JP4712333B2 - A method for introducing nucleic acids using a hybrid polysaccharide carrier. - Google Patents
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Description
本発明は、トランスフェクション能が高く、かつ生体に安全な、多糖系の新規なキャリアーを用いる核酸類の細胞への導入法に関する。 The present invention relates to a method for introducing nucleic acids into cells using a novel polysaccharide-based carrier having high transfection ability and safe for living bodies.
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。この療法に基づき既に開発段階に入っている医薬品の候補は、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐の疾病に対するものとなっている。 In recent years, antisense therapy has been actively studied in response to advances in genetic engineering, and a large number of literatures and patents relating to antisense drugs are being reported. Drug candidates that are already in the development stage based on this therapy are for various diseases such as various cancers and leukemias, viral diseases such as AIDS and hepatitis, psoriasis, Crohn's disease, asthma and rheumatism.
アンチセンス療法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡを医薬として使用する場合、配列特異性の他にヌクレアーゼに耐性があること、無毒性で、製造コストが安価であること、標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること、細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること、高い特異性と透過性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること、そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなど多くの課題がある。 Antisense oligonucleotides and siRNA used in antisense therapy are designed to have a sequence complementary to a specific sequence found in a target nucleic acid such as DNA, mRNA or mRNA precursor. When the antisense oligonucleotide or siRNA is used as a medicine, in addition to sequence specificity, it is resistant to nuclease, non-toxic, inexpensive to manufacture, and suitable for delivery to a target tissue or cell. It has pharmacokinetics, can penetrate cell membranes, vesicular organelle membranes, and nuclear membranes, penetrates into the target region of RNA molecules with high specificity and permeability, and maximizes the translation process of target proteins There are many problems such as making it possible to prevent it.
それらの課題の中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡの細胞内への導入効率を上げることは重要な課題であり、一般に、その解決のために遺伝子キャリアーが併用されている。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因として、これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用は制限されている。
近年、非ウイルス性の人工キャリアーとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＥＩと同様に窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリアー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、多数特許出願されている。 In recent years, polyethylenimine (PEI) as a non-viral artificial carrier, various cationic polymers and cationic lipids modified with nitrogen substituents like PEI are called gene carriers, transfection agents, drug carriers, etc. Many patent applications have been filed by name.
しかしながら、ＰＥＩのようなアミノ基を有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性も考えられる。事実、今まで検討されたカチオン性ポリマーは未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
一方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β-1,3-グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約20年の使用実績がある。
このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲートを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲートを製造する方法が述ベられている。
また、最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカンまたはβ−１，３−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、アンチセンスヌクレオチドや免疫刺激性核酸（ＣｐＧ ＤＮＡ）など各種の核酸と新しいタイプの複合体を形成することが見出された。そして、複合体の化学量論比を検討した際、核酸１分子に対してβ−１，３−グルカン２分子で複合体を構成していることが発見された。
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、水素結合および疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、ケースによってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている。さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜との透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされた。
さらに、細胞内へのトランスフェクション効率を高める手段として、最近は、標的細胞への特異的な透過性を活用する方法の研究が盛んである。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白にインテグリンがあり、そのインテグリン結合に有効と認められているペプチドとしてＲＧＤ配列が知られている。そして、ＲＧＤを含む配列のペプチドを、既知のカチオン性キャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、特許に例示されている。
同様に、細胞の表面に存在する糖レセプターを特異的に認識することを活用するトランスフェクションの方法も研究されている。例えば、肝細胞に代表されるガラクトース受容体をもつ細胞に対して、特異的に透過性を有するガラクトースまたはガラクトースを構成成分として含むラクトースで修飾された脂質、ペプチド等の遺伝子キャリアーが、肝臓癌のアンチセンスＤＮＡ治療薬のキャリアーとして特許出願されている。また、本発明者らにより、ガラクトースを結合させたβ−１，３−グルカンを用いた肝細胞ターゲッティング製剤について特許出願している。ガラクトースおよびラクトース以外にも、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノ-ス、グルコース、フコースおよびシアル酸などが細胞表面の各種レセプターを認識する糖として知られている。
コレステロールも細胞表層に存在するレセプターを介して細胞内に取り込まれる化合物として知られており、ドラッグ・デリバリーの分野では比較的頻繁に利用されている。
また、トランスフェリンは鉄輸送タンパク質として、葉酸は核酸の塩基部位の合成に細胞に必要不可欠な分子として、細胞表層に存在するレセプターを介して細胞内に取り込まれる化合物として知られており、これらの化合物やその誘導体もドラッグ・デリバリーに応用されている。
Transferrin is known as an iron transport protein, and folic acid is known as a compound that is essential for cells to synthesize nucleic acid bases, and is a compound that is incorporated into cells via receptors present on the cell surface. And its derivatives have also been applied to drug delivery.
さらに、近年、Ｔａｔペプチドやオリゴアルギニンを遺伝子導入剤に応用する試みがなされてきた。Ｔａｔペプチドは、ウイルスが細胞内に侵入する際に細胞膜を貫通させるために用いる物質である。この一部が連続したアルギニン配列で構成されている。これらの持つ正電荷や構造が、そのメカニズムは明らかにされてはいないが、細胞膜透過性に深く関与していると明確に示されている。そのため、多くの研究者によって非ウイルス性ベクターにＴａｔペプチドやオリゴアルギニン、ならびに類似の作用が期待されるＲｅｖペプチドおよびＡｎｔペプチド等が用いられている。
ドラッグ・デリバリーにおける細胞内への核酸の導入では、一般にエンドサイトーシスと呼ばれる経路で細胞膜を突破することが知られている。細胞内に導入後、エンドソームと呼ばれる脂質二分子膜に包摂され、リソソームへ移行して強力な分解酵素によって分解されるなどして代謝されてしまう。即ち、ドラッグ・デリバリーにおいてリソソームでの分解は大きな障壁であり、これを回避することによってデリバリー能の向上に大きく貢献できるものといえる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、400μg/ml以上の高濃度条件下において細胞膜融合を引き起こすことが知られており、その際に、脂質二分子膜を撹乱すると考えられる。その脂質二分子膜撹乱性により輸送小胞（エンドソーム）に包まれて細胞内に浸透した複合体が、局所的に脂質二分子膜の一種であるエンドソームに対するＰＥＧ濃度が増大し、エンドソームを突破し、脱出するものと考えられている。このまた、場合によっては細胞膜を直接撹乱することにより、エンドソームを経由せずに膜内に入って、リソソームでの分解を回避する可能性も考えられる。本発明者らにより、ＰＥＧを結合させたβ−１，３−グルカンを用いた核酸治療剤のデリバリーについて特許出願している。
シクロデキストリン（以下、ＣｙＤと表記することがある）にも同様に、脂質分子包接能により脂質二分子膜を撹乱する可能性を有することが知られている。そのため、ＣｙＤの遺伝子キャリアーとしての付加価値について、特に細胞内に導入された後のエンドソーム膜を突破し、ターゲットである核酸に向かって運搬できるものと考えられる。また、ＣｙＤは、脂質分子の他にアダマンタンなどの疎水性分子をゲストとして包接する作用を持ち、様々な分野に応用されている。
しかしながら、上記のような、機能を有する官能基を、複数組み合わせてβ-1,3-グルカンに修飾し、核酸のキャリアーとして相乗効果と最適化を図る試みは見られない。 However, there has been no attempt to synergize and optimize the nucleic acid carrier by combining a plurality of functional groups having the above functions into β-1,3-glucan in combination.
本発明の目的は、生体に対する安全性が高く、かつ核酸と特異な複合体を形成する能力のある多糖であるβ−１，３−グルカンに、標的細胞への核酸のトランスフェクション能を一段と高めるための新しい技術を提供することにある。 The object of the present invention is to further enhance the transfection ability of a nucleic acid into a target cell to β-1,3-glucan, which is a polysaccharide that is highly safe for living bodies and capable of forming a complex complex with a nucleic acid. To provide new technology for.
本発明に従えば、上記の目的を達成するものとして、標的細胞に核酸を導入する方法であって、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカン、または、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤またはアルカリ性溶剤に溶解した後、前記被導入核酸と水の存在下に混合することによって該核酸とβ−１，３−グルカンとから成る複合体を形成させ、この複合体を標的細胞に投与することを特徴とする方法が提供される。 According to the present invention, in order to achieve the above object, a method for introducing a nucleic acid into a target cell, which comprises a β-1,3-glucan having both a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group Alternatively, β-1,3-glucan having a cell membrane-permeable functional group and β-1,3-glucan having a lipid membrane disruptive functional group are dissolved in an aprotic polar solvent or an alkaline solvent, and then introduced. There is provided a method characterized by mixing a nucleic acid and water in the presence of water to form a complex composed of the nucleic acid and β-1,3-glucan and administering the complex to a target cell.
さらに、本発明は、別の観点から、β−１，３−グルカンの２本鎖と導入核酸の１本鎖とから成る複合体であって、β−１，３−グルカンの２本鎖のうちの１本が細胞膜透過性官能基を有し且つ他の１本が脂質膜撹乱性官能基を有するか、または、同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体から構成されることを特徴とする標的細胞に核酸を導入するための多糖系キャリアーを提供するものである。 Furthermore, from another viewpoint, the present invention is a complex comprising a double strand of β-1,3-glucan and a single strand of introduced nucleic acid, wherein the double strand of β-1,3-glucan One of them has a cell membrane-permeable functional group and the other one has a lipid membrane disruptive functional group, or the same β-1,3-glucan chain is a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane. The present invention provides a polysaccharide carrier for introducing a nucleic acid into a target cell, characterized in that it is composed of a complex having both disturbing functional groups.
本発明に従えば、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併せ持つβ−１，３−グルカンを核酸と複合体化したハイブリッド多糖系キャリアーとして核酸を投与することにより、標的細胞への当該核酸の導入効率を高め、治療効果を向上させることが出来る。 According to the present invention, by administering a nucleic acid as a hybrid polysaccharide carrier in which a β-1,3-glucan having both a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group is complexed with a nucleic acid, the nucleic acid is administered to a target cell. The efficiency of introduction of the nucleic acid can be increased, and the therapeutic effect can be improved.
本発明において用いられる細胞膜透過性官能基とは、背景技術に関連して例示したように、細胞表層に存在する受容体を特異的に認識することができ、また、正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通することにより核酸の細胞内への浸透に効果のある官能基または原子団を指称する。細胞表層に存在する受容体を特異的に認識する細胞膜透過性官能基の好ましい例としては、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、グルコース、フコースおよびシアル酸より選ばれる単糖またはオリゴ糖の残基が挙げられる。この他、ＲＧＤペプチド、コレステロール、トランスフェリン、または葉酸の残基も本発明で使用可能な細胞表層に存在する受容体を特異的に認識する細胞膜透過性官能基の例である。正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通するタイプの細胞膜透過性官能基の好適な例は、オリゴアルギニン、Ｔａｔペプチド、ＲｅｖペプチドまたはＡｎｔペプチドの残基である。 The cell membrane-permeable functional group used in the present invention can specifically recognize a receptor present on the cell surface layer as exemplified in relation to the background art, and can also be positively charged or molecularly structural. It refers to a functional group or atomic group that is effective in penetrating a nucleic acid into a cell by adsorbing and penetrating the cell membrane surface layer. Preferable examples of the cell membrane-permeable functional group that specifically recognizes a receptor present on the cell surface include a simple substance selected from galactose, mannose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, mannose, glucose, fucose and sialic acid. Examples include sugar or oligosaccharide residues. In addition, RGD peptide, cholesterol, transferrin, or folic acid residues are also examples of cell membrane-permeable functional groups that specifically recognize receptors present on the cell surface that can be used in the present invention. Suitable examples of the cell membrane-permeable functional group of the type that adsorbs and penetrates the cell membrane surface layer in terms of positive charge or molecular structure are oligoarginine, Tat peptide, Rev peptide or Ant peptide residues.
本発明において用いられる脂質膜撹乱性官能基とは、背景技術に関連して例示したように、細胞膜または細胞内に導入された後の輸送小胞を突破・脱出する機能を有し細胞内でのリソソームにおける分解を回避する効果をもたらす官能基または原子団を指称する。本発明において好適に用いられる脂質膜撹乱性官能基の典型例は、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、またはカルボン酸の残基である。 The lipid membrane disruptive functional group used in the present invention has a function of breaking through and exiting a cell membrane or a transported vesicle after being introduced into the cell, as exemplified in relation to the background art. Refers to a functional group or atomic group that has the effect of avoiding degradation in the lysosome. A typical example of the lipid membrane disrupting functional group preferably used in the present invention is a residue of polyethylene glycol, cyclodextrin, or carboxylic acid.
本発明に従い標的細胞に核酸を導入するためには、先ず、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンを極性溶媒（非プロトン性極性溶剤、例えば、ＤＭＳＯ）に溶解する（以下、この態様を第1の態様と言うことがある）。または、別の態様として、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤に溶解する（以下、この態様を第2の態様と言うことがある）。この操作により、もともと天然もしくは水中で3重螺旋として存在していたβ−１，３−グルカンは1本鎖になる。なお、ＤＭＳＯのような非プロトン性極性溶媒の代わりに水酸化ナトリウム溶液のようなアルカリ性溶剤に溶解してもよい。 In order to introduce a nucleic acid into a target cell according to the present invention, first, β-1,3-glucan having both a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group is used as a polar solvent (aprotic polar solvent such as , DMSO) (hereinafter, this embodiment may be referred to as the first embodiment). Alternatively, as another embodiment, β-1,3-glucan having a cell membrane-permeable functional group and β-1,3-glucan having a lipid membrane disrupting functional group are dissolved in an aprotic polar solvent (hereinafter referred to as “this”). The embodiment may be referred to as a second embodiment). By this operation, β-1,3-glucan that originally existed as a triple helix in nature or in water becomes a single strand. In addition, instead of an aprotic polar solvent such as DMSO, it may be dissolved in an alkaline solvent such as a sodium hydroxide solution.
次に、このようにして得られたβ−１，３−グルカンを水の存在下に被導入核酸と混合する。すなわち、非プロトン性極性溶剤（またはアルカリ性溶剤）中に溶解しているβ−１，３−グルカンに核酸（1本鎖）を加え、溶媒を水に戻す。かくして、β−１，３−グルカンの2本鎖と核酸（標的細胞に導入されるべき核酸）の1本鎖とから成る複合体が形成される（非特許文献１３）。 Next, the β-1,3-glucan thus obtained is mixed with the nucleic acid to be introduced in the presence of water. That is, nucleic acid (single strand) is added to β-1,3-glucan dissolved in an aprotic polar solvent (or alkaline solvent), and the solvent is returned to water. Thus, a complex composed of a double strand of β-1,3-glucan and a single strand of nucleic acid (nucleic acid to be introduced into the target cell) is formed (Non-patent Document 13).
かくして、本発明に従えば、β−１，３−グルカンの２本鎖と被導入核酸の１本鎖とから成る複合体であって、β−１，３−グルカンの２本鎖のうちの１本が細胞膜透過性官能基を有し且つ他の１本が脂質膜撹乱性官能基を有する複合体（第1の態様による場合）、または、同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体（第2の態様による場合）が形成され、この複合体の形態で核酸を標的細胞に導入する。図１１は、このような本発明のハイブリッド多糖系キャリアーを構成する複合体を概念的に示すものであり、図１１の（Ｂ）と（Ｃ）は同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体を示し、図１１の（Ａ）は2本のβ−１，３−グルカン鎖の一方が細胞膜透過性官能基を有し他方が脂質膜撹乱性官能基を有する複合体を示している。 Thus, according to the present invention, a complex composed of a double strand of β-1,3-glucan and a single strand of a nucleic acid to be introduced, wherein the double strand of β-1,3-glucan, A complex in which one has a cell membrane-permeable functional group and the other has a lipid membrane disruptive functional group (when according to the first embodiment), or the same β-1,3-glucan chain is a cell membrane A complex having both a permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group (when according to the second embodiment) is formed, and the nucleic acid is introduced into the target cell in the form of this complex. FIG. 11 conceptually shows a complex constituting such a hybrid polysaccharide carrier of the present invention, and (B) and (C) in FIG. 11 show the same β-1,3-glucan chain. FIG. 11A shows a complex having both a cell membrane permeable functional group and a lipid membrane disruptive functional group. FIG. 11A shows one of two β-1,3-glucan chains as a cell membrane permeable functional group. And the other has a lipid membrane disrupting functional group.
本発明は、β−１，３−グルカンに、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱能を有する官能基とを導入し、これらを導入しようとする核酸と複合体化して標的細胞に投与する方法である。そして、本発明で使用される核酸とは、疾病の治療等のために細胞内に導入されるべき遺伝子自体または該遺伝子を含む核酸、および類似の核酸類であり、上記のような官能基を有するβ−１，３−グルカンと複合体を形成するものであれば、どのような形態でも良い。すなわち、ＲＮＡ、オリゴＤＮＡ、１本鎖核酸、２本鎖核酸、プラスミドＤＮＡなどが本発明で用いられる核酸として包含されるが、実用的見地から特に好適な核酸物質はアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドである。 The present invention is a method of introducing a cell membrane-permeable functional group and a functional group having lipid membrane disrupting ability into β-1,3-glucan, complexing it with the nucleic acid to be introduced, and administering it to a target cell. It is. The nucleic acid used in the present invention is a gene itself to be introduced into a cell for disease treatment or the like, a nucleic acid containing the gene, and similar nucleic acids, and has a functional group as described above. Any form may be used as long as it forms a complex with β-1,3-glucan. That is, RNA, oligo DNA, single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid, plasmid DNA and the like are included as the nucleic acid used in the present invention, but particularly suitable nucleic acid substances from the practical viewpoint are antisense DNA, siRNA, CpG. An oligonucleotide such as DNA.
β−１，３−グルカンと核酸が形成する複合体は、前述のように、β−１，３−グルカンの2本鎖と核酸の1本鎖、すなわち、核酸１分子に対しβ−１，３−グルカン２分子で構成される。細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を導入した一対のβ−１，３−グルカン（例えば、ガラクトースを導入したβ−１，３−グルカンとＰＥＧを導入したβ−１，３−グルカン：図１１のＡ）を複合化の際に混合することで、核酸１分子に異なる機能を付加した２種類のβ−１，３−グルカン各１本から成る新しい複合体が形成される。これは、例えば、ガラクトースによる肝細胞特異的なレセプターを介した細胞膜透過能とＰＥＧによるリソソームでの分解回避能を併せ持つハイブリッド機能性キャリアーとして利用可能となる。 As described above, a complex formed by β-1,3-glucan and a nucleic acid is a β-1,3-glucan double strand and a nucleic acid single strand, ie, β-1, It consists of two 3-glucan molecules. A pair of β-1,3-glucans introduced with a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disruptive functional group (for example, β-1,3-glucan introduced with galactose and β-1,3-glucan introduced with PEG) : A) in FIG. 11 is mixed at the time of conjugation to form a new complex composed of one each of two types of β-1,3-glucans having different functions added to one nucleic acid molecule. This can be used, for example, as a hybrid functional carrier having both the ability of galactose to permeate through a hepatocyte-specific receptor and the ability of PEG to avoid degradation in lysosomes.
また、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンを核酸との複合体化に供してもよく、このような細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンとしては、一般に、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とが連結しているものを用いる。例えば、ＰＥＧを側鎖に修飾したβ−１，３−グルカンのＰＥＧ末端に細胞膜透過性官能基（例えば、ガラクトース）を共有結合により連結させたβ−１，３−グルカンを核酸と複合体化する（図１１のＢ）ことにより、ＰＥＧを修飾したβ−１，３−グルカンの細胞内におけるリソソームでの分解回避能（特許文献１２）と細胞膜透過能（ガラクトースによる肝細胞特異的細胞膜透過能の付加）の２つの機能を併せ持つハイブリッド機能性キャリアーとして利用する。 Further, β-1,3-glucan having both a cell membrane permeable functional group and a lipid membrane disruptive functional group may be used for complexation with a nucleic acid, and such cell membrane permeable functional group and lipid membrane disruption may be provided. As the β-1,3-glucan having both a functional group and a functional group, a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group are generally used. For example, β-1,3-glucan obtained by covalently linking a cell membrane-permeable functional group (eg, galactose) to the PEG end of β-1,3-glucan modified with PEG on the side chain is complexed with a nucleic acid. By doing (B in FIG. 11), the ability of β-1,3-glucan modified with PEG to avoid degradation in lysosomes in cells (Patent Document 12) and cell membrane permeability (hepatocyte-specific cell membrane permeability by galactose) It is used as a hybrid functional carrier that has two functions.
如上の手段の他に、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンとして、シクロデキストリン（ＣｙＤ）残基に包接される疎水性ゲスト分子を介して該ＣｙＤ残基と単糖またはオリゴ糖の残基が連結しているβ−１，３−グルカンを用いることもできる。例えば、β−１，３−グルカンの側鎖にＣｙＤを修飾することで、β−１，３−グルカンに脂質膜撹乱能の付加価値が与えられるが、さらに、得られたＣｙＤ修飾β−１，３−グルカンをガラクトースで修飾したアダマンタン（疎水性ゲスト分子）と混合すると、ＣｙＤの疎水分子包接能によって、側鎖のＣｙＤにガラクトース修飾アダマンタンが包接される（図１１のＣ）。すなわち、細胞膜透過性官能基であるガラクトースとリソソーム分解回避能をもつＣｙＤとがアダマンタンを介してβ−１，３−グルカンの側鎖上で連結したことになる。このように生成した２官能性β−１，３−グルカンは、ハイブリッド遺伝子キャリアーとして利用することができる。 In addition to the above means, as a β-1,3-glucan having both a cell membrane-permeable functional group and a lipid membrane disrupting functional group, via a hydrophobic guest molecule included in a cyclodextrin (CyD) residue Β-1,3-glucan in which the CyD residue is linked to a monosaccharide or oligosaccharide residue can also be used. For example, by modifying CyD on the side chain of β-1,3-glucan, the added value of lipid membrane disrupting ability is given to β-1,3-glucan. Furthermore, the obtained CyD-modified β-1 , 3-glucan is mixed with adamantane (hydrophobic guest molecule) modified with galactose, the galactose-modified adamantane is included in CyD of the side chain due to the hydrophobic molecule inclusion ability of CyD (C in FIG. 11). That is, galactose which is a cell membrane-permeable functional group and CyD having lysosome degradation avoidance ability are linked on the side chain of β-1,3-glucan via adamantane. The bifunctional β-1,3-glucan thus generated can be used as a hybrid gene carrier.
既述のように、本発明で使用する異なる官能基を修飾したβ−１，３−グルカンは、核酸との複合体化前に溶媒中で混合する。ＣｙＤを修飾したβ−１，３−グルカンと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストの場合もまた、核酸との複合化前に溶媒中で混合し結合させる。 As described above, the β-1,3-glucan modified with different functional groups used in the present invention is mixed in a solvent before complexing with a nucleic acid. In the case of β-1,3-glucan modified with CyD and a hydrophobic guest modified with a cell membrane-permeable functional group, they are mixed and bound in a solvent before complexing with a nucleic acid.
本発明で用いられるβ−１，３−グルカンとは、よく知られているように、グルコースがβ１→３グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合の異なる各種のものが知られている。その中でも、後述するように細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基を導入する反応の容易性から、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのように主鎖に対して約３０％以上の側鎖のグルコース残基を有するβ−１，３−グルカンが好適である。 As is well known, β-1,3-glucan used in the present invention is a polysaccharide in which glucose is bound by β1 → 3 glucoside bonds, and glucose in the side chain with respect to the number of glucose residues in the main chain. Various types having different ratios of the number of residues are known. Among them, as will be described later, from the ease of reaction for introducing a cell membrane permeable functional group or lipid membrane disruptive functional group, about 30% or more side chains with respect to the main chain such as schizophyllan, lentinan or scleroglucan. Β-1,3-glucan having the following glucose residues is preferred.
原料となるβ−１，３−グルカンに、所望の細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基を導入する方法としては、種々の反応が考えられるが、主鎖のグルコシド結合に影響を与えることなしに、側鎖に選択的に導入する方法として、β−１，３−グルカンに元々付いている側鎖のグルコースを利用し、過ヨウ素酸酸化／還元アミノ化を経由する方法が適当である。例えば、まず、側鎖のグルコースを過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化し、開環してカルボニルをつくる。それに導入する官能基のアミン誘導体と水素化ホウ素ナトリウムを反応させ、還元アミノ化することにより、アミド結合をリンカーとする、所望の官能基が導入された側鎖を有するβ−１，３−グルカンが得られる。例えば、β−１，３−グルカンに細胞膜透過性官能基としてグルコースを導入する場合には、アミン誘導体であるアミノエチルグルコシドと水素化ホウ素ナトリウムを反応させ、還元アミノ化することにより、側鎖にグルコースが導入できる（実施例２、図１参照）。
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
As a method for introducing a desired cell membrane-permeable functional group or lipid membrane-disturbing functional group into β-1,3-glucan as a raw material, various reactions can be considered, but this affects the glucoside bond of the main chain. As a method of selectively introducing into the side chain, a method of utilizing glucose of the side chain originally attached to β-1,3-glucan and passing through periodate oxidation / reductive amination is suitable. is there. For example, first, glucose in the side chain is oxidized with sodium periodate and opened to form carbonyl. A β-1,3-glucan having a side chain into which a desired functional group is introduced having an amide bond as a linker by reacting an amine derivative of a functional group to be introduced with sodium borohydride and reductive amination Is obtained. For example, when introducing glucose as a cell membrane-permeable functional group into β-1,3-glucan, aminoaminoglucoside, which is an amine derivative, is reacted with sodium borohydride and reductively aminated to form a side chain. Glucose can be introduced (see Example 2, FIG. 1).
Examples are shown below to illustrate the features of the present invention more specifically, but the present invention is not limited to these examples.
β−１，３−グルカン（シゾフィラン）の調製 原料となるβ−１，３−グルカンとして、３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手したSchizophyllum commune. Fries（ＡＴＣＣ ４４２００）を、最小培地を用いて7日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量45万の3重螺旋シゾフィランを得た。以下、シゾフィランをＳＰＧと表記することがある。
ＰＥＧ修飾シゾフィランの合成 ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。すなわち、実施例１で得られたシゾフィランの側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成したアルデヒドとアミン末端を持つＰＥＧ（ここでは分子量5,000）との還元アミノ化反応によりＰＥＧを導入した。但し、側鎖へ選択的にＰＥＧを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液にアミン末端を持つＰＥＧ100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することでPEG修飾シゾフィラン（以下、ＰＥＧ−ＳＰＧ）を得た。ＰＥＧのシゾフィランへの導入率は添加する過ヨウ素酸ナトリウムの当量数で制御することが可能であり、側鎖グルコース残基に対して1.0当量、5.0当量のものについても同様に合成を行った。
Synthesis of PEG-modified schizophyllan The synthesis of PEG (polyethylene glycol) -modified schizophyllan was synthesized according to the scheme of FIG. That is, the side chain of schizophyllan obtained in Example 1 was oxidized with periodate, and PEG was introduced by a reductive amination reaction between the produced aldehyde and PEG having an amine terminal (here, molecular weight 5,000). However, the synthesis method is not particularly limited as long as PEG can be selectively introduced into the side chain.
100 mg of schizophyllan prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to the side-chain glucose residue) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added to the previously prepared schizophyllan solution with cooling and stirring at 4 ° C. Two days later, the reaction solution was dialyzed against a dialysis membrane (exclusion limit 12000).
100 mg of PEG having an amine end was added to the resulting solution, dissolved, and stirred overnight at room temperature. 100 mg of sodium cyanoborohydride was added to the reaction solution, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and lyophilized. The obtained white solid was dissolved in 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, 100 mg of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and lyophilized to obtain PEG-modified schizophyllan (hereinafter, PEG-SPG). The rate of introduction of PEG into schizophyllan can be controlled by the number of equivalents of sodium periodate to be added, and 1.0 equivalent and 5.0 equivalents of side chain glucose residues were synthesized in the same manner.
ガラクトース修飾シゾフィランの合成 ガラクトース修飾シゾフィランは図１のスキームに従って合成した。例としてラクトノラクトンを用いた場合の合成法を示しているが、同様の合成法はすべての還元糖類（単糖、オリゴ糖、多糖）の導入に適用することができる。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、ラクトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ガラクトース修飾シゾフィラン（以下、Ｇａｌ−ＳＰＧ）を得た。 Synthesis of galactose modified schizophyllan Galactose modified schizophyllan was synthesized according to the scheme of FIG. A synthesis method using lactonolactone is shown as an example, but the same synthesis method can be applied to the introduction of all reducing sugars (monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides). 100 mg of schizophyllan having a molecular weight of 450,000 prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to side chain glucose) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added at 4 ° C. with cooling and stirring. The reaction solution was continuously stirred in the refrigerator for 2 days. After dialysis of the reaction solution with a dialysis membrane (exclusion limit 12000), 40 ml of 28% aqueous ammonia solution and 100 mg of sodium cyanoborohydride were added, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized. The resulting white solid was dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide, 1 g of lactonolactone (large excess) was added, and stirring was continued for 1 week at room temperature. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized to obtain galactose-modified schizophyllan (hereinafter, Gal-SPG).
グルコース修飾シゾフィランの合成 グルコース修飾シゾフィランの合成法は図１のスキームに従い合成し、ラクトノラクトンの代わりにここではマルトノラクトンを用いている。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、マルトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、グルコース修飾シゾフィラン（以下、Ｇｌｕ−ＳＰＧ）を得た。 Synthesis of glucose-modified schizophyllan The method of synthesizing glucose-modified schizophyllan is synthesized according to the scheme of FIG. 1, and maltonolactone is used here instead of lactonolactone. 100 mg of schizophyllan having a molecular weight of 450,000 prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to side chain glucose) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added at 4 ° C. with cooling and stirring. The reaction solution was continuously stirred in the refrigerator for 2 days. After dialysis of the reaction solution with a dialysis membrane (exclusion limit 12000), 40 ml of 28% aqueous ammonia solution and 100 mg of sodium cyanoborohydride were added, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized. The obtained white solid was dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide, 1 g (large excess) of maltonolactone was added, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then freeze-dried to obtain glucose-modified schizophyllan (hereinafter Glu-SPG).
ＰＥＧの末端にガラクトースまたはグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランの合成 ＰＥＧの末端にガラクトースまたはグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。シゾフィラン側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成した両末端にアミンを持つＰＥＧ（ここでは分子量200、600、1000、6000）との還元アミノ化反応によるＰＥＧの導入法を示しているが、側鎖へ選択的にＰＥＧを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液に両末端にアミンを持つＰＥＧ100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することで末端にアミンを持つＰＥＧ修飾シゾフィランを得た。
調製された末端にアミンを有するシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、ラクトノラクトンまたはマルトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＰＥＧの末端にガラクトースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィラン（以下、Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧ）およびＰＥＧの末端にグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィラン（以下、Ｇｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧ）を得た。今回、ＰＥＧの分子量が200であるＧａｌ−ＰＥＧ 200−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ 200−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が600であるＧａｌ−ＰＥＧ 600−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ 600−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が1000であるＧａｌ−ＰＥＧ 1K−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ １Ｋ−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が6000であるＧａｌ−ＰＥＧ ６Ｋ−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ ６Ｋ−ＳＰＧを得た。
Synthesis of PEG-modified schizophyllan in which galactose or glucose is bonded to the end of PEG The synthesis of PEG-modified schizophyllan in which galactose or glucose is bonded to the end of PEG was synthesized according to the scheme of FIG. The method of introducing PEG by reductive amination reaction with PEG (with
100 mg of schizophyllan prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to the side-chain glucose residue) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added to the previously prepared schizophyllan solution with cooling and stirring at 4 ° C. Two days later, the reaction solution was dialyzed against a dialysis membrane (exclusion limit 12000).
To the obtained solution, 100 mg of PEG having amines at both ends was added, dissolved, and stirred overnight at room temperature. 100 mg of sodium cyanoborohydride was added to the reaction solution, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and lyophilized. The obtained white solid was dissolved in 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, 100 mg of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and freeze-dried to obtain a PEG-modified schizophyllan having an amine at the end.
100 mg of schizophyllan having an amine at the prepared end was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to side chain glucose) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added at 4 ° C. with cooling and stirring. The reaction solution was continuously stirred in the refrigerator for 2 days. After dialysis of the reaction solution with a dialysis membrane (exclusion limit 12000), 40 ml of 28% aqueous ammonia solution and 100 mg of sodium cyanoborohydride were added, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized. The resulting white solid was dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide, 1 g of lactonolactone or maltonolactone (large excess) was added, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000), freeze-dried, PEG-modified schizophyllan (hereinafter, Gal-PEG-SPG) in which galactose was bonded to the end of PEG, and PEG in which glucose was bonded to the end of PEG. Modified schizophyllan (hereinafter Glu-PEG-SPG) was obtained. This time, Gal-PEG 200-SPG and Glu-PEG 200-SPG with a molecular weight of PEG of 200, Gal-PEG 600-SPG and Glu-PEG 600-SPG with a molecular weight of 600, and a molecular weight of PEG of 1000 There were obtained Gal-
ＣｙＤ修飾シゾフィランの合成 ＣｙＤ（シクロデキストリン）修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。シゾフィラン側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成したアミン末端を持つＣｙＤ（ここではβＣｙＤ）との還元アミノ化反応によるＣｙＤの導入法を示しているが、側鎖へ選択的にＣｙＤを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液にアミン末端を持つＣｙＤ（ここではβＣｙＤ）100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することでアミン末端を持つＣｙＤ修飾シゾフィラン（以下、βＣｙＤ−ＳＰＧ）を得た。
100 mg of schizophyllan prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to the side-chain glucose residue) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added to the previously prepared schizophyllan solution with cooling and stirring at 4 ° C. Two days later, the reaction solution was dialyzed against a dialysis membrane (exclusion limit 12000).
To the obtained solution, 100 mg of CyD having an amine end (here, βCyD) was added, dissolved, and stirred overnight at room temperature. 100 mg of sodium cyanoborohydride was added to the reaction solution, and stirring was continued at room temperature for 1 week. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and lyophilized. The obtained white solid was dissolved in 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, 100 mg of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and freeze-dried to obtain CyD-modified schizophyllan (hereinafter βCyD-SPG) having an amine terminal.
ガラクトース修飾アダマンタンおよびグルコース修飾アダマンタンの合成 1-アミノエチルアダマンタン0.50g(3.0mmol)とラクトノラクトンまたはマルトノラクトン1.53g(4.5mmol)をメタノール中で一晩攪拌する。これを濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した（溶離剤：クロロホルム／メタノール３：２）。得られた黄色固体をｎ−ブタノール／ｎ−ヘキサンを用いて再結晶し、白色固体のガラクトース修飾アダマンタン（以下、Ｇａｌ−Ａｄｍ）およびグルコース修飾アダマンタン（Ｇｌｕ−Ａｄｍ）を得た。アダマンタンへ選択的に細胞膜透過性官能基を導入できれば合成法は特に制限されない。 Synthesis of galactose-modified adamantane and glucose-modified adamantane 0.50 g (3.0 mmol) of 1-aminoethyladamantane and 1.53 g (4.5 mmol) of lactonolactone or maltonolactone are stirred overnight in methanol. This was concentrated and purified by column chromatography (eluent: chloroform / methanol 3: 2). The obtained yellow solid was recrystallized using n-butanol / n-hexane to obtain white solids of galactose-modified adamantane (hereinafter, Gal-Adm) and glucose-modified adamantane (Glu-Adm). The synthesis method is not particularly limited as long as a cell membrane-permeable functional group can be selectively introduced into adamantane.
化学修飾シゾフィランのキャラクタリゼーション 実施例２から実施例７にて得られた各化学修飾シゾフィランの細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基の導入率は、元素分析における窒素含有率から算出され、表１に示す導入率を得た。 Characterization of chemically modified schizophyllan The introduction rate of cell membrane permeable functional groups and lipid membrane disruptive functional groups of each chemically modified schizophyllan obtained in Examples 2 to 7 was calculated from the nitrogen content in elemental analysis, The introduction rate shown in Table 1 was obtained.
蛍光標識シゾフィランの合成 この実施例９および実施例１０は、後述の実施例１３で用いるサンプルを調製するためのものである。ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）中でシゾフィラン100mgとフルオロセインイソチオシアネート5mg（以下、ＦＩＴＣ）を混合し、遮光して３日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＦＩＴＣ標識シゾフィラン（以下、ＳＰＧ−ＦＩＴＣ）を得た。ＳＰＧに蛍光基を導入できれば合成法は特に制限されない。 Synthesis of fluorescently labeled schizophyllan Examples 9 and 10 are for preparing samples used in Example 13 described later. 100 mg of schizophyllan and 5 mg of fluorescein isothiocyanate (hereinafter referred to as FITC) were mixed in dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO), and the mixture was stirred for 3 days in the dark. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized to obtain FITC-labeled schizophyllan (hereinafter, SPG-FITC). The synthesis method is not particularly limited as long as a fluorescent group can be introduced into SPG.
蛍光標識アミノエタノール修飾シゾフィランの合成 アミノエタノール修飾シゾフィランは図１のスキームに従って合成した。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、２−アミノエタノール2ml（大過剰）を加え、一日後、水素化ホウ素ナトリウム200mg添加し、室温で３間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、アミノエタノール修飾シゾフィラン（以下、ＡＥ−ＳＰＧ）を得た。さらに、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）中でＡＥ−ＳＰＧ100mgとテトラメチルローダミンイソチオシアネート5mg（以下、ＴＲＩＴＣ）を混合し、遮光して３日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＴＲＩＴＣ標識アミノエタノール修飾シゾフィラン（以下、ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ）を得た。側鎖へ選択的にアミノエタノールや蛍光基を導入できれば合成法は特に制限されない。 Synthesis of fluorescently labeled aminoethanol-modified schizophyllan Aminoethanol -modified schizophyllan was synthesized according to the scheme of FIG. 100 mg of schizophyllan having a molecular weight of 450,000 prepared in Example 1 was dissolved in 100 ml of distilled water. Sodium periodate (3.3 mg, 0.1 equivalent to side chain glucose) was dissolved in a small amount of distilled water, and slowly added at 4 ° C. with cooling and stirring. The reaction solution was continuously stirred in the refrigerator for 2 days. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized. The obtained white solid was dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide, 2 ml of 2-aminoethanol (large excess) was added, and 200 mg of sodium borohydride was added after one day, and stirring was continued for 3 hours at room temperature. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized to obtain aminoethanol-modified schizophyllan (hereinafter referred to as AE-SPG). Further, 100 mg of AE-SPG and 5 mg of tetramethylrhodamine isothiocyanate (hereinafter referred to as TRITC) were mixed in dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO), and the mixture was stirred for 3 days while being shielded from light. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and lyophilized to obtain TRITC-labeled aminoethanol-modified schizophyllan (hereinafter referred to as AE-SPG-TRITC). The synthesis method is not particularly limited as long as aminoethanol or a fluorescent group can be selectively introduced into the side chain.
化学修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体化遺伝子治療剤の調製 実施例２から実施例７で合成された化学修飾シゾフィランをそれぞれジＤＭＳＯに溶解させ、濃度を20mg/mlに調整し、この溶液1μl、純水3μl、10mMのトリス緩衝液（pH7.8）1μlと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（1mg/ml）5μlを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌原遺伝子として文献に報告されているｃ−ｍｙｂ遺伝子のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列”５’−ＧＴＧ ＣＣＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＣＧ ＧＧＣ−３’“を適用した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂに対する参照サンプルとしてアンチセンス効果を持たないアンチセンスシーケンスのスクランブルシーケンスである”５’−ＴＧＣ ＴＧＣ ＧＣＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＧＣＧ−３’“を用いた。じっさいに使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、３’末端に40のｄＡをつけたシーケンスのｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、以下ＡＳ−ｃ−ｍｙｂと表記）、3’末端に40のｄＡをつけたｃ−ｍｙｂホスホロチオエートスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２、以下Ｓｃ−ｃ−ｍｙｂと表記）とした。
化学修飾シゾフィランとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとの複合体形成の円偏光二色性分散計による確認 化学修飾シゾフィランとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を確認するために、既存の手法〔K. Sakurai, S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520 (2000)〕を用いて円偏光二色性スペクトル測定により複合体の融解温度を測定した。測定サンプルは、10mMのＴｒｉｓ緩衝溶液（pH7.8）1050μlと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（0.5mg/ml）30μlを調整し、0.5mg/mlの濃度に調整した化学修飾シゾフィランのＤＭＳＯ溶液120μlを混合した。溶液は透明で、均一であった。４℃で３日間熟成した溶液の円偏光二色性スペクトルを測定した。ここでは、一例として、ＰＥＧ ５Ｋ（１０）−ＳＰＧとＡＳ−ｃ−ｍｙｂが形成した複合体の熱融解曲線を図２に例示した。また、合成した他の化学修飾シゾフィランやＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いても同様の結果が得られた。
図２より融解温度は50℃であり、生体温度においては安定な複合体を形成していることが示された。
Confirmation of formation of complex between chemically modified schizophyllan and antisense strand oligonucleotide by circular dichroism dispersometer In order to confirm formation of complex between chemically modified schizophyllan and antisense strand oligonucleotide, Sakurai, S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122 , 4520 (2000)], and the melting temperature of the composite was measured by circular dichroism spectrum measurement. The measurement sample was 1050 μl of 10 mM Tris buffer solution (pH 7.8) and 30 μl of antisense oligonucleotide solution (0.5 mg / ml), and 120 μl of chemically modified Schizophyllan solution in DMSO adjusted to a concentration of 0.5 mg / ml. Mixed. The solution was clear and uniform. The circular dichroism spectrum of the solution aged at 4 ° C. for 3 days was measured. Here, as an example, a thermal melting curve of a complex formed by
FIG. 2 shows that the melting temperature is 50 ° C. and a stable complex is formed at the living body temperature.
蛍光エネルギー移動を用いた異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸の混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成の評価 異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成能の評価について、蛍光エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）を用いて行った。ここでは、一例として、ＦＩＴＣで標識したシゾフィラン（ＳＰＧ−ＦＩＴＣ）とＴＲＩＴＣで標識したアミノエタノール修飾シゾフィラン（ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ）とｐｏｌｙ（Ｃ）（アマシャムより入手）を利用して、ＦＩＴＣからＴＲＩＴＣへのＦＲＥＴを観測することで、ＳＰＧ−ＦＩＴＣとＡＥ−ＳＰＧ−ＦＩＴＣとｐｏｌｙ（Ｃ）を含むヘテロシゾフィランハイブリッド形成能を評価した。サンプルは、トリス緩衝液10mM、ｐｏｌｙ（Ｃ）0.5mg/ml、ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ0.25mg/ml、ＳＰＧ−ＦＩＴＣ0〜0.25mg/mlを混合し、４℃で３日間静置して複合体を形成させて作成した。常温、FITCの励起波長である490nm（TRITCの励起波長は570nmであり、490nmではＴＲＩＴＣの蛍光はない）で、各サンプルの蛍光スペクトルを測定した。得られた各サンプルのFITCのピークである525nmとＴＲＩＴＣのピークである580nmの蛍光強度の比を取り、ＦＲＥＴの飽和点を100%としてＳＰＧ−ＦＩＴＣとＡＥ−ＳＰＧ−ＦＩＴＣとｐｏｌｙ（Ｃ）を含むヘテロシゾフィランハイブリッド形成率をプロットして図３を得た。図３から、異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成率は、異なる２種類の化学修飾シゾフィラン濃度の割合が１：１であるとき最も高いことが明らかとなった。
および〔比較例１〕
異なる２種類の化学修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を用いた癌細胞増殖抑制 96穴プレートに100μlの10％仔牛胎児血清および1mM非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）に懸濁した2×103個のガラクトース受容体を有するＨｅｐ Ｇ２を播種した。一晩、ＣＯ２インキュベーター内で37℃、5％ＣＯ２下で培養を行った後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例１１で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＰＥＧ ５Ｋ（10）−ＳＰＧおよびＧａｌ（8.7）−ＳＰＧ〔またはＧｌｕ（4.2）−ＳＰＧ〕の複合体を限外ろ過膜（排除限界3000：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、37℃、5％ＣＯ２下で96時間培養後、細胞数をCell
Counting Kit-8（同仁化学研究所）を用いたWST法を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂの最終濃度は50μg/mlとし、すべてのＡＳ−ｃ−ｍｙｂが化学修飾シゾフィランと複合化するように調製した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率100％として細胞増殖を評価した。
その結果を図４に例示する。図４に示すように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＰＥＧ ５Ｋ（10）−ＳＰＧおよびＧａｌ(8.7)−ＳＰＧの複合体である本発明に従う遺伝子治療剤の方が、細胞の生存率が低下するに至っている。また、この効果はＧａｌ(8.7)−ＳＰＧ／ＰＥＧ ５Ｋ(10)−ＳＰＧの混合比（mol/mol；主鎖であるＳＰＧの割合）が0.5から0.75の投与区で特に顕著に現れた。この効果は、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を組み合わせることにより得られたと考えられる。官能基の種類や修飾率、混合比を調整することで目的に合わせた高い効率のこれまでにない核酸キャリアーが得られていることが理解される。Ｈｅｐ Ｇ２に受容体を持たないグルコースを用いたＧｌｕ(4.2)−ＳＰＧ／ＰＥＧ ５Ｋ(10)−ＳＰＧの系では、ガラクトースを用いた場合と比較して癌細胞増殖抑制能が低下した。
2 × suspended in MEM medium (SIGMA) containing 100 μl of 10% calf fetal serum and 1 mM non-essential amino acid in 96-well plate of cancer cell growth inhibition using two different kinds of chemically modified schizophyllan and
The WST method using Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) was used, and the measurement was performed according to the attached protocol. The final concentration of AS-c-myb was 50 μg / ml and prepared so that all AS-c-myb was complexed with chemically modified schizophyllan. Cell proliferation was evaluated with the number of cells in the hole without AS-c-myb added as the survival rate of 100%.
The result is illustrated in FIG. As shown in FIG. 4, the gene therapy agent according to the present invention, which is a complex of AS-c-myb and
および〔比較例２〕
ＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を用いた癌細胞増殖抑制 実施例５で製造したＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランを実施例１４および比較例１と同様にＡＳ−ｃ−ｍｙｂと複合化させ、ガラクトース受容体を有するＨｅｐ Ｇ２に添加し、ＷＳＴ法によって癌細胞増殖抑制試験を行い、アンチセンス能を評価した。図５に示したように、ガラクトースを有するＧａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧをＡＳ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして利用した場合、高い癌細胞増殖抑制効果が得られた。特に、ＰＥＧの分子量が6000であるＧａｌ−ＰＥＧ ６Ｋ−ＳＰＧを用いた場合に顕著な効果が見られた。この結果においてもＰＥＧ修飾ＳＰＧやＧａｌ修飾ＳＰＧ単独をキャリアーとして用いた場合よりも高いアンチセンス効果を示した。実施例で用いた官能基以外の細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を併せ持つ多機能型キャリアーを同様の手法で合成すれば、あらゆる状況に対応できるハイブリッド多糖系キャリアーライブラリーを作成することが可能である。Ｈｅｐ Ｇ２に受容体を持たないグルコースを用いたＧｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧの系では、ガラクトースを用いた場合と比較して癌細胞増殖抑制能が低下した。
And [Comparative Example 2]
Suppression of cancer cell growth using PEG-modified schizophyllan and antisense oligonucleotide complex in which cell membrane-permeable functional group is bonded to the end of PEG PEG having cell membrane-permeable functional group bonded to the end of PEG produced in Example 5 The modified schizophyllan was complexed with AS-c-myb in the same manner as in Example 14 and Comparative Example 1, added to Hep G2 having a galactose receptor, and subjected to a cancer cell growth inhibition test by the WST method to evaluate the antisense ability. did. As shown in FIG. 5, when Gal-PEG-SPG having galactose was used as an AS-c-myb carrier, a high cancer cell proliferation inhibitory effect was obtained. In particular, a remarkable effect was observed when Gal-
〔比較例３〕
ＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランとスクランブルオリゴヌクレオチド複合体を用いた細胞生存率 実施例１５および比較例２と同様の実験系でＡＳ−ｃ−ｍｙｂの代わりにアンチセンス効果を持たないＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いて、Ｈｅｐ Ｇ２細胞生存率を検討した。図６に示したように細胞増殖率が大幅に変化することはなく、安全性の高いキャリアーであることが示された。
[Comparative Example 3]
Cell viability using a scrambled oligonucleotide complex with PEG-modified schizophyllan having a cell membrane-permeable functional group bound to the end of PEG In the same experimental system as Example 15 and Comparative Example 2, anti-antigen instead of AS-c-myb Hep G2 cell viability was examined using Sc-c-myb, which has no sense effect. As shown in FIG. 6, the cell growth rate did not change significantly, indicating that it is a highly safe carrier.
ＣｙＤ−ＳＰＧの疎水ゲスト包接能の保持 ＳＰＧにＣｙＤを化学修飾しても、ＣｙＤ−ＳＰＧに細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストが包接されることに支障がないことを示す必要がある。そこで、一例として、脂質膜やシクロデキストリンなどの高分子の疎水環境を調べる蛍光プローブとしてしばしば用いられるＡＮＳ−Ｎａ（1-Naphthalenesulfonic acid sodium salt）を利用し、βＣｙＤ−ＳＰＧがβＣｙＤそのものと同様にＡＮＳを包接することを示すことができると考えられる。一例として、βＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧ濃度1.34mM（βＣｙＤのみでは138μM、ＳＰＧの側鎖を含むグルコース4分子を1molとした、20mg/mlのβＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧ／ＤＭＳＯ 100μlをtotal
2mlに溶解した)、25℃、水の体積分率Ｖｗ=0.9、励起波長370nmで蛍光測定を行った。図７のように、βＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧがβＣｙＤそのものと同様にＡＮＳを包接することが示された。
Fluorescence was measured at 25 ° C., water volume fraction Vw = 0.9, excitation wavelength 370 nm. As shown in FIG. 7, it was shown that βCyD (10.3) -SPG included ANS similarly to βCyD itself.
ＣｙＤと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストのホスト−ゲスト作用の保持 疎水ゲストに細胞膜透過性官能基を化学修飾しても、ＣｙＤ−ＳＰＧに細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストが包接されることに支障がないことを示す必要がある。そこで、一例として、核酸やシクロデキストリンの蛍光プローブとしてよく用いられるdansyl(５−dimethylamino−１−naphthalenesulfonyl)基を導入したβＣｙＤ（以下、βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ）を利用し、βＣｙＤとＧａｌ−Ａｄｍがホスト−ゲスト会合体を形成するかどうか検討した。βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ／Ｇａｌ−Ａｄｍの系では、βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ濃度2μM、25℃、水の体積分率Ｖｗ=0.9、励起波長375nmで蛍光測定を行った。図８のように、βＣｙＤとＧａｌ−Ａｄｍがホスト−ゲスト会合体を形成することが示された。この結果と実施例１７の結果から、βＣｙＤ−ＳＰＧとＧａｌ−Ａｄｍがホスト-ゲスト会合体を形成することが示唆される。
および〔比較例４〕
ＣｙＤ−ＳＰＧと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水性ゲストをアンチセンスオリゴヌクレオチドキャリアーとして利用した癌細胞増殖抑制 一例として、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｃ−Ａｄｍ、βＣｙＤ−ＳＰＧ会合体を用いて、ガラクトースを特異的に認識するアシアロ糖レセプターを持つ肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）に対する癌細胞増殖抑制効果の向上を目的としたアンチセンス効果をＷＳＴ法によって検討した。サンプルや測定法については、実施例１４で述べたものと同様である。Ｇａｌ−Ａｄｍは、サンプル調製時に100μg/ml、つまり、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−Ａｄｍが半分程度会合体を形成している状態で添加した。図９に示した癌細胞増殖抑制試験の結果から、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−Ａｄｍ会合体を用いることで、Ｈｅｐ Ｇ２への高い細胞認識能とアンチセンス効果の上昇が見られた。
And [Comparative Example 4]
Examples of cancer cell growth inhibition using CyD-SPG and a hydrophobic guest modified with a cell membrane-permeable functional group as an antisense oligonucleotide carrier include βCyD-SPG / Gal-Adm, βCyD-SPG / Glc-Adm, βCyD-SPG Using the aggregate, an antisense effect aimed at improving the cancer cell proliferation inhibitory effect on liver cancer cells (Hep G2) having an asialoglycoreceptor that specifically recognizes galactose was examined by the WST method. The sample and measurement method are the same as those described in Example 14. Gal-Adm was added at the time of sample preparation in a state where 100 μg / ml, that is, βCyD-SPG / Gal-Adm formed an aggregate of about half. From the results of the cancer cell growth inhibition test shown in FIG. 9, the use of βCyD-SPG / Gal-Adm aggregate showed a high cell recognition ability to Hep G2 and an increase in the antisense effect.
〔比較例５〕
ＣｙＤ−ＳＰＧと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水性ゲストをスクランブルオリゴヌクレオチドキャリアーとして利用した癌細胞生存率 一例として、癌原遺伝子ｃ−ｍｙｂのアンチセンス鎖であるＡＳ−ｃ−ｍｙｂのスクランブル配列であるＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いて、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｃ−Ａｄｍ、βＣｙＤ−ＳＰＧと複合化させ、ＷＳＴ試験を行った。サンプルや測定法については、実施例１８および比較例４で述べたものと同様である。いずれのキャリアーを用いた場合でも図１０に示したように細胞増殖率が大幅に変化することはなく、安全性の高いキャリアーであることが示された。
[Comparative Example 5]
As an example of cancer cell viability using a hydrophobic guest modified with CyD-SPG and a cell membrane-permeable functional group as a scrambled oligonucleotide carrier, the scrambled sequence of AS-c-myb which is the antisense strand of the proto-oncogene c-myb Using Sc-c-myb, βCyD-SPG / Gal-Adm, βCyD-SPG / Glc-Adm, and βCyD-SPG were combined to perform a WST test. The sample and measurement method are the same as those described in Example 18 and Comparative Example 4. When any carrier was used, the cell proliferation rate did not change significantly as shown in FIG. 10, indicating that the carrier is highly safe.
本発明は、トランスフェクション能が高く生体に安全な核酸の標的細胞への導入技術として、標的指向性が高く、治療効果に優れた、かつ生体に安全な遺伝子治療の分野での利用が期待される。 The present invention is expected to be used in the field of gene therapy as a technology for introducing a nucleic acid having high transfection ability and safe for living organisms into a target cell, having high target directivity, excellent therapeutic effect and safe for living organisms. The
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