JP4734523B2 - Hypercholesterolemia disease model mouse - Google Patents
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Description
本発明は、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供することに関する。より具体的には、高コレステロール血症の疾患モデルマウスを提供することに関する。 The present invention relates to providing a disease model animal of hypercholesterolemia. More specifically, the present invention relates to providing a disease model mouse for hypercholesterolemia.
現代の成人病として、高コレステロール血症およびそれに起因する動脈硬化症は、重要な疾患の一つとされている。血清総コレステロール値の調節機構として、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）が主要な働きをしていることが知られている。HMG-CoA還元阻害薬であるスタチンは、LDL受容体の発現を調節することにより、血清総コレステロール値を低下させ、動脈硬化症の発症・進展を抑制することが知られている。スタチンは、このような作用により、世界の公衆衛生分野において多大な貢献をしている。 As modern adult diseases, hypercholesterolemia and arteriosclerosis resulting therefrom are regarded as one of important diseases. It is known that the low density lipoprotein receptor (LDLR) plays a major role as a regulation mechanism of serum total cholesterol levels. It is known that statins, which are HMG-CoA reduction inhibitors, regulate the expression of LDL receptors, thereby reducing serum total cholesterol levels and suppressing the onset and progression of arteriosclerosis. Statins make a great contribution to the global public health field through such actions.
このような血清総コレステロールを低下させる化合物は、高コレステロール血症の治療ならびに動脈硬化症の予防に非常に有用であるが、その様な化合物をスクリーニングするためのモデル動物は、現在までのところ、十分に開発がなされているとは言えない状況である。 Although such compounds that lower serum total cholesterol are very useful for the treatment of hypercholesterolemia and prevention of arteriosclerosis, model animals for screening such compounds have so far been The situation is not fully developed.
例えば、動脈硬化症のモデル動物については、家族性高コレステロール血症のモデル動物として、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）遺伝子のノックアウトマウスが作出された（非特許文献1）。このモデルマウスにおいては、高コレステロール食を与えた場合には1500〜2000 mg/dlの血清総コレステロール値を示し、顕著な動脈硬化症を発症することが知られていたものの、普通食を与えた場合にはわずか230 mg/dlの血清総コレステロール値を示すにすぎなかった（非特許文献1）。 For example, for a model animal of arteriosclerosis, a knockout mouse of a low density lipoprotein receptor (LDLR) gene was created as a model animal of familial hypercholesterolemia (Non-patent Document 1). In this model mouse, serum cholesterol level of 1500-2000 mg / dl was shown when fed a high cholesterol diet, and it was known to develop marked arteriosclerosis, but a regular diet was given. In some cases, it only showed a serum total cholesterol level of 230 mg / dl (Non-patent Document 1).
ApoE遺伝子のノックアウトマウスでは、普通食を与えた場合に450〜700 mg/dlの血清総コレステロール値を示し、LDLRノックアウトマウスよりは顕著な高コレステロール血症および動脈硬化症が認められたが（非特許文献2）、マウスはコレステロールエステル転送タンパク質(CETP)を持たないため、コレステロールを転送するメインのリポタンパク質がLDLではなくHDLであり、動脈硬化症を発症しにくいという問題点が存在していた。 ApoE gene knockout mice showed a serum total cholesterol level of 450-700 mg / dl when fed with a normal diet, and marked hypercholesterolemia and arteriosclerosis were observed compared to LDLR knockout mice (non-) Since the mouse does not have cholesterol ester transfer protein (CETP), the main lipoprotein that transfers cholesterol is HDL, not LDL, and there is a problem that it is difficult to develop arteriosclerosis. .
さらに、高コレステロール血症および動脈硬化症のモデル動物を得ることを目的として、LRLR遺伝子とApoE遺伝子とを両方とも欠損するLRLR／ApoEダブルノックアウトマウスが作出されたが、この場合にも普通食を与えた場合に450〜700 mg/dlの血清総コレステロール値を示すにすぎず、ApoEノックアウトマウスと同等の高コレステロール血症を示すにすぎなかった（非特許文献3）。 In addition, LRLR / ApoE double knockout mice lacking both the LRLR gene and the ApoE gene were created with the aim of obtaining hypercholesterolemia and arteriosclerosis model animals. When given, it only showed a serum total cholesterol level of 450-700 mg / dl and only hypercholesterolemia equivalent to ApoE knockout mice (Non-patent Document 3).
一方、ニューロメジンU（NMU）は、ブタの脊髄から単離された神経ペプチドであり主として消化管と下垂体に存在することが知られている。この物質は、平滑筋の収縮、血圧、摂食行動などに関わっていると考えられている物質である（非特許文献4）。 On the other hand, neuromedin U (NMU) is a neuropeptide isolated from the spinal cord of pigs and is known to exist mainly in the digestive tract and pituitary gland. This substance is considered to be involved in smooth muscle contraction, blood pressure, eating behavior, and the like (Non-Patent Document 4).
このNMU遺伝子を欠失させたNMUノックアウトマウスでは、過食、肥満、高インスリン血症がみられる他、加齢とともに高血糖や高脂血症の症状を呈するようになることが報告されている（非特許文献5）。 NMU knockout mice lacking the NMU gene have been reported to exhibit hyperglycemia and hyperlipidemia with age, as well as hyperphagia, obesity, and hyperinsulinemia. Non-patent document 5).
これらの疾患モデル動物は、いずれも高コレステロール食を与えた場合には顕著な血清総コレステロール値を示し、また顕著な動脈硬化症の症状を示すものの、普通食を与えた場合には、予期されたほどの高い血清総コレステロール値を示すことがなく、当該技術分野においては、普通食を与えた場合にも非常に高い総コレステロール値を示す動物モデルを開発することが急務とされている。
本発明は、従来のモデル動物では得られなかった顕著な高コレステロール血症を呈する新しい疾患モデル動物を提供することを課題とする。より具体的には、高コレステロール食を処方しなくても、普通食のみで高コレステロール血症を呈する疾患モデル糖物を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a new disease model animal that exhibits remarkable hypercholesterolemia that has not been obtained with conventional model animals. More specifically, an object of the present invention is to provide a disease model carbohydrate that exhibits hypercholesterolemia only with a normal diet without prescribing a high-cholesterol diet.
本発明の発明者らは、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする動物を作出したところ、顕著な高コレステロール血症を発症することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供することにより、上述した課題を解決できることを示した。 The inventors of the present invention have found that an animal characterized by deficiency of both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene has developed significant hypercholesterolemia. It came to complete. That is, the present invention shows that the above-mentioned problems can be solved by providing a disease model animal of hypercholesterolemia characterized by being deficient in both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene. It was.
本発明においては、上述したニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している動物を提供することにより、普通食で高コレステロール血症および動脈硬化症を発症する、疾患モデル動物を作出することができた。 In the present invention, a disease model animal that develops hypercholesterolemia and arteriosclerosis with a normal diet is produced by providing an animal that is deficient in both the above-mentioned neuromedin U (NMU) gene and ApoE gene. We were able to.
本発明は、本発明は、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供する。ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している動物は、まずNMU遺伝子を欠損している動物およびApoE遺伝子を欠損している動物をそれぞれ作出し、これらの動物を交配することにより作出することができる。 The present invention provides a disease model animal of hypercholesterolemia, characterized in that both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene are deficient. An animal lacking both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene is created by first creating an animal lacking the NMU gene and an animal lacking the ApoE gene, and then mating these animals. Can be created.
特定の遺伝子を欠失する動物は、一般的な遺伝子ノックアウト動物の作出方法（Joyner AL, Scarnes WC, Nature 338:153-156, 1989）を用いて作出することができる。そして、このような一般的な方法で作出された遺伝子ノックアウト動物は、標的とする遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠損することを特徴とする。したがって、NMU遺伝子を欠損している動物は、染色体上のNMU遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠失していることを特徴とし、そしてApoE遺伝子を欠損している動物は染色体上のApoE遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠失していることを特徴とする。動物におけるNMU遺伝子およびApoE遺伝子の有無は、動物由来の細胞（例えばマウスの場合には尾の先端切除片由来の細胞）からDNAを抽出し、それを鋳型として、NMU遺伝子に関しては欠失したアレルの検出にはフォワードプライマーとしてaatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat（SEQ ID NO: 1）およびリバースプライマーとしてcagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg（SEQ ID NO: 2）を用い、ワイルドタイプのアレルの検出には、フォワードプライマーとしてcccggcactt cgcccaatag cagccagtcc（SEQ ID NO:3)およびリバースプライマーとしてacctaagtta agtttctagt accactcacc（SEQ ID NO:4)を用いた。ApoE遺伝子に関してはフォワードプライマーとしてtagccgaggg agagccg（SEQ ID NO: 5）およびリバースプライマーとして欠失したアレルの検出にはgacttgggag ctctgcagc（SEQ ID NO: 6）、ワイルドタイプのアレルの検出にはgccgccccga ctgcatct（SEQ ID NO: 7）を用いて、それぞれPCR法を行って増幅の有無を調べることにより確認した。 An animal lacking a specific gene can be produced using a general gene knockout animal production method (Joyner AL, Scarnes WC, Nature 338: 153-156, 1989). And the gene knockout animal produced by such a general method is characterized in that both alleles of the target gene are deleted. Thus, animals that are deficient in the NMU gene are characterized by deletion of both alleles of the NMU gene on the chromosome, and animals that are deficient in the ApoE gene are alleles of the ApoE gene on the chromosome. It is characterized in that both genes are deleted. The presence or absence of the NMU gene and ApoE gene in animals is determined by extracting DNA from animal-derived cells (for example, cells derived from tail tip excision in the case of mice) and using it as a template for alleles deleted for the NMU gene. Aatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat (SEQ ID NO: 1) as a forward primer and cagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg (SEQ ID NO: 2) as a reverse primer, and cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc as a forward primer for wild type allele detection (SEQ ID NO: 3) and acctaagtta agtttctagt accactcacc (SEQ ID NO: 4) were used as reverse primers. For the ApoE gene, tagccgaggg agagccg (SEQ ID NO: 5) as a forward primer, gacttgggag ctctgcagc (SEQ ID NO: 6) for detection of alleles deleted as a reverse primer, and gccgccccga ctgcatct (SEQ ID NO: 6) for detection of wild type alleles. Using ID NO: 7), the PCR method was used to confirm the presence or absence of amplification.
これらのNMU遺伝子を欠損している動物（NMU-/-）とApoE遺伝子を欠損している動物（ApoE-/-）とを交配すると、F1ハイブリッド個体はすべて〔NMU+/-：ApoE+/-〕の遺伝子型をもつ個体となる。F1ハイブリッド個体同士を交配すると、25％の確率で〔NMU-/-：ApoE-/-〕の遺伝子型をもつ、NMU遺伝子およびApoE遺伝子の両方ともを欠損するNMU／ApoEダブルノックアウト動物が生まれる。この〔NMU-/-：ApoE-/-〕の遺伝子型を有するNMU／ApoEダブルノックアウト動物同士を交配することにより、NMU／ApoEダブルノックアウト動物を維持する。 When these NMU gene-deficient animals (NMU -/- ) and ApoE gene-deficient animals (ApoE -/- ) are crossed, all F1 hybrid individuals [NMU +/- : ApoE + / - the individuals with the genotype of]. When F1 hybrid individuals are mated, an NMU / ApoE double knockout animal having a genotype of [NMU − / − : ApoE − / − ] and lacking both the NMU gene and the ApoE gene is born with a probability of 25%. An NMU / ApoE double knockout animal is maintained by crossing NMU / ApoE double knockout animals having the genotype of [NMU − / − : ApoE − / − ].
本発明のNMU／ApoEダブルノックアウト動物の動物種は、実験モデル動物として一般的に利用されている動物種であって、遺伝子ノックアウト技術を利用することができる動物種であればどのような動物種であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、などが好ましい。 The animal species of the NMU / ApoE double knockout animal of the present invention is an animal species generally used as an experimental model animal, and any animal species that can use the gene knockout technique. Mice, rats, rabbits, goats, etc. are preferred.
このNMU／ApoEダブルノックアウト動物は、普通食を与え、自由飲水、25℃の条件下で飼育する。このように飼育された動物の血清コレステロール値は、当該技術分野において酵素法と呼ばれる血中コレステロール値の定量法を用いて測定する。この酵素法は、エステル型コレステロールを加水分解して遊離型コレステロールと脂肪酸を生成するコレステロールエステラーゼ、および遊離型コレステロールから過酸化水素とΔ4-コレステノンを生成するコレステロールオキシダーゼを使用する方法であり、この2種類の酵素の働きにより初期エステル型コレステロール濃度に依存して生成される過酸化水素を酸化剤として、ペルオキシダーゼの存在下で発色基質を酸化することにより、初期エステル型コレステロール濃度を定量することができる方法である。 This NMU / ApoE double knockout animal is fed on a normal diet and kept under free drinking water at 25 ° C. The serum cholesterol level of an animal reared in this way is measured using a method for quantifying blood cholesterol level called an enzymatic method in the art. This enzymatic method is a method using cholesterol esterase that hydrolyzes ester-type cholesterol to produce free cholesterol and fatty acid, and cholesterol oxidase that produces hydrogen peroxide and Δ 4 -cholesterone from free cholesterol, The initial ester cholesterol level is quantified by oxidizing the chromogenic substrate in the presence of peroxidase using hydrogen peroxide, which is generated depending on the initial ester cholesterol level, as an oxidizing agent. It is a method that can be.
本発明においては、血中に存在する、VLDL、LDL、HDLのすべてのコレステロールを定量することができる酵素法用キットを使用することが好ましい。このようなキットとしては、デタミナーL TCII、デタミナーTC-555（いずれも協和メデックス）やアクアオートカイノスT-CHO試薬（株式会社カイノス）などを使用することができる。 In the present invention, it is preferable to use an enzyme method kit capable of quantifying all VLDL, LDL and HDL cholesterol present in blood. As such a kit, it is possible to use Determiner L TCII, Determiner TC-555 (all Kyowa Medex), Aqua Auto Kinos T-CHO reagent (Kaynos Co., Ltd.), and the like.
血清総コレステロール値を定量する場合には、血清サンプルをそのまま使用するが、VLDL、LDL、およびHDLの各成分を定量する場合には、血清サンプルをまず各成分に分画し、それぞれの画分について上記酵素法による定量を行う。VLDL、LDL、およびHDLの各成分を分画するためには、血清中のリポタンパク質を分析可能なゲル濾過カラムを用いてHPLCなどを使用することができる。このようなゲル濾過カラムとしては、TSKgel LipopropakXL、TSKgel Lipopropak（いずれも東ソー）などを使用することができる。 When quantifying the serum total cholesterol level, the serum sample is used as it is, but when quantifying each component of VLDL, LDL, and HDL, the serum sample is first fractionated into each component, and then each fraction is fractionated. Quantification by the above enzyme method. In order to fractionate each component of VLDL, LDL, and HDL, HPLC or the like can be used using a gel filtration column capable of analyzing lipoproteins in serum. As such a gel filtration column, TSKgel LipopropakXL, TSKgel Lipopropak (both Tosoh) and the like can be used.
以下の実施例において、本発明を更に具体的に説明する。 The following examples further illustrate the present invention.
実施例1：ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子をともに欠損するマウスの作出
本実施例においては、ニューロメジンU（NMU）ノックアウトマウスとApoEノックアウトマウスとを交配することにより、NMU遺伝子およびApoE遺伝子をともに欠損するマウス（以下、「NMU／ApoEダブルノックアウトマウス」または「〔NMU-/-：ApoE-/-〕」という）を作出した。
Example 1: Production of a mouse deficient in both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene In this example, the NMU gene and the ApoE gene were synthesized by mating a neuromedin U (NMU) knockout mouse with an ApoE knockout mouse. Mice deficient in both (hereinafter referred to as “NMU / ApoE double knockout mice” or “[NMU − / − : ApoE − / − ]”) were created.
NMUノックアウトマウスは、久留米大学の児島将康教授の研究室で作出されたものの譲渡を受けた（Hanada R, et al., Nat. Med., 2004 10: 1067-73）。このマウスは、また、アポEノックアウトマウスC57BL/6J-Apoetm1Uncは、Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine, USA）より購入した。これらのマウスは、25℃、水および餌の自由摂取、無菌の条件下で、国立循環器病センターの実験動物指針に基づいて飼育した。 NMU knockout mice were transferred from a laboratory created by Professor Masayasu Kojima at Kurume University (Hanada R, et al., Nat. Med., 2004 10: 1067-73). The mice also apo E knockout mice C57BL / 6J-Apoe tm1Unc is, Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine , USA) were purchased from. These mice were bred at 25 ° C. under free access to water and food, under aseptic conditions, based on experimental animal guidelines of the National Cardiovascular Center.
NMUノックアウトマウスのオスおよびアポEノックアウトマウスのメスを交配して得られたF1マウス〔NMU+/-：ApoE+/-〕どうしをさらに交配することにより、1/16の確率で生じる「NMU／ApoEダブルノックアウトマウス」〔NMU-/-：ApoE-/-〕を得た。このマウスがNMU-/-：ApoE-/-ダブルノックアウトマウスであることは、マウスの尾の先端サンプルを採取し、このサンプルから得られる核酸について、NMU遺伝子に関しては、欠失アレルの検出にフォワードプライマーaatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat（SEQ ID NO: 1）およびリバースプライマーとしてcagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg（SEQ ID NO: 2）を用い、ワイルドタイプのアレルの検出には、フォワードプライマーとしてcccggcactt cgcccaatag cagccagtcc（SEQ ID NO:3)およびリバースプライマーとしてacctaagtta agtttctagt accactcacc（SEQ ID NO:4)を用いたPCRを行った。また、ApoE遺伝子に関してはフォワードプライマーとしてtagccgaggg agagccg（SEQ ID NO: 5）およびリバースプライマーとして欠失したアレルの検出にはgacttgggag ctctgcagc（SEQ ID NO: 6）、ワイルドタイプのアレルの検出にはgccgccccga ctgcatct（SEQ ID NO: 7）を用いて、それぞれPCR法を行って増幅の有無を調べることにより、遺伝子の欠損を確認した。 By further mating F1 mice [NMU +/- : ApoE +/- ] obtained by mating males of NMU knockout mice and females of Apo E knockout mice, the NMU / ApoE double knockout mouse ”[NMU − / − : ApoE − / − ] was obtained. The fact that this mouse is an NMU -/- : ApoE -/- double knockout mouse is taken from a sample at the tip of the mouse's tail, and the nucleic acid obtained from this sample is forwarded to detection of the deletion allele for the NMU gene. Primer aatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat (SEQ ID NO: 1) and cagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg (SEQ ID NO: 2) as reverse primers and wild type alleles detected as forward primer cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc (SEQ ID NO: 3 ) And acctaagtta agtttctagt accactcacc (SEQ ID NO: 4) as a reverse primer. For the ApoE gene, tagccgaggg agagccg (SEQ ID NO: 5) as a forward primer and gacttgggag ctctgcagc (SEQ ID NO: 6) for detection of alleles deleted as a reverse primer, and gccgccccga ctgcatct for detection of wild-type alleles. Using (SEQ ID NO: 7), the PCR was performed to check the presence or absence of amplification, thereby confirming the gene deletion.
このようにして得られた〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスは、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスどうしを交配させることにより維持し、また以下の実験に使用した。
実施例2：血清総コレステロール値の対比
本実施例においては、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清総コレステロール値を対比した。
[NMU − / − : ApoE − / − ] mice thus obtained were maintained by crossing [NMU − / − : ApoE − / − ] mice and used in the following experiments.
Example 2 Comparison of Serum Total Cholesterol Level In this example, serum total cholesterol levels in various gene-deficient mice when a normal diet was fed were compared.
12匹の12週齢のオスの〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスの尾静脈から血液を採血し、これを遠心分離して血清を得た。このサンプルを実験群とした。一方、対照群として、同じ週齢のオスのApoEノックアウトマウス、ニューロメジンUノックアウトマウス、LDL受容体ノックアウトマウス、ApoE／LDL受容体ダブルノックアウトマウスからも、同様にして採血し、これを遠心分離して血清を得た。血清総コレステロール値は、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーLTC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って測定した。 Blood was collected from the tail vein of 12 12-week-old male [NMU − / − : ApoE − / − ] mice, and centrifuged to obtain serum. This sample was used as an experimental group. On the other hand, as a control group, blood was collected in the same manner from male ApoE knockout mice, neuromedin U knockout mice, LDL receptor knockout mice, ApoE / LDL receptor double knockout mice of the same age, and centrifuged. Serum was obtained. The serum total cholesterol level was measured according to the instructions attached to the product using Determiner LTC custom-made (Kyowa Medex), an enzyme method reagent using cholesterol esterase and cholesterol oxidase.
それぞれのマウスの血清総コレステロール値の結果を、以下の表1および図1に示す。この図1において、「ApoE／NMU」：ApoE／ニューロメジンUダブルノックアウトマウス（すなわち、〔NMU-/-：ApoE-/-〕）、「ApoE」：ApoEノックアウトマウス、「NMU」：ニューロメジンUノックアウトマウス、「LDLR」：LDL受容体ノックアウトマウス、「ApoE／LDLR」：ApoE／LDL受容体ダブルノックアウトマウスからそれぞれ得られた結果を示す。結果は、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清総コレステロール値が高く、普通食を与えた場合でも顕著な高コレステロール血症を発症することが明らかになった。 The results of serum total cholesterol levels for each mouse are shown in Table 1 below and FIG. In FIG. 1, “ApoE / NMU”: ApoE / neuromedin U double knockout mouse (ie, [NMU − / − : ApoE − / − ]), “ApoE”: ApoE knockout mouse, “NMU”: neuromedin U knockout mouse. , “LDLR”: LDL receptor knockout mice, “ApoE / LDLR”: ApoE / LDL receptor double knockout mice. Results are expressed as mean ± standard deviation (mg / dl). As a result of statistical analysis of these data, the [NMU -/- : ApoE -/- ] mice had significantly higher serum total cholesterol levels than those of other mice, and even when fed a normal diet It has been found that cholesterolemia develops.
実施例3：VLDL値の対比
血清中のコレステロールのうち、VLDL、LDL、HDL分画のどの分画が上昇しているのかを調べることにより、リポタンパク質代謝の状態を知ることができる。そこで、本実施例においてはまず、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清VLDL値を対比した。
Example 3: Comparison of VLDL levels Among the cholesterol in serum, the state of lipoprotein metabolism can be known by examining which fraction of VLDL, LDL and HDL fractions is elevated. Therefore, in this example, first, serum VLDL values in various gene-deficient mice when a normal diet was fed were compared.
実施例2と同様に、12匹の12週齢のオスの実験群のマウスおよび5匹の同週齢のオスの対照群のマウスから、血清50μlずつを採取し、カラムとしてTSKgel LipopropaxXL（東ソー）を使用したHPLCにより、血清中のコレステロールをVLDL、LDL、HDLの各画分に分画した。本実施例においては、得られたVLDLを、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。 As in Example 2, 50 μl of each serum was collected from 12 mice in the 12-week-old male experimental group and 5 mice in the same-week-old male control group, and TSKgel LipopropaxXL (Tosoh) was used as the column. Cholesterol in serum was fractionated into VLDL, LDL, and HDL fractions by HPLC using. In the present example, the obtained VLDL is attached to the product using the reagent for the enzyme method using cholesterol esterase and cholesterol oxidase, Determiner L TC custom-made (Kyowa Medex), as in Example 2. Quantified according to instructions.
それぞれのマウスのVLDL-コレステロール値の結果を、表1および図2に示す。この図2は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例2に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清VLDL値が高いことが明らかになった。 The results of VLDL-cholesterol values for each mouse are shown in Table 1 and FIG. FIG. 2 shows the results obtained from each mouse of ApoE / NMU, ApoE, NMU, LDLR, and ApoE / LDLR (mouse abbreviations are as described in Example 2). Data are shown as mean ± standard deviation (mg / dl). As a result of statistical analysis of these data, it was found that the [NMU − / − : ApoE − / − ] mice had significantly higher serum VLDL levels than other mice.
実施例4：LDL-コレステロール値の対比
本実施例においては、続いて、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清LDL値を対比した。
Example 4: Comparison of LDL-cholesterol levels In this example, serum LDL levels in various gene-deficient mice were compared with the normal diet.
実施例3において得られた血清中LDL画分を、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。 In the same manner as in Example 2, the serum LDL fraction obtained in Example 3 was added to the product using Determiner LTC custom-made (Kyowa Medex), an enzyme method reagent that uses cholesterol esterase and cholesterol oxidase. Quantified according to the attached instructions.
それぞれのマウスのLDL-コレステロール値の結果を、表1および図3に示す。この図3は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例2に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差で示す（mg/dl）。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清LDL-コレステロール値が高いことが明らかになった。 The results of LDL-cholesterol values for each mouse are shown in Table 1 and FIG. FIG. 3 shows the results obtained from each of ApoE / NMU, ApoE, NMU, LDLR, and ApoE / LDLR mice (mouse abbreviations are as described in Example 2). Data are shown as mean ± standard deviation (mg / dl). As a result of statistical analysis of these data, it was revealed that [NMU − / − : ApoE − / − ] mice had significantly higher serum LDL-cholesterol levels than other mice.
実施例5： HDL-コレステロール値の対比
本実施例においては、続いて、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清HDL値を対比した。
Example 5: Comparison of HDL-cholesterol levels In this example, serum HDL levels in various gene-deficient mice when a normal diet was fed were compared.
実施例3において得られた血清中HDL画分を、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。 In the same manner as in Example 2, the serum HDL fraction obtained in Example 3 was added to the product using an enzyme method reagent using cholesterol esterase and cholesterol oxidase, Determiner L TC custom-made (Kyowa Medex). Quantified according to the attached instructions.
それぞれのマウスのHDL-コレステロール値の結果を、表1および図4に示す。この図4は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、血清HDL-コレステロール値が低いことが明らかになった。 The results of HDL-cholesterol levels for each mouse are shown in Table 1 and FIG. FIG. 4 shows the results obtained from each mouse of ApoE / NMU, ApoE, NMU, LDLR, and ApoE / LDLR (mouse abbreviations are as described in Examples). Data are shown as mean ± standard deviation (mg / dl). As a result of statistical analysis of these data, it was revealed that [NMU − / − : ApoE − / − ] mice had lower serum HDL-cholesterol levels than other mice.
この血清LDL-コレステロール値のデータと血清HDL-コレステロール値のデータとを組み合わせて考慮すると、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスで血清総コレステロール値が顕著に高くなったのは、いわゆる悪玉コレステロールと呼ばれるLDLおよびVLDLが増加することによっているのであり、その一方でいわゆる善玉コレステロールと呼ばれるHDLは増加しないことから、この〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスが、高コレステロール食を処方しなくても、普通食を与える環境下で、高コレステロール血症を発症しやすい体内環境が作られていることが明らかになった。 Considering the combination of the serum LDL-cholesterol data and the serum HDL-cholesterol data, the serum total cholesterol level was significantly increased in the [NMU -/- : ApoE -/- ] mice. This [NMU -/- : ApoE -/- ] mice have a high cholesterol diet because LDL and VLDL called bad cholesterol increase, while HDL called so-called good cholesterol does not increase. It was revealed that an internal environment that is likely to cause hypercholesterolemia was created in an environment where a normal diet was provided without prescription.
ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している本発明のNMU／ApoEダブルノックアウトマウスは、普通食で高コレステロール血症を発症することから、高コレステロール血症の疾患モデル動物として、高コレステロール血症のための治療薬あるいは予防薬を開発するために使用することができる。 Since the NMU / ApoE double knockout mouse of the present invention, which is deficient in both the neuromedin U (NMU) gene and the ApoE gene, develops hypercholesterolemia with a normal diet, as a disease model animal for hypercholesterolemia, It can be used to develop therapeutic or prophylactic drugs for hypercholesterolemia.
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