JP4713469B2 - Production of pantothenate using microorganisms that cannot sporulate - Google Patents
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Description
パントテネートは、ビタミンB複合体のメンバーで、例えば食物源から、水溶性ビタミンのサプリメントとして、または飼料添加物としてヒトを含めた哺乳動物の栄養に必要とされる。細胞ではパントテネートは、コエンザイムAおよびアシル担体蛋白質の生合成に主に用いられる。これらの必須補酵素は、これらの分子の4’−ホスホパンテテイン部分のスルフヒドリル基と共にチオエステルを形成するアシル部分の代謝に機能を果たす。 Pantothenate is a member of the vitamin B complex and is required for nutrition of mammals, including humans, for example from food sources, as a water-soluble vitamin supplement, or as a feed additive. In cells, pantothenate is primarily used for biosynthesis of coenzyme A and acyl carrier proteins. These essential coenzymes function in the metabolism of the acyl moiety that forms a thioester with the sulfhydryl group of the 4'-phosphopantethein moiety of these molecules.
パントテネートは、通常は大量の化学物質から化学合成を経て合成されている。しかし、化学合成に必要となる基質は高価で、ラセミ中間体を光学的に分割しなければならない。従って、パントテネート生合成法に有用な酵素を産生する細菌系または微生物系が採用されてきた。特に、パントテン酸の好ましい異性体を好都合に製造する手段として生物変換法が評価された。さらに最近は、微生物による直接合成法がD−パントテネートの産生を容易にする手段として検討された。 Pantothenate is usually synthesized from a large amount of chemical substances through chemical synthesis. However, the substrates required for chemical synthesis are expensive and the racemic intermediate must be optically resolved. Accordingly, bacterial or microbial systems that produce enzymes useful for pantothenate biosynthesis methods have been employed. In particular, bioconversion methods were evaluated as a means of conveniently producing the preferred isomer of pantothenic acid. More recently, direct synthesis by microorganisms has been investigated as a means of facilitating the production of D-pantothenate.
特許出願WO01/21772、WO02/057474、およびWO02/061108は、パントテネート産生に関与する生合成遺伝子をさらに高い発現レベルで有するB.スブチリス(B.subtilis)168株類を用いてパントテネートを製造する方法を記載している。これらの遺伝子には、panB、panC、panD、panE(ylbQ)、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA、およびserAがある。これらの遺伝子のさらに高レベルの発現を達成するために、当技術分野において公知である標準的な遺伝子組み換え法が使用された。これらの操作された株からのパントテネートの産生は流加培養による発酵48時間で37g/リットルから85g/リットルの範囲にわたった。 Patent applications WO01 / 21772, WO02 / 057474, and WO02 / 0661108 have biosynthesis genes involved in pantothenate production at higher expression levels. A method for producing pantothenate using B. subtilis strain 168 is described. These genes include panB, panC, panD, panE (ylbQ), ilvB, ilvN, ilvC, ilvD, glyA, and serA. In order to achieve higher levels of expression of these genes, standard genetic recombination methods known in the art were used. The production of pantothenate from these engineered strains ranged from 37 g / liter to 85 g / liter in 48 hours of fermentation by fed-batch culture.
環境および行政による規制の点から、もしも遺伝子修飾微生物が発酵過程の間またはバイオマスの処分の間に製造施設から漏れた場合に、その微生物が自然環境中で生存する能力を有さないことが重要である。この理由からB.スブチリスの胞子形成欠損株が、発酵過程(例えばリボフラビン(US5837528)、ビオチン(US6057136))に用いられる。概してspo0A突然変異が、胞子形成の停止に使用される。spo0A遺伝子は、胞子形成の開始を調節するタンパク質をコードする。点突然変異、フレームシフト突然変異または欠失突然変異のいずれかによるspo0Aの不活性化は、最初期の工程で胞子形成を停止させる結果、化学溶媒、放射線および/または熱にもはや耐性ではない株をもたらす。spo0Aにおける突然変異以外にWO97/03185は、胞子形成できないB.スブチリス以外のバチルス属の細菌を得るために、胞子形成特異的転写のシグマ因子σFをコードするバチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のspoIIACにおける突然変異を使用して、商業的に重要な酵素を製造する方法を記載している。 In terms of environmental and administrative regulations, if a genetically modified microorganism leaks from a manufacturing facility during the fermentation process or during the disposal of biomass, it is important that the microorganism does not have the ability to survive in the natural environment It is. For this reason B. A sporulation-deficient strain of Subtilis is used in the fermentation process (for example, riboflavin (US5837528), biotin (US6057136)). In general, the spo0A mutation is used to stop sporulation. The spo0A gene encodes a protein that regulates the initiation of sporulation. Inactivation of spo0A, either by point mutations, frameshift mutations or deletion mutations, stops sporulation in the earliest steps, resulting in strains that are no longer resistant to chemical solvents, radiation and / or heat Bring. In addition to mutations in spo0A, WO 97/03185 does not allow sporulation. To obtain bacteria of the genus Bacillus other than subtilis, a mutation in spoIIAC of Bacillus licheniformis that encodes the sigma factor σ F of sporulation-specific transcription is used to produce commercially important enzymes Is described.
B.スブチリスおよび他の関連グラム陽性細菌における内生胞子形成(胞子形成)過程は数工程からなる。胞子形成への加入は、DNA結合性主応答調節因子であるリン酸化spo0A(spo0A〜P)によって決定されている(Fawcettら、2000)。spo0A〜Pは、二つの重要な役割を演じている(PhillipsおよびStrauch、2002)。低い細胞内濃度でspo0A〜PはabrBの転写を抑制し、それによってAbrB依存性移行状態関連遺伝子の発現調節が高まる。次に、spo0A〜P濃度がさらに高い限界レベルに達したならば、Spo0A〜Pは、胞子形成への加入および方向付けに必要な遺伝子(sinI、spoIIG、spoIIE、spoIIAなど)を活性化する。Spo0A〜PがabrBの転写を抑制してAbrBがsigHの転写を抑制することから、spo0A〜Pは、σHのレギュロン内にある遺伝子を間接的に活性化する。σHは増殖定常期および胞子形成の初期に関与する遺伝子(spo0A、spo0F、spoIIA、phrC、phrEなど)の転写を決定する代替シグマ因子である(Brittonら、2002)。spo0A〜PおよびAbrBのレベルを増加または減少させる遺伝子ならびに遺伝子産物の例には、abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、sigH、spo0A,spo0B、spo0Eおよびspo0Fがあるが、それに限定されるわけではない。プロモーター部位でのspo0A〜P依存性結合に作用して遺伝子発現を活性化させるタンパク質の例には、spo0JAおよびspo0JBがあるが、それに限定されるわけではない。spo0A〜PおよびAbrBのレベルを増加または減少させるシグナルの例には、栄養シグナル、代謝シグナル、DNA状態シグナル、細胞密度(フェロモンおよび菌体密度感知分子)シグナルおよび細胞周期シグナルがあるが、それに限定されるわけではない。 B. The endospore formation (spore formation) process in subtilis and other related Gram-positive bacteria consists of several steps. Enrollment in sporulation has been determined by phosphorylated spo0A (spo0A-P), a DNA-binding main response regulator (Fawcett et al., 2000). spo0A-P plays two important roles (Phillips and Strauch, 2002). At low intracellular concentrations, spo0A-P represses abrB transcription, thereby increasing the regulation of AbrB-dependent transition state-related gene expression. Next, if spo0A-P concentrations reach even higher limit levels, Spo0A-P activates genes necessary for sporulation entry and orientation (sinI, spoIIG, spoIIE, spoIIA, etc.). Since spo0A-P represses transcription of abrB and AbrB represses transcription of sigH, spo0A-P indirectly activates genes in the σ H regulon. σ H is an alternative sigma factor that determines the transcription of genes (spo0A, spo0F, spoIIA, phrC, phrE, etc.) involved in the stationary phase of growth and early sporulation (Britton et al., 2002). Examples of genes and gene products that increase or decrease the levels of spo0A-P and AbrB include abrB, kapB, kbaA, kinA, kinB, kinC, kinD, kinE, kipA, kipI, obg, phrC, phrE, rapA, rapB , RapE, sigH, spo0A, spo0B, spo0E and spo0F, but are not limited thereto. Examples of proteins that act on spo0A-P dependent binding at the promoter site to activate gene expression include, but are not limited to, spo0JA and spo0JB. Examples of signals that increase or decrease spo0A-P and AbrB levels include, but are not limited to, nutritional signals, metabolic signals, DNA status signals, cell density (pheromone and cell density sensing molecules) signals, and cell cycle signals. It is not done.
これらの工程の後に、細胞は非対称に分裂してサイズが等しくなく異なる発達運命の二つの区画が発生する(PiggotおよびLosick、2002)。小さい方の区画である前胞子は、発達して胞子になるが、大きい方の区画である母細胞は発達中の胞子に栄養素を与える。胞子の形態形成が完了すると、母細胞は溶解して成熟した胞子を放出する。分化は、細胞特異的な四つのシグマ因子であるσF、σE、σGおよびσKの作用を必要とする。σF因子およびσE因子は非対称分裂(極性をもつ隔壁形成、第II期)後すぐに活性化し、このときσFは前胞子における遺伝子発現を指示し(Margolisら、1991)、σEは母細胞における遺伝子発現を指示する(DirksおよびLosick、1991)。胞子形成の後期に前胞子ではσFはσGにより置き換わられ、母細胞ではσEはσKにより置き換わられる(LosickおよびStragier、1992; LiおよびPiggot、2001)。 After these steps, the cells divide asymmetrically to produce two compartments of different developmental fate that are unequal in size (Piggot and Losick, 2002). The smaller compartment, the prespore, develops into a spore, while the larger compartment, the mother cell, provides nutrients to the developing spore. When spore morphogenesis is complete, the mother cells lyse and release mature spores. Differentiation requires the action of four cell-specific sigma factors, σ F , σ E , σ G and σ K. σ F and σ E factors are activated immediately after asymmetric division (polar septum formation, phase II), where σ F directs gene expression in the prespore (Margolis et al., 1991), and σ E is Directs gene expression in mother cells (Dirks and Losick, 1991). Later in sporulation, sigma F is replaced by sigma G in the prespore and sigma E is replaced by sigma K in the mother cell (Losick and Stragier, 1992; Li and Piggot, 2001).
σEはプロσEと呼ばれる不活性プロタンパク質から得られる(LaBellら、1987)。プロσEの合成は、隔壁形成前に始まる(Satolaら、1992)が、プロσEから成熟σEへのタンパク質分解性プロセシングは、母細胞における非対称分裂後に起こる。この反応は、胞子形成特異的プロテアーゼであるSpoIIGAによって仲介され、SpoIIGAはプロσEのアミノ末端から27個のアミノ酸を開裂させる(Stragierら、1988; Jonasら、1988; PetersおよびHaldenwang、1994)。プロセシング前にSpoIIGAは、σFの制御下で前胞子において産生する分泌されたシグナル伝達タンパク質(SpoIIR)によって活性化する(Londono-VallejoおよびStragier、1995; Hofmeisterら、1995; Karowら、1995)。σEおよび他のシグマ因子の活性化についての追加の情報をHelmannおよびMoran(2002)が総説している。 σ E is obtained from an inactive proprotein called proσ E (LaBell et al., 1987). Pro-sigma E synthesis begins before septum formation (Satola et al., 1992), while pro- lytic processing of pro-sigma E to mature sigma E occurs after asymmetric division in the mother cell. The reaction is mediated by SpoIIGA a sporulation-specific protease, SpoIIGA cleaves the 27 amino acids from the amino terminus of pro-σ E (Stragier et al, 1988; Jonas et, 1988; Peters and Haldenwang, 1994). SpoIIGA before processing is activated by the production to secreted signaling proteins (SpoIIR) before spores under the control of σ F (Londono-Vallejo and Stragier, 1995; Hofmeister et al., 1995; Karow et al, 1995). Additional information on the activation of σ E and other sigma factors is reviewed by Helmann and Moran (2002).
胞子形成突然変異を他の突然変異と組み合わせて単一の細菌に導入した結果として予想外の遺伝子活性化がもたらされることが示された。例えば、spo0A〜Pの非存在下で減少するγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子であるggtの発現は、abrBおよびspo0Aの二重ヌル突然変異体において野生型の発現レベルの3〜4倍に増大しうる(XuおよびStrauch、1996)。そのような株は、胞子形成もできない。しかし、これらの株が対照細胞と同レベルまたは対照細胞より高いパントテネートの産生を示しうることは認識されていなかった。特に、XuおよびStrauchに記載された細胞は、パントテネート化合物を過剰産生できない。 It has been shown that introducing sporulation mutations in combination with other mutations into a single bacterium results in unexpected gene activation. For example, expression of ggt, a gene encoding γ-glutamyl transpeptidase that decreases in the absence of spo0A-P, is 3-4 times the wild-type expression level in abrB and spo0A double null mutants. Can increase (Xu and Strauch, 1996). Such strains are also unable to sporulate. However, it was not recognized that these strains could show the same level of pantothenate production as control cells or higher than control cells. In particular, the cells described in Xu and Strauch cannot overproduce pantothenate compounds.
興味深いことに、WO01/21772、WO02/057474、およびWO02/061108に記載された遺伝子改変されたパントテネート産生B.スブチリス168株類は全て胞子形成について野生型である。胞子形成欠損株におけるパントテネートの産生を示す例は提供されていない。 Interestingly, genetically modified pantothenate production described in WO01 / 21772, WO02 / 057474, and WO02 / 061108 Subtilis 168 strains are all wild type for sporulation. No examples are provided showing the production of pantothenate in sporulation-deficient strains.
パントテネートを過剰産生できる胞子形成欠損微生物を提供することが本発明の目的である。B.スブチリスにも適する胞子形成欠損微生物の調製のための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。 It is an object of the present invention to provide a sporulation-deficient microorganism that can overproduce pantothenate. B. It is a further object of the present invention to provide a method for the preparation of sporulation-deficient microorganisms that are also suitable for subtilis.
通常に使用されているspo0A突然変異がパントテネート産生の重大な減少をもたらすことが発見された。しかし、SigE活性を欠くか、またはspo0AおよびAbrBの両方を欠くB.スブチリス細胞は、完全に胞子形成を欠き、対照細胞と同様またはそれよりも高いレベルでパントテネートの産生を示すことが見出された。 It has been discovered that the commonly used spo0A mutation results in a significant reduction in pantothenate production. However, B. lacks SigE activity or lacks both spo0A and AbrB. Subtilis cells were found to completely lack sporulation and show pantothenate production at levels similar to or higher than control cells.
したがって本発明は、パントテネート化合物を過剰産生できる胞子形成欠損微生物に関するものである。微生物は、非改変型の微生物に比べてSigE活性が低減するように改変されうる。SigEは、spoIIGB遺伝子によりコードされる遺伝子産物である。SigE活性の低減は、spoIIGB発現の欠如、spoIIGAがコードするプロテアーゼの発現の減少または欠如、他の上流の調節遺伝子もしくはタンパク質の発現の減少または欠如などによって引き起こされうる。好ましくは微生物の改変は、SigE活性の低減を引き起こす突然変異を含む。さらに好ましくは突然変異が、spoIIGA、spoIIGB、spoIIRおよびspoIIAC遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子に作用する。 Accordingly, the present invention relates to a spore formation-deficient microorganism that can overproduce pantothenate compounds. Microorganisms can be modified to have reduced SigE activity compared to unmodified microorganisms. SigE is a gene product encoded by the spoIIGB gene. Reduction in SigE activity can be caused by a lack of spoIIGB expression, a reduction or absence of expression of a protease encoded by spoIIGA, a reduction or absence of expression of other upstream regulatory genes or proteins, and the like. Preferably the microbial modification comprises a mutation that causes a reduction in SigE activity. More preferably, the mutation acts on one or more genes selected from the group consisting of spoIIGA, spoIIGB, spoIIR and spoIIAC genes.
B.スブチリスパントテネート過剰産生株において構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの使用によりspo0A遺伝子の発現を増加させることによって、パントテネートの産生がさらに増加することが、さらに見出された。この株は依然として胞子を形成することから、sigE突然変異の導入の結果としてspo0A過剰産生親株に比べ同様の量のパントテネートを産生し胞子を形成しないB.スブチリスがもたらされるであろう。したがって本発明の好ましい態様において、高いspo0A〜Pレベルと共に低減したSigE活性を有する微生物は、胞子を形成せずにより多くのパントテネートを産生できる。 B. It was further found that pantothenate production was further increased by increasing the expression of the spo0A gene through the use of a constitutive or inducible promoter in a subtilis spantothenate overproducing strain. Since this strain still forms spores, as a result of the introduction of the sigE mutation, it produces a similar amount of pantothenate compared to the spo0A overproducing parent strain and does not form spores. Subtilis will be brought. Thus, in a preferred embodiment of the present invention, a microorganism having reduced SigE activity with high spo0A-P levels can produce more pantothenate without forming spores.
本発明の別の態様において微生物は、非改変型の微生物に比べてSpo0AおよびAbrBの両方の活性が低減するように微生物は改変されうる。Spo0AおよびAbrBは、それぞれspo0AおよびabrB遺伝子によりコードされる遺伝子産物である。Spo0AおよびAbrB活性の低減は、遺伝子発現の欠如、シグナル(栄養シグナル、代謝シグナル、DNA状態シグナル、細胞密度[フェロモンおよび菌体密度感知分子]シグナルおよび細胞周期シグナル)の減少または欠如、他の上流の調節遺伝子もしくはタンパク質の発現の減少または欠如などによって起こりうる。好ましくは微生物の改変は、Spo0A/AbrB活性の低減を引き起こす突然変異を含む。さらに好ましくは突然変異は、abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、scoC、sigH、sinR、sinI、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0JAおよびspo0JB遺伝子からなる群より選択される一つ、二つまたはそれを超える遺伝子に作用する。 In another aspect of the invention, the microorganism can be modified such that the activity of both SpoOA and AbrB is reduced compared to an unmodified microorganism. Spo0A and AbrB are gene products encoded by spo0A and abrB genes, respectively. Reduction of Spo0A and AbrB activity is due to lack of gene expression, decreased or absent signals (nutrient signal, metabolic signal, DNA status signal, cell density [pheromone and cell density sensing molecule] signal and cell cycle signal), other upstream May be caused by a decrease or lack of expression of a regulatory gene or protein. Preferably, the microbial modification comprises a mutation that causes a reduction in Spo0A / AbrB activity. More preferably, the mutations are abrB, kapB, kbaA, kinA, kinB, kinC, kinD, kinE, kipA, kipI, obg, phrC, phrE, rapA, rapB, rapE, scoC, sigH, sinR, sinI, spo0A, sp0A, sp0A Act on one, two or more genes selected from the group consisting of spo0E, spo0F, spo0JA and spo0JB genes.
微生物は真核生物または原核生物でありうる。好ましくは微生物は、原核生物である。原核微生物は、グラム陽性またはグラム陰性でありうる。グラム陽性微生物には、バチルス属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococci)属およびストレプトミセス(Streptomyces)属の一つに属する微生物があるが、それに限定されるわけではない。好ましくは微生物は、バチルス属に属する。その例は、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス スブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス プンティス(Bacillus puntis)、バチルス ハロヅランス(Bacillus halodurans)などである。最も好ましくは微生物は、バチルス スブチリスである。本発明の微生物に対応する野生型形態は、胞子形成微生物である。 The microorganism can be eukaryotic or prokaryotic. Preferably the microorganism is a prokaryotic organism. Prokaryotic microorganisms can be gram positive or gram negative. Gram-positive microorganisms include, but are not limited to, those belonging to one of the genera Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci, and Streptomyces. I don't mean. Preferably, the microorganism belongs to the genus Bacillus. Examples are Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus puntis, Bacillus halodurans, and the like. Most preferably the microorganism is Bacillus subtilis. The wild-type form corresponding to the microorganism of the present invention is a spore-forming microorganism.
「パントテネート化合物」は、好ましくはパントテネートである。パントテネート化合物にはさらに、パントイン酸塩、α−ケトパントイン酸塩、α−ケトイソ吉草酸塩などのようなパントテネート生合成の生合成経路における中間体化合物がある。 The “pantothenate compound” is preferably pantothenate. Pantothenate compounds further include intermediate compounds in the biosynthetic pathway of pantothenate biosynthesis, such as pantoate, α-ketopantoate, α-ketoisovalerate, and the like.
本発明は、sigE遺伝子産物(SigEタンパク質)の機能低下を招く、微生物遺伝子に対する任意の突然変異を包含する。当業者に公知の胞子形成アッセイでSigEの機能をアッセイできる。本発明の微生物は、spoIIGB(sigE)遺伝子に突然変異を有する結果として機能的sigE遺伝子産物の発現の不在または減少をもたらすおそれがある。本発明は、spoIIGB(sigE)を活性化させることが公知である遺伝子における任意の突然変異をさらに包含する。これらには、spoIIGA、spoIIR、およびspoIIAC(sigF)があるが、それに限定されるわけではない(HelmannおよびMoran、2002)。本発明の微生物は、spoIIGA遺伝子に突然変異を有する結果として機能的spoIIGA遺伝子産物の発現の不在または減少をもたらすおそれがある。本発明の微生物は、spoIIR遺伝子に突然変異を有する結果、機能的spoIIR遺伝子産物の発現の不在または減少が生じているおそれがある。本発明の微生物は、spoIIAC遺伝子に突然変異を有する結果として機能的spoIIAC遺伝子産物の発現の不在または減少がをたらすおそれがある。 The present invention encompasses any mutation to a microbial gene that results in reduced function of the sigE gene product (SigE protein). SigE function can be assayed in sporulation assays known to those skilled in the art. The microorganisms of the present invention may result in the absence or reduction of expression of a functional sigE gene product as a result of having a mutation in the spoIIGB (sigE) gene. The present invention further encompasses any mutation in a gene known to activate spoIIGB (sigE). These include, but are not limited to, spoIIGA, spoIIR, and spoIIAC (sigF) (Helmann and Moran, 2002). The microorganisms of the present invention may result in the absence or reduction of functional spoIIGA gene product expression as a result of having a mutation in the spoIIGA gene. The microorganism of the present invention may have a mutation in the spoIIR gene resulting in the absence or reduction of expression of a functional spoIIR gene product. The microorganisms of the present invention may result in the absence or reduction of expression of a functional spoIIAC gene product as a result of having a mutation in the spoIIAC gene.
「発現」という用語は、核酸配列の転写および/またはその後の転写された配列からアミノ酸配列への翻訳を表す。核酸の発現減少は、例えば遺伝子の欠失により;リーディングフレームのフレームシフトの形成または停止コドンの導入による翻訳の成熟前停止を介した、コードされたタンパク質の活性を不活性化または減少させるヌクレオチド付加またはヌクレオチド除去により;プロモーター、リボソーム結合部位、および本明細書において記載される他の手法のような調節配列を改変することにより、遺伝子に突然変異を導入することによって達成されうる。 The term “expression” refers to transcription of a nucleic acid sequence and / or subsequent translation from a transcribed sequence to an amino acid sequence. Nucleic acid expression is reduced by, for example, gene deletion; nucleotide additions that inactivate or reduce the activity of the encoded protein through the formation of a frameshift in the reading frame or through prematurity termination of translation by introduction of a stop codon Or by nucleotide removal; by introducing mutations into the gene by modifying regulatory sequences such as promoters, ribosome binding sites, and other techniques described herein.
「突然変異」は、遺伝子配列における欠失、置換または付加でありうる。突然変異は、破壊、フレームシフト突然変異、またはナンセンス突然変異でありうる。突然変異は、遺伝子の配列全体またはその一部に作用する破壊でありうる。突然変異は、遺伝子のコード配列または非コード配列、例えばプロモーターに作用しうる。突然変異は、遺伝子の転写の完全な欠如または翻訳の成熟前停止を招きうる。同様に突然変異は、先行(または「上流の」)遺伝子に位置し、極性と称する過程により隣接(または「下流の」)遺伝子(類)の転写を破壊しうる。または突然変異は、翻訳後のタンパク質が野生型タンパク質に比べてタンパク質を非機能性にする突然変異を保有するという作用を有しうる。 A “mutation” can be a deletion, substitution or addition in a gene sequence. The mutation can be a disruption, a frameshift mutation, or a nonsense mutation. A mutation can be a disruption that affects the entire sequence of a gene or a portion thereof. Mutations can affect the coding or non-coding sequence of a gene, such as a promoter. Mutations can result in a complete lack of transcription of the gene or prematurity termination of translation. Similarly, a mutation may be located in a preceding (or “upstream”) gene and disrupt the transcription of an adjacent (or “downstream”) gene (s) by a process called polarity. Alternatively, the mutation can have the effect that the translated protein carries a mutation that renders the protein non-functional compared to the wild-type protein.
遺伝子に適当な突然変異を導入する方法は当業者に公知である。これらの方法には、細菌染色体への点突然変異の導入(CuttingおよびVander Horn、1990)、染色体DNAセグメントの除去およびそのセグメントから抗生物質耐性遺伝子への交換(Perego、1993)、トランスポゾンTn917もしくはミニTn10(Youngman、1990; Petitら、1990)のような転移因子またはpMUTINのようなプラスミド(Vagnerら、1998)の直接挿入があるが、それに限定されるわけではない。 Methods for introducing appropriate mutations into genes are known to those skilled in the art. These methods include the introduction of point mutations into the bacterial chromosome (Cutting and Vander Horn, 1990), removal of the chromosomal DNA segment and replacement of that segment with an antibiotic resistance gene (Perego, 1993), transposon Tn917 or mini There are, but are not limited to, direct insertion of transposable elements such as Tn10 (Youngman, 1990; Petit et al., 1990) or plasmids such as pMUTIN (Vagner et al., 1998).
好ましくは、sigE遺伝子産物の機能の低減を有する胞子形成欠損微生物は、spo0Aを過剰発現でき、さらに好ましくはその微生物は、spo0Aを過剰発現する。spo0Aの過剰発現は、本明細書に記載されるように達成されうる。 Preferably, a sporulation-deficient microorganism having a reduced function of the sigE gene product can overexpress spo0A, more preferably the microorganism overexpresses spo0A. Overexpression of spo0A can be achieved as described herein.
遺伝子の発現増加または過剰発現は、多様な方法で達成されうる。一つまたは複数の遺伝子を過剰発現する微生物を得る一つの取り組みは、例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多数のプロモーターを追加することによって、または発現が構成的になるように調節配列を除去することによって、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位を変更または改変することである。さらなる手技について以下に記載する。 Increased or overexpression of a gene can be achieved in a variety of ways. One approach to obtaining a microorganism that overexpresses one or more genes is to remove regulatory sequences, for example by adding a strong promoter, an inducible promoter or multiple promoters, or so that expression is constitutive By altering or modifying regulatory sequences or sites associated with the expression of a particular gene. Additional procedures are described below.
「プロモーター」は、遺伝子の転写開始の上流にあるDNA配列であり、RNAポリメラーゼおよび/または他のタンパク質の認識ならびに結合に関与して遺伝子の転写を開始させる。普通はプロモーターは、どのような条件で遺伝子が発現するかを決定している。 A “promoter” is a DNA sequence that is upstream of the start of transcription of a gene and is involved in the recognition and binding of RNA polymerase and / or other proteins to initiate transcription of the gene. Normally, a promoter determines under what conditions a gene is expressed.
「誘導性プロモーター」は、遺伝子のmRNA合成を特定の条件で一時的に開始させるものである。(i)プロモーターは、レプレッサーまたはアクチベーターのような補助因子によって主に調節されうる。レプレッサーは、プロモーター活性を抑制する配列特異的DNA結合タンパク質である。転写は、プロモーターのオペレーターにレプレッサーが結合するのを阻害する誘導因子の存在下でこのプロモーターから開始できる。グラム陽性微生物由来のそのようなプロモーターの例には、gnt(グルコン酸オペロンプロモーター);バチルスリケニフォルミス由来penP;glnA(グルタミンシンテターゼ);xylAB(キシロースオペロン);araABD(L−アラビノースオペロン)およびイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド[IPTG]のような誘導因子によって制御できるハイブリッドSPO1/lacプロモーターであるPspacプロモーター(YansuraおよびHenner、1984)があるが、それに限定されるわけではない。アクチベーターもプロモーター活性を誘導する配列特異的DNA結合タンパク質である。グラム陽性微生物由来のそのようなプロモーターの例には、二成分系(PhoP−PhoR、DegU−DegS、spo0A−リン酸リレー)、LevR、MryおよびGltCがあるが、それに限定されるわけではない。(ii)二次シグマ因子の産生は、特異的プロモーターからの転写を主に担っている可能性がある。グラム陽性微生物からの例には、胞子形成特異的シグマ因子であるσF、σE、σGおよびσKならびに一般ストレスシグマ因子σBにより活性化されるプロモーターがあるが、それに限定されるわけではない。σB介在性応答は、エネルギー制限および環境ストレスによって誘導される(HeckerおよびVolker、1998)。(iii)減衰および抗転写終結も転写を調節する。グラム陽性微生物からの例には、trpオペロンおよびsacB遺伝子があるが、それに限定されるわけではない。(iv)発現ベクターにおいて調節されている他のプロモーターは、ファージΦ105(Osbourneら、1985)からの温度感受性免疫レプレッサーおよびスクロース誘導性を付与するsacR調節系(KlierおよびRapoport、1988)に基づいている。 An “inducible promoter” is one that temporarily initiates mRNA synthesis of a gene under specific conditions. (I) Promoters can be regulated primarily by cofactors such as repressors or activators. A repressor is a sequence-specific DNA binding protein that suppresses promoter activity. Transcription can be initiated from this promoter in the presence of an inducer that inhibits the repressor from binding to the operator of the promoter. Examples of such promoters from gram positive microorganisms include gnt (gluconate operon promoter); bacillus licheniformis penP; glnA (glutamine synthetase); xylAB (xylose operon); araABD (L-arabinose operon) and There is, but is not limited to, the P spac promoter (Yansura and Henner, 1984), which is a hybrid SPO1 / lac promoter that can be controlled by inducers such as isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside [IPTG]. . Activators are also sequence-specific DNA binding proteins that induce promoter activity. Examples of such promoters from gram positive microorganisms include, but are not limited to, binary systems (PhoP-PhoR, DegU-DegS, spo0A-phosphate relay), LevR, Mry and GltC. (Ii) The production of secondary sigma factors may be mainly responsible for transcription from specific promoters. Examples from Gram-positive microorganisms include, but are not limited to, promoters activated by the spore formation specific sigma factors σ F , σ E , σ G and σ K and the general stress sigma factor σ B. is not. The σ B mediated response is induced by energy limitation and environmental stress (Hecker and Volker, 1998). (Iii) Attenuation and anti-transcription termination also regulate transcription. Examples from gram positive microorganisms include, but are not limited to, the trp operon and sacB genes. (Iv) Other promoters that are regulated in expression vectors are based on the temperature-sensitive immune repressor from phage Φ105 (Osbourne et al., 1985) and the sacR regulatory system conferring sucrose inducibility (Klier and Rapoport, 1988). Yes.
「構成的」プロモーターは、事実上全ての環境条件で遺伝子が発現することを可能にするもの、すなわち一定の非特異的遺伝子発現を指令するプロモーターである。「強力な構成的プロモーター」は、天然宿主細胞に比べて高頻度でmRNAを開始させるものである。強力な構成的プロモーターは、周知であり、宿主細胞において制御すべき特異的配列により適当なものを選択できる。グラム陽性微生物由来のそのような強力な構成的プロモーターの例には、SP01−26、SP01−15、veg、pyc(ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター)、およびamyEがあるが、それに限定されるわけではない。グラム陰性微生物由来のプロモーターの例にはtac、tet、trp−tet、lpp、lac、lpp−lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ−PR、およびλ−PLがあるが、それに限定されるわけではない。 A “constitutive” promoter is one that allows the gene to be expressed in virtually all environmental conditions, ie, a promoter that directs certain non-specific gene expression. A “strong constitutive promoter” is one that initiates mRNA more frequently than in a natural host cell. Strong constitutive promoters are well known and can be selected appropriately depending on the specific sequence to be controlled in the host cell. Examples of such strong constitutive promoters from gram positive microorganisms include, but are not limited to, SP01-26, SP01-15, veg, pyc (pyruvate carboxylase promoter), and amyE. Examples of promoters from gram-negative microorganisms include tac, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-P R , and λ- there is a P L, but is not limited to it.
本発明は、spo0AおよびAbrBの両方の機能の低減を招く、一つまたは複数の遺伝子に対する任意の突然変異をさらに包含する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼに対する酵素アッセイ(XuおよびStrauch、1996)および当業者に公知のマイクロアレイ法でspo0AおよびAbrBの機能をアッセイできる。さらに、胞子形成アッセイでspo0Aの機能をアッセイでき、AbrB調節性プロモーター(spo0VG、tycA、abrBなど)に融合したlacZレポーター遺伝子でAbrBの機能をアッセイできる。微生物は、spo0A遺伝子に少なくとも一つの突然変異およびabrB遺伝子に少なくとも一つの突然変異を有しうる。突然変異は、機能的spo0A遺伝子産物の不在または発現減少および機能的abrB遺伝子産物の不在または発現減少を招く。 The invention further encompasses any mutation to one or more genes that results in reduced function of both spo0A and AbrB. The functions of spo0A and AbrB can be assayed by enzymatic assays for γ-glutamyl transpeptidase (Xu and Strauch, 1996) and microarray methods known to those skilled in the art. In addition, spo0A function can be assayed in a sporulation assay, and AbrB function can be assayed with a lacZ reporter gene fused to an AbrB regulated promoter (spo0VG, tycA, abrB, etc.). The microorganism may have at least one mutation in the spo0A gene and at least one mutation in the abrB gene. Mutations result in the absence or decreased expression of a functional spo0A gene product and the absence or decreased expression of a functional abrB gene product.
spo0Aの機能低減を招く一つまたは複数の遺伝子に対する突然変異には、spo0Aを活性化することが公知である遺伝子に対する突然変異がある。これらにはspo0B、spo0F、kinA、kinB、kinC、kinD、kinEおよびsigHがあるが、それに限定されるわけではない。本発明の微生物は、spo0Bにおける突然変異を有する結果として機能的spo0B遺伝子産物の不在または発現減少をもたらしうる。本発明の微生物は、spo0Fにおける突然変異を有する結果として機能的spo0F遺伝子産物の不在または発現減少をもたらしうる。 Mutations to one or more genes that lead to reduced function of spo0A include mutations to genes known to activate spo0A. These include, but are not limited to, spo0B, spo0F, kinA, kinB, kinC, kinD, kinE, and sigH. The microorganisms of the present invention may result in the absence or reduced expression of a functional spo0B gene product as a result of having a mutation in spo0B. The microorganisms of the present invention may result in the absence or reduced expression of a functional spo0F gene product as a result of having a mutation in spo0F.
本発明の具体的な態様において、SigE機能の低減を招く突然変異ならびにspo0AおよびAbrBの両方の機能の低減を招く突然変異を組み合わせてもよい。したがって、本明細書において記載する様々な突然変異および改変の好ましい態様を組み合わせてもよい。これは以下に記載する方法に準用してあてはまる。 In a specific embodiment of the invention, mutations that result in reduced SigE function and mutations that result in reduced function of both spo0A and AbrB may be combined. Thus, the preferred embodiments of the various mutations and modifications described herein may be combined. This applies mutatis mutandis to the method described below.
本発明の微生物は、適当な条件でパントテネート化合物を過剰発現できる。本明細書に使用する「パントテネート化合物を過剰発現する」という用語は、本発明の微生物によるパントテネート化合物の産生が前記微生物の野生型形態に比べ有意に増加していることを指す。好ましくはパントテネートの過剰産生は、培養液1リットルあたりパントテネート少なくとも50mg、100mg、200mg、500mg、1g、3g、5gまたは10gの産生を意味する。 The microorganism of the present invention can overexpress pantothenate compounds under appropriate conditions. As used herein, the term “overexpressing pantothenate compounds” refers to a significant increase in the production of pantothenate compounds by the microorganism of the present invention compared to the wild-type form of the microorganism. Preferably overproduction of pantothenate means production of at least 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 1 g, 3 g, 5 g or 10 g of pantothenate per liter of culture.
一態様において本発明の微生物集団は、実施例2に記載するような条件で培養した場合に培養液1リットルあたりパントテネートを少なくとも100mg、好ましくは少なくとも125mg、さらに好ましくは少なくとも140mg、さらに好ましくは少なくとも200mg、なおさらに好ましくは少なくとも300mg、いっそうさらに好ましくは少なくとも400mg、最も好ましくは少なくとも500mg産生する。この実施例において最少培地で培養することが記載されている。または本発明の微生物集団は、実施例4または5に記載するような条件で培養した場合に培養液1リットルあたりパントテネートを少なくとも100mg、好ましくは少なくとも125mg、さらに好ましくは少なくとも140mg、さらに好ましくは少なくとも200mg、なおさらに好ましくは少なくとも300mg、いっそうさらに好ましくは少なくとも400mg、最も好ましくは少なくとも500mg産生しうる。 In one embodiment, the microbial population of the invention is at least 100 mg pantothenate per liter of culture, preferably at least 125 mg, more preferably at least 140 mg, more preferably at least 200 mg when cultured under conditions as described in Example 2. Still more preferably at least 300 mg, even more preferably at least 400 mg, most preferably at least 500 mg. In this example, culturing in a minimal medium is described. Alternatively, the microbial population of the present invention, when cultured under conditions as described in Example 4 or 5, is at least 100 mg pantothenate per liter of culture, preferably at least 125 mg, more preferably at least 140 mg, more preferably at least 200 mg. Still more preferably at least 300 mg, even more preferably at least 400 mg, most preferably at least 500 mg.
別の局面において本発明の微生物集団は、実施例3に記載するような条件で培養した場合に培養液1リットルあたりパントテネートを少なくとも5g、好ましくは少なくとも7.5g、最も好ましくは少なくとも10g産生する。この実施例は、流加培養による発酵を記載している。 In another aspect, the microbial population of the present invention produces at least 5 g, preferably at least 7.5 g, most preferably at least 10 g pantothenate per liter of culture when cultured under conditions as described in Example 3. This example describes fermentation by fed-batch culture.
本発明の胞子形成欠損微生物によるパントテネートの産生レベルは、対照細胞によるパントテネート産生レベルに匹敵する。したがって、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、同一の条件で培養した場合に胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の50%を超え、好ましくは75%を超え、さらに好ましくは100%を超えうる。実施例2に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の50%を超え、好ましくは75%を超えることが好ましい。実施例3に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の50%を超え、好ましくは75%を超え、最も好ましくは100%を超えることが好ましい。実施例4に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の50%を超え、好ましくは75%を超え、最も好ましくは100%を超えることが好ましい。実施例5に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の50%を超え、好ましくは75%を超え、最も好ましくは100%を超えることが好ましい。 The level of pantothenate production by the sporulation-deficient microorganism of the present invention is comparable to the level of pantothenate production by the control cells. Accordingly, the amount of pantothenate compound produced by the microbial population of the present invention exceeds 50% of the amount of pantothenate compound produced by the corresponding microbial population that is not deficient in sporulation when cultured under the same conditions, Preferably it exceeds 75%, more preferably it can exceed 100%. When cultured under the conditions described in Example 2, the amount of pantothenate compound produced by the microbial population of the present invention is 50% of the amount of pantothenate compound produced by the corresponding microbial population that is not deficient in sporulation. More than 75%, preferably more than 75%. When cultured under the conditions described in Example 3, the amount of pantothenate compound produced by the microbial population of the present invention is 50% of the amount of pantothenate compound produced by the corresponding microbial population that is not deficient in sporulation. It is preferred to exceed, preferably more than 75%, most preferably more than 100%. When cultured under the conditions described in Example 4, the amount of pantothenate compound produced by the microbial population of the present invention is 50% of the amount of pantothenate compound produced by the corresponding microbial population that is not deficient in sporulation. It is preferred to exceed, preferably more than 75%, most preferably more than 100%. When cultured under the conditions described in Example 5, the amount of pantothenate compound produced by the microbial population of the present invention is 50% of the amount of pantothenate compound produced by the corresponding microbial population that is not deficient in sporulation. It is preferred to exceed, preferably more than 75%, most preferably more than 100%.
「胞子形成を欠損していない対応する微生物」は、好ましくは低減したSigE機能または低減したspo0AおよびArbB機能を示すように改変されていない微生物である。例えば本発明の微生物がspoIIGA遺伝子に突然変異を有するならば、胞子形成を欠損していない対応する微生物は、spoIIGA遺伝子に突然変異を有さない以外は実質的に同一の微生物である。同じことが他の遺伝子の突然変異にもあてはまる。 A “corresponding microorganism that is not deficient in sporulation” is preferably a microorganism that has not been modified to exhibit reduced SigE function or reduced spo0A and ArbB function. For example, if the microorganism of the present invention has a mutation in the spoIIGA gene, the corresponding microorganism that is not deficient in sporulation is substantially the same microorganism except that it does not have a mutation in the spoIIGA gene. The same applies to mutations in other genes.
様々な方法でパントテネート化合物の過剰産生を達成できる。パントテネートを過剰産生するバチリススブチリス株の調製方法は、例えばWO01/21772、WO02/057474、およびWO02/061108に記載されている。パントテネート過剰産生微生物を得る一つの取り組みは、パントテネート生合成経路に関与する一つまたは複数の遺伝子を過剰発現させることである。「過剰発現した」または「過剰発現」という用語は、微生物の改変前に、または改変されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも高レベルでの遺伝子産物の発現を含む。一態様において本発明の微生物は、panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA、およびserA、ylmAならびにグリシン開裂経路に関与するgcv遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子を過剰発現する。 Overproduction of pantothenate compounds can be achieved in various ways. Methods for preparing B. subtilis strains that overproduce pantothenate are described, for example, in WO01 / 21772, WO02 / 057474, and WO02 / 061108. One approach to obtaining pantothenate overproducing microorganisms is to overexpress one or more genes involved in the pantothenate biosynthetic pathway. The term “overexpressed” or “overexpression” includes expression of the gene product at a level higher than that expressed in a comparable microorganism that has not been modified or in a comparable microorganism that has not been modified. In one aspect, the microorganism of the present invention is one selected from the group consisting of panB, panC, panD, panE, ilvB, ilvN, ilvC, ilvD, glyA, and serA, ylmA and a gcv gene involved in the glycine cleavage pathway or Overexpress multiple genes.
遺伝子の脱調節および/または少なくとも一つの遺伝子の過剰発現を含めるがそれに限定されるわけではない本明細書に記載する任意の方法により、微生物における遺伝子の過剰発現を実施できる。一態様において、微生物を遺伝子操作、例えば遺伝子工学により加工して、微生物の改変前に、または改変されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも大きなレベルの遺伝子産物を過剰発現させることができる。遺伝子操作には、例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多数のプロモーターを付加することによって、または発現が構成的となるように調節配列を除去することによって、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位を改変または修飾すること、染色体での特定遺伝子の位置を改変すること、リボソーム結合部位または転写終結因子のような特定遺伝子に隣接する核酸配列を変更すること、特定遺伝子のコピー数を増加させること、特定遺伝子の転写および/または特定遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質、例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなどを改変すること、あるいは当技術分野で慣例である、(例えばレプレッサータンパク質の発現を遮断するアンチセンス核酸分子を含めるがそれに限定されるわけではない)特定遺伝子の発現を脱調節する他の任意の通常の手段がありうるが、それに限定されるわけではない。適当なプロモーターの例は、Pveg、P15およびP26であるが、それに限定されるわけではない(Lee et al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180:57-65およびMoran et al., 1982, Mol. Gen. Genet. 186:339-46。 Overexpression of a gene in a microorganism can be performed by any method described herein including, but not limited to, deregulation of a gene and / or overexpression of at least one gene. In one embodiment, the microorganism can be processed by genetic engineering, such as genetic engineering, to overexpress a level of the gene product that is greater than that expressed in the comparable microorganism that has not been modified or that has not been modified. For genetic manipulation, for example, by adding a strong promoter, an inducible promoter or multiple promoters, or by removing regulatory sequences so that expression is constitutive, regulatory sequences associated with the expression of a particular gene Or change or modify the site, change the location of a specific gene in the chromosome, change the nucleic acid sequence adjacent to a specific gene, such as a ribosome binding site or transcription termination factor, increase the copy number of a specific gene Modifying proteins involved in transcription of specific genes and / or translation of specific gene products, such as regulatory proteins, suppressors, enhancers, transcriptional activators, etc., or are customary in the art (eg, repressors Antisense nucleus that blocks protein expression It includes molecules but not limited thereto) may be any conventional means express addition to deregulation of a specific gene, but is not limited thereto. Examples of suitable promoters are, but are not limited to, P veg , P 15 and P 26 (Lee et al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180: 57-65 and Moran et al. , 1982, Mol. Gen. Genet. 186: 339-46.
別の態様において、微生物の操作前に、または操作されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも大きいレベルの遺伝子産物を過剰発現するように微生物を物理的または環境的に操作できる。例えば、転写および/もしくは翻訳が増大または増加するように特定遺伝子の転写および/または特定遺伝子産物の翻訳を増加させることが公知であるか、そう推測される薬剤で微生物を処置でき、あるいはその薬剤の存在下で微生物を培養できる。または、転写および/または翻訳が増大または増加するように特定遺伝子の転写および/または特定遺伝子産物の翻訳を増加させるために、選択した温度で微生物を培養できる。 In another embodiment, the microorganism can be physically or environmentally manipulated to overexpress a level of the gene product prior to manipulation of the microorganism or greater than the level expressed in a comparable microorganism that has not been manipulated. For example, a microorganism can be treated with an agent known or suspected to increase transcription of a specific gene and / or translation of a specific gene product such that transcription and / or translation is increased or increased, or the agent Microorganisms can be cultured in the presence of Alternatively, the microorganism can be cultured at a selected temperature to increase transcription of a specific gene and / or translation of a specific gene product such that transcription and / or translation is increased or increased.
「脱調節された」または「脱調節」という用語は、微生物における遺伝子産物のレベルまたは活性が変更または改変されるような、その微生物における少なくとも一つの遺伝子の改変の変更を含む。好ましくは少なくとも一つの遺伝子は、遺伝子産物が増大または増加するように変更または改変される。 The term “deregulated” or “deregulated” includes alteration of alteration of at least one gene in the microorganism such that the level or activity of the gene product in the microorganism is altered or altered. Preferably at least one gene is altered or modified such that the gene product is increased or increased.
本発明はさらに、パントテネート化合物を過剰産生できる胞子形成欠損微生物を調製するための方法に関するものである。SigEの機能を調節する遺伝子における突然変異および場合によりspo0Aの機能の増加を含むように、パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を改変できる。本態様によれば、その方法は、
(a)パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を提供する工程、
(b)場合により微生物にDNA配列(例えばプロモーター)またはspo0Aの機能の増加を引き起こす突然変異を導入する工程、および
(c)胞子形成欠損微生物が得られるように工程(a)または(b)の微生物にSigEの機能の低減を引き起こす突然変異を導入する工程
を含む。
The present invention further relates to a method for preparing a sporulation-deficient microorganism capable of overproducing a pantothenate compound. Microorganisms that can overproduce pantothenate compounds can be modified to include mutations in genes that regulate SigE function and optionally increased spo0A function. According to this aspect, the method comprises:
(A) providing a microorganism capable of overproducing a pantothenate compound;
(B) optionally introducing a mutation that causes an increase in the function of a DNA sequence (eg promoter) or spo0A into the microorganism, and (c) in step (a) or (b) so as to obtain a sporulation-deficient microorganism. Introducing a mutation that causes a reduction in SigE function in the microorganism.
工程(b)および(c)の順序を入れ替えてもよい。 The order of steps (b) and (c) may be changed.
またはその方法は、
(a)パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を提供する工程、および
(b)胞子形成欠損微生物が得られるように工程(a)の微生物にspo0Aの機能の低減およびArbBの機能の低減を引き起こす突然変異を導入する工程
を含みうる。
Or that way
(A) providing a microorganism capable of overproducing a pantothenate compound, and (b) a mutation that causes the microorganism of step (a) to reduce spo0A function and ArbB function so as to obtain a sporulation-deficient microorganism. May be included.
別の態様において、パントテネート化合物の過剰産生をもたらす突然変異の実施前にsigE遺伝子の突然変異またはspo0A遺伝子およびarbB遺伝子の突然変異を導入してもよい。本態様によれば、その方法は、
(a)パントテネート化合物を過剰産生できない微生物を提供する工程、
(b)胞子形成欠損微生物が得られるように、工程(a)の微生物にSigE活性の低減を引き起こす突然変異を導入、または工程(a)の微生物にspo0A活性の低減およびAbrB活性の低減を引き起こす突然変異を導入する工程、ならびに
(c)パントテネート化合物を過剰産生できるように工程(b)で得られた胞子形成欠損微生物を改変する工程
を含む。
In another embodiment, sigE gene mutations or spo0A and arbB gene mutations may be introduced prior to performing mutations that result in overproduction of pantothenate compounds. According to this aspect, the method comprises:
(A) providing a microorganism that cannot overproduce pantothenate compounds;
(B) introducing a mutation that causes a decrease in SigE activity in the microorganism of step (a) or causing a decrease in spo0A activity and a decrease in AbrB activity in the microorganism of step (a) so as to obtain a sporulation-deficient microorganism And (c) modifying the sporulation-deficient microorganism obtained in step (b) so that the pantothenate compound can be overproduced.
本発明の工程(b)においてSigE活性の低減を引き起こす突然変異が導入されるならば、本方法は、工程(a)または(b)または(c)の微生物に、Spo0A機能の増加を起こすDNA配列(例えばプロモーター)または突然変異を導入する任意選択の工程を含みうる。 If a mutation that causes a reduction in SigE activity is introduced in step (b) of the present invention, the method will allow the microorganism of step (a) or (b) or (c) to have DNA causing an increase in SpoOA function. It may include an optional step of introducing a sequence (eg, a promoter) or mutation.
本発明の別の局面は、(a)パントテネート化合物が産生される条件で本発明の微生物を培養する工程、および(b)場合により細胞培養液からパントテネート化合物を回収する工程を含む、パントテネート化合物を製造するための方法である。 Another aspect of the present invention provides a pantothenate compound comprising: (a) culturing the microorganism of the present invention under conditions that produce a pantothenate compound; and (b) optionally recovering the pantothenate compound from a cell culture medium. It is a method for manufacturing.
本発明の方法は、パントテネート化合物が産生される条件で改変微生物を培養する工程を含む。「培養する」という用語は、本発明の生きた微生物を維持および/または増殖させることを含む。一態様において、液体培地で本発明の微生物を培養する。別の態様において、固体培地または半固体培地で微生物を培養する。好ましくは微生物の維持および/もしくは増殖に必須または有益な栄養素を含む液体培地で本発明の微生物を培養する。そのような栄養素には、例えば豆粉もしくは穀物粉、デンプン、糖、糖アルコール、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸およびアルコールのような複合糖質である炭素源または炭素基質;例えば穀物、豆、および塊茎由来の植物性タンパク質;ペプトン、ペプチドおよびアミノ酸、ならびに肉と、乳と、ペプトン、肉エキスおよびカゼイン加水分解物のような動物副産物とのような動物源由来のタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸;尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムのような無機窒素源;例えばリン酸、そのナトリウム塩およびカリウム塩であるリン源;例えばマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデンおよび/またはコバルト塩である微量元素;のみならずアミノ酸、ビタミン、増殖促進剤などのような増殖因子があるが、それに限定されるわけではない。 The method of the present invention includes the step of culturing the modified microorganism under conditions that produce a pantothenate compound. The term “culturing” includes maintaining and / or growing a living microorganism of the present invention. In one embodiment, the microorganism of the present invention is cultured in a liquid medium. In another embodiment, the microorganism is cultured in a solid or semi-solid medium. The microorganism of the present invention is preferably cultured in a liquid medium containing nutrients essential or beneficial for the maintenance and / or growth of the microorganism. Such nutrients include carbon sources or carbon substrates that are complex carbohydrates such as, for example, bean flour or cereal flour, starch, sugar, sugar alcohol, hydrocarbons, oils, fats, fatty acids, organic acids and alcohols; Plant proteins from peas, beans, and tubers; proteins, peptides and peptides derived from animal sources such as peptone, peptides and amino acids, and meat and milk and animal by-products such as peptone, meat extract and casein hydrolysates Amino acids; inorganic nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate and ammonium phosphate; phosphorous sources such as phosphoric acid, its sodium and potassium salts; eg magnesium, iron, manganese, calcium, copper, zinc, boron Trace elements, molybdenum and / or cobalt salts Amino acid not only vitamins, but there is a growth factor, such as growth-promoting agents, but are not limited to it.
微生物は制御されたpHで好ましくは培養される。一態様において、pH6.0から8.5の間で、さらに好ましくは約7のpHで微生物を培養する。当業者に公知の任意の方法により所望のpHを維持できる。 The microorganism is preferably cultured at a controlled pH. In one embodiment, the microorganism is cultured at a pH between 6.0 and 8.5, more preferably at a pH of about 7. The desired pH can be maintained by any method known to those skilled in the art.
好ましくは、制御された通気および制御された温度で微生物をさらに培養する。一態様において制御された温度は、15から70℃の間を含み、好ましくは温度は20から55℃の間、さらに好ましくは30から45℃の間または30から50℃の間である。 Preferably, the microorganism is further cultured with controlled aeration and controlled temperature. In one aspect, the controlled temperature comprises between 15 and 70 ° C, preferably the temperature is between 20 and 55 ° C, more preferably between 30 and 45 ° C or between 30 and 50 ° C.
液体培地で連続的または間欠的のどちらかで、静置培養、試験管培養、振盪培養、通気撹拌培養または発酵のような通常の培養法により微生物を培養できる。好ましくは、発酵装置で微生物を培養する。本発明の発酵法には、回分培養法、流加培養法および連続培養法の発酵がある。そのような多様なプロセスが開発され、当技術分野で周知である。 Microorganisms can be cultured by conventional culture methods such as stationary culture, test tube culture, shaking culture, aeration and agitation culture or fermentation, either continuously or intermittently in a liquid medium. Preferably, the microorganism is cultured in a fermentation apparatus. The fermentation methods of the present invention include batch culture methods, fed-batch culture methods and continuous culture methods. A variety of such processes have been developed and are well known in the art.
所望の量のパントテネート化合物を製造するのに十分な時間だけ培養を普通は継続する。 Incubation is usually continued for a time sufficient to produce the desired amount of pantothenate compound.
本発明の別の局面において本方法は、パントテネート化合物を回収する工程をさらに含む。「回収する」という用語は、培養液から化合物を単離、抽出、採取、分離または精製することを含む。通常の樹脂を用いた処理、通常の吸着剤を用いた処理、pHの変更、溶媒抽出、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などを含めるが、それに限定されるわけではない当技術分野で公知の任意の通常の単離または精製法により化合物の単離を実施できる。例えば、まず培養物から微生物を除去することによって培養液からパントテネート化合物を回収できる。次に培養液に陽イオン交換樹脂内または樹脂上を通過させ、望ましくない陽イオンを除去し、次に陰イオン交換樹脂内または樹脂上を通過させて、望ましくない無機陰イオンと、関心対象の化合物、例えばパントテネートよりも強い酸性度を有する有機酸とを除去する。結果としてもたらされたパントテネートを次に本明細書に記載するように塩に転換できる。 In another aspect of the invention, the method further comprises recovering the pantothenate compound. The term “recovering” includes isolating, extracting, collecting, separating or purifying the compound from the culture medium. Including, but not limited to, treatment with ordinary resins, treatment with ordinary adsorbents, pH change, solvent extraction, dialysis, filtration, concentration, crystallization, recrystallization, pH adjustment, lyophilization, etc. The isolation of the compound can be performed by any conventional isolation or purification method known in the art. For example, the pantothenate compound can be recovered from the culture solution by first removing the microorganisms from the culture. The culture is then passed in or on the cation exchange resin to remove unwanted cations and then in or on the anion exchange resin to remove unwanted inorganic anions and the Compounds, such as organic acids that have a stronger acidity than pantothenate, are removed. The resulting pantothenate can then be converted to a salt as described herein.
化合物は、通常は結果としてもたらされる調製物が実質的に他の化合物を有さない場合に「単離」されている。一態様において調製物は、所望の化合物の純度が(乾燥重量で)約80%を超え(例えば培地、成分または発酵副産物全てが約20%未満)、さらに好ましくは約90%を超える、なおさらに好ましくは約95%を超える、かつ最も好ましくは約98〜99%の超える所望の化合物の純度を有する。 A compound is typically “isolated” when the resulting preparation is substantially free of other compounds. In one embodiment, the preparation has a purity of the desired compound of greater than about 80% (by dry weight) (eg, less than about 20% of all media, components, or fermentation byproducts), more preferably greater than about 90%, still more Preferably the purity of the desired compound is greater than about 95%, and most preferably greater than about 98-99%.
別の態様において所望の化合物は、微生物からも培養物からも精製されない。産物の供給源として培養物または培養上清全体を使用できる。具体的な態様において培養物または培養上清は、修飾なしに使用される。さらなる実施形態において、培養物または培養上清は濃縮、乾燥および/または凍結乾燥される。 In another embodiment, the desired compound is not purified from the microorganism or from the culture. The culture or the entire culture supernatant can be used as a source of product. In a specific embodiment, the culture or culture supernatant is used without modification. In further embodiments, the culture or culture supernatant is concentrated, dried and / or lyophilized.
本明細書に記載する本発明の様々な態様を相互に組み合わせてもよい。 Various aspects of the invention described herein may be combined with one another.
以下の非限定的な実施例が、本発明をさらに例示する。 The following non-limiting examples further illustrate the invention.
実施例
一般的な方法
株とプラスミド。本発明のバチルス スブチリス株は、B.スブチリス菌168(trpC2)の原栄養誘導体である1A747株(Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、Ohio 43210、米国)から得られた。プラスミドpC194(GeneBank M19465、Cat#1E17 Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、Ohio 43210、米国)からクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)カセットを得た。RB50::[pRF69]::[pRF93]由来SPO1−15プロモーター(Perkins et al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22:8-18)を含むプラスミドpX12(Humbelin et al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22:1-7)の誘導体であるプラスミドpX123roDTD−SPO1−15から、B.スブチリスバクテリオファージSPO1のP15プロモーター(Lee et al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180:57-65)を得た。SWV215株[trpC2 pheA1 spo0A::kan](Xu and Strauch, 1996, J. Bacteriol. 178:4319-4322)、BHI株[trpC2 pheAl spo0HΔHindIII−EcoRI::cat](参考文献Healy et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:477-487においてBHIはBH100の誘導体である)、650株[trpC2 ilvB2 leuB16 spoIIAABC::cat](Pragai et al., 2004, J Bacteriol. 186:1182-1190)、731株[trpC2 spoIIIG::ermC](Partridge and Errington, 1993, Mol. Microbiol. 8:945-955)、および901株[trpC2 spoIIGA::aphA−3](Wu and Errington, 1994, Science 264:572-575)から胞子形成遺伝子における突然変異体を得た。SWV119株[trpC2 pheA1 abrB::tet](Xu and Strauch、1996)からabrB遺伝子における突然変異体を得た。spo0A遺伝子の過剰発現のために、AH1763株[trpC2 metC3 spo0A::neo amyE::Pspac spo0A(cat)](Henriques, A、個人的な情報交換)からPspacspo0A融合体を得た。
Examples General methods Strains and plasmids. The Bacillus subtilis strain of the present invention is a B. subtilis strain. It was obtained from strain 1A747 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, USA), which is a prototrophic derivative of Subtilis 168 (trpC2). A chloramphenicol resistance gene (cat) cassette was obtained from plasmid pC194 (GeneBank M19465, Cat # 1E17 Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, USA). Plasmid pX12 (Humbelin et al., 1999, containing the RB50 :: [pRF69] :: [pRF93] -derived SPO1-15 promoter (Perkins et al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22: 8-18) From plasmid pX123roDTD-SPO1-15, which is a derivative of J. Ind. Microbiol. Biotech. 22: 1-7) P 15 promoter of subtilis bacteriophage SPO1 (.. Lee et al, 1980, Mol Gen. Genet 180:. 57-65) was obtained. SWV215 strain [trpC2 pheA1 spo0A :: kan] (Xu and Strauch, 1996, J. Bacteriol. 178: 4319-4322), BHI strain [trpC2 pheAl spo0HΔHindIII-EcoRI :: cat] (reference document Healy et al., 1991) Mol. Microbiol. 5: 477-487, BHI is a derivative of BH100), 650 strain [trpC2 ilvB2 leuB16 spoIIABC :: cat] (Pragai et al., 2004, J Bacteriol. 186: 1182-1190), 731 strain [TrpC2 spoIIIG :: ermC] (Partridge and Errington, 1993, Mol. Microbiol. 8: 945-955), and 901 strain [trpC2 spoIIGA :: aphA-3] (Wu and Errington, 1994, Science 264: 572-575 ) Obtained a mutant in the sporulation gene. A mutant in the abrB gene was obtained from the strain SWV119 [trpC2 pheA1 abrB :: tet] (Xu and Strauch, 1996). Due to the overexpression of the spo0A gene, a Pspac spo0A fusion was obtained from the AH1763 strain [trpC2 metC3 spo0A :: neo amyE :: P spac spo0A (cat)] (Henriques, A, personal information exchange).
培地。B.スブチリス用の標準最少培地は1×Spizizen塩類、0.04%グルタミン酸ナトリウム、および0.5%グルコースを含有する。標準固体完全培地は、トリプトン血液寒天培地(TBAB、Difco)である。標準液体完全培地は、子ウシインフュージョン−酵母エキス培地(VY)である。これらの培地の組成を以下に記載する:
TBAB培地:Difcoトリプトン血液寒天培養基剤(カタログ#0232)33g、水1L。オートクレーブ滅菌。
VY培地:Difco子ウシインフュージョン培地(カタログ#0344)25g、Difco酵母エキス(カタログ#0127)5g、水1L。オートクレーブ滅菌。
最少培地(MM):10×Spizizen塩類100ml;50%グルコース10ml;40%グルタミン酸ナトリウム1ml、水で全量1Lとする。
10×Spizizen塩類:K2HPO4140g;(NH4)2SO420g;KH2PO460g;クエン酸Na3・2H2Oを10g;MgSO4・7H2Oを2g;水で全量1Lとする。
P培地:10×PAM100ml;10×Spizizen塩類100ml;50%グルコース10ml;滅菌蒸留水790ml。
P寒天培地:10×PAM100ml;10×Spizizen塩類100ml;50%グルコース10ml;寒天15gを含有する滅菌蒸留水790ml。
10×パントテネートアッセイ培地(10×PAM):Difcoパントテネートアッセイ培地(カタログ#260410)73g、水1L。オートクレーブ滅菌。
10×VFB最少培地(10×VFB MM):グルタミン酸Na2.5g;KH2PO415.7g;K2HPO415.7g;Na2HPO4・12H2Oを27.4g;NH4Clを40g;クエン酸1g;(NH4)2SO468g;水で全量1Lとする。
微量元素溶液:MnSO4・H2Oを1.4g;CoCl2・6H2Oを0.4g;(NH4)6Mo7O24・4H2Oを0.15g;AlCl3・6H2Oを0.1g;CuCl2・2H2Oを0.075g;水で全量200mlとする。
Fe溶液:FeSO4.7H2Oを0.21g;水で全量10mlとする。
CaCl2溶液:CaCl2・2H2Oを15.6g;水で全量500mlとする。
Mg/Zn溶液:MgSO4・7H2Oを100g;ZnSO4・7H2Oを0.4g;水で全量200mlとする。
VFB MM培地:10×VFB MM100ml;50%グルコース10ml;微量元素溶液2ml;Fe溶液2ml;CaCl2溶液2ml;Mg/Zn溶液2ml;滅菌蒸留水882ml。
VFB MMGT培地:10×VFB MM100ml;0.5Mトリス(pH6.8)100ml;50%グルコース44ml;微量元素溶液2ml;Fe溶液2ml;CaCl2溶液2ml;Mg/Zn溶液2ml;滅菌蒸留水748ml。
VF発酵回分培養用培地:所定の位置で溶液を滅菌:グルタミン酸ナトリウム0.75g;KH2PO44.71g;K2HPO44.71g;Na2HPO4・12H2Oを8.23g;NH4Clを0.23g;(NH4)2SO41.41g;酵母エキス(Merck)11.77g;Basildon消泡剤0.2ml;全量1L。
オートクレーブ後の溶液を発酵装置に入れる:グルコース・H2Oを27.3g;全量1L。
フィルターろ過滅菌した溶液を発酵装置に入れる:微量元素溶液2ml;CaCl2溶液2ml;Mg/Zn溶液2ml;Fe溶液2ml;全量1L。
VF発酵流加用培地:グルコース・H2Oを660g;全量1L。オートクレーブ滅菌。MgSO4・7H2Oを2g;MnSO4・H2Oを14.6mg;ZnSO4・H2Oを4mg;全量1L(オートクレーブ滅菌)を加える。
Culture medium. B. The standard minimal medium for Subtilis contains 1 × Spizizen salts, 0.04% sodium glutamate, and 0.5% glucose. Standard solid complete medium is tryptone blood agar (TBAB, Difco). The standard liquid complete medium is calf infusion-yeast extract medium (VY). The composition of these media is described below:
TBAB medium: 33 g of Difco tryptone blood agar culture base (catalog # 0232), 1 L of water. Autoclave sterilization.
VY medium: 25 g of Difco calf infusion medium (catalog # 0344), 5 g of Difco yeast extract (catalog # 0127), 1 L of water. Autoclave sterilization.
Minimal medium (MM): 100 ml of 10 × Spizizen salts; 10 ml of 50% glucose; 1 ml of 40% sodium glutamate;
10 × Spizizen salts: 140 g of K 2 HPO 4 ; 20 g of (NH 4 ) 2 SO 4 ; 60 g of KH 2 PO 4 ; 10 g of Na 3 .2H 2 O citrate; 2 g of MgSO 4 .7H 2 O; And
P medium: 10 × PAM 100 ml; 10 × Spizizen salts 100 ml; 50% glucose 10 ml; sterile distilled water 790 ml.
P agar medium: 10 × PAM 100 ml; 10 × Spizizen salts 100 ml; 50% glucose 10 ml; 790 ml sterile distilled water containing 15 g agar.
10 × Pantothenate Assay Medium (10 × PAM): 73 g Difco Pantothenate Assay Medium (Catalog # 260410), 1 L water. Autoclave sterilization.
10 × VFB minimal medium (10 × VFB MM): Na glutamate 2.5 g; KH 2 PO 4 15.7 g; K 2 HPO 4 15.7 g; Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 27.4 g; NH 4 Cl 40 g; citric acid 1 g; (NH 4) 2 SO 4 68 g;
Trace element solution: 1.4 g of MnSO 4 · H 2 O; 0.4 g of CoCl 2 · 6H 2 O; 0.15 g of (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O; AlCl 3 · 6H 2 O 0.1 g; CuCl 2 .2H 2 O 0.075 g;
Fe solution: FeSO 4 . 7H 2 O 0.21 g; make up to 10 ml with water.
CaCl 2 solution: 15.6 g of CaCl 2 .2H 2 O; make up to 500 ml with water.
Mg / Zn solution: 100 g of MgSO 4 .7H 2 O; 0.4 g of ZnSO 4 .7H 2 O;
VFB MM medium: 10 × VFB MM 100 ml; 50% glucose 10 ml; trace element solution 2 ml; Fe solution 2 ml; CaCl 2 solution 2 ml; Mg / Zn solution 2 ml; sterile distilled water 882 ml.
VFB MMGT medium: 10 × VFB MM 100 ml; 0.5 M Tris (pH 6.8) 100 ml; 50% glucose 44 ml; trace element solution 2 ml; Fe solution 2 ml; CaCl 2 solution 2 ml; Mg / Zn solution 2 ml;
VF fermentation batch culture medium: Sterilize solution in place: sodium glutamate 0.75 g; KH 2 PO 4 4.71 g; K 2 HPO 4 4.71 g; Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 8.23 g; 0.23 g of NH 4 Cl; 1.41 g of (NH 4 ) 2 SO 4 ; 11.77 g of yeast extract (Merck); 0.2 ml of Basildon antifoaming agent;
The solution after autoclaving is put into a fermenter: 27.3 g of glucose / H 2 O;
The filter sterilized solution is placed in the fermentation apparatus: 2 ml of trace element solution; 2 ml of CaCl 2 solution; 2 ml of Mg / Zn solution; 2 ml of Fe solution;
VF fermentation fed medium: 660 g of glucose / H 2 O; Autoclave sterilization. 2 g of MgSO 4 .7H 2 O; 14.6 mg of MnSO 4 .H 2 O; 4 mg of ZnSO 4 .H 2 O; 1 L in total (autoclaved) is added.
パントテネートアッセイ。三つの生物学的方法と一つの物理学的(HPLC)方法でパントテネートをアッセイした:
生物学的アッセイI−平板バイオアッセイ: 公知の方法を使用したサルモネラチフムリウム(Salmonella typhimurium)由来の指示株を用いてパントテネートを寒天平板でアッセイした。DM3(panC355)株(D. Downs、ウィスコンシン大学マジソン校、マジソン、ウィスコンシン州、米国)は、パントテネートに対してのみ応答する。標準的なペトリ皿にボトム寒天(bottom agar)として使用したP寒天培地20mlの上に細胞107個/mlのS.チフムリウムDM3(panC355)指示株および40μg/mlの2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド(Fluka;カタログ#93140)を含有するP寒天培地10mlを重層した。滅菌ピペットチップを使用してTBAB寒天上に増殖した単一コロニーからバイオアッセイ用P寒天平板に細菌を移した。37℃で一晩インキュベートした後に、約10mg/lを超えるPanを産生したB.スブチリスコロニー周囲にS.チフムリウムDM3の観察できる紫色のハロー(halo)が形成した。ハローのサイズはB.スブチリス株によるPan産生と相関した。
生物学的アッセイII−試験管バイオアッセイ:試験管培養物を使用して液体状態でパントテネートをアッセイした。B.スブチリス培養物をアッセイするために、上清をろ過滅菌し、試験管に1×パントテネートアッセイ培地(PAM)で希釈液を調製した。希釈液の総体積を5.0mlとした。これらの希釈液を入れた試験管にDM3指示株保存液を(1×PAMで)200倍に希釈したもの0.1mlを加えた。次にローラドラム型振盪装置で37℃で18〜24時間試験管を培養した。600nmで濁度の読み取りを行い(OD600)、既知量のパントテネートの標準曲線と比較した。具体的には、基準パントテネートを0.8、4、20、50、および100μg/lのレベルに希釈し、各希釈液に上記のように調製した指示株を加え、37℃で18〜24時間後(未知試料と同じインキュベーション時間)に濁度を測定することによって標準曲線を調製した。対数回帰式を作るために標準曲線の直線部分を使用した。次にこの式を使用して希釈した試料のOD600値から未知試料中のパントテネート濃度を計算した。
生物学的アッセイIII−96穴マイクロタイタープレートバイオアッセイ:96穴マイクロタイタープレート形式を使用した液体状態でもパントテネートをアッセイした。96穴マイクロタイタープレートの各穴に細胞5.5×105個/mlのS.チフムリウムDM3を含有するパントテネートアッセイ培地(PAM)180μlを入れた。B.スブチリス培養物をアッセイするために、ろ過滅菌した培養上清60μlを第1列、B〜H行の穴に加えた。混合後、試料60μlを第2列の次の穴に移した。これらの4倍希釈工程を第12列まで繰り返した。第12列で試料を混合後、60μlを捨て、このようにして各穴は試料180μlを含んでいた。接着フィルムをプレートにかぶせ、蒸発を避け、300rpmで培養物を撹拌しながら37℃で17hインキュベートした。濁度の読み取りを600nmで行い、既知量のパントテネート(Pan)の標準曲線と比較した。Pan標準液(100mg/ml)60μlを各マイクロタイタープレートの第1列A行の穴に加えることによって標準曲線を調製した。未知試料について上に記載したように、希釈、インキュベーションおよびPan標準液の濁度の測定を行った。
HPLCアッセイ:恒温機能付きオートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えるAgilent 1100 HPLCシステムを用いてPhenomenex LUNA C8カラムで試料のクロマトグラフィーを実施した。カラム寸法は、150×4.6mm、粒子サイズは5ミクロンである。カラム温度を20℃に一定に保った。移動相は、0.1%酢酸(A)とメタノール(B)との混液である。15分間で1%Bから45%Bへの勾配溶出を適用する。流速は1ml/minである。220nmでのUV吸収からパントテネートをモニターした。パントテネートは約9.6分に溶出する。この方法のキャリブレーション範囲は、パントテネート1〜100mg/lである。
Pantothenate assay. Pantothenate was assayed by three biological methods and one physical (HPLC) method:
Biological Assay I-Plate Bioassay: Pantothenate was assayed on an agar plate using an indicator strain from Salmonella typhimurium using known methods. The DM3 (panC355) strain (D. Downs, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wis., USA) responds only to pantothenate. 10 7 cells / ml of S. pylori on 20 ml of P agar medium used as bottom agar in a standard Petri dish. 10 ml of P agar medium containing Tyhumulium DM3 (panC355) indicator strain and 40 μg / ml 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Fluka; catalog # 93140) was overlaid. Bacteria were transferred from single colonies grown on TBAB agar to a bioassay P agar plate using a sterile pipette tip. B. produced more than about 10 mg / l of Pan after overnight incubation at 37 ° C. Around S. subtilis colonies An observable purple halo formed of Tyhumulium DM3. The size of the halo is B. Correlated with Pan production by subtilis strains.
Biological Assay II-Tube Bioassay: Pantothenate was assayed in a liquid state using a tube culture. B. To assay a subtilis culture, the supernatant was sterilized by filtration and a dilution was prepared in 1 × pantothenate assay medium (PAM) in a test tube. The total volume of the diluted solution was 5.0 ml. 0.1 ml of DM3 indicator stock solution diluted 200-fold (in 1 × PAM) was added to the test tube containing these dilutions. Next, the test tube was cultured at 37 ° C. for 18 to 24 hours using a roller drum type shaker. Turbidity readings were taken at 600 nm (OD 600 ) and compared to a standard curve of known amounts of pantothenate. Specifically, the standard pantothenate was diluted to levels of 0.8, 4, 20, 50, and 100 μg / l, and the indicator strain prepared as described above was added to each diluted solution, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 18 to 24 hours. A standard curve was prepared by measuring turbidity later (same incubation time as unknown sample). The linear portion of the standard curve was used to create a log regression equation. The pantothenate concentration in the unknown sample was then calculated from the OD 600 value of the diluted sample using this equation.
Biological Assay III-96-well Microtiter Plate Bioassay: Pantothenate was also assayed in liquid state using a 96-well microtiter plate format. In each well of a 96-well microtiter plate, 5.5 × 10 5 cells / ml of S.P. 180 μl of pantothenate assay medium (PAM) containing Tyhumulium DM3 was added. B. To assay the subtilis culture, 60 μl of filter sterilized culture supernatant was added to the wells in the first row, rows BH. After mixing, 60 μl of sample was transferred to the next hole in the second row. These 4-fold dilution steps were repeated up to the 12th column. After mixing the sample in the twelfth row, 60 μl was discarded, thus each hole contained 180 μl of sample. An adhesive film was placed on the plate to avoid evaporation and the culture was incubated at 37 ° C. for 17 h with stirring at 300 rpm. Turbidity readings were taken at 600 nm and compared to a standard curve of known amounts of pantothenate (Pan). A standard curve was prepared by adding 60 μl of Pan standard solution (100 mg / ml) to the hole in row 1 row A of each microtiter plate. Dilution, incubation and Pan standard turbidity measurements were performed as described above for unknown samples.
HPLC assay: Samples were chromatographed on a Phenomenex LUNA C8 column using an Agilent 1100 HPLC system equipped with a thermostat autosampler and a diode array detector. The column dimensions are 150 x 4.6 mm and the particle size is 5 microns. The column temperature was kept constant at 20 ° C. The mobile phase is a mixture of 0.1% acetic acid (A) and methanol (B). Apply gradient elution from 1% B to 45% B over 15 minutes. The flow rate is 1 ml / min. Pantothenate was monitored from UV absorption at 220 nm. Pantothenate elutes at about 9.6 minutes. The calibration range for this method is 1-100 mg / l pantothenate.
分子的手法および遺伝的手法。標準的な遺伝的手法および分子生物学的手法は、当技術分野において一般的に公知であり、以前に記載されている。DNA形質転換、PBS1普遍形質導入、および他の標準的なB.スブチリスの遺伝的手法も当技術分野で一般的に公知であり、以前に記載されている(HarwoodおよびCutting、1992)。 Molecular and genetic methods. Standard genetic and molecular biology techniques are generally known in the art and have been previously described. DNA transformation, PBS1 universal transduction, and other standard B.P. Subtilis genetic techniques are also generally known in the art and have been previously described (Harwood and Cutting, 1992).
胞子形成アッセイ。B.スブチリス培養物から試料1mlを採取し滅菌蒸留水で10倍希釈系列を調製した。80℃で20分間熱処理後にTBAB寒天平板に入れ、37℃で20hインキュベートしてから、オリジナルの培養物1ml中の「熱耐性」コロニー形成単位(cfu)の数を決定した。熱耐性胞子の力価(cfu/ml)を熱処理前の細菌細胞の力価(cfu/ml)で割ることによって胞子形成頻度を計算した。 Sporulation assay. B. A 1 ml sample was taken from the subtilis culture and a 10-fold dilution series was prepared with sterile distilled water. After heat treatment at 80 ° C. for 20 minutes, they were placed on TBAB agar plates and incubated at 37 ° C. for 20 h before determining the number of “heat-resistant” colony forming units (cfu) in 1 ml of the original culture. The frequency of spore formation was calculated by dividing the titer of heat-resistant spores (cfu / ml) by the titer of bacterial cells before heat treatment (cfu / ml).
発酵。グルコース/塩溶液を含むVF発酵回分培養用培地1.4リットルを初めに含む撹拌発酵槽、例えばBIOFLO 3000 New Brunswickの2リットル容器でパントテネート産生株を増殖させた。NBS Biocommand 32市販ソフトウェア(New Brunswick Scientific Co., Inc.、エジソン、ニュージャージー州、米国)でコンピュータ制御を行った;データ収集およびグルコース流加の制御にLucullusソフトウェア(Biospektra AG、シュリーレン、スイス)を使用した。 fermentation. Pantothenate producing strains were grown in a stirred fermentor initially containing 1.4 liters of VF fermentation batch culture medium containing glucose / salt solution, for example, a 2 liter container of BIOFLO 3000 New Brunswick. Computer controlled with NBS Biocommand 32 commercial software (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, USA); using Lucullus software (Biospektra AG, Schlieren, Switzerland) to control data collection and glucose feed did.
発酵用の植菌を調製するために、二回の種培養プロトコルを使用した。第一の種は、10g/リットルのソルビトールを含有するVY培地25mlに凍結細菌保存培養液50μlを植菌し、培養物を37℃で6時間増殖させることからなる。次に、10g/リットルのソルビトールを含有するVY発酵回分培養用培地60ml(グルコースなし)に植菌するために1ODの細胞を使用し、この第二の種を37℃で8〜12時間増殖させた。この第二の種を発酵容器に植菌するために使用し、植菌の量は通常、初発培地体積の4〜5%である。細菌をVY培地で対数増殖後期(OD600=0.8〜1.0)まで増殖させ、滅菌グリセロールを終濃度20%まで添加し、次に1mlずつにした試料をドライアイスで凍結させ、凍結した細菌を−80℃で貯蔵することによって凍結細菌保存液を調製した。 Two seed culture protocols were used to prepare the inoculum for fermentation. The first species consists of inoculating 50 μl of a frozen bacterial stock culture in 25 ml of VY medium containing 10 g / liter sorbitol and allowing the culture to grow at 37 ° C. for 6 hours. Next, 1 OD cells were used to inoculate 60 ml of VY fermentation batch culture medium (without glucose) containing 10 g / liter sorbitol, and this second species was grown at 37 ° C. for 8-12 hours. It was. This second species is used to inoculate the fermentation vessel, and the amount of inoculation is typically 4-5% of the initial media volume. Bacteria are grown in VY medium until late logarithmic growth (OD 600 = 0.8-1.0), sterilized glycerol is added to a final concentration of 20%, then 1 ml aliquots are frozen on dry ice and frozen Frozen bacteria stock solutions were prepared by storing the resulting bacteria at −80 ° C.
発酵の際に、水酸化アンモニウム溶液(28%水溶液)を自動的に添加することでリアクター中のpHを6.8の一定に保った。発酵温度を39℃とした。撹拌装置を自動的に(400rpmから1000rpmの範囲で)工程調節し、手動で通気速度を1〜2vvmに維持することによって溶存酸素(pO2)の最低濃度15%を達成した。消泡剤(Basildon)を随時手動で加えた。 During the fermentation, the pH in the reactor was kept constant at 6.8 by automatically adding ammonium hydroxide solution (28% aqueous solution). The fermentation temperature was 39 ° C. The minimum concentration of dissolved oxygen (pO 2 ) of 15% was achieved by automatically adjusting the stirrer (in the range of 400 rpm to 1000 rpm) and manually maintaining the aeration rate at 1-2 vvm. Antifoam (Basildon) was added manually at any time.
発酵は回分培養プロセスでありえるが、好ましくは糖質が制限された流加培養プロセスである。したがって、通常はプロセス時間6〜8時間後の状況である初発グルコースの消費後に規定のVF発酵流加用溶液(上記参照)をリアクターに供給した。そのとき、14g/hの速度で流加用溶液の定常添加を開始した。 Fermentation can be a batch culture process, but is preferably a fed-batch process with limited carbohydrates. Therefore, the prescribed VF fermentation fed-batch solution (see above) was fed into the reactor after consumption of the initial glucose, which is usually the situation after 6-8 hours of process time. At that time, steady addition of the feed solution was started at a rate of 14 g / h.
実施例1
本実施例は、B.スブチリスのパントテネート過剰産生株の構築について記述する。
Example 1
In this embodiment, B.I. Describes the construction of a pantothenate overproducing strain of Subtilis.
B.スブチリス株PA12
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、B.スブチリス原栄養菌株1A747のpanBCDオペロンのプロモーター領域における欠失突然変異を発生させた。その突然変異ではbirAとpanBの間の215bp長のヌクレオチド領域をスタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)(GeneBank M58515)由来のクロラムフェニコール耐性(cat)カセットに交換した。これを行うために、pBR322プラスミド(GeneBank J01749)のNheI部位とClaI部位の間に、panBの転写方向と逆方向にcatカセットをまず導入した。次に、二つのPCR断片の「アーム」を発生させた:製造業者(Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science)が説明するように40mM dNTPを1μl、10×緩衝液を5μlおよびPCR酵素(TaqおよびTgo)を0.75μlを含有する反応体積50μlに溶かした1A747染色体DNA0.1μgに、プライマーpanB/up2/for/R1およびpanB/up2/rev/ClaIまたはプライマーpanB/down2/for/NheIおよびpanB/down2/rev/Bam (表1)の100mM溶液0.2μlを加えた。アニーリング温度58℃および伸長時間60秒を使用して30サイクルにわたりPCR反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれF1およびF2と呼ぶ断片を精製し、それぞれ(F1では)EcoRI部位とClaI部位の間、および(F2では)NheIとBamHIの間に連続的に挿入を行った。連結したDNAを形質転換により大腸菌(E. coli)TOP10細胞(Invitrogen)に導入し、濃度100μg/mlでアンピシリン耐性について選択を行った。この結果として大腸菌プラスミドpPA5がもたらされた。次に、DNA形質転換によりB.スブチリス1A747の染色体にΔpanBp::cat欠失カセットを導入し、5μg/mlクロラムフェニコール(Cm)を含有するTBAB寒天平板で標準条件を用いてクロラムフェニコール耐性(Cmr)について選択を行った。panBプロモーター領域に欠失を含む単一Cmrコロニーを単離し、PA1(ΔpanBp::cat)と名付けた。予想どおりPA1も最少培地での増殖にパントテネートを要求するパントテネート栄養要求株(Pan-)であった。panB/up2/for/R1プライマーおよびpanB/down2/rev/Bamプライマー(表1)を使用して、再び標準的な反応条件を用いた診断PCRで欠失突然変異を確認した。
B. Subtilis strain PA12
Using the polymerase chain reaction (PCR), A deletion mutation in the promoter region of the panBCD operon of Subtilis prototrophic strain 1A747 was generated. In that mutation, the 215 bp long nucleotide region between birA and panB was replaced with a chloramphenicol resistance (cat) cassette from Staphylococcus aureus (GeneBank M58515). In order to do this, a cat cassette was first introduced between the NheI and ClaI sites of the pBR322 plasmid (GeneBank J01749) in the direction opposite to the transcription direction of panB. Next, “arms” of two PCR fragments were generated: 1 μl of 40 mM dNTP, 5 μl of 10 × buffer and PCR enzyme (Taq) as described by the manufacturer (Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science). And Tgo) in 0.1 μg of 1A747 chromosomal DNA in a reaction volume of 50 μl containing 0.75 μl, primers panB / up2 / for / R1 and panB / up2 / rev / ClaI or primers panB / down2 / for / NheI and panB 0.2 μl of a 100 mM solution of / down2 / rev / Bam (Table 1) was added. The PCR reaction was performed for 30 cycles using an annealing temperature of 58 ° C. and an extension time of 60 seconds. The resulting fragments, called F1 and F2, respectively, were purified and sequential insertions were made between EcoRI and ClaI sites (in F1) and between NheI and BamHI (in F2), respectively. The ligated DNA was introduced into E. coli TOP10 cells (Invitrogen) by transformation and selected for ampicillin resistance at a concentration of 100 μg / ml. This resulted in the E. coli plasmid pPA5. Next, by B. Select for chloramphenicol resistance (Cm r ) using standard conditions on a TBAB agar plate containing a ΔpanB p :: cat deletion cassette into the subtilis 1A747 chromosome and containing 5 μg / ml chloramphenicol (Cm) Went. A single Cm r colony containing a deletion in the panB promoter region was isolated and named PA1 (ΔpanB p :: cat). As expected, PA1 was also a pantothenate auxotroph (Pan − ) that required pantothenate for growth on minimal medium. Using the panB / up2 / for / R1 primer and the panB / down2 / rev / Bam primer (Table 1), the deletion mutation was again confirmed by diagnostic PCR using standard reaction conditions.
次の工程は、panB遺伝子上流に強力な構成的プロモーターを導入することであった。B.スブチリスのSP01バクテリオファージ由来のP15およびP26(Leeら、1980)を含めた任意の数のそのようなプロモーターが文献に記載されている。panBのリボソーム結合部位(RBS)の上流にP15を含むDNA断片を発生させるためにロングフランキングホモロジーポリメラーゼ連鎖反応(LFH−PCR)を使用した。これを行うために二つのPCR断片である「アーム」をまず作製した:製造業者(Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science)が説明するように40mM dNTPを1μl、10×緩衝液を5μlおよびPCR酵素(TaqおよびTgo)を0.75μlを含有する反応体積50μlに溶かした1A747染色体DNA0.1μgに、プライマーP1panBCDおよびP2panBCDまたはプライマーP3panBCDおよびP4panBCD(表2)の100mM溶液0.2μlを加えた。アニーリング温度55.7℃および伸長時間45秒を使用して30サイクルにわたりPCR反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれF3およびF4と呼ぶ断片を精製し、次に第二ラウンドのPCRにおけるプライマーとして使用した。F3およびF4を50倍に希釈し、それぞれ1μlを、反応体積50μlに溶かした直鎖化したプラスミドpX123roDTD−SPO1−15(P15プロモーターを含む)0.1μgに加えた。最初の10サイクルにアニーリング温度63℃および伸長時間6分を使用した。次の20サイクルに伸長時間を1サイクル毎に20秒間延長した。次に、結果としてもたらされた産物をテンプレートとして第三ラウンドのPCRに使用した。PCR産物を50倍に希釈し、1μlを上記のようにdNTP、緩衝液および酵素を含有する反応体積50μlに溶かしたプライマーP1panBCDおよびP4panBCDの100mM溶液0.2μlと混合した。PCR反応のパラメーターは、第二ラウンドPCRで使用したパラメーターと同一とした。次にDNA形質転換によりpanBプロモーター欠失株PA1に完成したPCR断片を導入し、標準条件を用いて最少培地寒天平板上でパントテネート原栄養性(Pan+)について選択した。これらのPan+コロニーはクロラムフェニコール感受性(Cms)でもあり、プロモーターカセットの挿入を確認した。P15プロモーターから発現されたpanBCDオペロンを含む単一Pan+Cmsコロニー単離して、PA12(P15panBCD)と名付けた。再び標準的な反応条件を用いたP15seqプライマーおよびP4panBCDプライマー(表2)を使用した診断PCRによって、panB遺伝子上流にP15プロモーターが存在することを確認した。振盪フラスコ培養においてPA12は、VFB MM培地で約100mg/リットルのパントテネートを、VFB MMGT培地で250mg/リットルのパントテネートを産生した(HPLC/MSアッセイに基づく)が、1A747対照は、1mg/リットル未満のパントテネートしか産生しなかった。VF培地および増殖条件を用いた標準的な流加培養による発酵では、PA12は48時間でおよそ10〜14g/リットルのパントテネートを産生した。 The next step was to introduce a strong constitutive promoter upstream of the panB gene. B. P 15 and P 26 (Lee et al., 1980) derived from SP01 bacteriophage subtilis any number of such promoters, including described in the literature. Long flanking homology polymerase chain reaction (LFH-PCR) was used to generate a DNA fragment containing P 15 upstream of the ribosome binding site (RBS) of panB. To do this, two PCR fragments, “arms”, were first generated: 1 μl of 40 mM dNTP and 5 μl of 10 × buffer and PCR as described by the manufacturer (Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science). 0.2 μl of a 100 mM solution of primers P1panBCD and P2panBCD or primers P3panBCD and P4panBCD (Table 2) was added to 0.1 μg of 1A747 chromosomal DNA in which the enzyme (Taq and Tgo) was dissolved in 50 μl of a reaction volume containing 0.75 μl. The PCR reaction was performed for 30 cycles using an annealing temperature of 55.7 ° C. and an extension time of 45 seconds. The resulting fragments, called F3 and F4, respectively, were purified and then used as primers in the second round of PCR. The F3 and F4 were diluted 50-fold, respectively 1 [mu] l, plasmid pX123roDTD-SPO1-15 was linearized dissolved in the reaction volume 50 [mu] l (including P 15 promoter) was added to 0.1 [mu] g. An annealing temperature of 63 ° C. and an extension time of 6 minutes was used for the first 10 cycles. The extension time was extended for 20 seconds per cycle for the next 20 cycles. The resulting product was then used as a template for the third round of PCR. The PCR product was diluted 50-fold and 1 μl was mixed with 0.2 μl of a 100 mM solution of primers P1panBCD and P4panBCD dissolved in a reaction volume of 50 μl containing dNTPs, buffer and enzyme as described above. The parameters of the PCR reaction were the same as those used in the second round PCR. The completed PCR fragment was then introduced into the panB promoter-deficient strain PA1 by DNA transformation and selected for pantothenate prototrophy (Pan + ) on minimal medium agar plates using standard conditions. These Pan + colonies is also the chloramphenicol sensitive (Cm s), to confirm the insertion of the promoter cassettes. Isolated single Pan + Cm s colonies containing PanBCD operon expressed from P 15 promoter, was designated PA12 (P 15 panBCD). By diagnostic PCR using P15seq primers and P4panBCD primers using standard reaction conditions again (Table 2), it was confirmed that the presence of P 15 promoter panB gene upstream. In shake flask culture, PA12 produced approximately 100 mg / liter pantothenate in VFB MM medium and 250 mg / liter pantothenate in VFB MMGT medium (based on HPLC / MS assay), whereas the 1A747 control was less than 1 mg / liter. Only pantothenate was produced. In fermentation by standard fed-batch culture using VF medium and growth conditions, PA12 produced approximately 10-14 g / liter pantothenate in 48 hours.
B.スブチリスPA49株
panE遺伝子上流に強力な構成的プロモーター(ylbQ)も含む株を構築するために、まず欠失突然変異を構築した。panE遺伝子の調査から二つの潜在的開始部位が明らかとなった:開始部位1(5’−AAATTGGGTG−3’(RBS)−7nt−ATG)はBspHI部位と重複し、BsaXI部位と重複する開始部位2(5’−GGAGG−3’(RBS)−5nt−TTG)の33bp上流である。結果として、S.アウレウスエリスロマイシン耐性(Emr)遺伝子(GeneBank V01278)を使用したLFH−PCRによってpanE/ylbQプロモーター領域の219bpの欠失を構築した。これを行うために、二つのPCR断片の「アーム」をまず作製した:製造業者(Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science)が説明するように40mM dNTPを1μl、10×緩衝液を5μlおよびPCR酵素(TaqおよびTgo)を0.75μl含有する反応体積50μlに溶かした1A747染色体DNA0.1μgに、プライマーP1panEおよびP2panE/ErまたはプライマーP3panE/Er/2およびP4panE(表3)の100mM溶液0.2μlを加えた。アニーリング温度55.7℃および伸長時間45秒を用いて30サイクルにわたりPCR反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれF1およびF2と呼ぶ断片を精製し、次に第二ラウンドのPCRにおけるプライマーとして使用した。F1およびF2断片を50倍に希釈し、それぞれ1μlを、反応体積50μlに溶かした直鎖化したプラスミドpDG646(ermカセットを含む;Guerout-Fleuryら、1995)0.1μgに加えた。最初の10サイクルではアニーリング温度63℃および伸長時間6分を使用した。次の20サイクルでは1サイクル毎に伸長時間を20秒延長した。次に、結果としてもたらされた産物をテンプレートとして第三ラウンドのPCRに使用した。PCR産物を50倍に希釈し、その1μlを上記のようにdNTP、緩衝液、および酵素を含有する反応体積50μlに溶かしたプライマーP1panEおよびP4panEの100mM溶液0.2μlと混合した。PCR反応パラメーターは第二ラウンドPCRに使用したものと同一とした。次に、形質転換によりPA4(1A747の染色体DNAを用いた形質転換によりB.スブチリスCU550 trpC2 ilvC4 leu−124から得られたTrp+コロニー)に完成したPCR断片を導入した結果として、パントテネート栄養要求株であるEmrコロニーがもたらされた。この株をPA5(ΔpanEp::erm ilvC leuC)と呼んだ。欠失の構造を確認するために診断PCRを使用した。その後、議論しない濃度のPA1染色体DNAの形質転換によって、PA5にpanBのプロモーター欠失を導入してPA6(ilvC leuC ΔpanBp::catΔpanEp::erm)を発生させた。
B. In order to construct a strain that also contains a strong constitutive promoter (ylbQ) upstream of the subtilis PA49 strain panE gene, a deletion mutation was first constructed. Investigation of the panE gene revealed two potential start sites: start site 1 (5′-AAATTGGGGTG-3 ′ (RBS) -7nt-ATG) overlaps the BspHI site and overlaps the BsaXI site. 2 (5′-GGAGGG-3 ′ (RBS) -5nt-TTG) 33 bp upstream. As a result, S. A 219 bp deletion of the panE / ylbQ promoter region was constructed by LFH-PCR using the Aureus erythromycin resistance (Em r ) gene (GeneBank V01278). To do this, “arms” of two PCR fragments were first made: 1 μl of 40 mM dNTPs, 5 μl of 10 × buffer and PCR as described by the manufacturer (Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science). 0.1 μg of 1A747 chromosomal DNA dissolved in a reaction volume of 50 μl containing 0.75 μl of enzymes (Taq and Tgo), 0.2 μl of 100 mM solution of primers P1panE and P2panE / Er or primers P3panE / Er / 2 and P4panE (Table 3) Was added. The PCR reaction was performed for 30 cycles using an annealing temperature of 55.7 ° C. and an extension time of 45 seconds. The resulting fragments, called F1 and F2, respectively, were purified and then used as primers in the second round of PCR. F1 and F2 fragments were diluted 50-fold and 1 μl each was added to 0.1 μg of linearized plasmid pDG646 (containing erm cassette; Guerout-Fleury et al., 1995) dissolved in 50 μl reaction volume. The first 10 cycles used an annealing temperature of 63 ° C. and an extension time of 6 minutes. In the next 20 cycles, the extension time was extended by 20 seconds per cycle. The resulting product was then used as a template for the third round of PCR. The PCR product was diluted 50-fold and 1 μl was mixed with 0.2 μl of a 100 mM solution of primers P1panE and P4panE dissolved in 50 μl of reaction volume containing dNTPs, buffer, and enzyme as described above. The PCR reaction parameters were the same as those used for the second round PCR. Next, as a result of introducing the completed PCR fragment into PA4 (Trp + colony obtained from B. subtilis CU550 trpC2 ilvC4 leu-124 by transformation using chromosomal DNA of 1A747) by transformation, pantothenate auxotrophic strain Resulting in an Em r colony. This strain was called PA5 (ΔpanE p :: erm ilvC leuC). Diagnostic PCR was used to confirm the structure of the deletion. Thereafter, the panB promoter deletion was introduced into PA5 by transformation of PA1 chromosomal DNA at a non-discussed concentration to generate PA6 (ilvC leuC ΔpanB p :: catΔpanE p :: erm).
次の工程は、panBおよびpanEの両方の上流に強力な構成的P15プロモーターを同時に導入することであった。LFH−PCRを再び使用してpanBのオープンリーディングフレーム上流にP15を含みpanEのオープンリーディングフレーム上流にP15を含むDNA断片を発生させた。これを行うために、PA12(上記参照)を構築するために用いたのと同じPCRプロトコルを使用して、プライマーP1panBおよびP2panB/P15(F1)ならびにプライマーP3panB/P15およびP4panB(F2)(表1および2、P15panBの構築)と、P1panEおよびP2panE/P15(F1)ならびにP3panE/P15およびP4panE(F2)(表3および4、P15panEの構築)を使用してpanBおよびpanEについて二つのPCR断片の「アーム」を作製した。 The next step was to simultaneously introduce a strong constitutive P 15 promoter upstream of both panB and panE. LFH-PCR and using again contains an open reading frame upstream P 15 of panB the open reading frame upstream of the panE caused a DNA fragment containing the P 15. To do this, using the same PCR protocol used to construct PA12 (see above), primers P1panB and P2panB / P15 (F1) and primers P3panB / P15 and P4panB (F2) (Table 1). and and 2, the construction of P 15 panB), P1panE and P2panE / P15 (F1) and P3panE / P15 and P4panE (F2) (tables 3 and 4, P 15 construction of panE) for panB and panE two using An “arm” of the PCR fragment was made.
次に、DNA形質転換によりpanBおよびpanEのプロモーター欠失株PA6(ilvC IeuC ΔpanBp::cat ΔpanEp::erm)に完成したP15panBおよびP15panEのPCR断片を一緒に導入し、標準的な条件を用いて最少培地寒天平板でパントテン酸原栄養性(Pan+)について選択した。回収したPan+コロニーもCmsおよびエリスロマイシン感受性(Ems)であり、プロモーターカセットの挿入を確認した。P15プロモーターから発現したpanBCDオペロンおよびpanE遺伝子の両方を含む単一Pan+CmsEmsコロニーを単離してPA32と名付けた。再び標準的な反応条件を用いてP15seqおよびP4panBプライマーを使用した診断PCRで、panB遺伝子上流にP15プロモーターが存在することを確認した(表1および2)。P15seqおよびP4panEプライマーを使用してpanE遺伝子についての同一の制御を実施した(表3および4)。しかし、panEの前方のP15プロモーターのその後の配列決定から、P15プロモーターの部分欠失が明らかとなった。 Next, the PCR fragments of P 15 panB and P 15 panE completed into the panB and panE promoter-deficient strain PA6 (ilvC IeuC ΔpanB p :: cat ΔpanE p :: erm) by DNA transformation were introduced together, and the standard Were selected for pantothenic acid prototrophy (Pan + ) on minimal medium agar plates using typical conditions. Recovered Pan + colonies are Cm s and erythromycin sensitive (Em s), to confirm the insertion of the promoter cassettes. Single Pan + Cm s Em s colony containing both panBCD operon and panE gene expressed from P 15 promoter was designated PA32 isolated. Again under standard reaction conditions to diagnostic PCR using P15seq and P4panB primers were used to confirm the presence of P 15 promoter panB gene upstream (Tables 1 and 2). The same control for the panE gene was performed using P15seq and P4panE primers (Tables 3 and 4). However, the subsequent sequencing of the front P 15 promoter panE, revealed partial deletion of the P 15 promoter.
部分欠失したP15panE遺伝子を正しい構築に入れ替えるために、PA5(ΔpanEp::erm ilvC leuC)由来染色体DNAを使用したDNA形質転換によりΔpanEp::erm突然変異をPA32に再導入し、エリスロマイシン耐性について選択した。この結果として、PA41株(P15panBCDΔpanEp::erm ilvC leuC)が生じた。前に述べたようにLFH−PCRにより発生したP15panEのDNA断片を次に形質転換によりPA41に導入し、Pan+原栄養菌株を選択した。この結果としてPA43株(ilvC leuC P15panBCD P15panE)がもたらされた。このIlv-Leu-栄養要求株を、次に標準法を用いて野生型B.スブチリス1A747で調製したPBS1ファージ溶解液を使用して形質導入してIlv+Leu+原栄養性にした。この結果としてPA49株(P15panBCD P15panE)がもたらされた。 To replace the partially deleted P 15 panE gene with the correct construction, the ΔpanE p :: erm mutation was reintroduced into PA32 by DNA transformation using chromosomal DNA from PA5 (ΔpanE p :: erm ilvC leuC), Selected for erythromycin resistance. This resulted in the PA41 strain (P 15 panBCDΔpanE p :: erm ilvC leuC). Introducing DNA fragment P 15 panE generated by LFH-PCR as previously discussed next PA41 by transformation were selected Pan + prototrophy strains. This resulted in the strain PA43 (ilvC leuC P 15 panBCD P 15 panE). This Ilv − Leu − auxotroph is then transformed into wild type B. cerevisiae using standard methods. PBS1 phage lysate prepared with Subtilis 1A747 was used to transduce to Ilv + Leu + prototrophy. This resulted in the PA49 strain (P 15 panBCD P 15 panE).
振盪フラスコ培養において、PA49はVFB MMGT培地中で平均しておよそ400mg/リットルのパントテネートを産生した(HPLC/MSアッセイに基づく)。 In shake flask culture, PA49 produced on average approximately 400 mg / liter pantothenate in VFB MMGT medium (based on HPLC / MS assay).
実施例2
本実施例は、胞子形成欠損突然変異spo0A、spo0H、spoIIA(sigF)spoIIG(sigE)およびspoIIIG(sigG)を含むB.スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験を記述する。
Example 2
This example includes a sporulation deficient mutation spo0A, spo0H, spoIIA (sigF) spoIIG (sigE) and spoIIIG (sigG). Describe the construction and testing of a subtilispantothenate overproducing strain.
胞子形成を欠損したB.スブチリス突然変異体の構築。
それぞれSWV215株(spo0A::kan)、BHI株(spo0HΔHindIII−EcoRI::cat)、650株(spoIIAABC::cat)、901株(spoIIGA::aphA−3)および731株(spoIIIG::ermC)からの染色体DNAの形質転換により胞子形成欠損突然変異を1A747(野生型株)およびパントテネート過剰産生株であるPA12に導入した。染色体DNAの抽出および「Groningen」法によるB.スブチリス株の形質転換はBron(1990)にしたがった。ermC遺伝子について0.3μg/mlのエリスロマイシン(Em)および25μg/mlのリンコマイシン(Lm);cat遺伝子について6μg/mlのCm;ならびにkanおよびaphA−3遺伝子について10μg/mlのカナマイシン(Km)を含有するTBAB寒天培地で形質転換体を選択した。形質転換効率は、染色体DNA1μgあたり形質転換体およそ5×104個で、結果として以下の株の発生がもたらされた:
(i)SWV215のDNA由来のカナマイシン耐性(Kmr)形質転換体を1A747_spo0AおよびPA12_spo0Aと名付け;
(ii)BHIのDNA由来Cmr形質転換体を1A747_sigHおよびPA12_sigHと名付け;
(iii)650のDNA由来Cmr形質転換体を1A747_sigFおよびPA12_sigFと名付け;
(iv)901のDNA由来Kmr形質転換体を1A747_sigEおよびPA12_sigEと名付け;
(v)731のDNA由来エリスロマイシン/リンコマイシン耐性(Emr/Lmr)形質転換体を1A747_sigGおよびPA12_sigGと名付けた。
B. deficient in sporulation Construction of a subtilis mutant.
From the strain SWV215 (spo0A :: kan), BHI (spo0HΔHindIII-EcoRI :: cat), 650 (spoIIAABC :: cat), 901 (spoIIGA :: aphA-3) and 731 (spoIIIG :: ermC), respectively A spore formation-deficient mutation was introduced into 1A747 (wild-type strain) and PA12, a pantothenate-overproducing strain, by transformation of the chromosomal DNA. Chromosomal DNA extraction and “Groningen” method Subtilis strains were transformed according to Bron (1990). 0.3 μg / ml erythromycin (Em) and 25 μg / ml lincomycin (Lm) for the ermC gene; 6 μg / ml Cm for the cat gene; and 10 μg / ml kanamycin (Km) for the kan and aphA-3 genes. Transformants were selected on the TBAB agar medium contained. The transformation efficiency was approximately 5 × 10 4 transformants per μg of chromosomal DNA, resulting in the development of the following strains:
(I) SWA215 DNA-derived kanamycin resistant (Km r ) transformants were named 1A747_spo0A and PA12_spo0A;
(Ii) BHI DNA-derived Cm r transformants were named 1A747_sigH and PA12_sigH;
(Iii) 650 DNA-derived Cm r transformants were named 1A747_sigF and PA12_sigF;
(Iv) 901 DNA-derived Km r transformants were named 1A747_sigE and PA12_sigE;
(V) 731 DNA-derived erythromycin / lincomycin resistance (Em r / Lm r ) transformants were named 1A747_sigG and PA12_sigG.
胞子形成の初期工程の主要調節因子である以外に、spo0AおよびシグマH(σH)は表面が関連したB.スブチリス群落内(surface associated B.subtilis communities)での胞子形成部位として働く気中構造(aerial structures)の形成に重大な役割も果たす(Brendaら、2001)。したがって、spo0Aを欠如した1A747_spo0AおよびPA12_spo0Aは、TBAB寒天平板で構造化されていないムコイドのコロニーを産生し、σHを欠如した1A747_sigHおよびPA12_sigHは、類似しているがあまり激しくない(寒天表面であまり強力に広がらない)表現型を示した。対照的にシグマF(σF)、シグマE(σE)およびシグマG(σG)を欠如した他の突然変異体は、野生型株と極めて類似したコロニー形態のコロニーを形成した。 In addition to being a major regulator of the early steps of sporulation, spo0A and sigma H (σ H ) are surface related B. It also plays a critical role in the formation of aerial structures that act as sporulation sites in surface associated B. subtilis communities (Brenda et al., 2001). Thus, 1A747_spo0A and PA12_spo0A lacking spo0A produced unstructured mucoid colonies on TBAB agar plates, while 1A747_sigH and PA12_sigH lacking σ H were similar but less intense (less on the agar surface) Phenotype that does not spread strongly). In contrast, other mutants lacking sigma F (σ F ), sigma E (σ E ) and sigma G (σ G ) formed colonies with colony morphology very similar to the wild type strain.
B.スブチリスにおいて胞子形成欠損突然変異がパントテネート産生および胞子形成に及ぼす作用。
上記の各形質転換実験から、独立して単離した25個のコロニーについて平板ハロー試験からパントテネート産生を試験した。大多数の被験コロニーを代表するハローのサイズを有する各突然変異体の二つのコロニーを振盪フラスコ培養で分析した。バッフル付き250ml容マイヤーフラスコ入れたVFB MM20mlに植菌するために、適当な抗生物質を補充したTAB平板上に増殖した単一コロニーを使用した。250rpmで攪拌しながら細菌を37℃で培養した。培養が定常増殖後期(培養約18時間後)に達したときに、細胞の濁度を600nmで測定し(OD600)、「熱耐性」cfuの数を胞子形成アッセイで決定した。次に、孔径0.45μmのフィルターでろ過して細胞を除去し、生物学的方法とHPLCアッセイ法の両方を使用して培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、突然変異体1A747_spo0A、PA12_spo0A、1A747_sigHおよびPA12_sigHの総パントテネート産生が親株に比べて2分の1から3分の1に減少したことを示した(表5)。これは、spo0AおよびσHの機能の欠如がパントテネート産生に負に作用したことを示している。σFまたはσEを欠如した突然変異体において、パントテネートの産生は実験誤差内で対照レベルと同様であり、これは後期で胞子形成を遮断する突然変異がパントテネート産生にほとんどまたは全く効果を有さなかったことを示している。培養物のOD600の測定によって決定された全突然変異体の細胞バイオマスは、親対照のバイオマスと同様であった。親株1A747およびPA12の胞子形成頻度はおよそ0.3〜1%であった。spo0A、σHおよびσEを欠如した突然変異体では胞子が全く検出されなかった。しかし、1A747_sigFおよびPA12_sigFの培養物から少数の熱耐性細胞を検出した(表5)。これは、spoIIAABC遺伝子における突然変異の結果として胞子形成の完全な欠如がもたらされなかったことを示している。これらの結果に基づき、シグマE遺伝子に突然変異を含む株のみが、対照レベルのパントテネートを産生し、かつ胞子形成細菌を完全に欠いていた。
B. Effects of sporulation-deficient mutations on pantothenate production and sporulation in subtilis.
From each of the transformation experiments described above, 25 independently isolated colonies were tested for pantothenate production from a plate halo test. Two colonies of each mutant with a halo size representing the majority of test colonies were analyzed in shake flask cultures. A single colony grown on a TAB plate supplemented with the appropriate antibiotic was used to inoculate 20 ml of VFB MM in a 250 ml Meyer flask with baffle. Bacteria were cultured at 37 ° C. with stirring at 250 rpm. When the culture reached late stationary growth (after about 18 hours in culture), the turbidity of the cells was measured at 600 nm (OD 600 ) and the number of “heat-resistant” cfu was determined by a sporulation assay. The cells were then removed by filtration through a 0.45 μm pore size filter and the pantothenate content in the post-culture medium was assayed using both biological and HPLC assays. The results showed that the total pantothenate production of mutants 1A747_spo0A, PA12_spo0A, 1A747_sigH and PA12_sigH was reduced from one-half to one-third compared to the parent strain (Table 5). This indicates that the lack of spo0A and σ H functions negatively affected pantothenate production. In mutants lacking σ F or σ E , pantothenate production is similar to the control level within experimental error, which indicates that mutations that block sporulation later have little or no effect on pantothenate production. It shows that there was not. The cell biomass of all mutants, determined by measuring the OD 600 of the culture, was similar to the parent control biomass. The sporulation frequency of parent strains 1A747 and PA12 was approximately 0.3-1%. No spores were detected in mutants lacking spo0A, σ H and σ E. However, a few heat resistant cells were detected from the cultures of 1A747_sigF and PA12_sigF (Table 5). This indicates that the mutation in the spoIIABC gene did not result in a complete lack of sporulation. Based on these results, only strains containing mutations in the Sigma E gene produced control levels of pantothenate and were completely devoid of spore-forming bacteria.
σG突然変異を含む株は、他のspo突然変異体が表現しない別個の表現型を作り出した。これを1A747野生型細胞に導入した場合、結果としてもたらされる突然変異体は、正常レベルのパントテネートを産生し、胞子を産生しない。しかし、操作されたPA12株では、結果としてもたらされる株は非常に低レベルのパントテネートを産生し、胞子を産生しない(表5)。これらの結果は、タンパク質産物がパントテネート産生(または排出)に関与しているようなシグマGにより転写される遺伝子の発現を阻害するか、極性によって下流の遺伝子の転写を遮断するかのどちらかによって、erm遺伝子によるσGの破壊が、パントテネートの高レベルの発現を遮断したことを示唆した。spoIIIG下流のDNA配列の調査は、spoIIIGと同時転写されうる単一遺伝子ylmAの存在を明らかにした。ylmA遺伝子は、ABC輸送体の構成要素の一つとして機能できる未知のATP結合タンパク質を潜在的にコードする。その結果、タンパク質の個別の、または操作されたpanおよび/またはilv生合成遺伝子と組み合わせた過剰産生は、より高いパントテネート産生を招くことができた。さらに、パントテネートの産生を回復させるSpo-Pan-表現型のサプレッサー宿主突然変異の結果としてより高いパントテネートの産生を有する株をもたらすことができた。 strain containing sigma G mutation, other spo mutant produced a distinct phenotype not expressed. When this is introduced into 1A747 wild type cells, the resulting mutant produces normal levels of pantothenate and no spores. However, with the engineered PA12 strain, the resulting strain produces very low levels of pantothenate and no spores (Table 5). These results depend on either inhibiting the expression of genes transcribed by Sigma G whose protein product is involved in pantothenate production (or excretion) or blocking the transcription of downstream genes by polarity. , disruption of sigma G by erm gene, suggesting that blocked the expression of high levels of pantothenate. Investigation of the DNA sequence downstream of spoIIIG revealed the presence of a single gene ylmA that can be co-transcribed with spoIIIG. The ylmA gene potentially encodes an unknown ATP binding protein that can function as one of the components of the ABC transporter. As a result, overproduction of proteins combined with individual or engineered pan and / or ilv biosynthetic genes could lead to higher pantothenate production. Furthermore, a Spo - Pan - phenotype suppressor host mutation that restores pantothenate production could result in strains with higher pantothenate production.
実施例3
本実施例は、胞子形成欠損突然変異spo0AまたはspoIIG(sigE)を含むB.スブチリスパントテネート過剰産生株の発酵について記述する。実験室規模の2リットル容発酵装置を使用した標準的な流加培養による発酵でsigE突然変異体(PA12_sigE)、spo0A突然変異体(PA12_spo0A)およびそれらの親株PA12を48時間増殖させた。パントテネートレベルと細菌の胞子形成頻度の両方を発酵過程中に測定した。表6に示すように、親株およびsigE突然変異体の両方でパントテネート産生は同様であったが、spo0A突然変異体ではおよそ85%低減していた。グルコースに対するパントテネートの収率は、sigE突然変異体と親株の間でこれも同様であった。胞子は、親株では検出されたが、どちらの突然変異体でも検出されなかった。
Example 3
This example shows that a B. cerevisiae containing a sporulation-deficient mutation spo0A or spoIIG (sigE). The fermentation of the subtilis spantothenate overproducing strain is described. The sigE mutant (PA12_sigE), spo0A mutant (PA12_spo0A) and their parent strain PA12 were grown for 48 hours in a standard fed-batch fermentation using a laboratory scale 2 liter fermenter. Both pantothenate levels and bacterial sporulation frequency were measured during the fermentation process. As shown in Table 6, pantothenate production was similar in both the parent strain and the sigE mutant, but was reduced by approximately 85% in the spo0A mutant. The pantothenate yield relative to glucose was similar between the sigE mutant and the parent strain. Spores were detected in the parent strain but not in either mutant.
本発明を実施例により例示したが、実施例は本発明の具体的な態様を単に示すものである。これを読んだ当業者には多くの態様が明らかであろうことから、これが本発明をそれに限定するものとして解釈すべきではない。 While the invention has been illustrated by way of examples, the examples are merely illustrative of specific embodiments of the invention. Since many embodiments will be apparent to those of ordinary skill in the art reading this, this should not be construed as limiting the invention thereto.
実施例4
本実施例は、spo0AおよびabrBにヌル突然変異を含むB.スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験について記述する。
Example 4
This example demonstrates that B. cerevisiae containing null mutations in spo0A and abrB. Describes the construction and testing of subtilispantothenate overproducing strains.
SWV215株(spo0A::kan)およびSWV119株(abrB::tet)由来染色体DNAを用いた形質転換によって、パントテネート過剰産生株であるPA49にabrBとspo0Aとの単一および二重突然変異を導入した。kan遺伝子について10μg/mlのKm、tet遺伝子について10μg/mlのテトラサイクリン(Tc)を含むTBAB寒天培地で形質転換体を選択した。形質転換効率は、spo0A::kanでは形質転換体2×103個/μgDNA、abrB::tetでは形質転換体4×102個/μgDNA、ならびにspo0A::kanおよびabrB::tet二重突然変異体では形質転換体4個/μgDNAであった。結果として生じた株は以下の通りである:
(i)SWV215のDNAからのKmr形質転換体をPA1030と名付け;
(ii)SWV119のDNAからのテトラサイクリン耐性(Tcr)形質転換体をPA1037と名付け;
(iii)SWV215のDNAとSWV119のDNAとからのKmrおよびTcr形質転換体をPA1051と名付けた。
Single and double mutations of abrB and spo0A were introduced into PA49, a pantothenate overproducing strain, by transformation using chromosomal DNA from the SWV215 strain (spo0A :: kan) and the SWV119 strain (abrB :: tet). . Transformants were selected on TBAB agar medium containing 10 μg / ml Km for the kan gene and 10 μg / ml tetracycline (Tc) for the tet gene. The transformation efficiency was 2 × 10 3 transformants / μg DNA for spo0A :: kan, 4 × 10 2 transformants / μg DNA for abrB :: tet, and spo0A :: kan and abrB :: tet double suddenly. The mutant was 4 transformants / μg DNA. The resulting strains are as follows:
(I) Km r transformant from SWV215 DNA was named PA1030;
(Ii) a tetracycline resistant (Tc r ) transformant from SWV119 DNA was named PA1037;
(Iii) a Km r and Tc r transformants from the SWV215 DNA and SWV119 DNA of was named PA1051.
各突然変異体の四つのコロニーについて振盪フラスコ培養におけるパントテネート産生および胞子形成を分析した。適当な抗生物質を補充したTBAB平板に増殖した単一コロニーを使用して、適当な抗生物質を補充したVY培地10mlに植菌を行った。250rpmで撹拌しながら細菌を37℃で一晩(約17h)増殖させた。VFB MMGT培地20mlで一晩培養後の培養物を希釈(1:100)し、対数増殖中期まで増殖させた(OD600=0.6〜0.8)。初発濁度OD600=0.03でのVFB MMGT培地30mlにこれらの培養物を植菌し、バッフル付き250ml容マイヤーフラスコで250rpmで撹拌しながら37℃で細菌を増殖させた。増殖18h後に細胞濁度を600nmで測定し(OD600)、胞子形成アッセイで「熱耐性」cfu数を決定した。次に孔径0.45μmのフィルターでろ過することにより細胞を除去し、HPLCアッセイ法で培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、培養物のOD600の測定により決定された全ての突然変異体の細胞バイオマスが親対照と同様であったことを示した。PA1030(spo0A::kan)およびPA1037(abrB::tet)の総パントテネート産生は親PA49株に比べて1/3〜1/4に減少した(表7)。これは、(実施例2でも示されたように)spo0AおよびAbrBの機能の欠如がパントテネート産生に負に作用することを示している。しかし、二重突然変異体PA1051(spo0A::kan abrB::tet)は、PA49対照よりも40%多いパントテネートを産生し、胞子を産生しなかった。これらの結果に基づくと、abrBおよびspo0Aの二重ヌル突然変異体においてパントテネート産生は野生型発現レベルを超えて増大しうる。 Four colonies of each mutant were analyzed for pantothenate production and sporulation in shake flask cultures. A single colony grown on a TBAB plate supplemented with the appropriate antibiotic was used to inoculate 10 ml of VY medium supplemented with the appropriate antibiotic. Bacteria were grown overnight (about 17 h) at 37 ° C. with stirring at 250 rpm. The culture after overnight culture in 20 ml of VFB MMGT medium was diluted (1: 100) and grown to mid-logarithmic growth (OD 600 = 0.6 to 0.8). These cultures were inoculated into 30 ml of VFB MMGT medium with an initial turbidity OD 600 = 0.03, and the bacteria were grown at 37 ° C. with stirring at 250 rpm in a 250 ml Meyer flask with baffle. After 18 h of growth, cell turbidity was measured at 600 nm (OD 600 ) and the number of “heat-resistant” cfu was determined by a sporulation assay. Next, the cells were removed by filtration through a filter having a pore size of 0.45 μm, and the pantothenate content in the culture medium after the culture was assayed by HPLC assay. The results showed that the cell biomass of all mutants determined by measuring the OD 600 of the culture was similar to the parent control. Total pantothenate production of PA1030 (spo0A :: kan) and PA1037 (abrB :: tet) was reduced to 1/3 to 1/4 compared to the parental PA49 strain (Table 7). This indicates that lack of spo0A and AbrB function negatively affects pantothenate production (as also demonstrated in Example 2). However, the double mutant PA1051 (spo0A :: kan abrB :: tet) produced 40% more pantothenate and no spores than the PA49 control. Based on these results, pantothenate production can be increased beyond wild-type expression levels in abrB and spo0A double null mutants.
実施例5
本実施例は、spo0Aを過剰発現し胞子形成欠損突然変異(spoIIGA)を含むB.スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験について記述する。
Example 5
This example shows that B. overexpressing spo0A contains a sporulation-deficient mutation (spoIIGA). Describes the construction and testing of subtilispantothenate overproducing strains.
Pspac−spo0AおよびsigE−ヌル突然変異を保有するB.スブチリス株の構築
実施例2においてspo0Aの欠如が親株に比べてパントテネート産生を2分の1から3分の1に減少させることが示された。spo0A遺伝子の過剰発現がパントテネート産生に及ぼす効果を検討するために、AH1763株(amyE::Pspacspo0A[cat])由来染色体DNAを用いた形質転換によりPA49のamyE遺伝子にIPTG誘導性Pspac−spo0A融合体を導入した。6μg/mlのCmを含むTBAB寒天培地で形質転換体を選択し、結果としてもたらされたCmr株をPA1025と名付けた。次に、901株(spoIIGA::aphA−3)由来染色体DNAを用いた形質転換によってspoIIGAにおける胞子形成欠損突然変異をPA1025に導入した。cat遺伝子については6μg/mlのCm、aphA−3遺伝子については10μg/mlのKmを含むTBAB寒天培地で形質転換体を選択し、結果としてもたらされたCmrおよびKmr株をPA1064と名付けた。
B. carrying Pspac- spo0A and sigE-null mutations. Construction of a subtilis strain In Example 2, the absence of spo0A was shown to reduce pantothenate production from one-half to one-third compared to the parent strain. In order to examine the effect of overexpression of spo0A gene on pantothenate production, IPTG-inducible P spac − was expressed in the amyE gene of PA49 by transformation using chromosomal DNA derived from AH1763 strain (amyE :: P spac spo0A [cat]). A spo0A fusion was introduced. Transformants were selected on TBAB agar containing 6 μg / ml Cm and the resulting Cm r strain was named PA1025. Next, a sporulation-deficient mutation in spoIIGA was introduced into PA1025 by transformation using chromosomal DNA derived from strain 901 (spoIIGA :: aphA-3). Transformants were selected on TBAB agar medium containing 6 μg / ml Cm for the cat gene and 10 μg / ml Km for the aphA-3 gene, and the resulting Cm r and Km r strains were named PA1064. It was.
B.スブチリスにおけるパントテネート産生に及ぼすspo0A過剰発現の効果。
適当な抗生物質を補充したVY培地10mlに植菌するためにPA49、PA1025およびPA1064の単一コロニーを使用した。250rpmで撹拌しながら37℃で細菌を一晩(約17h)増殖させた。一晩培養後の培養物をVFB MMGT培地20mlで希釈(1:100)し、対数増殖中期(OD600=0.6〜0.8)まで増殖させた。30mlのVFB MMGTおよび10mMのIPTGを含有するVFB MMGT培地30mlに初発濁度OD600=0.03でこれらの培養物を植菌し、バッフル付き250ml容マイヤーフラスコで250rpmで撹拌しながら37℃で細菌を増殖させた。増殖18h後に細胞濁度を600nmで測定し(OD600)、胞子形成アッセイで「熱耐性」cfu数を決定した。次に孔径0.45μmのフィルターでろ過することにより細胞を除去して、HPLCアッセイ法で培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、培養物のOD600の測定により決定された全ての突然変異体の細胞バイオマスが親対照と同様であることを示した。誘導物質IPTGの非存在下では、PA1025(Pspacspo0A)およびPA1064(Pspacspo0AspoIIGA::aphA−3)からの総パントテネート産生は、PA49親株と同様であった(表8)。10mMのIPTGを使用してPspacプロモーターからのspo0Aの発現を誘導した場合、PA1025は親対照に比べて70%多いパントテネートおよび10倍の胞子を産生した。一方、PA1064もPA49対照よりも70%多いパントテネートを産生したが、胞子形成を欠損していた。
B. Effect of spo0A overexpression on pantothenate production in Subtilis.
Single colonies of PA49, PA1025 and PA1064 were used to inoculate 10 ml of VY medium supplemented with appropriate antibiotics. Bacteria were grown overnight (about 17 h) at 37 ° C. with stirring at 250 rpm. The culture after overnight culture was diluted (1: 100) with 20 ml of VFB MMGT medium and grown to mid-logarithmic growth (OD 600 = 0.6 to 0.8). 30 ml of VFB MMGT medium containing 30 ml of VFB MMGT and 10 mM IPTG were inoculated with these cultures at an initial turbidity of OD 600 = 0.03 at 37 ° C. with stirring at 250 rpm in a 250 ml Meyer flask with baffle. Bacteria were grown. After 18 h of growth, cell turbidity was measured at 600 nm (OD 600 ) and the number of “heat-resistant” cfu was determined by a sporulation assay. Next, the cells were removed by filtration through a filter having a pore size of 0.45 μm, and the pantothenate content in the culture medium after the culture was assayed by HPLC assay. The results showed that the cell biomass of all mutants determined by measuring the OD 600 of the culture was similar to the parent control. In the absence of inducer IPTG, total pantothenate production from PA1025 ( Pspac spo0A) and PA1064 ( Pspac spo0AspoIIGA :: aphA-3) was similar to the PA49 parental strain (Table 8). When 10 mM IPTG was used to induce the expression of spo0A from the P spac promoter, PA1025 produced 70% more pantothenate and 10 times more spores compared to the parental control. On the other hand, PA1064 produced 70% more pantothenate than the PA49 control, but lacked sporulation.
Claims (6)
低減したSigE活性を示し、かつ、spo0A遺伝子を過剰発現するように;又は、
低減したSpo0A活性および低減したAbrB活性を示すように、改変された微生物。A sporulation-deficient microorganism belonging to the genus Bacillus, which overproduces a pantothenate compound ,
Exhibit low Hesi was SigE activity, and to overexpress spo0A gene; or,
A microorganism that has been modified to exhibit reduced SpoOA activity and reduced AbrB activity.
該パントテネート化合物が産生される条件で微生物を培養する工程、を含み、
前記微生物はパントテネート化合物を過剰産生する、バチルス(Bacillus)属に属する胞子形成欠損微生物であって、
低減したSigE活性を示すように;
低減したSigE活性を示し、かつ、spo0A遺伝子を過剰発現するように;又は、
低減したSpo0A活性および低減したAbrB活性を示すように、改変された微生物、である方法。A process for producing a pantothenate compound comprising:
Process the pantothenate compound is cultured microorganism under conditions produced, seen including a
The microorganism is a sporulation-deficient microorganism belonging to the genus Bacillus, which overproduces a pantothenate compound,
To show reduced SigE activity;
Exhibit reduced SigE activity and overexpress the spo0A gene; or
A method that is a microorganism that has been modified to exhibit reduced SpoOA activity and reduced AbrB activity .
(a)panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA、serA、ylmA及びgcv遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子を過剰発現させた、バチルス属の微生物を提供する工程、および
(b)バチルス属の胞子形成欠損微生物が得られるように、
工程(a)の該微生物にSpo0A活性の低減およびAbrB活性の低減を引き起こす突然変異を導入するか、
もしくは工程(a)の該微生物にSigE活性の低減およびspo0A遺伝子の過剰発現を引き起こす突然変異を導入する工程;
を含む方法。A method for the preparation of a sporulation-deficient microorganism belonging to the genus Bacillus, which can overproduce pantothenate compounds, comprising the following steps:
(A) a microorganism belonging to the genus Bacillus, overexpressing one or more genes selected from the group consisting of panB, panC, panD, panE, ilvB, ilvN, ilvC, ilvD, glyA, serA, ylmA and gcv genes And (b) so as to obtain a sporulation-deficient microorganism of the genus Bacillus ,
Microorganism in or introducing a mutation that causes a reduction in reducing and AbrB activity Spo0A activity Engineering as (a),
Or introducing a mutation that causes a reduction in SigE activity and overexpression of the spo0A gene in the microorganism of step (a);
Including methods.
低減したSigE活性を示すように;
低減したSigE活性を示し、かつ、spo0A遺伝子を過剰発現するように;又は、
低減したSpo0A活性および低減したAbrB活性を示すように、改変された微生物である、使用。Use of a sporulation-deficient microorganism belonging to the genus Bacillus for the preparation of a pantothenate compound, the microorganism comprising:
To show reduced SigE activity;
Exhibit reduced SigE activity and overexpress the spo0A gene; or
Use, which is a microorganism that has been modified to exhibit reduced SpoOA activity and reduced AbrB activity .
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