JP4729684B2

JP4729684B2 - Method for producing polylactic acid degrading enzyme and / or proteinase K-like protease

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Publication number: JP4729684B2
Application number: JP2001248343A
Authority: JP
Inventors: 豊常盤; ジャレラートアムナット; 明人土屋
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2021-08-17
Also published as: JP2003009855A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ乳酸分解酵素又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ乳酸は、乳酸から製造される直鎖脂肪族ポリエステルであり、その乳酸は発酵プロセスによりでんぷんのような再生可能バイオマスから製造されている。そして、ポリ乳酸は、高融点、高透明性及び優れた生体適合性のような特性を持つため、生分解性材料として医療用の縫合糸などとして応用されており、近年、その生産量が急増している。
【０００３】
しかしながら、ポリ乳酸は自然界において分解されるものの、その速度は遅く、さらにポリ乳酸を分解する微生物の分布も限定されている。このため、今後生産量が増加するであろうポリ乳酸を分解する方法の確立が急務である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ポリ乳酸の分解方法としては、微生物の産生するポリ乳酸分解酵素を用いて分解する方法が広く研究されているが、未だ現実的に満足な結果が得られていないのが現状である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌によるポリ乳酸分解酵素の産生について詳細に研究し、該産生菌の培地中に、特定のオリゴペプチド、アミノ酸、タンパク質、絹フィブロイン、絹フィブロイン加水分解物などの成分を添加して培養したところ、培地中のポリ乳酸分解酵素の生産量を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産することを見出し、本発明を完成した。また、Tritirachium album ATCC22563とSaccharothrix waywayandensis JCM9114等がポリ乳酸分解酵素及びプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のポリ乳酸分解酵素又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法を提供するものである。
項１．グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からポリ乳酸分解酵素を採取することを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
項２．バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からポリ乳酸分解酵素を採取することを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
項３．ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌がTritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Staphylococcus属及びSaccharopolyspora属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする項１又は２に記載のポリ乳酸分解酵素の製造法。
項４．グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを採取することを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
項５．バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを採取することを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
項６．ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌がTritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Staphylococcus属及びSaccharopolyspora属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする項４又は５に記載のプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、ポリ乳酸とは、ポリマーの主要な構成単位として乳酸を有するポリマーをいい、例えば、ポリL-乳酸やポリD-乳酸等の乳酸ホモポリマー、L-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とアラニン、グリコール酸、グリコリド、グリシン、ε−カプロラクトン、グルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、糖類、多価アルコールの少なくとも１種との乳酸コポリマー、ポリD,L-乳酸などが挙げられる。好ましくは、乳酸ホモポリマー、L-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とアラニン若しくはグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリD,L-乳酸であり、さらに好ましくはL-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリL-乳酸である。ポリ乳酸の数平均分子量は特に制限されないが、好ましくは5000〜1×10⁶、さらに好ましくは50000〜4×10⁵である。ポリ乳酸中の乳酸単位の重量比率は特に制限されないが、好ましくは10％以上、さらに好ましくは30％以上である。
【０００８】
本発明において、ポリ乳酸分解酵素産生菌は、ポリ乳酸分解酵素を生産する菌であれば特に制限されない。例えば、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Staphylococcus属に属する菌である。好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Streptomyces属に属する菌があげられ、さらに好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属に属する菌があげられる。かかる菌として具体的にはTritirachium album（以下、T. albumとする）、Amycolatopsis orientalis subsp. orientalis（以下、A. orientalisとする）、Saccharothrix waywayandensis（以下、S. waywayandensisとする）をあげることができる。
【０００９】
また、本発明において、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌は、プロテイナーゼＫまたはプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを産生する菌であれば特に制限されない。ここでプロテイナーゼＫ様プロテアーゼとは、例えば、タンパク質をペプチド結合鎖の中ほどから切断するセリンプロテアーゼの一種で、分子量が約２９０００、至適ｐＨが７．５〜１２．０程度、等電点がｐＨ８．９程度のような性質を有するプロテアーゼである。例えば、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Staphylococcus属に属する菌である。好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Streptomyces属に属する菌があげられ、さらに好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属に属する菌があげられる。かかる菌として具体的にはT. album、A. orientalis、S. waywayandensis等をあげることができる。
【００１０】
上記の産生菌を培養する培地としては、従来から用いられているカビ、放線菌、酵母、細菌用培地等を使用できる。例えば、蒸留水1000ml当たり、酵素エキス100mg、FeSO₄・7H₂O 10mg、MgSO₄・7H₂O 200mg、(NH₄)₂SO₄ 1000mg、CaCl₂・2H₂O 20mg、NaCl 100mg、Na₂MoO₄・2H₂O 0.5mg、Na₂WO₄ 0.5mg、MnSO₄ 0.5mgである。また、水道水1000ml当たり、牛肉エキス100mg、ペプトン100mgのような培地も例示される。
【００１１】
本発明では、上記の培地に、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物の少なくとも１種の成分が添加される。これらの成分は、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌の培地中に存在することによって、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌に対してポリ乳酸分解酵素の生産能力を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産するように作用する。好ましくは、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種である。さらに好ましくは、バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００１２】
これらの成分の添加量は、例えば培地100ml当たり１mg〜10ｇ、好ましくは10mg〜３ｇ、さらに好ましくは50mg〜１ｇである。
【００１３】
上記オリゴペプチドとしては、２〜２０個程度のアミノ酸残基で構成され、アミノ酸残基としてグリシン、アラニン、バリンの少なくとも１種を少なくとも１個有するオリゴペプチドを挙げることができる。グリシン残基、アラニン残基及びバリン残基の数、並びにこれらの配列位置や結合態様は特に制限されない。また、好ましいアミノ酸残基の個数は２〜５個である。好ましいオリゴペプチドの具体例としては、アラニル−アラニンジペプチド（以下、(Ala)₂とする）、グリシル−アラニンジペプチド（以下、Gly-Alaとする）、バリニル−グリシンジペプチド（以下、Val-Glyとする）、グリシル−バリンジペプチド（以下、Gly-Valとする）、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド（以下、(Ala)₃とする）、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド（以下、(Gly)₂-Alaとする）、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド（以下、(Gly)₃とする）、グリシル−バリニル−グリシントリペプチド（以下、Gly-Val-Glyとする）などが挙げられる。
【００１４】
上記大豆は、大豆を水解、変性したものも包含する。大豆の形態としては様々な形態のものが使用可能である。表面積を大きくする点では粉末状が好ましい。また、経済性や窒素源の観点からは大豆かすが使用される。
【００１５】
上記グリシン、アラニン、バリン、コラーゲン、エラスチン、ケラチンは、特に制限されず、市販のものを使用できる。
【００１６】
上記絹フィブロインは、好ましくは生糸を精練することによりセリシンを除いた不溶性タンパク質である。絹フィブロインの形態は特に制限されず、例えば、繊維状、粉末状、ペレット状、小片状等の形態の絹フィブロインが使用されるが、表面積が大きいため微生物が利用しやすい粉末状の絹フィブロインが好ましく使用される。
【００１７】
上記絹フィブロイン加水分解物は、絹フィブロインを加水分解して得られる、アミノ酸残基の数が２〜５０個、好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜５個のペプチドをいう。絹フィブロインの加水分解の方法は、絹フィブロイン加水分解物が得られる限り特に制限されない。例えば、加水分解剤としては、塩酸、硫酸、ヨウ化水素酸、苛性ソーダ、水酸化バリウム等の酸加水分解剤、炭酸ナトリウムなどのアルカリ加水分解剤、トリプリン、キモトリプシン、パンクレアチンなどの加水分解酵素などが使用される。加水分解条件は、特に制限されないが、塩酸を使用する場合、例えば絹フィブロインの１倍量以上の３〜６Ｎ塩酸で１０〜１６０℃で０．１〜２４時間する条件を挙げることができる。また、酵素で処理する場合には、絹フィブロインを可溶化してから酵素処理しても良いし、可溶化せずに酵素処理しても良い。
【００１８】
培養温度は、ポリ乳酸分解酵素が産生される限り特に制限されないが、使用する菌種の生育に適した温度が好ましい。例えば、Tritirachium属に属する微生物の場合、10〜45℃、好ましくは20〜30℃であり、Amycolatopsis属に属する微生物の場合、10〜55℃、好ましくは25〜37℃であり、Saccharothrix属に属する微生物の場合、10〜45℃、好ましくは25〜37℃である。
【００１９】
培地のｐＨは、使用する菌種の生育に適したｐＨが好ましい。例えば、Tritirachium属に属する微生物の場合、4.0〜8.0、好ましくは5.0〜6.0であり、Amycolatopsis属に属する微生物の場合、5.0〜9.0、好ましくは6.5〜7.5であり、Saccharothrix属に属する微生物の場合、5.0〜9.0、好ましくは6.5〜7.5である。
【００２０】
培養時間は、特に制限されず、使用する菌種、菌量、培地等に応じて適宜選択される。例えば１〜14日間、好ましくは２〜10日間である。
【００２１】
また、培養時は、必ずしも必要ではないが、撹拌することが好ましい。さらに培養菌に応じて好気的条件、嫌気的条件が選択される。他の培養条件については、本発明の目的を考慮して適宜選択される。
【００２２】
上述のようにして培養された培養物から酵素を採取する方法としては、例えば常法により培養液を濾過等により菌体を除去し、必要により透析、塩析、イオン交換樹脂によるイオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等により精製する方法等が挙げられる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養することによって、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌に対してポリ乳酸分解酵素の生産能力を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産するように作用する。したがって、この培養の培養物から、より多くの又はより活性の高いポリ乳酸分解酵素を採取することができ、生分解性プラスチックの分解をより環境負荷の低い状態で実現可能である。
【００２４】
【実施例】
ＰＬＡ（ポリL-乳酸）ペレット（ラクティ#1012（数平均分子量（Mn）＝2.8×10⁵））及び市販のＰＬＡブラウンフィルムは島津製作所から入手した。酵素アッセイ用のＰＬＡパウダーは次のようにして作った：５％（wt/vol）クロロホルム溶液を、１Ｌのメタノールに滴下して、繊維状の沈殿物を得た。その繊維を濾過し、１日空気で乾かし、次いで真空下で一晩乾燥した。次にその繊維を液体窒素下、金属製乳鉢中にて低温で寝かせ、次いで真空下８０℃で乾燥させた。
【００２５】
他のポリエステル粉末は、ＰＣＬ（ポリ(e-カプロラクトン）)（ユニオンカーバイド社のトーンP-767-P（Mn＝1.8×10⁴）)、ＰＨＢ（ポリ(β-ヒドロキシブチレート)）（三菱ガスケミカル社製、Mn＝1.5×10⁵）を用いた。ＰＢＳ（ポリ(ブチレンスクシネート)）ペレット（ショウワ高分子社のバイオノル#1020（Mn＝5.8×10⁴）を低温（-160℃〜-140℃）で粉砕して使用した。
【００２６】
大豆は、コーヒー豆を挽く道具で粉末状にした大豆かすを使用した。ゼラチン、コラーゲン、エラスチンは、シグマ社から購入した。ケラチンはカミ商事株式会社から購入した。
【００２７】
蚕の繭から得られる絹フィブロイン粉末はトスコ社から購入し、熱湯で洗浄して水溶性成分を除去した。この絹フィブロイン粉末のアミノ酸分析は、44.6モル％グリシン、29.5モル％アラニン、11.7モル％セリンであった。ウシ頚部靱帯のエラスチンはシグマケミカル社から購入した。全ての粉末サンプルは250μｍメッシュで篩い分けしてから使用した。
【００２８】
絹フィブロイン加水分解物は、絹フィブロインを２０倍量の３Ｎ塩酸で３７℃、４８時間処理し、Dowex-50のカラムクロマトグラフィーで精製したものを使用した。加水分解物の成分は、Gly-Val-Gly、Gly-Val、Val-Gly、Ala、Gly、Ala-Ala、Ala-Ala-Ala、Gly-Gly、Gly-Gly-Alaなどのアミノ酸、オリゴペプチドの混合物であった。
【００２９】
また、実施例において菌株はT. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114を使用した。
【００３０】
実施例１ T. album ATCC22563によるＰＬＡ分解
以前報告された方法（H. Pranamuda, Y. Tokiwa, Biotechnol. Lett. 1999, 21, 901）によって調製された基本培地及びEbelingら（Eur. J. Biochem. 1974, 47, 91）に記載のプロテアーゼ生産用液体培地をT. album ATCC22563の液体培養に使用した。基本培地の組成は1000ml当たり、酵素エキス100mg、FeSO₄・7H₂O 10mg、MgSO₄・7H₂O 200mg、(NH₄)₂SO₄ 1000mg、CaCl₂・2H₂O 20mg、NaCl 100mg、Na₂MoO₄・2H₂O 0.5mg、Na₂WO₄ 0.5mg、MnSO₄ 0.5mgで、pHは5.4付近である。プロテアーゼ生産用培地の組成は、グルコース1％、カゼインペプトン1％、MgSO₄・7H₂O 0.01％、CaCl₂・H₂O 0.005％、KH₂PO₄ 0.28％、Na₂HPO₄ 0.07％で、pHは5.7〜5.9である。
【００３１】
本培養に先立って、100mlの麦芽培地（W. Ebeling, M. Hennrich, M. Klockow, H. Metzt, H. D. Orth, H. Lang, Eur. J. Biochem, 1974, 47, 91）に菌を植え、ロータリーシェーカー（180rpm）で30℃5日間培養することによってシード培養物を調製した。シード培養物の10mlを100mlの培養液を含有する500mlのエルレンマイヤーフラスコ中でインキュベートした。100mgのＰＬＡブラウンフィルム（厚さ約46μｍ）を5％（wt/vol）次亜塩素酸ナトリウムで前もって殺菌し、無菌的に培養液に加えた。また、滅菌の前に0.1％ゼラチンも加えた。フラスコをロータリーシェーカー（180rpm）にて30℃で14日間インキュベートした。なお、各々の培養液についてゼラチンを加えないサンプルでもインキュベートした。
【００３２】
培養液の5mlをとり、水溶性有機炭素濃度（TOC）及びpHを測定した。TOCの測定にはTOC-5000アナライザー（島津製作所）を使用した。TOCは、L-乳酸、乳酸オリゴマー等の分解生成物の蓄積の指標となる。残存フィルムは、クロロホルム100mlで抽出しエバポレーターで乾燥することによって、培養液から直接回収した。フィルム抽出後、培養液中の細胞を遠心分離（4500g、10分）して回収し、105℃で16時間乾燥した。培養液中に含まれるL-乳酸をエンジマティックバイオアナライシスキット（ベーリンガーカンハイム社）で酵素的に分析した。結果を表１に示す。表１中のフィルム減少量の欄から、培地中にゼラチンを添加することによって、培養液がＰＬＡを強く分解することが示されている。したがって、ゼラチンはT. albumのＰＬＡ分解のインデューサーとして有用である。
【００３３】
【表１】

【００３４】
実施例２各種基質に対するT. album ATCC22563培養濾液の分解活性
0.1％ゼラチン含有培地でT. album ATCC22563菌を培養した培養液を濾過し、得られた培養濾液のＰＬＡ、ＰＣＬ、ＰＢＳ、ＰＨＢ、絹フィブロイン及びエラスチンに対する分解活性を測定した。培養濾液を前もって適量の5mMリン酸バッファーで2日間透析し、1mlの培養濾液（タンパク質0.15mg）を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgの基質及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。基質及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。
【００３５】
スクシニル-(L-アラニル-L-アラニル-L-アラニン)p-ニトロアニリド（Suc-(Ala)₃-pNA）（シグマケミカル社）に対する酵素活性を、該ニトロアニリドから遊離するp-ニトロアニリン（p-NA）の濃度を測定することによって評価した。1mlの培養濾液及び1.0mMのSuc-(Ala)₃-pNAを含有する4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで10分間モニターした。酵素活性の１ユニットを、Suc-(Ala)₃-pNAから1分間に遊離した1.0μモルのp-NAと規定する。
【００３６】
T. albumから得られるプロテイナーゼＫ（E.C. 3.4.21.64）及びブタ膵臓から得られるエラスターゼ（E.C. 3.4.21.36）（共にシグマケミカル社）を、0.1Mリン酸バッファー（pH7）を用いて各々0.001％（wt/vol）の酵素溶液として、上記基質に対する活性を測定し、培養濾液と比較した。結果を表２に示す。培養濾液は、エラスターゼと明らかに異なる基質特異性を示している。また、培養濾液は、基室であるSuc-(Ala)₃-pNAや絹フィブロイン、エラスチンと比較するとポリ乳酸に対して特に強い活性を示すことから、プロテイナーゼＫとも異なるＰＬＡ分解酵素を産生していることが示唆される。
【００３７】
【表２】

【００３８】
実施例３
表３に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液でT. album ATCC22563を、ゼラチンを除いた実施例１と同様な培養条件で10日間培養した。0.2mlの培養液及び1.0mMのSuc-(Ala)₃-pNAを含有する4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで測定した。1mlの培養液を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。評価は、ＰＬＡ分解活性の場合、TOC値が10以上を「＋」、5以下を「−」で示し、Suc-(Ala)₃-pNA分解活性の場合、遊離するp-NAが1.1μモル／min（410nmの吸光度が0.020）以上を「＋」、0μモル／min（410nmの吸光度が0.003）以下の場合を「−」で示した。なお、Suc-(Ala)₃-pNA分解活性は、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ活性の指標となり、これは以下の実施例においても同様である。
【００３９】
【表３】

【００４０】
実施例４
表４、５、６に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過し、培養濾液を得た。1.0mMのSuc-(Ala)₃-pNAを含有する0.2mlの培養濾液及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで測定した。
【００４１】
【表４】

【００４２】
【表５】

【００４３】
【表６】

【００４４】
実施例５
表７、８に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過し、培養濾液を得た。Suc-(Ala)₃-pNA分解活性の測定は、実施例３と同様に行った。ＰＬＡ分解活性の測定は次のようにして行った。1mlの培養濾液を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。タンパク質の測定は、培養濾液をフォーリン−シオカルチュー−フェノール試薬（シグマケミカル社）を用いるローリー法で測定することにより行った。
【００４５】
【表７】

【００４６】
【表８】

【００４７】
実施例６
表９に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過して得られた培養濾液のpH、タンパク質濃度、TOC、乾燥細胞重量を測定した。
【００４８】
【表９】

【００４９】
実施例７
表１０、表１１、表１２に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過して得られた培養濾液の1mlを、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、酵素反応値から両方のコントロールを控除して得られた。TOC形成値は、ＰＬＡ酵素分解の指標となる。
【００５０】
【表１０】

【００５１】
【表１１】

【００５２】
【表１２】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing polylactic acid-degrading enzyme or proteinase K-like protease.
[0002]
[Prior art]
Polylactic acid is a linear aliphatic polyester produced from lactic acid, which is produced from renewable biomass such as starch by a fermentation process. Polylactic acid has properties such as high melting point, high transparency, and excellent biocompatibility, so it has been applied as a biodegradable material as a medical suture, and its production volume has increased rapidly in recent years. is doing.
[0003]
However, although polylactic acid is degraded in nature, its rate is slow and the distribution of microorganisms that degrade polylactic acid is also limited. Therefore, there is an urgent need to establish a method for decomposing polylactic acid, which will increase production in the future.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
As a method for decomposing polylactic acid, a method of decomposing using a polylactic acid-degrading enzyme produced by microorganisms has been widely studied, but at present, a practically satisfactory result has not yet been obtained.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventor has studied in detail the production of polylactic acid-degrading enzymes by polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease-producing bacteria, and a specific oligopeptide, amino acid, protein, When the components such as silk fibroin and silk fibroin hydrolyzate were added and cultured, it was found that the production amount of polylactic acid-degrading enzyme in the medium was increased or a more active enzyme was produced. completed. In addition, the present inventors have found that Tritirachium album ATCC22563, Saccharothrix waywayandensis JCM9114 and the like produce polylactic acid degrading enzyme and proteinase K-like protease, thereby completing the present invention.
[0006]
That is, the present invention provides the following method for producing a polylactic acid-degrading enzyme or proteinase K-like protease.
Item 1. It consists of oligopeptides containing glycine residues, oligopeptides containing alanine residues, oligopeptides containing valine residues, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin and silk fibroin hydrolyzate A polylactic acid-degrading enzyme is collected from a culture by culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium and / or a proteinase K-like protease-producing bacterium in the presence of at least one selected from the group Production method of degrading enzyme.
Item 2. Valine, alanine, glycine, alanyl-alanine dipeptide, glycyl-alanine dipeptide, valyl-glycine dipeptide, glycyl-valine dipeptide, alanyl-alanyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-glycine tripeptide, Polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria and / or proteinase K-like protease in the presence of at least one selected from the group consisting of glycyl-valyl-glycine tripeptide, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin hydrolyzate A method for producing a polylactic acid-degrading enzyme, comprising culturing a producing bacterium and collecting polylactic acid-degrading enzyme from the culture.
Item 3. Polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease-producing bacteria are in any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Streptomyces, Bacillus, Streptoalloteichus, Kibdelosporangium, Lentzea, Saccharomonospora, Staphylococcus, and Saccharopolysp Item 3. The method for producing a polylactic acid-degrading enzyme according to Item 1 or 2, which is a microorganism to which the microorganism belongs.
Item 4. It consists of oligopeptides containing glycine residues, oligopeptides containing alanine residues, oligopeptides containing valine residues, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin and silk fibroin hydrolyzate A proteinase K characterized by culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium and / or a proteinase K-like protease-producing bacterium in the presence of at least one selected from the group, and collecting the proteinase K-like protease from the culture. A method for producing a protease.
Item 5. Valine, alanine, glycine, alanyl-alanine dipeptide, glycyl-alanine dipeptide, valyl-glycine dipeptide, glycyl-valine dipeptide, alanyl-alanyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-glycine tripeptide, Polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria and / or proteinase K-like protease in the presence of at least one selected from the group consisting of glycyl-valyl-glycine tripeptide, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin hydrolyzate A method for producing a proteinase K-like protease, comprising culturing a producing bacterium and collecting a proteinase K-like protease from the culture.
Item 6. Polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease-producing bacteria are in any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Streptomyces, Bacillus, Streptoalloteichus, Kibdelosporangium, Lentzea, Saccharomonospora, Staphylococcus, and Saccharopolysp Item 6. The method for producing a proteinase K-like protease according to Item 4 or 5, wherein the proteinase is a microorganism.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, polylactic acid refers to a polymer having lactic acid as a main structural unit of the polymer, for example, lactic acid homopolymers such as poly L-lactic acid and poly D-lactic acid, and at least one of L-lactic acid and D-lactic acid. Examples include lactic acid copolymer of seed and at least one of alanine, glycolic acid, glycolide, glycine, ε-caprolactone, glycol, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, saccharide, polyhydric alcohol, poly D, L-lactic acid, etc. . Preferably, it is a lactic acid homopolymer, a lactic acid copolymer of at least one of L-lactic acid and D-lactic acid and alanine or glycolide, and poly D, L-lactic acid, more preferably at least one of L-lactic acid and D-lactic acid. Poly (L-lactic acid), a lactic acid copolymer of glyceride and glycolide. The number average molecular weight of polylactic acid is not particularly limited, but is preferably 5000 to 1 × 10 ⁶ , more preferably 50000 to 4 × 10 ⁵ . The weight ratio of lactic acid units in polylactic acid is not particularly limited, but is preferably 10% or more, more preferably 30% or more.
[0008]
In the present invention, the polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium is not particularly limited as long as it is a bacterium that produces polylactic acid-degrading enzyme. Examples include bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Streptomyces, Bacillus, Streptoalloteichus, Kibdelosporangium, Lentzea, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, and Staphylococcus. Preferred are bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Kibdelosporangium, Lentzea, and Streptomyces, and more preferred are bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix. Specific examples of such bacteria include Tritirachium album (hereinafter referred to as T. album), Amycolatopsis orientalis subsp. Orientalis (hereinafter referred to as A. orientalis), and Saccharothrix waywayandensis (hereinafter referred to as S. waywayandensis). .
[0009]
In the present invention, the proteinase K-like protease-producing bacterium is not particularly limited as long as it is a bacterium that produces proteinase K or proteinase K-like protease. Here, proteinase K-like protease is a kind of serine protease that cleaves a protein from the middle of the peptide bond chain, and has a molecular weight of about 29000, an optimum pH of about 7.5 to 12.0, and an isoelectric point. It is a protease having properties such as about pH 8.9. Examples include bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Streptomyces, Bacillus, Streptoalloteichus, Kibdelosporangium, Lentzea, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, and Staphylococcus. Preferred are bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, Saccharothrix, Kibdelosporangium, Lentzea, and Streptomyces, and more preferred are bacteria belonging to the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix. Specific examples of such bacteria include T. album, A. orientalis, S. waywayandensis and the like.
[0010]
As the medium for culturing the above-mentioned producing bacteria, conventionally used molds, actinomycetes, yeasts, bacterial media, and the like can be used. For example, per distilled water 1000 ml, the enzyme extract _{_{100mg, FeSO 4 · 7H 2 O}} 10mg, MgSO 4 · 7H 2 O 200mg, (NH 4) 2 SO 4 1000mg, CaCl 2 · 2H 2 O 20mg, NaCl 100mg, Na 2 MoO ₄ · 2H ₂ O 0.5 mg, Na ₂ WO ₄ 0.5 mg, and MnSO ₄ 0.5 mg. In addition, a medium such as beef extract 100 mg and peptone 100 mg per 1000 ml of tap water is also exemplified.
[0011]
In the present invention, an oligopeptide containing a glycine residue, an oligopeptide containing an alanine residue, an oligopeptide containing a valine residue, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk At least one component of fibroin and silk fibroin hydrolyzate is added. These components are present in the medium of polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease-producing bacteria, so that they can produce polylactic acid-degrading enzymes against polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease-producing bacteria. Or act to produce a more active enzyme. Preferably, an oligopeptide containing a glycine residue, an oligopeptide containing an alanine residue, an oligopeptide containing a valine residue, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin and silk fibroin hydrolyzate At least one selected from the group. More preferably, valine, alanine, glycine, alanyl-alanine dipeptide, glycyl-alanine dipeptide, valyl-glycine dipeptide, glycyl-valine dipeptide, alanyl-alanyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl- It is at least one selected from the group consisting of glycine tripeptide, glycyl-valyl-glycine tripeptide, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, and silk fibroin hydrolyzate.
[0012]
The amount of these components added is, for example, 1 mg to 10 g, preferably 10 mg to 3 g, more preferably 50 mg to 1 g, per 100 ml of the medium.
[0013]
As said oligopeptide, the oligopeptide which consists of about 2-20 amino acid residues and has at least 1 sort (s) of glycine, alanine, and valine as an amino acid residue can be mentioned. The number of glycine residues, alanine residues and valine residues, and their sequence positions and binding modes are not particularly limited. The preferred number of amino acid residues is 2-5. Specific examples of preferred oligopeptides include alanyl-alanine dipeptide (hereinafter referred to as (Ala) ₂ ), glycyl-alanine dipeptide (hereinafter referred to as Gly-Ala), and valinyl-glycine dipeptide (hereinafter referred to as Val-Gly). ), Glycyl-valine dipeptide (hereinafter referred to as Gly-Val), alanyl-alanyl-alanine tripeptide (hereinafter referred to as (Ala) ₃ ), glycyl-glycyl-alanine tripeptide (hereinafter referred to as (Gly) ₂ -Ala) And glycyl-glycyl-glycine tripeptide (hereinafter referred to as (Gly) ₃ ), glycyl-valinyl-glycine tripeptide (hereinafter referred to as Gly-Val-Gly), and the like.
[0014]
The soybeans include those obtained by hydrolyzing and modifying soybeans. Various forms of soybean can be used. From the viewpoint of increasing the surface area, a powder form is preferable. From the viewpoint of economy and nitrogen source, soybean meal is used.
[0015]
The glycine, alanine, valine, collagen, elastin, and keratin are not particularly limited, and commercially available products can be used.
[0016]
The silk fibroin is preferably an insoluble protein excluding sericin by scouring raw silk. The form of silk fibroin is not particularly limited, and for example, silk fibroin in the form of fibers, powders, pellets, small pieces, etc. is used, but powdery silk fibroin that is easy for microorganisms to use because of its large surface area Are preferably used.
[0017]
The silk fibroin hydrolyzate refers to a peptide having 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 5 amino acid residues obtained by hydrolyzing silk fibroin. The method for hydrolyzing silk fibroin is not particularly limited as long as a silk fibroin hydrolyzate is obtained. Examples of hydrolyzing agents include acid hydrolyzing agents such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydroiodic acid, caustic soda and barium hydroxide, alkaline hydrolyzing agents such as sodium carbonate, hydrolytic enzymes such as triprin, chymotrypsin and pancreatin. Is used. Hydrolysis conditions are not particularly limited, but when hydrochloric acid is used, for example, conditions of 3 to 6N hydrochloric acid at least 1 times that of silk fibroin and 0.1 to 24 hours at 10 to 160 ° C. can be mentioned. In the case of treatment with an enzyme, the silk fibroin may be solubilized and then treated with an enzyme, or the enzyme may be treated without being solubilized.
[0018]
The culture temperature is not particularly limited as long as polylactic acid-degrading enzyme is produced, but a temperature suitable for the growth of the bacterial species to be used is preferable. For example, in the case of a microorganism belonging to the genus Tritirachium, it is 10 to 45 ° C, preferably 20 to 30 ° C, and in the case of a microorganism belonging to the genus Amycolatopsis, it is 10 to 55 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and belongs to the genus Saccharothrix In the case of microorganisms, the temperature is 10 to 45 ° C, preferably 25 to 37 ° C.
[0019]
The pH of the medium is preferably a pH suitable for the growth of the bacterial species used. For example, in the case of a microorganism belonging to the genus Tritirachium, 4.0 to 8.0, preferably 5.0 to 6.0, in the case of a microorganism belonging to the genus Amycolatopsis, 5.0 to 9.0, preferably 6.5 to 7.5, and in the case of a microorganism belonging to the genus Saccharothrix, It is 5.0 to 9.0, preferably 6.5 to 7.5.
[0020]
The culture time is not particularly limited, and is appropriately selected according to the type of bacteria used, the amount of bacteria, the medium, and the like. For example, it is 1 to 14 days, preferably 2 to 10 days.
[0021]
Moreover, it is not necessarily required at the time of culture, but stirring is preferable. Furthermore, aerobic conditions and anaerobic conditions are selected according to the culture. Other culture conditions are appropriately selected in view of the object of the present invention.
[0022]
As a method for collecting the enzyme from the culture cultured as described above, for example, the cells are removed by filtration of the culture solution by a conventional method, and if necessary, dialysis, salting out, ion exchange with an ion exchange resin, gel Examples of the method include purification by filtration and affinity chromatography.
[0023]
【The invention's effect】
According to the present invention, an oligopeptide containing a glycine residue, an oligopeptide containing an alanine residue, an oligopeptide containing a valine residue, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin and silk By culturing polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria and / or proteinase K-like protease-producing bacteria in the presence of at least one selected from the group consisting of fibroin hydrolysates, polylactic acid-degrading enzyme-producing bacteria or proteinase K-like protease It acts to enhance the production capacity of polylactic acid-degrading enzyme or produce a more active enzyme against the producing bacteria. Therefore, more or more active polylactic acid-degrading enzyme can be collected from the culture of this culture, and biodegradable plastics can be decomposed with a lower environmental load.
[0024]
【Example】
PLA (poly L-lactic acid) pellets (Lacty # 1012 (number average molecular weight (Mn) = 2.8 × 10 ⁵ )) and a commercially available PLA brown film were obtained from Shimadzu Corporation. PLA powder for enzyme assay was prepared as follows: A 5% (wt / vol) chloroform solution was dropped into 1 L of methanol to obtain a fibrous precipitate. The fiber was filtered, air dried for one day and then dried under vacuum overnight. The fibers were then laid at low temperature in a metal mortar under liquid nitrogen and then dried at 80 ° C. under vacuum.
[0025]
Other polyester powders are PCL (poly (e-caprolactone)) (Tone P-767-P (Mn = 1.8 × 10 ⁴ ) from Union Carbide), PHB (poly (β-hydroxybutyrate)) (Mitsubishi Gas) Chemical Company, Mn = 1.5 × 10 ⁵ ) was used. PBS (poly (butylene succinate)) pellets (Bionor # 1020 (Mn = 5.8 × 10 ⁴ ) from Showa Polymer Co., Ltd.) were used after being pulverized at low temperature (−160 ° C. to −140 ° C.).
[0026]
As the soybean, soybean ground powdered with a tool for grinding coffee beans was used. Gelatin, collagen and elastin were purchased from Sigma. Keratin was purchased from Kami Shoji Co., Ltd.
[0027]
Silk fibroin powder obtained from cocoon cocoons was purchased from Tosco Corporation and washed with hot water to remove water-soluble components. The amino acid analysis of this silk fibroin powder was 44.6 mol% glycine, 29.5 mol% alanine, 11.7 mol% serine. Bovine cervical ligament elastin was purchased from Sigma Chemical Company. All powder samples were sieved with a 250 μm mesh before use.
[0028]
As the silk fibroin hydrolyzate, silk fibroin treated with 20 times the amount of 3N hydrochloric acid at 37 ° C. for 48 hours and purified by Dowex-50 column chromatography was used. Hydrolyzate components include amino acids and oligopeptides such as Gly-Val-Gly, Gly-Val, Val-Gly, Ala, Gly, Ala-Ala, Ala-Ala-Ala, Gly-Gly, Gly-Gly-Ala It was a mixture of
[0029]
In the examples, T. album ATCC22563, A. orientalis IFO12362, and S. waywayandensis JCM9114 were used.
[0030]
Example 1 PLA degradation by T. album ATCC22563 and basal media prepared by the method previously reported (H. Pranamuda, Y. Tokiwa, Biotechnol. Lett. 1999, 21, 901) and Ebeling et al. (Eur. J. Biochem. 1974, 47, 91) was used for liquid culture of T. album ATCC22563. Per the composition of the basal medium 1000 ml, the enzyme extract _{_{100mg, FeSO 4 · 7H 2 O}} 10mg, MgSO 4 · 7H 2 O 200mg, (NH 4) 2 SO 4 1000mg, CaCl 2 · 2H 2 O 20mg, NaCl 100mg, Na 2 MoO ₄ · 2H ₂ O 0.5 mg, Na ₂ WO ₄ 0.5 mg, MnSO ₄ 0.5 mg, pH is around 5.4. The composition of the protease production medium is 1% glucose, 1% casein peptone, MgSO ₄ · 7H ₂ O 0.01%, CaCl ₂ · H ₂ O 0.005%, KH ₂ PO ₄ 0.28%, Na ₂ HPO ₄ 0.07%, The pH is 5.7-5.9.
[0031]
Prior to the main culture, the fungus was planted in 100 ml of malt medium (W. Ebeling, M. Hennrich, M. Klockow, H. Metzt, HD Orth, H. Lang, Eur. J. Biochem, 1974, 47, 91). A seed culture was prepared by culturing at 30 ° C. for 5 days on a rotary shaker (180 rpm). 10 ml of the seed culture was incubated in a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of culture medium. 100 mg PLA brown film (thickness about 46 μm) was pre-sterilized with 5% (wt / vol) sodium hypochlorite and aseptically added to the culture. Also 0.1% gelatin was added prior to sterilization. The flask was incubated for 14 days at 30 ° C. on a rotary shaker (180 rpm). In addition, it incubated also in the sample which does not add gelatin about each culture solution.
[0032]
5 ml of the culture solution was taken and the water-soluble organic carbon concentration (TOC) and pH were measured. A TOC-5000 analyzer (Shimadzu Corporation) was used for TOC measurement. TOC is an index of accumulation of decomposition products such as L-lactic acid and lactic acid oligomer. The remaining film was directly recovered from the culture solution by extraction with 100 ml of chloroform and drying with an evaporator. After the film extraction, the cells in the culture solution were collected by centrifugation (4500 g, 10 minutes) and dried at 105 ° C. for 16 hours. The L-lactic acid contained in the culture solution was enzymatically analyzed with the Enzymatic Bioanalysis Kit (Boehringer Kahnheim). The results are shown in Table 1. From the column of film reduction amount in Table 1, it is shown that the culture solution strongly decomposes PLA by adding gelatin to the medium. Thus, gelatin is useful as an inducer of PLA degradation of T. album.
[0033]
[Table 1]

[0034]
Example 2 Degradation activity of T. album ATCC22563 culture filtrate against various substrates
The culture solution obtained by culturing T. album ATCC22563 in a medium containing 0.1% gelatin was filtered, and the degradation activity of the obtained culture filtrate with respect to PLA, PCL, PBS, PHB, silk fibroin and elastin was measured. The culture filtrate is dialyzed in advance against an appropriate amount of 5 mM phosphate buffer for 2 days, and 1 ml of culture filtrate (0.15 mg protein) is added to 0.1 ml 0.5% (wt / vol) octyl-glucopyranoside, 10 mg substrate and 4 ml 0.1 M phosphorus. It was added into a 50 ml vial containing a suspension consisting of acid buffer (pH 7). As the substrate and culture filtrate control, those obtained by removing the culture filtrate and substrate from the mixture, respectively, were used. The reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 12 hours on a rotary shaker (100 rpm), the solution was filtered through a 0.22 μm filter, and the TOC concentration of each sample was measured. TOC values were obtained by subtracting both controls.
[0035]
Enzymatic activity against succinyl- (L-alanyl-L-alanyl-L-alanine) p-nitroanilide (Suc- (Ala) ₃ -pNA) (Sigma Chemical Co.) is reduced to p-nitroaniline released from the nitroanilide ( It was evaluated by measuring the concentration of p-NA). A mixture of 1 ml of the culture filtrate and 4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7) containing 1.0 mM Suc- (Ala) ₃ -pNA was incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and the liberated p-NA was measured with a spectrophotometer ( Shimadzu UV-VIS) was monitored at 410 nm for 10 minutes. One unit of enzyme activity is defined as 1.0 μmole of p-NA released from Suc- (Ala) ₃ -pNA per minute.
[0036]
Proteinase K obtained from T. album (EC 3.4.21.64) and elastase obtained from porcine pancreas (EC 3.4.21.36) (both from Sigma Chemical Co.) were each 0.001% (0.1M phosphate buffer (pH 7)). As an enzyme solution (wt / vol), the activity against the substrate was measured and compared with the culture filtrate. The results are shown in Table 2. The culture filtrate shows a substrate specificity that is clearly different from elastase. In addition, the culture filtrate exhibits a particularly strong activity against polylactic acid as compared with Suc- (Ala) ₃ -pNA, silk fibroin, and elastin, which are the base chambers. It is suggested that
[0037]
[Table 2]

[0038]
Example 3
T. album ATCC22563 was cultured for 10 days under the same culture conditions as in Example 1 except for gelatin in a culture solution containing 0.1% (wt / vol) of various inducers shown in Table 3. A mixture of 0.2 ml culture medium and 4 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 7) containing 1.0 mM Suc- (Ala) ₃ -pNA was incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and the released p-NA was measured with a spectrophotometer. (Shimadzu UV-VIS) was measured at 410 nm. 1 ml of culture was added into a 50 ml vial containing a suspension consisting of 0.1 ml 0.5% (wt / vol) octyl-glucopyranoside, 10 mg PLA and 4 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 7). As the PLA substrate control and culture filtrate control, those obtained by removing the culture filtrate and substrate from the mixture, respectively, were used. The reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 12 hours on a rotary shaker (100 rpm), the solution was filtered through a 0.22 μm filter, and the TOC concentration of each sample was measured. TOC values were obtained by subtracting both controls. In the evaluation of PLA degradation activity, TOC values of 10 or more are indicated by “+”, and 5 or less are indicated by “−”. In the case of Suc- (Ala) ₃ -pNA degradation activity, 1.1 μmol of p-NA is liberated. / Min (absorbance at 410 nm is 0.020) or more is indicated by “+”, and 0 μmol / min (absorbance at 410 nm is 0.003) or less is indicated by “−”. The Suc- (Ala) ₃ -pNA degrading activity is an indicator of proteinase K-like protease activity, and this is the same in the following examples.
[0039]
[Table 3]

[0040]
Example 4
Example 1 in which the bacteria (T. album ATCC22563, A. orientalis IFO12362, S. waywayandensis JCM9114) were removed from the culture solution containing various inducers of 0.1% (wt / vol) shown in Tables 4, 5 and 6 The cells were cultured for 10 days under the same culture conditions. The culture solution was filtered to obtain a culture filtrate. A mixture of 0.2 ml of culture filtrate containing 1.0 mM Suc- (Ala) ₃ -pNA and 4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7) was incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and the released p-NA was spectrophotometered. (Shimadzu UV-VIS) was measured at 410 nm.
[0041]
[Table 4]

[0042]
[Table 5]

[0043]
[Table 6]

[0044]
Example 5
Bacteria (T. album ATCC22563) were cultured for 10 days under the same culture conditions as in Example 1 except for gelatin in a culture solution containing various inducers of 0.1% (wt / vol) shown in Tables 7 and 8. The culture solution was filtered to obtain a culture filtrate. Suc- (Ala) ₃ -pNA degradation activity was measured in the same manner as in Example 3. The measurement of PLA degradation activity was performed as follows. 1 ml of the culture filtrate was added into a 50 ml vial containing a suspension consisting of 0.1 ml 0.5% (wt / vol) octyl-glucopyranoside, 10 mg PLA and 4 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 7). As the PLA substrate control and culture filtrate control, those obtained by removing the culture filtrate and substrate from the mixture, respectively, were used. The reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 12 hours on a rotary shaker (100 rpm), the solution was filtered through a 0.22 μm filter, and the TOC concentration of each sample was measured. TOC values were obtained by subtracting both controls. The protein was measured by measuring the culture filtrate by a Lowry method using a foreign-siocultural-phenol reagent (Sigma Chemical Co.).
[0045]
[Table 7]

[0046]
[Table 8]

[0047]
Example 6
Bacteria (T. album ATCC22563) were cultured for 10 days under the same culture conditions as in Example 1 except for gelatin in a culture solution containing various inducers of 0.1% (wt / vol) shown in Table 9. The pH, protein concentration, TOC, and dry cell weight of the culture filtrate obtained by filtering the culture solution were measured.
[0048]
[Table 9]

[0049]
Example 7
Implementation of bacteria (T. album ATCC22563, A. orientalis IFO12362, S. waywayandensis JCM9114) in a culture solution containing various inducers of 0.1% (wt / vol) shown in Table 10, Table 11, and Table 12 except gelatin The cells were cultured for 10 days under the same culture conditions as in Example 1. 1 ml of the culture filtrate obtained by filtering the culture broth was added to 50 ml containing 0.1 ml of 0.5% (wt / vol) octyl-glucopyranoside, 10 mg PLA and 4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7) suspension. Added in a vial. As the PLA substrate control and culture filtrate control, those obtained by removing the culture filtrate and substrate from the mixture, respectively, were used. The reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 12 hours on a rotary shaker (100 rpm), the solution was filtered through a 0.22 μm filter, and the TOC concentration of each sample was measured. The TOC value was obtained by subtracting both controls from the enzyme reaction value. The TOC formation value is an indicator of PLA enzymatic degradation.
[0050]
[Table 10]

[0051]
[Table 11]

[0052]
[Table 12]

Claims

A medium for culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, or a proteinase K-like protease-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix , Oligopeptides containing glycine residues, oligopeptides containing alanine residues, oligopeptides containing valine residues, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, and silk fibroin hydrolyzate Adding at least one component selected from: and
Wherein in the resulting medium in Step, the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria, wherein the proteinase K-like protease-producing bacteria, or the step of culturing the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria and the proteinase K-like protease-producing bacteria,
A process for producing a polylactic acid-degrading enzyme, comprising:

In a medium for culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, or a proteinase K-like protease-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, Valine, alanine, glycine, alanyl-alanine dipeptide, glycyl-alanine dipeptide, valyl-glycine dipeptide, glycyl-valine dipeptide, alanyl-alanyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-glycine tripeptide, Adding at least one component selected from the group consisting of glycyl-valyl-glycine tripeptide, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin hydrolyzate, and
Wherein in the resulting medium in Step, the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria, wherein the proteinase K-like protease-producing bacteria, or the step of culturing the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria and the proteinase K-like protease-producing bacteria,
A process for producing a polylactic acid-degrading enzyme, comprising:

The method for producing a polylactic acid-degrading enzyme according to claim 1 or 2, further comprising a step of collecting the polylactic acid-degrading enzyme from the culture obtained in the culturing step .

The method for producing a polylactic acid-degrading enzyme according to claim 1-3, wherein the amount of the component added is 1 mg to 10 g per 100 ml of the medium.

In a medium for culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, or a proteinase K-like protease-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, From the group consisting of oligopeptides containing glycine residues, oligopeptides containing alanine residues, oligopeptides containing valine residues, valine, alanine, glycine, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, and silk fibroin hydrolyzate Adding at least one selected ingredient; and
Wherein in the resulting medium in Step, the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria, wherein the proteinase K-like protease-producing bacteria, or the step of culturing the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria and the proteinase K-like protease-producing bacteria,
A process for producing a proteinase K-like protease.

In a medium for culturing a polylactic acid-degrading enzyme-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, or a proteinase K-like protease-producing bacterium belonging to any of the genus Tritirachium, Amycolatopsis, and Saccharothrix, Valine, alanine, glycine, alanyl-alanine dipeptide, glycyl-alanine dipeptide, valyl-glycine dipeptide, glycyl-valine dipeptide, alanyl-alanyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-alanine tripeptide, glycyl-glycyl-glycine tripeptide, Adding at least one component selected from the group consisting of glycyl-valyl-glycine tripeptide, gelatin, soybean, collagen, elastin, keratin, silk fibroin hydrolyzate, and
Wherein in the resulting medium in Step, the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria, wherein the proteinase K-like protease-producing bacteria, or the step of culturing the polylactic acid decomposing enzyme-producing bacteria and the proteinase K-like protease-producing bacteria,
A process for producing a proteinase K-like protease.

The method for producing a proteinase K-like protease according to claim 4 or 5, comprising a step of collecting a proteinase K-like protease from the culture obtained in the culturing step .

The method for producing a proteinase K-like protease according to claim 5-7, wherein the amount of the component added is 1 mg to 10 g per 100 ml of the medium.