JP4677568B2 - Production method of plants that grow nodules with high nitrogen fixation activity - Google Patents

Production method of plants that grow nodules with high nitrogen fixation activity Download PDF

Info

Publication number
JP4677568B2
JP4677568B2 JP2007508097A JP2007508097A JP4677568B2 JP 4677568 B2 JP4677568 B2 JP 4677568B2 JP 2007508097 A JP2007508097 A JP 2007508097A JP 2007508097 A JP2007508097 A JP 2007508097A JP 4677568 B2 JP4677568 B2 JP 4677568B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
symbiotic
plant
activity
dna
globin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2007508097A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2006098225A1 (en
Inventor
俊樹 内海
宜司 下田
Original Assignee
国立大学法人 鹿児島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 鹿児島大学 filed Critical 国立大学法人 鹿児島大学
Publication of JPWO2006098225A1 publication Critical patent/JPWO2006098225A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4677568B2 publication Critical patent/JP4677568B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Description

本発明は、窒素固定活性の高い根粒を着生する植物の作出法に関する。   The present invention relates to a method for producing a plant in which a nodule having high nitrogen fixation activity is formed.

ダイズ、アズキ、インゲンマメ等のマメ科作物は、根粒菌の感染によって共生器官である根粒を着生（形成）し、この根粒中に共生している根粒菌（バクテロイド）が空中窒素固定を行うことにより、窒素含量の低い土壌においても良好に生育することができる。このため、マメ科作物を栽培する場合には、通常の肥料を与えること以外に、予め培養した根粒菌を作物の種子に塗布することが行われている。マメ科作物における根粒の窒素固定能をさらに高めるために、窒素固定能を増強した根粒菌の開発なども行われている（特許文献１）。
マメ科作物以外にも、アカシア、ネムノキなどのマメ科樹木や、ハンノキ、ヤシャブシなどの非マメ科樹木で、根に共生窒素固定菌が住み着いて根粒を形成し、効率よく空中窒素を固定して宿主樹木に窒素を供給することが知られている。これらの根粒を着生する樹木では、葉の窒素濃度が高く、そのため落葉の窒素濃度も高い。このことから根粒を着生する樹木は、土壌中の微生物量を増やし肥沃な土壌に改良するのに有効であり、いわゆる肥料木として荒地の緑化にも使用されている。
このような植物の根粒の窒素固定能を増強することは、農業上だけでなく環境保全の上でも非常に有用と思われる。
ところで、マメ科植物の根粒細胞には、マメ科植物だけが持つ共生型グロビン遺伝子が非常に強く発現していることが知られている。共生型グロビン遺伝子の遺伝子産物であるグロビンとヘムから構成される共生型ヘモグロビン（レグヘモグロビンとも呼ばれる）は、根粒の全可溶性タンパク質の２０〜３０％を占めると言われるが、根粒以外の組織には全く存在していない。共生型ヘモグロビンは、動物の血液中のヘモグロビンと同様に、酸素等と強い親和性を示す。共生型ヘモグロビンは、根粒細胞内の酸素分圧を、根粒中の根粒菌の呼吸に十分であり、かつ根粒菌の窒素固定能に必要なニトロゲナーゼ（酸素により失活する）を失活させないレベルに調節する機能を担うとされている。
一方、近年の遺伝子解析技術の発展に伴い、マメ科植物以外の植物もグロビン遺伝子を持つことが明らかになってきた。マメ科植物以外の植物で発見されたグロビン遺伝子は、マメ科植物が持つ共生型グロビン遺伝子とは異なる遺伝子であったため、「非共生型グロビン遺伝子」（非共生型ヘモグロビン遺伝子とも呼ばれる）と名付けられた。現在では、全ての植物が非共生型グロビン遺伝子を持つと考えられている。すなわち、マメ科植物は共生型グロビン遺伝子と非共生型グロビン遺伝子の両方を持つが、非マメ科植物は非共生型グロビン遺伝子のみを持つと考えられる。マメ科のモデル植物であるミヤコグサでも、非共生型グロビン遺伝子が報告されている（非特許文献１）。
非共生型グロビン遺伝子は、共生型グロビン遺伝子とは異なり、植物の全ての組織で発現していることが知られている。低温（４℃）や低酸素分圧（酸素濃度５％以下）に植物をさらすと、非共生型グロビン遺伝子の発現量が増加することが報告されている。非共生型グロビン遺伝子を導入して過剰発現させたシロイヌナズナでは、低酸素ストレスに対する耐性が強化されたという報告もある（非特許文献２）。
特開２００３−３３１７４号公報 Ｕｃｈｉｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）４３（１１）：ｐ．１３５１−１３５８ Ｈｕｎｔ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００２）ＵＳＡ９９：ｐ．１７１９７−１７２０２ Leguminous crops such as soybean, azuki bean, kidney bean, etc., grow (form) the nodules that are symbiotic organs by infection with rhizobia, and the rhizobia (bacteroids) symbiotic in these nodules perform nitrogen fixation in the air Therefore, it can grow well even in soil with a low nitrogen content. For this reason, when cultivating leguminous crops, in addition to applying ordinary fertilizer, pre-cultured rhizobia is applied to the seeds of the crop. In order to further increase the nitrogen fixing ability of nodules in legume crops, development of rhizobia having enhanced nitrogen fixing ability has been carried out (Patent Document 1).
In addition to leguminous crops, leguminous trees such as Acacia and Nemunoki, and non-leguminous trees such as alder and Yashabushi, where symbiotic nitrogen-fixing bacteria settle in the roots to form nodules and efficiently fix aerial nitrogen. It is known to supply nitrogen to the host tree. Trees that grow these nodules have a high nitrogen concentration in the leaves and therefore a high nitrogen concentration in the fallen leaves. For this reason, trees with root nodules are effective in increasing the amount of microorganisms in the soil and improving them into fertile soil, and are also used for greening of wasteland as so-called fertilizer trees.
Enhancing the nitrogen fixing ability of such plant nodules seems to be very useful not only for agriculture but also for environmental conservation.
By the way, it is known that the symbiotic globin gene possessed only by legumes is expressed very strongly in the nodule cells of legumes. Symbiotic hemoglobin (also called leghemoglobin) composed of globin and heme, which is a gene product of the symbiotic globin gene, is said to occupy 20-30% of the total soluble protein of the nodule. It doesn't exist at all. Symbiotic hemoglobin exhibits a strong affinity for oxygen and the like, similar to hemoglobin in animal blood. Symbiotic hemoglobin reduces the oxygen partial pressure in the nodule cells to a level that is sufficient for the respiration of the rhizobia in the nodule and does not deactivate nitrogenase (deactivated by oxygen), which is necessary for the nitrogen fixing ability of the rhizobia. It is said to be responsible for adjusting functions.
On the other hand, with the recent development of gene analysis technology, it has become clear that plants other than legumes also have globin genes. The globin gene found in plants other than legumes was named a “non-symbiotic globin gene” (also called a non-symbiotic hemoglobin gene) because it was different from the symbiotic globin genes of legumes. It was. Currently, all plants are thought to have non-symbiotic globin genes. That is, leguminous plants have both symbiotic globin genes and non-symbiotic globin genes, but non-leguminous plants have only non-symbiotic globin genes. A non-symbiotic globin gene has also been reported in Miyakogusa, which is a model plant of the legume family (Non-patent Document 1).
It is known that non-symbiotic globin genes are expressed in all tissues of plants, unlike symbiotic globin genes. It has been reported that the expression level of non-symbiotic globin genes increases when plants are exposed to low temperature (4 ° C.) or low oxygen partial pressure (oxygen concentration of 5% or less). There is a report that Arabidopsis thaliana overexpressed by introducing a non-symbiotic globin gene has enhanced resistance to hypoxic stress (Non-patent Document 2).
JP 2003-33174 A Uchiumi et al. , Plant Cell Physiol. (2002) 43 (11): p. 1351-1358 Hunt, P.M. W. , Et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (2002) USA99: p. 17197-17202

本発明は、窒素固定活性が増大した根粒を着生する根粒着生植物の作出方法、そして根粒において高い窒素固定活性を示す根粒着生植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子を導入して過剰発現させたミヤコグサ、及びヤシャブシ非共生型グロビン遺伝子を導入して過剰発現させたミヤコグサは、窒素固定活性の高い根粒を着生できることを見出し、その知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］非共生型グロビン遺伝子を根粒着生植物中で過剰発現させることを特徴とする、窒素固定活性が増大した根粒を着生できる根粒着生植物の作出方法。
この方法において非共生型グロビン遺伝子としては、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡからなるものがより好ましい：
（ａ）配列番号１又は８に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号３又は１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
この方法においては、好ましくは、過剰発現プロモーターに連結された非共生型グロビン遺伝子を根粒着生植物に導入することにより、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させる。
この方法により、好ましくは、野生株と比較して窒素固定活性が少なくとも３倍に増大した根粒を着生できる根粒着生植物を作出することができる。この方法により作出される根粒着生植物は、好ましくは、１０〜１００ｎＭ／ｍｉｎ／ｇの窒素固定活性を示す、窒素固定活性が増大した根粒を着生することができる。
この方法において非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させる根粒着生植物は、マメ科植物であることが好ましい。さらにこの方法では、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させた根粒着生植物に、さらに共生窒素固定菌を接種することがより好ましい。
［２］上記１の方法によって作出される、窒素固定活性が増大した根粒を着生できる根粒着生植物。この根粒着生植物は、根に根粒を有しているものがより好ましい。
［３］過剰発現プロモーターに連結された非共生型グロビン遺伝子を含む、根粒の窒素固定活性を増大させるためのベクター。
このベクターに含まれる非共生型グロビン遺伝子としては、マメ科植物又は非マメ科根粒着生植物由来のものが好ましい。その非共生型グロビン遺伝子としては、上記［１］の（ａ）〜（ｅ）に示すＤＮＡがなお好ましい。
［４］上記［２］の根粒着生植物を栽培することを特徴とする、植物栽培における窒素固定効率を増大させる方法。
本発明の根粒着生植物の作出法によれば、所望の根粒着生植物において、根粒の窒素固定活性を格段に向上させることができる。本発明の根粒の窒素固定活性を増大させるためのベクターは、この作出法において使用すると、根粒の窒素固定活性を顕著に増大させることができる。また本発明で得られる根粒着生植物は、高い窒素固定活性を有する根粒を着生することができ、その結果、その植物の生長が促進され、窒素含量も増加する。本発明に係る、根粒着生植物を栽培することにより植物栽培における窒素固定量を増大させる方法は、ある環境において空気中から固定される窒素量を増大させ、その環境下での当該根粒着生植物の収量又は生長量を増大させるだけでなく、ひいては土壌中の窒素量を増大させて土壌を肥沃化することができる。
本願明細書は、本願の優先権の主張の基礎となる日本国特許出願２００５−０７１６７７号の明細書および図面に記載された内容を包含する。An object of the present invention is to provide a method for producing a nodule-growing plant that forms a nodule having an increased nitrogen-fixing activity, and a nodule-growing plant that exhibits high nitrogen-fixing activity in the nodule.
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors introduced Miyakogusa non-symbiotic globin gene and overexpressed it, and Yachabushi nonsymbiotic globin gene introduced and overexpressed. Miyakogusa has found that root nodules with high nitrogen-fixing activity can be established, and has completed the present invention based on the findings.
That is, the present invention includes the following.
[1] A method for producing a nodule-growing plant capable of growing a nodule having increased nitrogen fixation activity, wherein the non-symbiotic globin gene is overexpressed in the nodule-growing plant.
In this method, the non-symbiotic globin gene is more preferably one consisting of DNA selected from the group consisting of the following (a) to (e):
(A) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8
(B) a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8 under a stringent condition and encodes a protein having non-symbiotic globin activity
(C) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9
(D) DNA comprising an amino acid sequence in which 1 to 50 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9, and encoding a protein having non-symbiotic globin activity
(E) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 10.
In this method, preferably, a non-symbiotic globin gene is overexpressed by introducing a non-symbiotic globin gene linked to an overexpression promoter into a nodulating plant.
By this method, it is possible to produce a nodule-growing plant that can preferably grow a nodule having a nitrogen fixation activity increased at least three times that of the wild strain. The nodulating plant produced by this method is preferably capable of growing nodules having an increased nitrogen fixing activity and exhibiting a nitrogen fixing activity of 10 to 100 nM / min / g.
In this method, the nodulating plant that overexpresses the non-symbiotic globin gene is preferably a leguminous plant. Furthermore, in this method, it is more preferable to inoculate a nodulating plant in which the non-symbiotic globin gene is overexpressed with a symbiotic nitrogen-fixing bacterium.
[2] A nodule-growing plant produced by the method 1 described above, capable of growing nodules with increased nitrogen fixation activity. As for this nodulation plant, what has a nodule in a root is more preferable.
[3] A vector for increasing nitrogen fixation activity of nodules, comprising a non-symbiotic globin gene linked to an overexpression promoter.
As the non-symbiotic globin gene contained in this vector, those derived from legumes or non-legume nodulating plants are preferred. As the non-symbiotic globin gene, the DNA shown in (a) to (e) of [1] above is still more preferable.
[4] A method for increasing nitrogen fixation efficiency in plant cultivation, comprising cultivating the nodulating plant of the above [2].
According to the method for producing a nodule-growing plant of the present invention, the nitrogen-fixing activity of the nodule can be significantly improved in the desired nodule-growing plant. When the vector for increasing the nitrogen fixation activity of the nodules of the present invention is used in this production method, the nitrogen fixation activity of the nodules can be remarkably increased. In addition, the nodule-growing plant obtained in the present invention can grow nodules having high nitrogen fixation activity, and as a result, the growth of the plant is promoted and the nitrogen content is also increased. According to the present invention, a method for increasing the nitrogen fixation amount in plant cultivation by cultivating a nodule-growing plant increases the nitrogen amount fixed from the air in a certain environment, and the nodule growth under the environment. Not only can the yield or growth of plants be increased, but by extension, the amount of nitrogen in the soil can be increased to fertilize the soil.
This specification includes the contents described in the specification and drawings of Japanese Patent Application No. 2005-071677, which is the basis for the priority claim of the present application.

図１は、ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子のゲノム構造とアミノ酸配列を示す図である。
図２は、野生型ミヤコグサにおける非共生型グロビン遺伝子の発現量を示す図である。図２Ａは組織別の発現量、図２Ｂはストレス条件下での発現量を示す。
図３は、毛状根の形質転換に用いた形質転換用ベクターの構造を示す図である。
図４は、形質転換体における非共生型グロビン遺伝子導入を確認した実験を示す写真である。図４Ａは、形質転換体における毛状根誘導の様子を示す。図４Ｂは、形質転換根において観察されたＧＦＰ蛍光を示す。図４Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現確認の結果を示す。
図５は、形質転換毛状根における根粒の着生の様子を示す写真である。図５ＡはＬｊＨｂ１遺伝子を含まないベクターを導入したミヤコグサ毛状根（コントロール根）である。図５ＢはＬｊＨｂ１遺伝子を導入しそれを過剰発現させた毛状根である。白抜きの矢じりマークは形質転換毛状根に形成された根粒を示す。網掛けの矢じりマークは、形質転換されなかった毛状根に形成された根粒を示す。形質転換された根粒だけが蛍光を発していることが示されている。
図６は、形質転換毛状根に形成された根粒の窒素固定活性（ＡＲＡ活性）を示すガスクロマトグラフィーによるエチレン量の測定データを示す図である。
図７は、ミヤコグサのグロビンタンパク質を大腸菌で発現させるのに用いたベクターを示す模式図である。
図８は、大腸菌で発現させたミヤコグサグロビンタンパク質（共生型［左のグラフ、図８Ａ］及び非共生型［右のグラフ、図８Ｂ］）と、一酸化窒素との親和性を示す吸光度スペクトルである。各ラインは、それぞれ一酸化窒素と混合した時間毎のデータを示す。
図９は、ＲＴ−ＰＣＲを用いたミヤコグサ形質転換体におけるＡｆＨｂ１遺伝子の発現確認の結果を示す写真である。
図１０は、ＡｆＨｂ１を導入したミヤコグサ形質転換体の植物全体及び形成された根粒における窒素固定活性（ＡＲＡ活性）を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the genomic structure and amino acid sequence of a non-symbiotic globin gene.
FIG. 2 is a diagram showing the expression level of a non-symbiotic globin gene in wild-type Lotus japonicus. FIG. 2A shows the expression level by tissue, and FIG. 2B shows the expression level under stress conditions.
FIG. 3 is a diagram showing the structure of a transformation vector used for transformation of hairy roots.
FIG. 4 is a photograph showing an experiment confirming non-symbiotic globin gene introduction in the transformant. FIG. 4A shows a state of hairy root induction in the transformant. FIG. 4B shows the GFP fluorescence observed in the transformed roots. FIG. 4C shows the results of transgene expression confirmation by RT-PCR.
FIG. 5 is a photograph showing the appearance of nodule formation in transformed hairy roots. FIG. 5A shows hairy roots (control roots) into which a vector not containing the LjHb1 gene has been introduced. FIG. 5B is a hairy root into which the LjHb1 gene was introduced and overexpressed. Open arrowhead marks indicate the nodules formed on the transformed hairy roots. Shaded arrowhead marks indicate nodules formed on hairy roots that were not transformed. Only transformed root nodules have been shown to fluoresce.
FIG. 6 is a graph showing measurement data of ethylene content by gas chromatography showing nitrogen fixation activity (ARA activity) of nodules formed in transformed hairy roots.
FIG. 7 is a schematic diagram showing a vector used to express the globin protein of Lotus japonicus in E. coli.
FIG. 8 is an absorbance spectrum showing the affinity between Miyakogusa globin protein expressed in E. coli (symbiotic type [left graph, FIG. 8A] and non-symbiotic type [right graph, FIG. 8B]) and nitric oxide. is there. Each line shows data for each time mixed with nitric oxide.
FIG. 9 is a photograph showing the results of confirming the expression of the AfHb1 gene in the Lotus japonicus transformant using RT-PCR.
FIG. 10 is a diagram showing nitrogen fixation activity (ARA activity) in the whole plant and the formed nodules of the Lotus japonicus transformant introduced with AfHb1.

以下、本発明を詳細に説明する。
１．根粒着生植物
本発明では、根粒着生植物中で非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させることにより、窒素固定活性が増大した根粒を着生することができる根粒着生植物を作製する。本明細書において根粒着生植物とは、根粒を着生（形成）することができる植物種を意味する。根粒とは、根に共生窒素固定菌が住み着いて粒状の構造を形成した共生器官である。根粒着生植物には、マメ科植物（マメ科作物及びマメ科樹木を含む）の他、アクチノリザル植物と総称される、カバノキ科やハンノキ科などの一部の非マメ科植物（主に非マメ科樹木）も含まれる。マメ科植物の根には根粒菌が共生窒素固定菌として共生し、根粒を形成する。一方、その一部の非マメ科植物では、根に放線菌が共生窒素固定菌として共生し、根粒を形成する。本発明において有用な根粒着生植物としては、マメ科植物ではミヤコグサ、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、アルファルファ、タルウマゴヤシ、クローバー、ササゲ、レンズマメ、ニセアカシア、エニシダ、ハギ、エンジュ、モルッカネムなど、非マメ科植物ではヤシャブシ、ハンノキ、ヤマモモ、モクマオウ、ドクウツギ、グミなどが挙げられる。
本発明において、根粒着生植物は、根粒を着生（形成）することができる生物種の植物である限り、非共生型グロビン遺伝子を導入する時点において、植物体を再生する時点において、あるいは他の任意の時点において、根粒が着生している植物体であっても、根粒が着生していない植物体であってもよい。
本明細書において、用語「根粒着生植物」は、植物体（植物個体全体）だけでなく、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、胚軸、子葉など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）及び植物培養細胞（例えばカルス）などの植物体の任意の部分をも含めて意味するものとする。
２．非共生型グロビン遺伝子とその取得
本発明に係る非共生型グロビン遺伝子は、ヘム（ポルフィリンと２価鉄の錯塩）と会合して非共生型ヘモグロビンを形成するグロビンタンパク質をコードする。この非共生型ヘモグロビンは、動物のヘモグロビンと同様に、酸素、二酸化炭素、一酸化炭素などに対して強い親和性を有するタンパク質である。また非共生型ヘモグロビンは、共生型ヘモグロビンと比較して、酸素や一酸化窒素などに対してより強力な親和性を有する。本明細書では、非共生型グロビン遺伝子にコードされているグロビンの活性を、非共生型グロビン活性と呼ぶ。
本発明に係る非共生型グロビン遺伝子は、任意の植物から単離したものであってよい。本発明の非共生型グロビン遺伝子は、根粒着生植物由来のものがより好ましく、ミヤコグサ、ダイズなどのマメ科植物から単離されるものであってもよいし、ヤシャブシなどの非マメ科の根粒着生植物から単離されるものであってもよい。本発明で用いる非共生型グロビン遺伝子は、さらに、オオムギ、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物を含む、根粒着生植物以外の植物から単離されるものでもよい。なお本発明で用いることができる既知の非共生型グロビン遺伝子として、以下のようなものがある：ミヤコグサ（非特許文献１）、ヤシャブシ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ２２１３４４）、イネ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７６０３０）、アルファルファ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７２１７２；Ｓｅｒｏｇｅｌｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（２０００）４８２，ｐ．１２５−１３０）、ダイズ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４７１４３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３（１２），ｐ．５６８２−５６８７）、シロイヌナズナ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９４９９８；Ｔｒｅｖａｓｋｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９７）９４ｐ．１２２３０−１２２３４）。
本発明で用いる非共生型グロビン遺伝子は、ｃＤＮＡであってもよいし、エキソンとイントロンを含むゲノムＤＮＡであってもよい。本明細書において「遺伝子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、ＤＮＡは少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡを包含し、ＲＮＡは、ｍＲＮＡなどを包含する。本明細書において「遺伝子」は、コード配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などの配列を含んでもよい。
限定するものではないが、好ましい１つの態様では、本発明に係るマメ科植物由来の非共生型グロビン遺伝子として、ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子を用いることができる。例えば、本発明の非共生型グロビン遺伝子として、ミヤコグサから単離した配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、及びミヤコグサから単離した配列番号３の塩基配列からなるゲノム断片のＤＮＡを好適に使用することができる。また、配列番号２のアミノ酸配列からなるミヤコグサ非共生型グロビンタンパク質をコードするＤＮＡも、有利に使用できる。
本発明の非共生型グロビン遺伝子としては、非共生型グロビン活性を有する限り、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜５０個、好ましくは１〜３５個、より好ましくは１若しくは数個（例えば２〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。また本発明で用いる非共生型グロビン遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２のアミノ酸配列からなる非共生型グロビンタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。本発明の非共生型グロビン遺伝子はまた、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
一方、別の態様では、本発明に係る非マメ科根粒着生植物由来の非共生型グロビン遺伝子として、限定するものではないが、例えば、ヤシャブシ非共生型グロビン遺伝子を好適に用いることができる。例えば、本発明の非共生型グロビン遺伝子として、ヤシャブシから単離した配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、及びヤシャブシから単離した配列番号１０の塩基配列からなるゲノム断片のＤＮＡを好適に使用することができる。また、配列番号９のアミノ酸配列からなるヤシャブシ非共生型グロビンタンパク質をコードするＤＮＡも、有利に使用できる。
本発明の非共生型グロビン遺伝子として、非共生型グロビン活性を有する限り、配列番号９に示されるアミノ酸配列において１〜５０個、好ましくは１〜３５個、より好ましくは１若しくは数個（例えば２〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。また本発明で用いる非共生型グロビン遺伝子は、配列番号８に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号９のアミノ酸配列からなる非共生型グロビンタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。本発明の非共生型グロビン遺伝子はまた、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
限定するものではないが、本発明の一実施形態においては、非共生型グロビン遺伝子にコードされたグロビンタンパク質が持つ非共生型グロビン活性は、そのグロビンが形成する非共生型ヘモグロビンの酸素、二酸化炭素、又は一酸化窒素などに対する親和性によって表すことができる。本発明の非共生型グロビン活性は、例えば、その非共生型グロビンをコードする非共生型グロビン遺伝子を含む発現ベクターを用いてグロビンタンパク質を組換え生産し、得られたグロビンタンパク質とヘムとから再構成させた非共生型ヘモグロビンについて、酸素、二酸化炭素、又は一酸化窒素などに対する親和性を常法により測定し、その測定値を指標として表すことができる。非共生型ヘモグロビンの酸素、二酸化炭素、又は一酸化窒素に対する親和性の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
一例として、非共生型ヘモグロビンの一酸化窒素に対する親和性は、一酸化窒素の存在下で５００ｎｍ〜６００ｎｍの波長で吸光度を測定し、その吸光度スペクトルから判断することができる。一般に、ヘモグロビンは５００〜６００ｎｍの波長の光で吸光度曲線を描くと、５４０ｎｍと５７５ｎｍに２つの特徴的なピークが観察される（図８参照）。一酸化窒素との反応終了後の状態のヘモグロビンではこの２つのピークが見られなくなる。そこで、ヘモグロビンタンパク質について、一酸化窒素と混合した後、常法により吸光度スペクトルを解析することにより、そのヘモグロビンタンパク質の一酸化窒素との親和性を測定することができる。なお、単離及び／又は精製されたヘモグロビンは、通常、酸素と結合した状態（オキシヘモグロビンと呼ばれる）で存在する。非共生型ヘモグロビンも、例えば組換え生産される場合、酸素と結合した状態で単離される。非共生型ヘモグロビンは酸素よりも一酸化窒素との親和性が高いことから、単離された非共生型ヘモグロビンに一酸化窒素を添加すると、吸光度スペクトルにおいて２つのピークが消失し、一酸化窒素との反応終了後のスペクトルへの移行が観察されることになる。このようなヘモグロビンの一酸化窒素との親和性測定法については、Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｐｅｒａｚｚｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００４）１６，ｐ．２７８５−２７９４を参照することができる。
以上のようにして測定される吸光度スペクトルを非共生型ヘモグロビンと共生型ヘモグロビンとで比較解析すると、それらの一酸化窒素との親和性を相対的に比較できる。この吸光度スペクトルの比較からは、非共生型ヘモグロビンが、共生型ヘモグロビンと比べて急速に一酸化窒素と結合することができることが示される。本発明では、吸光度スペクトルにおいて非共生型ヘモグロビンと一酸化窒素との結合が示されるまでの一酸化窒素との混合時間を指標として、非共生型ヘモグロビンの一酸化窒素との親和性を判断することができる。
本発明では、例えば、非共生型グロビン（配列番号２又は９）をコードする遺伝子を含むベクターを用いて非共生型グロビンを大腸菌中で組換え生産させ、その大腸菌中で非共生型グロビンとヘムから再構成される非共生型ヘモグロビンを採取し、その非共生型ヘモグロビンについて、上記のような方法で一酸化窒素に対する親和性を測定することができる。本発明の非共生型グロビンは、限定するものではないが、このような非共生型グロビン（配列番号２又は９）由来の非共生型ヘモグロビンの一酸化窒素に対する親和性と比較して、同程度の一酸化窒素に対する親和性を有することが好ましい。
以上のような本発明に係る非共生型グロビン遺伝子は、例えば配列番号１〜３及び８〜１０の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、任意の植物（例えば根粒着生植物；ミヤコグサ、ヤシャブシなど）由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また本発明の非共生型グロビン遺伝子は、任意の植物（例えば根粒着生植物；ミヤコグサ、ヤシャブシなど）由来の核酸を鋳型とし、非共生型グロビン遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。これらの方法において鋳型として用いる核酸は、例えば、任意の植物から、常法により抽出したゲノムＤＮＡであってよいし、常法により抽出したｍＲＮＡから逆転写合成したｃＤＮＡ等であってもよい。鋳型として用いる核酸は、精製ゲノムＤＮＡ、精製ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等であってもよい。あるいは本発明で用いる非共生型グロビン遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、得られた非共生型グロビン遺伝子の塩基配列（ひいてはコードされるアミノ酸配列）に所望の突然変異を導入してもよい。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
３．根粒着生植物における非共生型グロビン遺伝子の過剰発現
本発明では、非共生型グロビン遺伝子を遺伝子工学的手法により根粒着生植物中で過剰発現させる。本発明において、遺伝子を「過剰発現させる」とは、当該遺伝子を、宿主生物中で、任意の遺伝子工学的手法（例えば遺伝子導入）などにより、その宿主生物で通常発現されている量を超える量（例えば１０％以上）で発現するように遺伝子操作するか、または当該遺伝子を持たない宿主生物中に当該遺伝子を導入して発現させることを意味する。非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させる具体的手段は限定されず、当業者に公知の任意の手法を用いることができる。限定するものではないが、一般的な方法としては、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現プロモーターの下流に正しい読み枠で発現されるように連結して構築した形質転換ベクターを、根粒着生植物中に導入する手法が挙げられる。この場合、非共生型グロビン遺伝子をベクター中に組み込むには、例えば、非共生型グロビン遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切り出し、過剰発現プロモーターを含有する発現ベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン・フレームとなるように挿入して連結すればよい。あるいは、予め過剰発現プロモーターの下流に非共生型グロビン遺伝子を連結したＤＮＡ断片を、ベクター中に組み込んでもよい。過剰発現プロモーターに連結した非共生型グロビン遺伝子のゲノム断片を相同組換えなどの方法により根粒着生植物のゲノムＤＮＡに組み込んでもよい。非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させる根粒着生植物としては、上述の任意の根粒着生植物（例えばミヤコグサ）を好適に使用できる。
本発明において、「過剰発現プロモーター」とは、その過剰発現プロモーターに連結した遺伝子を、宿主の植物細胞中で、強力に（大量に）発現させる能力を有するプロモーターを意味する。本発明の過剰発現プロモーターは、特に、根粒特異的な発現をもたらすプロモーター（根粒特異的プロモーター）であってもよい。本発明の過剰発現プロモーターは、誘導性プロモーターであっても構成性プロモーターであってもよい。なおプロモーターとは、一般に構造遺伝子の５’側上流に存在する発現制御領域又はその改変配列を含むＤＮＡを言う。本発明では、過剰発現プロモーターとして、植物細胞での外来遺伝子発現に適した任意のプロモーターを使用することができる。本発明で用いる過剰発現プロモーターの好適な例としては、限定するものではないが、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、イネアクチンプロモーター、改変３５Ｓブロモーター、タバコＰＲ１ａプロモーター、シロイヌナズナＰＲ−１プロモーターなどが挙げられる。
非共生型グロビン遺伝子を導入するための形質転換ベクターとしては、植物細胞への導入用ベクターであれば任意のものを使用できる。例えば、アグロバクテリウム法を利用する場合には、アグロバクテリウム由来のプラスミドベクター（Ｔｉプラスミドなど）又はバイナリーベクターを使用することが好ましい。本発明で用いる形質転換ベクターには、非共生型グロビン遺伝子、そして場合により過剰発現ベクターを含む他、形質転換体の選抜を容易にする選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の複製開始点など）などを含んでもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、セフォタックス遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）やルシフェラーゼ）遺伝子（ＬＵＣ，ＬＵＸ）などが挙げられる。本発明においては、「ベクター」は、いわゆる発現カセットを包含するものとする。「発現カセット」とは、プロモーターＤＮＡ配列と発現させたい遺伝子のＤＮＡ配列とを含み、当該遺伝子のＤＮＡ配列が植物細胞中で発現可能であるような配置でプロモーターＤＮＡ配列に結合されているＤＮＡ断片を意味する。発現カセットは必ずしも自律複製能を有していなくてもよい。
また、過剰発現プロモーターを予め含むベクターとしては、ｐＢＩ系バイナリーベクターなど、例えばｐＫＡＮＮＩＢＡＬ、ＩＧ１２１−Ｈｍ、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１などが挙げられる。
本発明は、以上のような非共生型グロビン遺伝子を過剰発現プロモーターに連結させて含むベクターも提供する。このような形質転換ベクターは、根粒の窒素固定活性を増大させるために任意の根粒着生植物に導入することができ、非常に便利に使用できる。
形質転換ベクターを根粒着生植物に導入する方法としては、限定するものではないが、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法などの、植物用に広く用いられている植物形質転換法を用いることができる。これらの植物形質転換法は、『島本功、岡田清孝 監修「新版 モデル植物の実験プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで」（２００１）秀潤社』などの一般的な教科書の記載に記載されている。形質転換ベクターを導入した植物細胞は、カナマイシン耐性など選択マーカーを利用した方法で選択をかけ、レポータータンパク質の検出や導入遺伝子の発現解析などにより導入遺伝子の発現を確認しつつ、常法により植物体を再生させることが好ましい。
より具体的には、例えばアグロバクテリウム法では、例えばＮａｇｅｌらの方法を用い、まずベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに導入し、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、Ｔｈｙｋａｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（１９９８）ｐ，５１８−５２５、Ｓｔｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．（１９９７）４８，ｐ．１３５７−１３６５、Ｏｇａｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）１１６ １５９−１６８、又はＨｉｅｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９４）６，２７１−２８２に記載されたような方法で目的の遺伝子を植物に導入し、植物体に再生させればよい。
ポリエチレングリコール法を用いる場合には、まず細胞壁を酵素で溶かして取り除き、プロトプラストにしてから、非共生型グロビン遺伝子を、ポリエチレングリコールを用いて細胞内に導入し、植物体に再生すればよい（Ｄａｔｔａ ＳＫ：Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｅｄｓ）ｐｐ．６６−７４（１９９５））。
エレクトロポレーション法を用いる場合には、まず細胞壁を酵素で溶かして取り除き、プロトプラストにしてから、電気パルスをかけて非共生型グロビン遺伝子を細胞内に導入し、その後植物体に再生すればよい（Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００：１５０３（１９９２））。
パーティクルガン法を用いる場合には、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１））。このように調製した試料に対し、遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて、非共生型グロビン遺伝子でコーティングした金やタングステンなどの微粒子（径約１〜２μｍ）を高圧ガスで噴射することにより、当該遺伝子を植物細胞内に導入する。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。非共生型グロビン遺伝子を細胞内に導入したら、上記と同様にして植物体に再生すればよい。
以上のようにして形質転換された本発明の根粒着生植物においては、非共生型グロビン遺伝子は、その植物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている状態で発現されてもよいし、ゲノム外ＤＮＡとして（例えばベクター中に保持されたままで）発現されてもよい。
以上のようにして非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させた形質転換植物細胞若しくは植物組織（毛状根、葉、茎、根粒など）、又はその再生させた植物体については、非共生型グロビン遺伝子の発現をノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、リポーター遺伝子の発現などの常法により確認することが好ましい。
４．植物体における根粒形成と根粒の窒素固定活性の測定
本発明において非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させた形質転換された根粒着生植物は、共生窒素固定菌が存在する環境下で生育することにより根粒を着生することができる。しかしこの根粒着生植物に、共生窒素固定菌を接種することによって、人為的に根粒を着生させることも可能である。根粒着生植物への共生窒素固定菌の接種は、当業者に周知の方法に従って行うことができる（例えば、Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｓ．，Ｋａｔａｈｉｒａ，Ｓ．ａｎｄ Ａｂｅ，Ｍ．Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ ８１，ｐ．９１−９９（１９８４）を参照）。
本発明において「共生窒素固定菌」とは、植物に共生して根粒を形成し、窒素をアンモニアとして固定して宿主植物に与える能力（窒素固定能）を有する微生物を意味する。共生窒素固定菌には、真正細菌では根粒菌（リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アロリゾビウム（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、放線菌ではフランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）属菌がある。根粒菌はマメ科植物とニレ科パラスポニア（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ）属植物に感染し、フランキア属菌はカバノキ科、ヤマモモ科などの主に樹木に感染することが知られているが、この共生窒素固定菌−宿主植物の関係には例外も知られている。従って形質転換された根粒着生植物には、その植物種に感染できる共生窒素固定菌を接種すればよい。例えば、ミヤコグサには、ミヤコグサ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）を接種すればよい。
本発明において非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させた根粒着生植物に共生窒素固定菌を接種し、根粒を着生させると、その根粒において窒素固定活性が顕著に増大する。この根粒における窒素固定活性は、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させていない同じ種の植物（野生株）を対照として比較して、根粒単位重量当たり少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、例えば３倍〜６倍に増大する。
根粒における窒素固定活性は、当業者に公知の任意の窒素固定活性の測定法を利用して行えばよい。本発明では、根粒における窒素固定活性を、根粒からの抽出物について、アセチレンをエチレンに還元する活性（アセチレン還元活性［Ａｃｅｔｙｌｅｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ］；ＡＲＡ活性）として測定することが好ましい。ＡＲＡ活性は、根粒の単位重量（１グラムなど）当たり、かつ単位時間（１時間、１分間など）当たりのエチレン発生量として表すことができる。このＡＲＡ活性の測定は、例えば後述の実施例に従って行えばよい。本発明に係る非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させた根粒着生植物は、限定するものではないが、例えば、根粒において１０〜１００ｎＭ／ｍｉｎ／ｇ、好ましくは１１〜４０ｎＭ／ｍｉｎ／ｇのＡＲＡ活性を示す。
本発明は、上記のようにして得られる、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現し、根に根粒を有する根粒着生植物にも関する。
５．その他の実施形態
本発明の方法によって作出される根粒着生植物は、高い窒素固定活性を示す根粒を着生するため、それを栽培することにより、その栽培環境下で空気中の窒素を多量に固定することができる。従って本発明は、植物栽培における窒素固定効率を増大させる方法をも提供する。「植物栽培における窒素固定効率を増大させる」とは、一定栽培面積当たり又は栽培植物１個体当たりの一定期間内の窒素固定量を、同じ環境下での形質転換させていない同じ植物による窒素固定量と比較して増加させることを意味する。本発明において「栽培」とは、当該植物を意図的に特定の場所又は環境下で生育させることを意味する。本発明において「栽培」は農業上の栽培を包含するが、必ずしも農業的な作業（耕作、播種、植苗、間引き、消毒、剪定、間伐、収穫など）を行わなくてもよい。本発明における栽培には、限定するものではないが、例えば作物や園芸植物の栽培、造園、園芸、荒廃地や海岸などの緑化用の植栽、貧栄養土壌の肥沃化のための植栽、塩類土壌や乾燥土壌などの土壌改良用の植栽が含まれる。
本発明の方法によって作出される根粒着生植物は、植物栽培における窒素固定効率を増大させることにより、ある環境下で空気中から固定される窒素量を増大させ、当該植物組織中の窒素固定濃度を高め、その根粒着生植物の収量又は生長量を増大させることができる。さらに、本発明の根粒着生植物を栽培することにより、長期的には、土壌中の窒素量を増大させて土壌を肥沃化することができ、その土壌を利用して他の植物の収量も増加させることができる。また本発明の根粒着生植物を栽培することにより、貧栄養土壌、塩類土壌、乾燥土壌等を効果的に緑化することができる。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Nodulation plant
  In the present invention, a non-symbiotic globin gene is overexpressed in a nodulating plant, thereby producing a nodulating plant capable of growing a nodule having increased nitrogen fixation activity. In the present specification, the nodulating plant means a plant species capable of growing (forming) nodule. A nodule is a symbiotic organ in which a symbiotic nitrogen-fixing bacterium settles in the root to form a granular structure. In addition to legumes (including leguminous crops and legumes), rhizobia plants include some non-legumes (mainly non-legumes) such as birch and alderaceae, which are collectively referred to as actinorisal plants. Family tree). The roots of legumes are symbiotic as symbiotic nitrogen-fixing bacteria and form nodules. On the other hand, in some non-leguminous plants, actinomycetes coexist in the roots as symbiotic nitrogen-fixing bacteria to form nodules. As the nodulating plants useful in the present invention, as for legumes, cypress, soybean, azuki bean, kidney bean, pea, broad bean, peanut, alfalfa, taruma palm, clover, cowpea, lentil, false acacia, staghorn, hagi, enju, molcanem Examples of non-leguminous plants include Yashabushi, alder tree, bayberry, mokumao, dokutsugi, and gummy.
  In the present invention, as long as the nodule-growing plant is a plant of a species that can grow (form) nodules, at the time of introducing the non-symbiotic globin gene, at the time of regenerating the plant, or other The plant body in which the nodule has grown may be sufficient as the plant body in which the nodule has settled at the arbitrary time.
  In the present specification, the term “nodulating plant” refers not only to a plant body (whole plant individual) but also to a plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, hypocotyl, cotyledon, etc.), plant tissue (eg, It is meant to include any part of the plant body such as epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fence-like tissue, spongy tissue, etc.) and plant cultured cells (eg callus).
2. Non-symbiotic globin gene and its acquisition
  The non-symbiotic globin gene according to the present invention encodes a globin protein that associates with heme (a complex salt of porphyrin and divalent iron) to form non-symbiotic hemoglobin. This non-symbiotic hemoglobin is a protein having a strong affinity for oxygen, carbon dioxide, carbon monoxide and the like, similar to animal hemoglobin. Non-symbiotic hemoglobin has a stronger affinity for oxygen, nitric oxide, and the like than symbiotic hemoglobin. In this specification, the activity of globin encoded by the non-symbiotic globin gene is referred to as non-symbiotic globin activity.
  The non-symbiotic globin gene according to the present invention may be isolated from any plant. The non-symbiotic globin gene of the present invention is more preferably derived from a nodulating plant, may be isolated from legumes such as Miyakogusa and soybean, or may be isolated from a non-leguminous nodule such as a chafer. It may be isolated from a live plant. The non-symbiotic globin gene used in the present invention may further be isolated from plants other than nodulating plants, including monocotyledonous plants such as barley, rice and corn. Note that known non-symbiotic globin genes that can be used in the present invention include the following: Miyakogusa (Non-Patent Document 1), Yashabushi (DDBJ / EMBL / GenBank Accession No. AB221344), Rice (DDBJ / EMBL / GenBank accession number U76030), alfalfa (DDBJ / EMBL / GenBank accession number AF172172; Serogelies et al., FEBS Lett. (2000) 482, p. 125-130), soybean (DDBJ / EMBL / GenBank accession) No. U47143; Anderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93 (12), p. Shepherd's purse (DDBJ / EMBL / GenBank accession number U94998;. Trevaskis, et al, PNAS (1997) 94p.12230-12234).
  The non-symbiotic globin gene used in the present invention may be cDNA or genomic DNA containing exons and introns. In the present specification, “gene” includes DNA and RNA, DNA includes at least genomic DNA, cDNA, and synthetic DNA, and RNA includes mRNA and the like. In the present specification, the “gene” may include a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence in addition to the coding sequence.
  Although it does not limit, in one preferable aspect, the Lotus japonicus non-symbiotic globin gene can be used as the non-symbiotic globin gene derived from the leguminous plant according to the present invention. For example, as the non-symbiotic globin gene of the present invention, DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from Miyakogusa and DNA of a genomic fragment consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 isolated from Miyakogusa are preferably used. be able to. In addition, a DNA encoding the Lotus japonicus non-symbiotic globin protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be advantageously used.
  As long as it has non-symbiotic globin activity, the non-symbiotic globin gene of the present invention has 1 to 50, preferably 1 to 35, more preferably 1 or several in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (for example, A DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which 2 to 10 amino acids have been deleted, substituted or added may be used. The non-symbiotic globin gene used in the present invention is a DNA having a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a DNA base encoding a non-symbiotic globin protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the sequence under a stringent condition and encodes a protein having non-symbiotic globin activity. The non-symbiotic globin gene of the present invention may also be a DNA encoding a protein having a non-symbiotic globin activity consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  On the other hand, in another aspect, the non-symbiotic globin gene derived from the non-leguminous nodule-growing plant according to the present invention is not limited, but, for example, a jachabushi non-symbiotic globin gene can be preferably used. For example, as the non-symbiotic globin gene of the present invention, DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 isolated from Yashabushi and DNA of a genomic fragment consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 isolated from Yashabushi are preferably used. be able to. Further, a DNA encoding a Yachabushi non-symbiotic globin protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 can also be used advantageously.
  As long as it has non-symbiotic globin activity as the non-symbiotic globin gene of the present invention, 1 to 50, preferably 1 to 35, more preferably 1 or several (for example, 2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which 10 to 10 amino acids are deleted, substituted, or added may be used. The non-symbiotic globin gene used in the present invention is a DNA having a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 or a DNA base encoding a non-symbiotic globin protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. It may be a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the sequence under a stringent condition and encodes a protein having non-symbiotic globin activity. The non-symbiotic globin gene of the present invention may also be a DNA encoding a protein having a non-symbiotic globin activity consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  In the present invention, “stringent conditions” refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed. For example, nucleic acids having high homology, that is, DNAs having 90% or more, preferably 95% or more homology, hybridize and nucleic acids having lower homology do not hybridize. More specifically, the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., This refers to conditions at a formamide concentration of 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%. Furthermore, under stringent conditions, the filter washing conditions after hybridization are usually such that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably It is 55-70 degreeC, More preferably, it is 60-65 degreeC.
  In one embodiment of the present invention, the non-symbiotic globin activity of the globin protein encoded by the non-symbiotic globin gene is not limited to the oxygen, carbon dioxide of non-symbiotic hemoglobin formed by the globin. Or by affinity for nitric oxide or the like. The non-symbiotic globin activity of the present invention is obtained by, for example, recombinantly producing a globin protein using an expression vector containing a non-symbiotic globin gene encoding the non-symbiotic globin, and regenerating from the obtained globin protein and heme. About the comprised nonsymbiotic hemoglobin, the affinity with respect to oxygen, a carbon dioxide, or nitric oxide can be measured by a conventional method, and the measured value can be expressed as an index. The affinity of non-symbiotic hemoglobin to oxygen, carbon dioxide, or nitric oxide can be measured by methods known to those skilled in the art.
  As an example, the affinity of non-symbiotic hemoglobin for nitric oxide can be determined from the absorbance spectrum obtained by measuring the absorbance at a wavelength of 500 nm to 600 nm in the presence of nitric oxide. Generally, when hemoglobin draws an absorbance curve with light having a wavelength of 500 to 600 nm, two characteristic peaks are observed at 540 nm and 575 nm (see FIG. 8). In hemoglobin in the state after completion of the reaction with nitric oxide, these two peaks are not observed. Therefore, after the hemoglobin protein is mixed with nitric oxide and then the absorbance spectrum is analyzed by a conventional method, the affinity of the hemoglobin protein with nitric oxide can be measured. The isolated and / or purified hemoglobin usually exists in a state of being bound to oxygen (referred to as oxyhemoglobin). Non-symbiotic hemoglobin is also isolated in a bound state with oxygen, for example when produced recombinantly. Since non-symbiotic hemoglobin has a higher affinity for nitric oxide than oxygen, when nitric oxide is added to the isolated non-symbiotic hemoglobin, two peaks disappear in the absorbance spectrum. The transition to the spectrum after the completion of the reaction is observed. Such a method for measuring the affinity of hemoglobin with nitric oxide is described in Michel Perazzoli et al. The Plant Cell (2004) 16, p. Reference can be made to 2785-2794.
  When the absorbance spectrum measured as described above is comparatively analyzed between non-symbiotic hemoglobin and symbiotic hemoglobin, their affinity with nitric oxide can be relatively compared. This comparison of absorbance spectra indicates that non-symbiotic hemoglobin can bind to nitric oxide more rapidly than symbiotic hemoglobin. In the present invention, the affinity of non-symbiotic hemoglobin with nitric oxide is determined using as an index the mixing time of nitric oxide until the binding between non-symbiotic hemoglobin and nitric oxide is shown in the absorbance spectrum. Can do.
  In the present invention, for example, non-symbiotic globin is recombinantly produced in E. coli using a vector containing a gene encoding non-symbiotic globin (SEQ ID NO: 2 or 9). Non-symbiotic hemoglobin reconstituted from the above can be collected, and the affinity for nitric oxide can be measured for the non-symbiotic hemoglobin by the method described above. The non-symbiotic globin of the present invention is not limited, but is comparable to the affinity for nitric oxide of non-symbiotic hemoglobin derived from such non-symbiotic globin (SEQ ID NO: 2 or 9). It preferably has an affinity for nitric oxide.
  The non-symbiotic globin gene according to the present invention as described above can be obtained by using, for example, a primer designed on the basis of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 8 to 10 with any plant (for example, nodulating plants; Etc.) can be obtained as a nucleic acid fragment by performing PCR amplification using the nucleic acid derived from the template as a template. The non-symbiotic globin gene of the present invention is hybridized using a nucleic acid derived from any plant (for example, nodulating plants; Miyakogusa, Yashabushi, etc.) as a template and a DNA fragment that is a part of the non-symbiotic globin gene as a probe. Can be obtained as a nucleic acid fragment. The nucleic acid used as a template in these methods may be, for example, genomic DNA extracted from an arbitrary plant by a conventional method, or cDNA that is reverse-transcribed and synthesized from mRNA extracted by a conventional method. The nucleic acid used as a template may be purified genomic DNA, purified cDNA, cDNA library, genomic DNA library, or the like. Alternatively, the non-symbiotic globin gene used in the present invention may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods.
  Further, a desired mutation may be introduced into the base sequence (and thus the encoded amino acid sequence) of the obtained non-symbiotic globin gene by site-directed mutagenesis. In order to introduce a mutation into a gene, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto can be employed. For example, using a mutagenesis kit (for example, Mutan-K (manufactured by TAKARA) or Mutan-G (manufactured by TAKARA)) using site-directed mutagenesis or the like, or LA PCR in vitro Mutagenesis of TAKARA Mutation is introduced using a series kit.
  Preparation of mRNA used in the present invention, preparation of cDNA, PCR, RT-PCR, library preparation, ligation into vector, cell transformation, determination of DNA base sequence, nucleic acid chemical synthesis, N-terminal of protein Experiments such as determination of the amino acid sequence on the side, mutagenesis, protein extraction, and the like can be carried out by the methods described in ordinary experiments. Such experimental documents include, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds. Sambrook, J .; & Russell, DW. And Cold Spring Harbor Laboratory Press.
3. Overexpression of non-symbiotic globin genes in nodulating plants
  In the present invention, a non-symbiotic globin gene is overexpressed in a nodulating plant by a genetic engineering technique. In the present invention, “overexpressing” a gene means that the gene exceeds the amount normally expressed in the host organism by any genetic engineering technique (for example, gene transfer). It means that the gene is manipulated so that it is expressed (for example, 10% or more), or the gene is introduced into a host organism that does not have the gene and expressed. The specific means for overexpressing the non-symbiotic globin gene is not limited, and any method known to those skilled in the art can be used. Although not limited, as a general method, a transformation vector constructed by linking a non-symbiotic globin gene so that it is expressed in the correct reading frame downstream of an overexpression promoter is used in a nodulating plant. The method to introduce to is mentioned. In this case, in order to incorporate the non-symbiotic globin gene into the vector, for example, a DNA fragment containing the non-symbiotic globin gene is excised with an appropriate restriction enzyme and downstream of the overexpression promoter in the expression vector containing the overexpression promoter. What is necessary is just to insert and connect so that it may become an in-frame to an appropriate restriction enzyme site | part. Alternatively, a DNA fragment in which a non-symbiotic globin gene is linked in advance downstream of an overexpression promoter may be incorporated into a vector. A genomic fragment of a non-symbiotic globin gene linked to an overexpression promoter may be incorporated into the genomic DNA of a nodulating plant by a method such as homologous recombination. As the nodulating plant that overexpresses the non-symbiotic globin gene, any of the above-mentioned nodulating plants (for example, Miyakogusa) can be suitably used.
  In the present invention, the “overexpression promoter” means a promoter having the ability to strongly (in large quantities) express a gene linked to the overexpression promoter in a host plant cell. The overexpression promoter of the present invention may be a promoter that provides nodule-specific expression (a nodule-specific promoter). The overexpression promoter of the present invention may be an inducible promoter or a constitutive promoter. The promoter generally refers to a DNA containing an expression control region or a modified sequence thereof existing 5 'upstream of a structural gene. In the present invention, any promoter suitable for foreign gene expression in plant cells can be used as the overexpression promoter. Preferable examples of the overexpression promoter used in the present invention include, but are not limited to, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, rice actin promoter, modified 35S blower, tobacco PR1a promoter, Arabidopsis thaliana PR-1 promoter, etc. Is mentioned.
  As a transformation vector for introducing the non-symbiotic globin gene, any vector can be used as long as it is a vector for introduction into plant cells. For example, when the Agrobacterium method is used, it is preferable to use an Agrobacterium-derived plasmid vector (such as Ti plasmid) or a binary vector. The transformation vector used in the present invention includes a non-symbiotic globin gene and, optionally, an overexpression vector, as well as a selection marker gene, reporter gene, and binary vector system that facilitates selection of transformants. An origin of replication (such as an origin of replication derived from Ti or Ri plasmid) may also be included. Examples of the selection marker gene include drug resistance genes such as cefotax gene, hygromycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene and the like. Examples of reporter genes include green fluorescent protein gene (GFP) and luciferase) genes (LUC, LUX). In the present invention, the “vector” includes a so-called expression cassette. “Expression cassette” refers to a DNA fragment comprising a promoter DNA sequence and a DNA sequence of a gene to be expressed, which is linked to the promoter DNA sequence in such an arrangement that the DNA sequence of the gene can be expressed in plant cells. Means. An expression cassette does not necessarily have autonomous replication ability.
  In addition, examples of the vector containing the overexpression promoter in advance include pBI binary vectors such as pKANNIBAL, IG121-Hm, pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3, and pCAMBIA1301.
  The present invention also provides a vector comprising the non-symbiotic globin gene as described above linked to an overexpression promoter. Such a transformation vector can be introduced into any nodule-growing plant in order to increase the nitrogen fixing activity of the nodule and can be used very conveniently.
  A method for introducing a transformation vector into a nodule-growing plant is not limited. For example, the Agrobacterium method, particle gun method, electroporation method, polyethylene glycol (PEG) method, microinjection method, protoplast fusion Plant transformation methods widely used for plants, such as the method, can be used. These plant transformation methods are described in general textbooks such as “Isao Shimamoto and Kiyotaka Okada“ New Protocol Experimental Protocol for Model Plants From Genetic Methods to Genome Analysis ”(2001) Shujunsha”. Yes. Plant cells into which a transformation vector has been introduced are selected by a method using a selection marker such as kanamycin resistance, and the expression of the transgene is confirmed by detection of a reporter protein or expression analysis of the transgene. Is preferably regenerated.
  More specifically, for example, in the Agrobacterium method, for example, the method of Nagel et al. Is used. First, a vector is introduced into Agrobacterium by electroporation, and then the transformed Agrobacterium is transferred to Plant Molecular Biology Manual ( S. B. Gelvin et.al., Academic Publishers), Thykaer, T .; et al. , Cell Biology, 2nd ed. (1998) p, 518-525, Stiller, J. et al. , Et al. , J .; Exp. Bot. (1997) 48, p. 1357-1365, Ogar, P .; et al. , Plant Science (1996) 116 159-168, or Hiei Y. et al. et al. Plant J .; (1994) 6, 271-282, the gene of interest may be introduced into a plant and regenerated into a plant body.
  When the polyethylene glycol method is used, the cell wall is first dissolved and removed with an enzyme to form a protoplast, and then the non-symbiotic globin gene is introduced into the cell using polyethylene glycol and regenerated into a plant body (Datta). SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spanenberg, Eds) pp. 66-74 (1995)).
  When the electroporation method is used, the cell wall is first dissolved and removed with an enzyme, converted to a protoplast, and then an electric pulse is applied to introduce a non-symbiotic globin gene into the cell, which is then regenerated into a plant body ( Toki S, et al., Plant Physiol., 100: 1503 (1992)).
  When using the particle gun method, a plant body, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, after preparing a section, or after preparing a protoplast (Christow P). , Et al., Biotechnology 9: 957 (1991)). For the sample prepared in this way, using a gene transfer device (for example, PDS-1000 (BIO-RAD), etc.), fine particles such as gold and tungsten (diameter of about 1 to 2 μm) coated with a non-symbiotic globin gene. Is injected with a high-pressure gas to introduce the gene into plant cells. The treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm. Once the non-symbiotic globin gene is introduced into the cell, it may be regenerated into a plant in the same manner as described above.
  In the nodulating plant of the present invention transformed as described above, the non-symbiotic globin gene may be expressed in the state of being incorporated in the genomic DNA of the plant, or as extragenomic DNA. It may be expressed (eg, while retained in a vector).
  For transformed plant cells or plant tissues (hairy roots, leaves, stems, nodules, etc.) overexpressing the non-symbiotic globin gene as described above, or the regenerated plants, the non-symbiotic globin gene It is preferable to confirm the expression by a conventional method such as Northern blotting, Southern blotting, or reporter gene expression.
4). Measurement of nodulation and nitrogen fixation activity of nodules in plants
  In the present invention, a transformed nodulating plant overexpressed with a non-symbiotic globin gene can grow a nodule by growing in an environment where symbiotic nitrogen-fixing bacteria are present. However, it is possible to artificially grow the nodule by inoculating this nodulating plant with a symbiotic nitrogen-fixing bacterium. Inoculation of symbiotic nitrogen-fixing bacteria into nodulating plants can be performed according to methods well known to those skilled in the art (for example, Higashi, S., Katahira, S. and Abe, M. Plant and Soil 81, p. 91). -99 (1984)).
  In the present invention, the “symbiotic nitrogen-fixing bacterium” means a microorganism that has the ability to symbiotically grow in plants to form nodules, fix nitrogen as ammonia, and give it to the host plant (nitrogen-fixing ability). Symbiotic nitrogen-fixing bacteria include rhizobia (Rhizobium), bradyrhizobium (Azorhizobium), sinorhozium (Minorzium), rhizobium (R), and mesolizobium (M). There is a genus of Francia. It is known that rhizobia infects legumes and plants of the genus Parasponia, and Francia spp. Are known to infect mainly trees such as birch family and bayberry. Exceptions are also known for host plant relationships. Therefore, the transformed nodulating plant may be inoculated with a symbiotic nitrogen-fixing bacterium capable of infecting the plant species. For example, Miyakogusa may be inoculated with Mesohizobium loti.
  In the present invention, when a symbiotic nitrogen-fixing bacterium is inoculated into a nodule-growing plant in which a non-symbiotic globin gene is overexpressed and the nodule is allowed to grow, the nitrogen-fixing activity in the nodule is significantly increased. The nitrogen fixation activity in this nodule is at least 2 times, preferably at least 3 times, for example 3 times, per nodule unit weight as compared to a plant of the same species (wild strain) that does not overexpress the non-symbiotic globin gene. Increased by 2-6 times.
  The nitrogen fixation activity in the nodules may be performed using any method for measuring nitrogen fixation activity known to those skilled in the art. In this invention, it is preferable to measure the nitrogen fixation activity in a nodule as an activity (acetylene reduction activity; ARA activity) which reduces an acetylene to ethylene about the extract from a nodule. ARA activity can be expressed as the amount of ethylene generated per unit weight (such as 1 gram) of nodules and per unit time (such as 1 hour, 1 minute). Measurement of this ARA activity may be performed according to, for example, the examples described later. The nodule-growing plant in which the non-symbiotic globin gene according to the present invention is overexpressed is not limited, and for example, 10 to 100 nM / min / g, preferably 11 to 40 nM / min / g ARA in the nodule. Shows activity.
  The present invention also relates to a nodule-growing plant that is obtained as described above and overexpresses a non-symbiotic globin gene and has a root nodule.
5. Other embodiments
  The nodulation plant produced by the method of the present invention produces a nodule exhibiting high nitrogen fixation activity, so that it can fix a large amount of nitrogen in the air under the cultivation environment by cultivating it. it can. Accordingly, the present invention also provides a method for increasing the nitrogen fixation efficiency in plant cultivation. “Increasing the nitrogen fixation efficiency in plant cultivation” means that the nitrogen fixation amount within a certain period per certain cultivation area or per individual cultivated plant is the amount of nitrogen fixation by the same plant not transformed in the same environment. It means to increase compared to. In the present invention, “cultivation” means that the plant is intentionally grown in a specific place or environment. In the present invention, “cultivation” includes agricultural cultivation, but it is not always necessary to perform agricultural work (cultivation, sowing, planting, thinning, disinfection, pruning, thinning, harvesting, etc.). The cultivation in the present invention is not limited, for example, cultivation of crops and horticultural plants, landscaping, horticulture, planting for greening of wasteland and coast, planting for fertilization of oligotrophic soil, Planting for soil improvement such as saline soil and dry soil is included.
  The nodulation plant produced by the method of the present invention increases the nitrogen fixation efficiency in plant cultivation, thereby increasing the amount of nitrogen fixed from the air under a certain environment, and the nitrogen fixation concentration in the plant tissue. And the yield or growth amount of the nodulating plant can be increased. Furthermore, by cultivating the nodulating plants of the present invention, it is possible to fertilize the soil by increasing the amount of nitrogen in the soil over the long term, and the yield of other plants can also be increased using the soil. Can be increased. In addition, by cultivating the nodulating plant of the present invention, it is possible to effectively greenen oligotrophic soil, salt soil, dry soil and the like.

以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の技術的範囲はこれらにより限定されるものではない。
［実施例１］ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子（ＬｊＨｂ１）の単離及び同定
ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）の非共生型グロビン遺伝子（ＬｊＨｂ１）を、ミヤコグサのゲノムライブラリー（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＤＮＡ Ｒｅｓ．８：ｐ．３１１−３１８）からＰＣＲ法によってスクリーニングして単離した。スクリーニングに用いるプライマーは、ミヤコグサのＥＳＴライブラリーに存在する非共生型グロビン遺伝子ホモログの配列（クローン名：ＡＶ４１３９５９、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ２３８２２０）に基づいて設計した。このプライマーの配列は以下の通りである。
ＬｊＨｂ１Ｆ１：５’−ＴＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号４；フォワードプライマー）
ＬｊＨｂ１Ｆ２：５’−ＴＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧ−３’（配列番号５；フォワードプライマー）
ＬｊＨｂ１Ｒ１：５’−ＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号６；リバースプライマー）
ＬｊＨｂ１Ｒ２：５’−ＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＣ−３’（配列番号７；リバースプライマー）
ＬｊＨｂ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ（Ｒ）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、以下の反応条件で行った：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル。
このようなミヤコグサのゲノムライブラリーのスクリーニングの結果、ＴＡＣクローン（ＬｊＴＯＩＯ１）上に存在する遺伝子ＬｊＨｂ１を同定した。ミヤコグサゲノム上のＬｊＨｂ１の塩基配列を解析した結果、この遺伝子は開始コドンから終止コドンまでの全長が１０１２ｂｐであり、１６１アミノ酸残基をコードする遺伝子であることが分かった。ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子（ＬｊＨｂ１）のゲノム上の構造とそれにコードされるアミノ酸配列を図１に示す。遺伝子ＬｊＨｂ１は、植物グロビン遺伝子に共通する、４つのエキソンと３つのイントロンを含む構造をしており、ミヤコグサの６つの染色体のうち第３染色体に存在していた。
［実施例２］非共生型グロビン遺伝子（ＬｊＨｂ１）の発現解析
ＬｊＨｂ１の発現解析を、ＲＴ−ＰＣＲにより、組織別の発現と、ストレス条件下での発現の２つの実験系で行った。組織別の発現を調べた実験系では、組織サンプルとして、ミヤコグサ（発芽６週目の成長個体）の１）葉、２）茎、３）根、４）根粒の４つを用いた。ストレス条件下での発現を調べた実験系では、サンプルとして、１）無処理（対照）、２）ショ糖添加、３）低温、４）低酸素の４つを用いた。ＲＴ−ＰＣＲには実施例１で使用したプライマーＬｊＨｂ１Ｆ１とＬｊＨｂ１Ｒ２を用い、逆転写と転写産物の増幅のためにＯｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。遺伝子ＬｊＨｂ１の発現レベルは、電気泳動によって確認した。電気泳動写真をイメージングして、そのバンドの濃さに基づき、ＬｊＨｂ１の発現量を相対値で表した。
組織別の発現を調べた実験の結果を図２Ａに示す。ＬｊＨｂ１は、成長個体の様々な器官で発現していることが示された。それぞれの発現量（相対値）は、葉で０．４、茎で０．４、根で１．０、根粒で３６．０であった。このように、特に根粒組織では強く発現していた。またストレス条件下での発現を調べた実験の結果を図２Ｂに示す。ＬｊＨｂ１は、無処理と比較した相対的な発現量としてみた場合、低温（図２Ｂにおける発現量：約２５０）や低酸素（図２Ｂにおける発現量：約４５０）といったストレス処理によっても強く発現することが示された。
［実施例３］形質転換用ベクターの構築
ＬｊＨｂ１を過剰に発現する形質転換ミヤコグサ植物体及び形質転換毛状根を作出するために、強力なプロモーターにＬｊＨｂ１のｃＤＮＡを連結した遺伝子を構築した。形質転換用のベクター構築には、プラスミドｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００１ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７，５８１−５９０）、ｐＨＫＮ２９（Ｋｕｍａｇａｉ ａｎｄ Ｋｏｕｃｈｉ，２００３ ＭＰＭＩ １６（８），６６３−６６８）、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３１，８０５−８１３）を使用した。
ミヤコグサの根粒から、全ＲＮＡを常法によって抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって完全長のＬｊＨｂ１ ｃＤＮＡをクローニングした。得られた完全長ＬｊＨｂ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、まず、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬのカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの下流に連結した。さらにこのベクターから３５Ｓ−ＬｊＨｂ１ ｃＤＮＡ断片を切り出し、それをｐＨＫＮ２９のＧＦＰ領域の下流に連結し、プラスミドベクターｐＲ３５ＳＬｊＨｂ１とした（図３）。このｐＲ３５ＳＬｊＨｂ１は、後述の通り、形質転換毛状根の誘導のために使用した。
また、完全長のＬｊＨｂ１ ｃＤＮＡをｐＩＧ１２Ｉ−Ｈｍの３５Ｓプロモーターの下流に連結して、プラスミドベクターｐＴ３５ＳｌｊＬｂ１とした。このｐＴ３５ＳｌｊＬｂ１は、後述の通り、形質転換ミヤコグサ植物体の作出のために使用した。
［実施例４］形質転換毛状根の作出と遺伝子導入及び発現の確認
実施例３で作製したプラスミドベクターを使用して、アグロバクテリウム・リゾジェネスを介した毛状根誘導型の形質転換系により、ＬｊＨｂ１を導入したミヤコグサの形質転換毛状根を作出した。
まず、実施例３でＬｊＨｂ１を過剰発現するように構築したベクターｐＲ３５ＳＬｊＨｂ１を、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＬＢＡ１３３４（Ｄｒ．Ｃｌａｒａ Ｄｉａｚ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より分与）に、エレクトロポレーションにより直接導入した。このｐＲ３５ＳＬｊＨｂ１を保持するアグロバクテリウム・リゾジェネスの菌体懸濁液を、胚軸の部分で切断した播種後５日目のミヤコグサ実生に接種した。その後、これを滅菌したろ紙上に載せ、共存培養培地（１／１０ Ｂ５，ＢＡＰ ０．５μｇ／ｍｌ，ＮＡＡ ０．０５μｇ／ｍｌ，ＭＥＳ（ｐＨ５．２）５ｍＭ，アセトシリンゴン２０μｇ／ｍｌ）にて５日間共存培養した。共存培養終了後、抗生物質セフォタックス（ｃｅｆｏｔａｘ）（２００μｇ／ｍｌ；中外製薬株式会社）を添加したＧａｍｂｏｒｇＢ５培地（製造：日本製薬株式会社、販売：和光純薬工業株式会社）上に載せ、毛状根を誘導した。誘導した毛状根を図４Ａに示す。なお図４Ａは、成長段階や毛状根の発生時期が異なる各種サンプルを示している。
毛状根へのＬｊＨｂ１遺伝子導入の有無は、ＧＦＰ蛍光の検出と、３５ＳプロモーターとＬｊＨｂ１との融合遺伝子をＰＣＲ増幅して検出することにより、確認した。ＬｊＨｂ１遺伝子が導入された毛状根では、ＧＦＰが産生され、緑色蛍光が観察された（図４Ｂ）。図４Ｂの左側（上段及び下段）の写真は明視野観察、右側（上段及び下段）の写真は暗視野観察の結果である。共生型グロビン遺伝子が過剰発現し、ＧＦＰ蛍光が観察された根がはっきりと観察される。
さらに、形質転換毛状根から常法により全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、導入したＬｊＨｂ１遺伝子の発現を確認した。また野生株のミヤコグサ毛状根をコントロールとして使用した。この結果を図４Ｃに示す。図４Ｃ中、ミヤコグサのあらゆる組織及びあらゆる時期において同程度発現していることが知られる遺伝子ＬｊｅＩＦ−４Ａを、遺伝子発現に用いたＲＮＡ量が被験サンプルと対照（コントロール）サンプルとで同じであることを示す指標として用いた。
この結果に示される通り、ＬｊＨｂ１遺伝子を導入した毛状根では、ＬｊＨｂ１遺伝子を導入していない野生株の毛状根に比べ、約１００倍を超える量のＬｊＨｂ１遺伝子発現が誘導されていた。
［実施例５］形質転換毛状根における根粒形成及び根粒の窒素固定活性の測定
実施例４でＬｊＨｂ１遺伝子の導入が確認された毛状根誘導植物を、培養土（バーミキュライト：パーライト＝４：１）に移植し、ＫＮＯ３を終濃度が１ｍＭになるように加えたフェラウス培地（Ｆａｈｒａｅｕｓ，（１９５７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）３７４−３８１）を与え、１週間生育させた。その後、新しい培養土に移植し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度のミヤコグサ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ３０３０９９）をその毛状根に接種した。根粒菌接種後、窒素源を含まない培地を与え、さらに４週間生育させた。なお形質転換植物の生育条件は、１６時間 明／８時間 暗のサイクルで、植物育成チャンバー内、２５〜２６℃とした。４週間後、毛状根には根粒が形成された（図５）。
次いで、毛状根に着生した根粒について、窒素固定活性を、アセチレンをエチレンに還元する活性（Ａｃｅｔｙｌｅｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＲＡ）として測定した。具体的には、まず毛状根より採取した根粒を１５ｃｍの試験管に入れ、ゴムキャップで密閉した。試験管内の空気をアスピレーターで充分吸引した後、アセチレンガスを充満させた。この試験管を室温で２時間インキュベートした後、試験管中の気体を採取し、ガスクロマトグラフィーでエチレンの発生量を測定した。この測定結果を図６に示す。
図６に示す測定結果から、ＬｊＨｂ１を導入し過剰発現させた毛状根に着生した根粒における単位重量（根粒のグラム重量）当たりのＡＲＡ活性は、１１．１５ｎＭ／ｍｉｎ／ｇと算出された［１．４５×２１．５−０．５＝３０．６７（ｎＭ／ｇ）；３０．６７（ｎＭ）÷２．７５分＝約１１．１５ｎＭ／ｍｉｎ／ｇ］。一方、対照実験として、ＬｊＨｂ１を導入していない毛状根に着生した根粒における単位重量（根粒のグラム重量）当たりのＡＲＡ活性は、２．１２ｎＭ／ｍｉｎ／ｇと算出された［１．４５×４−０．５＝５．３（ｎＭ／ｇ）；５．３（ｎＭ）÷２．５分＝２．１２ｎＭ／ｍｉｎ／ｇ］。ＬｊＨｂ１を導入し過剰発現させた毛状根（形質転換体）に着生した根粒では、窒素固定活性が５倍以上になったことが示された。
［実施例６］形質転換植物体の作出
１）ミヤコグサへのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の感染
播種後５日経過したミヤコグサ実生から、胚軸を、子葉の直下と根の境目で切り出した。一方、実施例３で作製したｐＴ３５ＳｌｊＬｂ１を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５（名古屋大学 中村研三教授より分与）に、エレクトロポレーションにより直接導入した。得られたｐＴ３５ＳｌｊＬｂ１を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５の菌体懸濁液（１．０×１０７細胞／ｍｌ、ＯＤ６００＝０．１０×０．１５）に、終濃度１００μＭのアセトシリンゴンを加え、切り出した胚軸をその溶液に浸漬した。胚軸は溶液中で約５ｍｍ厚の切片に切断した。この切片は、そのまま３０分間にわたり菌体懸濁液中に浸漬することにより、アグロバクテリウムに感染させた。感染後の切片を滅菌したろ紙上に載せ、共存培養培地（１／１０ Ｂ５，ＢＡＰ ０．５μｇ／ｍｌ，ＮＡＡ ０．０５μｇ／ｍｌ，ＭＥＳ（ｐＨ５．２）５ｍＭ，アセトシリンゴン２０μｇ／ｍｌ）中で、２５℃で３〜５日間にわたり共存培養した。
２）カルスの誘導
共存培養した切片を、除菌用の抗生物質セフォタックス（２５０μｇ／ｍｌ）と形質転換体選抜用の抗生物質ハイグロマイシンＢを加えたカルス培地（１×Ｂ５，２％スクロース，ＢＡＰ ０．５μｇ／ｍｌ，ＮＡＡ ０．０５μｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ＮＨ４，０．３％ｐｈｙｔａｇｅｌ）に移し、２５℃にて、１４時間 明／１０時間 暗のサイクルで、５週間にわたり培養した。切片の植え替えは１〜２週間毎に行った。
３）カルスからのシュートの誘導
上記カルス培地で５週間培養した切片をシュート誘導培地（１×Ｂ５，２％スクロース，ＢＡＰ ０．５μｇ／ｍｌ，ＮＡＡ ０．０５μｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ＮＨ４，０．３％ｐｈｙｔａｇｅｌ）に移し、２５℃にて、１４時間 明（６１００ ｌｕｘ）／１０時間 暗のサイクルで、２週間にわたり培養した。その後、カルス化した切片を、ハイグロマイシンＢを添加していないシュート誘導培地に移植して、前記と同様の培養条件で３週間培養した。カルスの植え替えは１〜２週間毎に行った。
４）シュートの伸長
カルスをシュート伸長培地（１×Ｂ５，２％スクロース，ＢＡＰ ０．２μｇ／ｍｌ，０．３％ｐｈｙｔａｇｅｌ）に移し、２５℃にて、１４時間 明（６１００ ｌｕｘ）／１０時間 暗のサイクルで、３週間にわたり培養した。カルスの植え替えは１〜２週間毎に行った。その後、カルスを植物ホルモンを含まないシュート伸長培地に移植して、前記と同様の培養条件で２〜３週間培養して、シュート伸長を促した。
５）根の誘導と伸長
シュート伸長培地に置床したカルスから生じた５ｍｍ以上のシュートを、シュート基部からカミソリで切り出した。このシュートを縦にして、シュート基部を根誘導培地（１／２ Ｂ５，１％スクロース，０．５μｇ／ｍｌ ＮＡＡ，０．４％ｐｈｙｔａｇｅｌ）に差し込んだ状態で、１４時間 明（６１００ ｌｕｘ）／１０時間 暗のサイクルで、１週間以上培養した。その後、切り口が肥大化したシュートを、根伸長培地（１／２ Ｂ５，１％スクロース）に差し込んで、前記と同様の培養条件で２〜３週間培養し、根の伸長を促した。
６）形質転換植物体の栽培
上記のように根を伸長させて得られた植物体を、培地から抜き取り、根に付着したゲルを水中でよく洗い落とした。この植物体を、１／１０倍に希釈した市販のＢ５培地（和光純薬工業株式会社）を染み込ませたバーミキュライトに移植し、１４時間 明（６１００ ｌｕｘ）／１０時間 暗のサイクルで栽培した。こうして栽培したミヤコグサ植物体は種子をつけたため、その種子を収穫した。その後、種子をパワーソイル（クレハ園芸用培土）を入れた播種し、栽培した。
こうして生長させた植物体については、３５ＳプロモーターとＬｊＨｂ１の融合遺伝子をＰＣＲ増幅して検出することにより、ＬｊＨｂ１の遺伝子導入の成否を確認した。またＬｊＨｂ１遺伝子の発現量の増加は、ＲＴ−ＰＣＲを行って確認した。
［実施例７］ミヤコグサ形質転換植物体の根粒形成と窒素固定活性
実施例６で作製し、ＬｊＨｂ１遺伝子の導入と発現が確認されたミヤコグサ形質転換植物体を、培養土（バーミキュライト：パーライト＝４：１）に移植して栽培し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度のミヤコグサ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ ３０３０９９）を接種した。根粒菌接種後、形質転換植物体を、１６時間 明（６１００ ｌｕｘ）／８時間 暗のサイクルで、植物育成チャンバー内、２５〜２６℃にて、４週間にわたり栽培した。４週間後、着生した根粒を植物体から採取し、実施例５と同様にして、ＡＲＡ活性を測定した。測定の結果、ＬｊＨｂ１を過剰発現しているミヤコグサ形質転換植物体に着生した根粒における単位重量（根粒のグラム重量）当たりのＡＲＡ活性は、１７．２１ｎＭ／ｍｉｎ／ｇと算出された。一方、対照実験として、ＬｊＨｂ１を導入していないミヤコグサ（通常のミヤコグサ、野生型）に着生した根粒における単位重量（根粒のグラム重量）当たりのＡＲＡ活性は、５．０５ｎＭ／ｍｉｎ／ｇと算出された。
なお、本実施例で得られた植物体に形成された根粒は、形質転換体及び非形質転換体のいずれも、平均７個であった。根粒の大きさ、色などの外観には特に差異は見られなかった。
［実施例８］ミヤコグサの非共生型グロビンと共生型グロビンの一酸化窒素との親和性の比較
実施例３で得られた完全長のＬｊＨｂ１ ｃＤＮＡ（開始コドンから終止コドンまでの配列を配列番号１に示す；配列番号２のアミノ酸配列をコードする）を、タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に常法によりクローニングし（図７）、それを大腸菌に導入して形質転換体を得た。また対照サンプルとして、ミヤコグサ共生型グロビン遺伝子を、同様に発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３中にクローニングし（図７）、それを大腸菌に導入して形質転換体を得た。得られた大腸菌形質転換体を培養し、発現誘導することにより、大腸菌の体内で、可溶性であり活性をもった非共生型グロビンを大量に組換え生産させることができた。次いで、非共生型グロビン遺伝子を発現させた大腸菌を常法により回収し、破壊した後、タンパク質精製を行ったところ、活性をもった非共生型ヘモグロビンを得ることができた。非共生型グロビン遺伝子を導入した大腸菌中でヘムが同時に供給されるため、大腸菌を破壊して得られるグロビンは、大腸菌由来のヘムと会合してヘモグロビンとしての活性をもった状態で単離されたものである。
次いで、得られた共生型ヘモグロビンに一酸化窒素を混合し、経時的に吸光度測定を行った。一酸化窒素の混合を開始してから０分、５分後、１５分後、３０分後の５００ｎｍ〜６００ｎｍの波長での吸光度スペクトルを図８に示す。図８に示される通り、一酸化窒素の混合時間が長くなるにつれて、５４０ｎｍと５７５ｎｍの２つのピークが消失したことが示されている。特に非共生型ヘモグロビンでは、５７５ｎｍのピークがより早く喪失し、１５分経過後にはほとんど消失していていた。一方共生型ヘモグロビンの方は、５４０ｎｍのピークはあまり減失せず、３０分経過後でも、５７５ｎｍのピークも弱いながらもまだ存在し２つのピークが観察された。
［実施例９］ヤシャブシ非共生型グロビン遺伝子（ＡｆＨｂ１）の単離及び同定
ヤシャブシ（Ａｌｎｕｓ ｆｉｒｍａ）の非共生型グロビン遺伝子（ＡｆＨｂ１）を、ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子ＬｊＨｂ１のＤＮＡ断片をプローブとして、ヤシャブシの根粒ｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｓａｋｕｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，″Ａ ｃｌａｓｓ １ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａ ｌｎｕｓ ｆｉｒｍａ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｏ ｄｅｔｏｘｉｆｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．″Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（２００６）１９（４）印刷中）のスクリーニングによって単離した。
スクリーニング用プローブは、ミヤコグサ非共生型グロビン遺伝子ＬｊＨｂ１（クローン名：ＡＶ４１３９５９、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ２３８２２０）の配列に基づいて設計し、実施例１で使用したプライマーＬｊＨｂ１Ｆ１（５’−ＴＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＣＡＴＣＧＣ−３’；配列番号４）とＬｊＨｂ１Ｒ１（５’−ＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧ−３’；配列番号６）を用いてミヤコグサのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅することにより得た。プローブとしてのＬｊＨｂ１断片を増幅するためのこのＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ（Ｒ）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルの条件で行った。
このようなヤシャブシの根粒ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの結果、ＡｆＨｂ１遺伝子が同定された。塩基配列解析の結果、ＡｆＨｂ１遺伝子は、そのｃＤＮＡにおける開始コドンから終止コドンまでの塩基長が４８３ｂｐであり、１６０個のアミノ酸をコードする遺伝子であることが分かった。ＡｆＨｂ１（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ２２１３４４）のｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を配列番号８に、コードされているアミノ酸配列を配列番号９に示す。さらに、ヤシャブシのＡｆＨｂ１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（開始コドンから終止コドンまで）を配列番号１０に示す。
［実施例１０］ヤシャブシ非共生型グロビン遺伝子（ＡｆＨｂ１）の発現解析
ＡｆＨｂ１の発現解析は、ヤシャブシの各種器官の組織から常法により抽出したｍＲＮＡを試料として、ＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲには下記のＡｆＨｂ１Ｆ１プライマーとＡｆＨｂ１Ｒ３プライマーを用い、逆転写とその転写産物の増幅にはＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、逆転写産物の増幅にも下記ＡｆＨｂ１Ｆ１プライマーとＡｆＨｂ１Ｒ３プライマーを用いた。使用したそれらプライマーの配列を以下に示す。
ＡｆＨｂ１Ｆ１：５’−ＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＴ−３’（配列番号１１；フォワードプライマー）
ＡｆＨｂ１Ｒ３：５’−ＧＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１２；リバースプライマー）
得られた増幅産物を電気泳動し、撮影した電気泳動写真をイメージングしてそのバンドの濃さから各組織におけるＡｆＨｂ１遺伝子の発現量を決定した。
このＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果は、ＡｆＨｂ１遺伝子がヤシャブシの成長個体の様々な器官で発現していたことを示した。特に、根粒組織では強く発現していた。またＡｆＨｂ１遺伝子は、ミヤコグサのＬｊＨｂ１遺伝子と同様に、低温といったストレス処理によっても強く発現が誘導されることが分かった。
［実施例１１］形質転換用ベクターの構築
ＡｆＨｂ１遺伝子の機能を明らかにするため、ＡｆＨｂ１遺伝子を過剰に発現する形質転換ミヤコグサの作出を試みた。形質転換用のベクター構築には、プラスミドｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７，５８１−５９０）とｐＨＫＮ２９（Ｋｕｍａｇａｉ ａｎｄ Ｋｏｕｃｈｉ．２００３ ＭＰＭＩ １６（８），６６３−６６８）を使用した。
まず、ヤシャブシの根粒から抽出した全ＲＮＡより逆転写によって合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより完全長のＡｆＨｂ１ ｃＤＮＡをクローニングした。得られたＡｆＨｂ１ｃＤＮＡは、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬのカリフラワーモザイクウィルス由来３５Ｓプロモーターの下流に連結した。さらにこの３５Ｓ−ＡｆＨｂ１ ｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＨＫＮ２９のＧＦＰ領域の下流へ連結して、最終的な形質転換ベクターｐＡｆＨｂ１Ｓとした。
［実施例１２］形質転換毛状根の作出
ＡｆＨｂ１を用いたミヤコグサの形質転換には、アグロバクテリウム・リゾジェネスを介した毛状根誘導型の形質転換系を採用した。この形質転換法は共トランスフェクションという原理に基づくものであり、アグロバクテリウム・リゾジェネスによって、誘導される毛状根が形質転換される。本実施例における形質転換毛状根の作出は実施例３の方法に準じて行った。
実施例１１で作製した、ＡｆＨｂ１遺伝子を過剰発現するように構築した形質転換ベクターｐＡｆＨｂ１Ｓを、アグロバクテリウム・リゾジェネスＬＢＡ１３３４にエレクトロポレーションにより直接導入した。該ベクターｐＡｆＨｂ１Ｓを導入したアグロバクテリウム・リゾジェネスＬＢＡ１３３４の菌体懸濁液を、胚軸の部分で切断した播種後５日目のミヤコグサ実生に接種し、感染させた。その後、これを滅菌したろ紙上に載せ、共存培養培地にて５日間共存培養した。共存培養終了後、寒天培地［抗生物質セフォタックス（ｃｅｆｏｔａｘ）（２００μｇ／ｍｌ；中外製薬株式会社）を添加したＧａｍｂｏｒｇＢ５培地（製造：日本製薬株式会社、販売：和光純薬工業株式会社）］上にのせ、毛状根を誘導した。
毛状根へのＡｆＨｂ１導入の有無は、実施例４と同様にして、ＧＦＰ蛍光検出とＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。その結果、ＡｆＨｂ１を導入したアグロバクテリウム・リゾジェネスを感染させた全てのミヤコグサ個体において，ＧＦＰの蛍光を発する毛状根が誘導されていた。一方、ＲＴ−ＰＣＲによる確認の結果、ＡｆＨｂ１を導入した毛状根（形質転換体）では、ＡｆＨｂ１を導入していない野生株の毛状根に比べ、約１００倍を超える量のＡｆＨｂ１の遺伝子発現が誘導されていた。ＲＴ−ＰＣＲを用いたＡｆＨｂ１遺伝子の発現確認の結果を図９に示す。図９中、ＬｊｅＩＦ−４Ａは陽性対照である。
［実施例１３］形質転換個体の表現型の解析
実施例１２においてＡｆＨｂ１遺伝子による形質転換が確認された毛状根を持つ植物を、培養土（バーミキュライト：パーライト＝４：１）に移植し、ＫＮＯ３を終濃度が１ｍＭになるように加えたフェラウス培地（Ｆａｈｒａｅｕｓ，（１９５７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）３７４−３８１）を与え、１週間生育させた。その後、新しい培養土に移植し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度のミヤコグサ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ ３０３０９９）をその毛状根に接種した。根粒菌接種後は、窒素源を入れないフェラウス培地を与え、さらに４週間生育させた。この形質転換植物の生育条件は、１６時間 明／８時間 暗のサイクルで、植物育成チャンバー内で２５〜２６℃とした。生育した植物体の毛状根には根粒が形成された。根粒の数は、形質転換体及び非形質転換体のいずれも、１植物体当たり平均９個であった。根粒の大きさ、色などの外観には、形質転換体と非形質転換体の間で特に差異は見られなかった。
次いで、形質転換体の表現型の一つとして、毛状根に着生した根粒の窒素固定活性を測定した。窒素固定活性は、アセチレンをエチレンに還元する活性（Ａｃｅｔｙｌｅｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＲＡ）として、実施例５に記載した方法に従って測定した。結果を図１０に示す。図１０中、対照は、ＡｆＨｂ１遺伝子を含まないプラスミドｐＨＫＮ２９を導入したミヤコグサを試料として用いたものである。
測定の結果、ＡｆＨｂ１を導入し過剰発現させた毛状根に着生した根粒は、ＡｆＨｂ１を導入していないミヤコグサ野生株の毛状根に着生した根粒と比較して、単位重量当たり３〜５倍の窒素固定活性を示した。図１０に示す通り、ＡｆＨｂ１を過剰発現させた毛状根に着生した根粒は、単位重量当たり７．２ｎＭ／ｍｉｎ／ｇのＡＲＡ活性（平均値）を示した。ＡｆＨｂ１を導入したミヤコグサの植物体全体についても測定を行ったところ、単位重量当たり１３ｎＭ／ｍｉｎ／ｇのＡＲＡ活性（平均値）が示された。一方、対照実験として、ＡｆＨｂ１を導入していない野生株の毛状根に着生した根粒は、単位重量当たり２．６ｎＭ／ｍｉｎ／ｇのＡＲＡ活性（平均値）を示した。ＡｆＨｂ１を導入していない野生株の植物体全体では、単位重量当たり５ｎＭ／ｍｉｎ／ｇのＡＲＡ活性（平均値）が示された。
以上の結果から、ヤシャブシの非共生型グロビン遺伝子ＡｆＨｂ１を導入したミヤコグサでも、その毛状根に着生した根粒における窒素固定活性が顕著に向上することが示された。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, the technical scope of this invention is not limited by these.
[Example 1] Isolation and identification of non-symbiotic globin gene (LjHb1)
  A non-symbiotic globin gene (LjHb1) of Lotus japonicus was isolated by screening by PCR from the genome library of Soya (Sato et al. (2000) DNA Res. 8: p. 311-318). . Primers used for screening were designed based on the sequence of a non-symbiotic globin gene homolog existing in the EST library of Miyakogusa (clone name: AV413959, DDBJ / EMBL / GenBank accession number: AB238220). The sequence of this primer is as follows.
  LjHb1F1: 5'-TTCTCACTTCACTTCCATGCC-3 '(SEQ ID NO: 4; forward primer)
  LjHb1F2: 5'-TTGGTCAAGTCATGGAGCG-3 '(SEQ ID NO: 5; forward primer)
  LjHb1R1: 5'-TCACAGTGACTTTTCCACG-3 '(SEQ ID NO: 6; reverse primer)
  LjHb1R2: 5'-AGACAGACATGGCATGAGGGC-3 '(SEQ ID NO: 7; reverse primer)
  PCR for amplifying the LjHb1 gene is GeneAmp.(R)A PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used under the following reaction conditions: 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  As a result of screening of the genomic library of Miyakogusa, the gene LjHb1 present on the TAC clone (LjTOIO1) was identified. As a result of analyzing the base sequence of LjHb1 on the Lotus japonicus genome, it was found that this gene has a total length of 1012 bp from the start codon to the stop codon and encodes 161 amino acid residues. FIG. 1 shows the genomic structure of the non-symbiotic globin gene (LjHb1) and the amino acid sequence encoded thereby. The gene LjHb1 has a structure including four exons and three introns common to the plant globin gene, and was present on the third chromosome among the six chromosomes of Miyakogusa.
[Example 2] Expression analysis of non-symbiotic globin gene (LjHb1)
  LjHb1 expression analysis was performed by RT-PCR in two experimental systems: tissue-specific expression and stressed expression. In the experimental system in which the expression for each tissue was examined, four tissue samples, 1) leaves, 2) stems, 3) roots, and 4) nodules, were used as tissue samples. In the experimental system in which the expression under stress conditions was examined, four samples were used: 1) untreated (control), 2) sucrose addition, 3) low temperature, and 4) hypoxia. For RT-PCR, the primers LjHb1F1 and LjHb1R2 used in Example 1 were used, and One-step RT-PCR kit (QIAGEN) was used for reverse transcription and transcription product amplification. The expression level of the gene LjHb1 was confirmed by electrophoresis. An electrophoretic photograph was imaged, and the expression level of LjHb1 was expressed as a relative value based on the intensity of the band.
  FIG. 2A shows the results of an experiment for examining the expression by tissue. LjHb1 was shown to be expressed in various organs of growing individuals. The expression levels (relative values) were 0.4 for leaves, 0.4 for stems, 1.0 for roots, and 36.0 for root nodules. Thus, it was strongly expressed especially in the nodule tissue. Moreover, the result of the experiment which investigated the expression under stress conditions is shown to FIG. 2B. LjHb1 is strongly expressed by stress treatment such as low temperature (expression level in FIG. 2B: about 250) and hypoxia (expression level in FIG. 2B: about 450) when viewed as a relative expression level compared to no treatment. It has been shown.
[Example 3] Construction of vector for transformation
  In order to produce transformed Lotus root plants and transgenic hairy roots that overexpress LjHb1, a gene in which LjHb1 cDNA was linked to a strong promoter was constructed. For the construction of a vector for transformation, plasmids pKANNIBAL (Wesley et al. 2001 the plant Journal 27,581-590), pHKN29 (Kumagai and Kouchi, 2003 MPMI 16 (8), 663-668), pIG121-Hm (Oh) et al., 1990 Plant Cell Physiol., 31, 805-813).
  Total RNA was extracted from the root nodules of Lotus japonicus by conventional methods, cDNA was synthesized by RT-PCR, and full-length LjHb1 cDNA was cloned by PCR using this cDNA as a template. The obtained full-length LjHb1 cDNA (SEQ ID NO: 1) was first ligated downstream of the 35S promoter of pKANNIBAL cauliflower mosaic virus. Furthermore, a 35S-LjHb1 cDNA fragment was excised from this vector and ligated downstream of the GFP region of pHKN29 to obtain plasmid vector pR35SLjHb1 (FIG. 3). This pR35SLjHb1 was used for the induction of transformed hairy roots as described below.
  Further, the full-length LjHb1 cDNA was ligated downstream of the 35S promoter of pIG12I-Hm to obtain a plasmid vector pT35SljLb1. As described later, this pT35SljLb1 was used for the production of transformed Lotus japonicus plants.
[Example 4] Production of transformed hairy root, gene introduction and confirmation of expression
  Using the plasmid vector prepared in Example 3, transformed hairy roots of Lotus japonicus into which LjHb1 had been introduced were produced by a hairy root induction type transformation system via Agrobacterium rhizogenes.
  First, the vector pR35SLjHb1 constructed so as to overexpress LjHb1 in Example 3 was transferred from Agrobacterium rhizogenes LBA1334 (Dr. Clara Diaz (Institute Molecular Plant Science), Directly introduced by poration. The cell suspension of Agrobacterium lysogenes carrying this pR35SLjHb1 was inoculated into Miyakogusa seedlings on the fifth day after sowing that were cut at the hypocotyl part. Thereafter, this was placed on a sterilized filter paper and placed in a co-culture medium (1/10 B5, BAP 0.5 μg / ml, NAA 0.05 μg / ml, MES (pH 5.2) 5 mM, acetosyringone 20 μg / ml). For 5 days. After completion of co-culture, the mixture is placed on Gamborg B5 medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., sales: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) supplemented with the antibiotic cefotax (200 μg / ml; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) Induced. The induced hairy root is shown in FIG. 4A. FIG. 4A shows various samples with different growth stages and hairy root generation times.
  The presence or absence of LjHb1 gene introduction into the hairy root was confirmed by detecting GFP fluorescence and detecting the 35S promoter and LjHb1 fusion gene by PCR amplification. In the hairy root into which the LjHb1 gene was introduced, GFP was produced and green fluorescence was observed (FIG. 4B). The left-side (upper and lower) photographs in FIG. 4B are the results of bright-field observation, and the right-hand (upper and lower) photographs are the results of dark-field observation. The root where the symbiotic globin gene is overexpressed and GFP fluorescence is observed is clearly observed.
  Furthermore, total RNA was extracted from the transformed hairy root by a conventional method, and RT-PCR was performed to confirm the expression of the introduced LjHb1 gene. Wild strained roots were used as controls. The result is shown in FIG. 4C. In FIG. 4C, the amount of RNA used for gene expression of the gene LjeIF-4A, which is known to be expressed at the same level in all tissues and at all times, is the same in the test sample and the control (control) sample. It was used as an index indicating
  As shown in the results, in the hairy root into which the LjHb1 gene was introduced, the expression of the LjHb1 gene more than about 100 times was induced as compared with the wild-type hairy root into which the LjHb1 gene was not introduced.
[Example 5] Measurement of nodule formation and nitrogen fixing activity of transformed hairy roots
  The hairy root-derived plant in which the introduction of the LjHb1 gene was confirmed in Example 4 was transplanted to culture soil (vermiculite: perlite = 4: 1), and KNO3Was added to a final concentration of 1 mM to give Ferrau's medium (Fahraeus, (1957) J. Gen. Microbiol. 16 (2) 374-381) and grown for 1 week. Then transplanted to new culture soil, 1 × 107The hairy roots were inoculated with Mesohizobium loti MAFF303099 at a cell / ml concentration. After inoculation with rhizobia, a medium containing no nitrogen source was given, and further grown for 4 weeks. The growth conditions of the transformed plant were 16 hours light / 8 hours dark cycle, and 25-26 ° C. in the plant growth chamber. Four weeks later, nodules were formed on the hairy roots (FIG. 5).
  Next, the nitrogen fixing activity of the nodules grown on the hairy roots was measured as the activity of reducing acetylene to ethylene (Acetylene reduction activity; ARA). Specifically, first, nodules collected from the hairy roots were put into a 15 cm test tube and sealed with a rubber cap. The air in the test tube was sufficiently sucked with an aspirator, and then filled with acetylene gas. After the test tube was incubated at room temperature for 2 hours, the gas in the test tube was collected, and the amount of ethylene generated was measured by gas chromatography. The measurement results are shown in FIG.
  From the measurement results shown in FIG. 6, the ARA activity per unit weight (gram weight of root nodules) in the root nodules grown on hairy roots over-expressed with LjHb1 was calculated to be 11.15 nM / min / g. [1.45 × 21.5−0.5 = 30.67 (nM / g); 30.67 (nM) ÷ 2.75 minutes = about 11.15 nM / min / g]. On the other hand, as a control experiment, the ARA activity per unit weight (gram weight of root nodules) in root nodules grown on hairy roots not introduced with LjHb1 was calculated as 2.12 nM / min / g [1.45. × 4-0.5 = 5.3 (nM / g); 5.3 (nM) ÷ 2.5 minutes = 2.12 nM / min / g]. It was shown that the nodule grown on the hairy root (transformant) overexpressed by introducing LjHb1 increased the nitrogen fixation activity by 5 times or more.
[Example 6] Production of transformed plant body
1) Infection of A. tumefaciens to Lotus japonicus
  Hypocotyls were cut out at the border between the cotyledons and the roots from Miyakogusa seedlings after 5 days of sowing. On the other hand, pT35SljLb1 prepared in Example 3 was directly introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105 (provided by Professor Kenzo Nakamura, Nagoya University) by electroporation. A cell suspension of Agrobacterium tumefaciens EHA105 holding the obtained pT35SljLb1 (1.0 × 107Cells / ml, OD600= 0.10 × 0.15), acetosyringone having a final concentration of 100 μM was added, and the cut hypocotyl was immersed in the solution. The hypocotyl was cut into sections about 5 mm thick in solution. This section was infected with Agrobacterium by being immersed in the cell suspension as it was for 30 minutes. The section after infection was placed on a sterilized filter paper, and coculture medium (1/10 B5, BAP 0.5 μg / ml, NAA 0.05 μg / ml, MES (pH 5.2) 5 mM, acetosyringone 20 μg / ml) The cells were cocultured at 25 ° C. for 3 to 5 days.
2) Callus induction
  The co-cultured sections were treated with callus medium (1 × B5, 2% sucrose, BAP 0.5 μg / ml) to which antibiotic cefotax (250 μg / ml) for sterilization and antibiotic hygromycin B for selection of transformants were added. , NAA 0.05 μg / ml, 10 mM NH4, 0.3% phytagel) and cultured at 25 ° C. in a 14 hour light / 10 hour dark cycle for 5 weeks. Sections were replanted every 1-2 weeks.
3) Induction of shoot from callus
  Sections cultured for 5 weeks in the above callus medium were used for shoot induction medium (1 × B5, 2% sucrose, BAP 0.5 μg / ml, NAA 0.05 μg / ml, 10 mM NH).4, 0.3% phytagel) and cultured at 25 ° C. in a 14 hour light (6100 lux) / 10 hour dark cycle for 2 weeks. Thereafter, the callus sections were transplanted to a shoot induction medium to which hygromycin B was not added, and cultured for 3 weeks under the same culture conditions as described above. Callus replanting was performed every 1-2 weeks.
4) Chute elongation
  Callus was transferred to shoot elongation medium (1 × B5, 2% sucrose, BAP 0.2 μg / ml, 0.3% phytagel) at 25 ° C. for 14 hours light (6100 lux) / 10 hours dark cycle, Cultured for 3 weeks. Callus replanting was performed every 1-2 weeks. Thereafter, the callus was transplanted into a shoot elongation medium containing no plant hormone, and cultured for 2 to 3 weeks under the same culture conditions as described above to promote shoot elongation.
5) Root induction and elongation
  A shoot of 5 mm or more generated from a callus placed on a shoot elongation medium was cut out from the shoot base with a razor. The shoots were placed vertically and the shoot base was inserted into a root induction medium (1/2 B5, 1% sucrose, 0.5 μg / ml NAA, 0.4% phytagel) for 14 hours (6100 lux) / The cells were cultured for 10 weeks in a dark cycle for over 1 week. Thereafter, the shoots with enlarged cut ends were inserted into a root elongation medium (1/2 B5, 1% sucrose) and cultured for 2 to 3 weeks under the same culture conditions as described above to promote root elongation.
6) Cultivation of transformed plants
  The plant obtained by extending the roots as described above was extracted from the medium, and the gel adhering to the roots was washed well in water. This plant body was transplanted to vermiculite soaked with a commercially available B5 medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted 1/10 times, and cultivated in a cycle of 14 hours light (6100 lux) / 10 hours darkness. The cultivated Miyakogusa plant was seeded and harvested. Thereafter, the seeds were sown and cultivated with power soil (Kureha Horticulture Soil).
  The plant thus grown was confirmed by PCR amplification of the 35S promoter and LjHb1 fusion gene to confirm the success of LjHb1 gene transfer. The increase in the expression level of the LjHb1 gene was confirmed by RT-PCR.
[Example 7] Nodulation and nitrogen fixation activity of Lotus japonicus transformed plants
  The Lotus japonicus transformed plant produced in Example 6 and confirmed to have introduced and expressed the LjHb1 gene was transplanted and cultivated in culture soil (vermiculite: perlite = 4: 1).7Inoculated with Mesohizobium loti MAFF 303099 at a cell / ml concentration. After inoculation with rhizobia, transformed plants were cultivated in a plant growth chamber at 25-26 ° C. for 4 weeks in a 16 hour light (6100 lux) / 8 hour dark cycle. After 4 weeks, the rooted nodules were collected from the plant body, and ARA activity was measured in the same manner as in Example 5. As a result of the measurement, the ARA activity per unit weight (gram weight of root nodules) in the nodules grown on the Lotus japonicus transformed plants overexpressing LjHb1 was calculated to be 17.21 nM / min / g. On the other hand, as a control experiment, the ARA activity per unit weight (gram weight of root nodules) in the root nodules that had not been introduced with LjHb1 (ordinary seedlings, wild type) was calculated to be 5.05 nM / min / g. It was done.
  In addition, the average number of nodules formed on the plant body obtained in this example was 7 for both the transformant and the non-transformant. There was no particular difference in the appearance such as the size and color of the nodules.
[Example 8] Comparison of affinity between nitric oxide and non-symbiotic globin of sorghum
  The full-length LjHb1 cDNA obtained in Example 3 (the sequence from the start codon to the stop codon is shown in SEQ ID NO: 1; encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2) was converted into the protein expression vector pGEX4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). ) Was cloned by a conventional method (FIG. 7) and introduced into E. coli to obtain a transformant. As a control sample, the symbiotic globin gene was similarly cloned into the expression vector pGEX4T-3 (FIG. 7) and introduced into E. coli to obtain a transformant. By culturing the resulting Escherichia coli transformant and inducing expression, it was possible to recombinantly produce a large amount of soluble and active non-symbiotic globin in the body of Escherichia coli. Subsequently, Escherichia coli in which the non-symbiotic globin gene was expressed was recovered by a conventional method, destroyed, and then purified by protein. As a result, active non-symbiotic hemoglobin could be obtained. Since heme is simultaneously supplied in E. coli introduced with a non-symbiotic globin gene, the globin obtained by destroying E. coli was isolated in association with heme derived from E. coli and having activity as hemoglobin. Is.
  Subsequently, nitric oxide was mixed with the obtained symbiotic hemoglobin, and absorbance was measured over time. FIG. 8 shows absorbance spectra at wavelengths of 500 nm to 600 nm after 0 minutes, 5 minutes, 15 minutes, and 30 minutes after the start of the mixing of nitric oxide. As shown in FIG. 8, it is shown that two peaks at 540 nm and 575 nm disappeared as the mixing time of nitric oxide increased. In particular, in the case of non-symbiotic hemoglobin, the peak at 575 nm was lost earlier and almost disappeared after 15 minutes. On the other hand, in the case of symbiotic hemoglobin, the peak at 540 nm did not decrease so much, and even after 30 minutes, the peak at 575 nm was still weak, but two peaks were observed.
[Example 9] Isolation and identification of Yashabushi non-symbiotic globin gene (AfHb1)
  Using a non-symbiotic globin gene (AfHb1) of Alnus farma and a DNA fragment of Miyakogusa non-symbiotic globin gene LjHb1 as a probe, a nodule cDNA library (Sasakura, F. et al., “A class 1 hemoglob”). (from) Gene. A lnus farm functions in symbiotic and nonsymbiotic tissues to detox toxic oxid. "Mol. Plant Microbe.
  The screening probe was designed on the basis of the sequence of Miyakogusa non-symbiotic globin gene LjHb1 (clone name: AV413959, DDBJ / EMBL / GenBank accession number: AB238220). -3 ′; SEQ ID NO: 4) and LjHb1R1 (5′-TCACAGGTGAACTTTCCAGCG-3 ′; SEQ ID NO: 6), and obtained by PCR amplification from Miyakogusa genomic DNA. This PCR to amplify the LjHb1 fragment as a probe is GeneAmp(R)PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used, and the conditions were 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds under 30 cycles.
  The AfHb1 gene was identified as a result of such screening of the rhododendron nodule cDNA library. As a result of nucleotide sequence analysis, it was found that the AfHb1 gene has a base length of 483 bp from the start codon to the stop codon in the cDNA, and encodes 160 amino acids. The base sequence from the start codon to the stop codon of cDNA of AfHb1 (DDBJ / EMBL / GenBank accession number: AB221344) is shown in SEQ ID NO: 8, and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 9. Furthermore, the base sequence (from the start codon to the stop codon) of the genomic DNA of the Yachabushi AfHb1 gene is shown in SEQ ID NO: 10.
[Example 10] Expression analysis of Yashabushi non-symbiotic globin gene (AfHb1)
  The expression analysis of AfHb1 was performed using RT-PCR using mRNA extracted from tissues of various organs of Yashabushi by a conventional method. The following AfHb1F1 primer and AfHb1R3 primer are used for RT-PCR, One-Step RT-PCR kit (QIAGEN) is used for reverse transcription and amplification of the transcription product, and the following AfHb1F1 primer is also used for amplification of the reverse transcription product. AfHb1R3 primer was used. The sequences of those primers used are shown below.
  AfHb1F1: 5'-GCTGCTATTCAAATCTGCAAT-3 '(SEQ ID NO: 11; forward primer)
  AfHb1R3: 5'-GGGGGGCTGTGTATTTAG-3 '(SEQ ID NO: 12; reverse primer)
  The obtained amplification product was electrophoresed, the photographed electrophoretic photograph was imaged, and the expression level of the AfHb1 gene in each tissue was determined from the intensity of the band.
  The results of the expression analysis by RT-PCR showed that the AfHb1 gene was expressed in various organs of Yashabushi growing individuals. In particular, it was strongly expressed in the nodule tissue. It was also found that the expression of the AfHb1 gene is strongly induced by stress treatment such as low temperature, like the LjHb1 gene of Lotus japonicus.
[Example 11] Construction of vector for transformation
  In order to clarify the function of the AfHb1 gene, an attempt was made to produce a transformed Lotus japonicus that overexpresses the AfHb1 gene. Plasmid pKANNIBAL (Wesley et al. 2001 The Plant Journal 27,581-590) and pHKN29 (Kumagai and Kouchi.2003 MPMI 16 (8), 663-668) were used for the construction of the vector for transformation.
  First, a full-length AfHb1 cDNA was cloned by PCR using a cDNA synthesized by reverse transcription from total RNA extracted from the root nodules of Yachabushi as a template. The obtained AfHb1 cDNA was ligated downstream of the 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus of pKANNIBAL. Furthermore, this 35S-AfHb1 cDNA fragment was excised and ligated downstream of the GFP region of pHKN29 to obtain the final transformation vector pAfHb1S.
[Example 12] Production of transformed hairy roots
  For transformation of Lotus japonicus using AfHb1, a hairy root induction type transformation system via Agrobacterium rhizogenes was employed. This transformation method is based on the principle of co-transfection, and the induced hairy root is transformed by Agrobacterium rhizogenes. Production of transformed hairy roots in this example was performed according to the method of Example 3.
  The transformation vector pAfHb1S constructed so as to overexpress the AfHb1 gene prepared in Example 11 was directly introduced into Agrobacterium lysogenes LBA1334 by electroporation. The cell suspension of Agrobacterium lysogenes LBA1334 into which the vector pAfHb1S was introduced was inoculated and infected with Miyakogusa seedlings on the fifth day after seeding, which had been cut at the hypocotyl part. Thereafter, this was placed on a sterilized filter paper and co-cultured for 5 days in a co-culture medium. After completion of co-culture, put on agar medium [Gamborg B5 medium supplemented with antibiotic cefotax (200 μg / ml; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) (manufacturing: Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., sales: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] Induced hairy roots.
  The presence or absence of AfHb1 introduction into the hairy root was confirmed using GFP fluorescence detection and RT-PCR in the same manner as in Example 4. As a result, hairy roots emitting fluorescence of GFP were induced in all the Spodoptera individuals infected with Agrobacterium lysogenes into which AfHb1 was introduced. On the other hand, as a result of confirmation by RT-PCR, in the hairy root (transformant) into which AfHb1 was introduced, the gene expression of AfHb1 was about 100 times greater than that of the wild-type hairy root into which AfHb1 was not introduced. Has been induced. The results of confirming the expression of the AfHb1 gene using RT-PCR are shown in FIG. In FIG. 9, LjeIF-4A is a positive control.
[Example 13] Analysis of phenotype of transformed individuals
  A plant having a hairy root that was confirmed to be transformed with the AfHb1 gene in Example 12 was transplanted to a culture soil (vermiculite: perlite = 4: 1), and KNO.3Was added to a final concentration of 1 mM to give Ferrau's medium (Fahraeus, (1957) J. Gen. Microbiol. 16 (2) 374-381) and grown for 1 week. Then transplanted to new culture soil, 1 × 107The hairy root was inoculated with Mesohizobium loti MAFF 303099 at a cell / ml concentration. After inoculation with rhizobia, ferrous medium without nitrogen source was given, and further grown for 4 weeks. The growth condition of this transformed plant was a cycle of 16 hours light / 8 hours dark, and was 25 to 26 ° C. in the plant growth chamber. Nodules were formed on the hairy roots of the grown plants. The average number of root nodules was 9 per plant for both transformants and non-transformants. There was no particular difference between the transformants and the non-transformants in the appearance of nodule size and color.
  Next, as one of the phenotypes of the transformant, the nitrogen fixing activity of nodules grown on hairy roots was measured. The nitrogen fixation activity was measured according to the method described in Example 5 as the activity of reducing acetylene to ethylene (acetylene reduction activity; ARA). The results are shown in FIG. In FIG. 10, the control is Miyakogusa into which a plasmid pHKN29 that does not contain the AfHb1 gene is introduced as a sample.
  As a result of the measurement, the nodules grown on the hairy roots over-expressed by introducing AfHb1 were 3 to 3 per unit weight compared to the root nodules planted on the hairy roots of the wild sorghum strain not introduced with AfHb1. It showed 5 times the nitrogen fixation activity. As shown in FIG. 10, nodules grown on hairy roots overexpressing AfHb1 exhibited ARA activity (average value) of 7.2 nM / min / g per unit weight. Measurements were also made on the whole plant of A. thaliana introduced with AfHb1, and an ARA activity (average value) of 13 nM / min / g per unit weight was shown. On the other hand, as a control experiment, nodules grown on wild-type hairy roots into which AfHb1 had not been introduced exhibited an ARA activity (average value) of 2.6 nM / min / g per unit weight. In the whole plant of the wild strain into which AfHb1 was not introduced, ARA activity (average value) of 5 nM / min / g was shown per unit weight.
  From the above results, it was shown that the nitrogen fixation activity in the nodules grown on the hairy roots is also significantly improved even in the Lotus japonicus into which the non-symbiotic globin gene AfHb1 of Yashabushi was introduced.

本発明の根粒着生植物の作出法により、根粒の窒素固定活性を格段に向上させた根粒着生植物を得ることができる。本発明の根粒着生植物を栽培することにより植物栽培における窒素固定量を増大させる方法は、当該根粒着生植物の収量又は生長量を増大させる目的や、土壌中の窒素量を増大させて土壌を肥沃化し、また荒廃地等を緑化する目的のために使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。By the method for producing a nodule-growing plant of the present invention, a nodule-growing plant in which the nitrogen fixing activity of the nodule is remarkably improved can be obtained. The method for increasing the nitrogen fixation amount in plant cultivation by cultivating the nodulating plant of the present invention is intended to increase the yield or growth amount of the nodulating plant, or by increasing the amount of nitrogen in the soil. It can be used for the purpose of fertilizing and greening desolated land.
All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

配列番号４〜７、１１及び１２の配列は、プライマーを示す。
［配列表］
The sequences of SEQ ID NOs: 4-7, 11 and 12 represent primers.
[Sequence Listing]

Claims (12)

非共生型グロビン遺伝子を根粒着生植物中で過剰発現させ、その根粒着生植物に共生窒素固定菌を接種し、着生した根粒における窒素固定活性の増大を確認することを特徴とする、窒素固定活性が増大した根粒を着生できる根粒着生植物の作出方法。A non-symbiotic globin gene is overexpressed in a nodulating plant, inoculated with a symbiotic nitrogen-fixing bacterium, and an increase in nitrogen-fixing activity in the grown nodule is confirmed. A method for producing a nodule-growing plant capable of growing nodules with increased fixing activity. 非共生型グロビン遺伝子が、以下の(a)〜(e)からなる群より選択されるDNAからなるものである、請求項１に記載の方法。
(a) 配列番号１又は８に示される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１又は８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、配列番号１又は８に示される塩基配列と90％以上の相同性を有するDNA
(c) 配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d) 配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードする、DNA
(e) 配列番号３又は１０に示される塩基配列からなるDNAThe method according to claim 1, wherein the non-symbiotic globin gene comprises DNA selected from the group consisting of the following (a) to (e).
(a) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8
(b) a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8 under a stringent condition and encodes a protein having non-symbiotic globin activity , DNA having 90% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8
(c) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9
(d) DNA consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9, and encoding a protein having non-symbiotic globin activity
(e) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 10 過剰発現プロモーターに連結された非共生型グロビン遺伝子を根粒着生植物に導入することにより、非共生型グロビン遺伝子を過剰発現させる、請求項１又は２に記載の方法。  The method according to claim 1 or 2, wherein a non-symbiotic globin gene is overexpressed by introducing a non-symbiotic globin gene linked to an overexpression promoter into a nodulating plant. 窒素固定活性の増大が、野生株と比較して少なくとも３倍の増大である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the increase in nitrogen fixation activity is at least a 3-fold increase compared to the wild type strain. 窒素固定活性が増大した根粒が、10〜100 nM/min/gの窒素固定活性を示す根粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the nodule having an increased nitrogen fixation activity is a nodule exhibiting a nitrogen fixation activity of 10 to 100 nM / min / g. 根粒着生植物がマメ科植物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the nodulating plant is a leguminous plant. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって作出される根粒着生植物を栽培することを特徴とする、植物栽培における窒素固定効率を増大させる方法。 A method for increasing nitrogen fixation efficiency in plant cultivation, comprising cultivating a nodulating plant produced by the method according to any one of claims 1 to 6 . 根粒着生植物に着生する根粒の窒素固定活性を増大させるための、過剰発現プロモーターに連結された非共生型グロビン遺伝子の使用であって、該非共生型グロビン遺伝子が、以下の(a)〜(d)からなる群より選択されるDNAからなるものである、使用。Use of a non-symbiotic globin gene linked to an overexpression promoter for increasing the nitrogen fixation activity of a nodule growing on a nodule-growing plant, wherein the non-symbiotic globin gene comprises the following (a) to Use which consists of DNA selected from the group consisting of (d).
(a) 配列番号１又は８に示される塩基配列からなるDNA(a) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 8
(b) 配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA(b) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9
(c) 配列番号２又は９に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非共生型グロビン活性を有するタンパク質をコードする、DNA(c) a DNA comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 9, and encoding a protein having non-symbiotic globin activity
(d) 配列番号３又は１０に示される塩基配列からなるDNA(d) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 10 非共生型グロビン遺伝子が、ベクター中に組み込まれている、請求項８に記載の使用。Use according to claim 8, wherein the non-symbiotic globin gene is incorporated into the vector. 窒素固定活性の増大が、野生株と比較して少なくとも３倍の増大である、請求項８又は９に記載の使用。Use according to claim 8 or 9, wherein the increase in nitrogen fixation activity is at least a 3-fold increase compared to the wild type strain. 根粒の窒素固定活性を、10〜100 nM/min/gの窒素固定活性へと増大させる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。Use according to any one of claims 8 to 10, wherein the nitrogen fixing activity of the nodules is increased to a nitrogen fixing activity of 10 to 100 nM / min / g. 根粒着生植物がマメ科植物である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用。The use according to any one of claims 8 to 11, wherein the nodulating plant is a legume.
JP2007508097A 2005-03-14 2006-03-03 Production method of plants that grow nodules with high nitrogen fixation activity Active JP4677568B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005071677 2005-03-14
JP2005071677 2005-03-14
PCT/JP2006/304681 WO2006098225A1 (en) 2005-03-14 2006-03-03 Method of constructing plant having nodules with high nitrogen fixation activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2006098225A1 JPWO2006098225A1 (en) 2008-08-21
JP4677568B2 true JP4677568B2 (en) 2011-04-27

Family

ID=36991571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007508097A Active JP4677568B2 (en) 2005-03-14 2006-03-03 Production method of plants that grow nodules with high nitrogen fixation activity

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JP4677568B2 (en)
CN (1) CN101208430B (en)
AU (1) AU2006224032B2 (en)
CA (1) CA2600560C (en)
WO (1) WO2006098225A1 (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
CN108602729B (en) 2015-07-13 2022-07-05 皮沃特生物公司 Methods and compositions for improving plant traits
AU2016336328A1 (en) 2015-10-05 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored nif clusters
UY37566A (en) * 2017-01-12 2018-07-31 Pivot Bio Inc METHODS AND COMPOSITIONS TO IMPROVE CHARACTERISTICS IN PLANTS
CN108728425B (en) * 2017-04-13 2021-12-03 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 Gene for regulating nitrogen fixation capacity of root nodule plant and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004242631A (en) * 2003-02-17 2004-09-02 Japan Science & Technology Agency Method for increasing active nitrogen stress tolerance of plant
WO2004087755A2 (en) * 2003-04-01 2004-10-14 Cropdesign N.V. Plant haemoglobin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005055703A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-23 University Of Manitoba Method of modifying plant phenotypes with nonsymbiotic hemoglobin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004242631A (en) * 2003-02-17 2004-09-02 Japan Science & Technology Agency Method for increasing active nitrogen stress tolerance of plant
WO2004087755A2 (en) * 2003-04-01 2004-10-14 Cropdesign N.V. Plant haemoglobin

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006224032B2 (en) 2010-06-24
AU2006224032A1 (en) 2006-09-21
CA2600560A1 (en) 2006-09-21
WO2006098225A1 (en) 2006-09-21
CA2600560C (en) 2013-07-16
CN101208430B (en) 2013-07-17
JPWO2006098225A1 (en) 2008-08-21
CN101208430A (en) 2008-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107827964B (en) Transcription factor PwNAC2 related to plant stress tolerance, and coding gene and application thereof
CN112779234B (en) Phyllostachys pubescens PeAPX5 gene and application thereof
CN109232725B (en) Soybean C2H2 type single zinc finger protein transcription factor, coding gene and application
CN104903444B (en) Highly yielding ability nucleic acid, the method for preparing the increased genetically modified plants of yield, the method for increasing the yield of plant are assigned to plant
JP4677568B2 (en) Production method of plants that grow nodules with high nitrogen fixation activity
CN113831397A (en) Proanthocyanidins substance regulatory factor NtMYB330, and expression vector, transformant, kit and method thereof
CN109021084A (en) Trifoliate orange Cold resistant genes PtrERF109 and its application in plant cold resistance genetic improvement
CN109971766B (en) Plant stress tolerance associated protein PwRBP1, and coding gene and application thereof
CN112280786B (en) Herbicide-tolerant corn even HH2823 transformation event with high nutrient utilization efficiency and specificity identification method and application thereof
CN110218247B (en) Interaction of two proteins PwRBP1 and PwNAC1 for synergistically improving plant stress tolerance and application thereof
JP2015171326A (en) Gene that provides plants with disease resistance, drought resistance, salinity tolerance, increased photosynthesis efficiency and increased number of tillers
CN110684088B (en) Protein ZmbZIPa3 and application of coding gene thereof in regulating and controlling plant growth and development and stress tolerance
CN114703199B (en) Plant drought resistance related gene TaCML46 and application thereof
CN112794887B (en) Duli pear transcription factor PbrWRKY40 and application thereof in improving total acid content of plants and salt resistance genetic improvement
CN105505984B (en) Carrier of rice respiratory burst oxidase gene OsRboh (LOC_Os01g25820) and application thereof
CN109750008B (en) Upland cotton optical signal path regulating factor GhCOP1 and application thereof
CN102115751A (en) Rape BnPABP 5 gene and application of promoter thereof
US20080295198A1 (en) Method for Producing Plant Forming Nodules with High Nitrogen-Fixing Activity
CN111454987B (en) Application of GhNAC091 gene in improving plant photosynthesis efficiency and strong light tolerance
CN114230649B (en) Tn1 protein related to rice tillering force, related biological material and application thereof
CN114231556B (en) Application of GmECT2 in regulating plant height
CN108192919A (en) A kind of method for cultivating drought resisting transgene cotton
CN111304221B (en) Cymbidium CgWRKY31 gene and application thereof
CN110760522B (en) AK209 gene and its coded protein and application in resisting stress and increasing yield
CN110256543B (en) PwNAC1 gene and application of encoding protein thereof in plant stress resistance

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070808

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100720

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100916

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101026

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101117

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110104

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150