068395A (en) * | 2010-08-06 | 2013-04-24 | 汤浅真 | Therapeutic agent for disease |
JP6154231B2 (en) * | 2013-07-22 | 2017-06-28 | 学校法人同志社 | Anticancer drug |
JP6731730B2 (en) * | 2015-01-07 | 2020-07-29 | 東京都公立大学法人 | Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) treatment with epigenetic control carrier with antioxidant function |
KR20240013509A (en) * | 2022-07-22 | 2024-01-30 | (주)아이엠지티 | Sonosensitive porphyrin-liposomes and the uses thereof |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57206613A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Hidetoshi Tsuchida | Phospholipid liposome containing clathrated iron (2) porphyrin complex and oxygen-adsorption and desorption agent |
JPS59179128A (en) * | 1983-03-31 | 1984-10-11 | Hidetoshi Tsuchida | Oxygen adsorbing and desorbing agent |
JPS60188329A (en) * | 1984-03-07 | 1985-09-25 | Ajinomoto Co Inc | Transfer accelerator for liposome inclusion substance |
JPS61225123A (en) * | 1985-03-29 | 1986-10-06 | Hidetoshi Tsuchida | Phospholipid liposome |
JPH06122628A (en) * | 1992-02-05 | 1994-05-06 | Quadra Logic Technol Inc | Liposome composition of prophyrin photosensitizer |
JPH11509834A (en) * | 1995-08-02 | 1999-08-31 | キューエルティー フォトセラピューティクス,インコーポレイテッド | Method for making liposomes containing hydro-monobenzoporphyrin photosensitizer |
JP2000247978A (en) * | 1999-02-25 | 2000-09-12 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | Metal porphyrin complex and pharmaceutical composition containing the same |
JP2000302685A (en) * | 1999-02-18 | 2000-10-31 | Sankyo Co Ltd | Liposome preparation containing anti-tumor agent |
JP2001515455A (en) * | 1995-06-07 | 2001-09-18 | プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ | Transport of macromolecules into cells |
JP2001521939A (en) * | 1997-11-03 | 2001-11-13 | デューク・ユニバーシティー | Substituted porphyrins |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5707608A (en) * | 1995-08-02 | 1998-01-13 | Qlt Phototherapeutics, Inc. | Methods of making liposomes containing hydro-monobenzoporphyrin photosensitizer |
-
2004
- 2004-07-07 JP JP2004200163A patent/JP4741205B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57206613A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Hidetoshi Tsuchida | Phospholipid liposome containing clathrated iron (2) porphyrin complex and oxygen-adsorption and desorption agent |
JPS59179128A (en) * | 1983-03-31 | 1984-10-11 | Hidetoshi Tsuchida | Oxygen adsorbing and desorbing agent |
JPS60188329A (en) * | 1984-03-07 | 1985-09-25 | Ajinomoto Co Inc | Transfer accelerator for liposome inclusion substance |
JPS61225123A (en) * | 1985-03-29 | 1986-10-06 | Hidetoshi Tsuchida | Phospholipid liposome |
JPH06122628A (en) * | 1992-02-05 | 1994-05-06 | Quadra Logic Technol Inc | Liposome composition of prophyrin photosensitizer |
JP2001515455A (en) * | 1995-06-07 | 2001-09-18 | プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ | Transport of macromolecules into cells |
JPH11509834A (en) * | 1995-08-02 | 1999-08-31 | キューエルティー フォトセラピューティクス,インコーポレイテッド | Method for making liposomes containing hydro-monobenzoporphyrin photosensitizer |
JP2001521939A (en) * | 1997-11-03 | 2001-11-13 | デューク・ユニバーシティー | Substituted porphyrins |
JP2000302685A (en) * | 1999-02-18 | 2000-10-31 | Sankyo Co Ltd | Liposome preparation containing anti-tumor agent |
JP2000247978A (en) * | 1999-02-25 | 2000-09-12 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | Metal porphyrin complex and pharmaceutical composition containing the same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005041869A (en) | 2005-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6389539B2 (en) | Porphyrin nanovesicle | |
Yang et al. | Near-infrared light triggered liposomes combining photodynamic and chemotherapy for synergistic breast tumor therapy | |
US20120039987A1 (en) | Niosome having metal porphyrin complex embedded therein, process for producing the same and drug with the use thereof | |
JP5372371B2 (en) | Cationic bacteriochlorophyll derivatives and uses thereof | |
WO2005099689A1 (en) | Topical delivery of phthalocyanines | |
EP1567147B1 (en) | Water-soluble anionic bacteriochlorophyll derivatives and their uses | |
CN115023418A (en) | Bis-aminoquinoline and nanoformulation for cancer treatment | |
JP4741205B2 (en) | Metalloporphyrin complex-embedded liposome, method for producing the same, and medicament using the same | |
EP2934303B1 (en) | Compositions and method for light triggered release of materials from nanovesicles | |
JP2005501859A (en) | Platinum complexes and their use in the treatment of cancer | |
US20050008687A1 (en) | Metal-porphyrin-complex-embedded liposomes, production process thereof, and medicines making use of the same | |
IE65987B1 (en) | Phospholipid delivery vehicle for aqueous-insoluble active ingredients | |
Giacomazzo et al. | Ruthenium (II) polypyridyl complexes with π-expansive ligands: synthesis and cubosome encapsulation for photodynamic therapy of non-melanoma skin cancer | |
Wang et al. | Incorporation of 7-dehydrocholesterol into liposomes as a simple, universal and efficient way to enhance anticancer activity by combining PDT and photoactivated chemotherapy | |
Krivosheeva et al. | Effect of substituents in chlorin e6 derivatives on the loading efficiency of the photosensitizer into the liposome membrane and their biological activity | |
EP2968615B1 (en) | Particles comprising luminescent lanthanide complexes | |
US10918599B2 (en) | Serum-stable compositions and methods for light-triggered release of materials | |
Çoban et al. | Liposomes in photodynamic therapy | |
KR20070008623A (en) | Niosome having metal porphyrin complex embedded therein, process for producing the same and drug with the use thereof | |
Charron | Fundamentals of Porphyrin-lipid J-aggregation in Nanomedicine | |
Massiot | Design of photoactivatable drug delivery systems made of lipids and porphyrins or lipid-porphyrin conjugates for the controlled release of active pharmaceutical ingredients | |
WO2020189641A1 (en) | Phthalocyanin compound and ribosome preparation and cancer/tumor treatment drug using same | |
AU2008200847A1 (en) | Metallotetrapyrrolic photosensitizing agents for use in photodynamic therapy | |
JP2015209417A (en) | Oral therapeutic agent for diseases | |
Wei et al. | Biotin-modified cyclometalated iridium-based photosensitizers as mitochondria-targeted theranostic agents for tumor photodynamic therapy in vitro and in vivo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100907 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110111 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110314 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110419 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110506 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4741205 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140513 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |