JP4665613B2 - L-tyrosine producing bacterium and method for producing L-tyrosine - Google Patents
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Description
本発明は、発酵法によるＬ−チロシン生産菌及びＬ−チロシンの製造法に関する。 The present invention relates to an L-tyrosine producing bacterium by fermentation and a method for producing L-tyrosine.
一般にＬ−チロシンは、医薬品の原料や合成中間体として有用な物質である。従来のＬ−チロシン製造法としては、調味料の原料となる大豆などの植物性タンパク質分解物を製造する際に沈殿するオリからＬ−チロシンを抽出する方法（特許文献１）、ブレビバクテリウム属細菌などを用いる直接発酵法(特許文献２)が知られている。 Generally, L-tyrosine is a substance useful as a raw material for pharmaceuticals or a synthetic intermediate. As a conventional L-tyrosine production method, a method of extracting L-tyrosine from oli which precipitates when producing a vegetable protein degradation product such as soybean as a raw material for seasoning (Patent Document 1), Brevibacterium genus A direct fermentation method using bacteria or the like (Patent Document 2) is known.
ブレビバクテリウム属細菌はアロゲン酸経路というＬ−チロシン生合成系をもっており、芳香族共通経路のプレフェン酸からプレフェン酸アミノトランスフェレラーゼによりアロゲン酸が生成し、さらにアロゲン酸デヒドロゲナーゼによってＬ−チロシンが生成する。この経路上の二つの酵素は最終産物であるＬ−チロシンに阻害されるものがないという特徴から、従来からＬ−チロシンの製造にブレビバクテリウム属細菌が利用されている。しかし、この細菌は生育が遅いゆえに生産性が低いという問題点があった。 Brevibacterium bacteria have an L-tyrosine biosynthetic system called the allogenic acid pathway, allogenic acid is generated from prefenic acid, a common aromatic pathway, by prephenic acid aminotransferase, and L-tyrosine is generated by allogenic dehydrogenase. To do. Since two enzymes on this pathway are not inhibited by the final product L-tyrosine, Brevibacterium bacteria have been conventionally used for the production of L-tyrosine. However, this bacterium has a problem of low productivity because of its slow growth.
一方、エシェリヒア・コリのＬ−チロシン生合成系はブレビバクテリウム属細菌と異なり、プレフェン酸がプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（以下「PDH」と略す。）により脱水されて４−ヒドロキシフェニルピルビン酸となり、さらに芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼによってＬ−チロシンが合成される。エシェリヒア・コリによる直接発酵法でＬ−チロシンを製造するに当たり、最大の問題となるのが、このＬ−チロシン特異経路の最初の酵素であるPDHが低濃度のＬ−チロシンによって強い阻害を受けてしまうという点である。エシェリヒア・コリで効率よくＬ−チロシンを製造するためには、このPDHのＬ−チロシンによる阻害を解除することが先決となる。 On the other hand, the L-tyrosine biosynthetic system of Escherichia coli differs from Brevibacterium bacteria, and prefenic acid is dehydrated by prephenic acid dehydrogenase (hereinafter abbreviated as “PDH”) to form 4-hydroxyphenylpyruvic acid, and further, aroma L-tyrosine is synthesized by the family amino acid aminotransferase. The biggest problem in producing L-tyrosine by direct fermentation using Escherichia coli is that PDH, the first enzyme in this L-tyrosine-specific pathway, is strongly inhibited by low concentrations of L-tyrosine. It is a point to end up. In order to efficiently produce L-tyrosine with Escherichia coli, it is first determined to cancel the inhibition of PDH by L-tyrosine.
これまでにエシェリヒア・コリのＬ−チロシンに生成に関する例としてはp−フルオロ−チロシン耐性菌がＬ−チロシンを排出したという報告（非特許文献１）、その他β−２−チエニル−アラニン耐性菌（非特許文献２）、ｐ−アミノフェニルアラニン耐性菌（非特許文献３）に関しても、Ｌ−チロシンを排出したという報告がある。しかし、これらの中には、その変異点が３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（DS）遺伝子などにあって、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（tyrA）以外の変異点であるか、または変異点が不明であった。したがって、フィードバック阻害が解除されたPDHを保持するＬ−チロシン生産菌は報告されておらず、またPDH活性のフィードバック阻害解除の原因となる遺伝子変異の報告もなかった。 Examples of the production of L-tyrosine in Escherichia coli so far include reports that p-fluoro-tyrosine-resistant bacteria have excreted L-tyrosine (Non-patent Document 1), other β-2-thienyl-alanine-resistant bacteria ( Non-patent document 2) and p-aminophenylalanine resistant bacteria (non-patent document 3) have also been reported to have discharged L-tyrosine. However, among these, the mutation point is in the 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase (DS) gene and the like, and the mutation point is other than the prefenate dehydrogenase gene (tyrA). There were some or unknown mutation points. Therefore, no L-tyrosine-producing bacterium that retains PDH whose feedback inhibition has been released has been reported, and there has been no report of a gene mutation that causes cancellation of feedback inhibition of PDH activity.
他の微生物ではバチルス属細菌においてD−チロシン耐性菌からPDHのフィードバックが阻害された菌株が取得されているが（非特許文献４）、この阻害解除によって実際にＬ−チロシンが生成されているのかどうか記されておらず、また遺伝子の変異点は調べられていない。さらに、エシェリヒア・コリはdadA（D-amino acid dehydrogenase A）遺伝子を有し、D-tyrosine耐性であるため（非特許文献５），この方法をエシェリヒア・コリに応用することも不可能である。 In other microorganisms, a strain in which PDH feedback is inhibited from a D-tyrosine-resistant bacterium in a bacterium belonging to the genus Bacillus (Non-Patent Document 4), is L-tyrosine actually produced by this inhibition cancellation? It is not described, and the mutation point of the gene has not been investigated. Furthermore, since Escherichia coli has a dadA (D-amino acid dehydrogenase A) gene and is resistant to D-tyrosine (Non-patent Document 5), it is impossible to apply this method to Escherichia coli.
エシェリヒア・コリにおいて、PDHはtyrA遺伝子上にあり、Chorismate mutase(CM)と同一のポリペプチドを形成している(配列番号１)。PDHのL−チロシンによる阻害に関しては、わずか300μMの濃度で阻害されてしまうこという報告があり（非特許文献６）、また、tyrA遺伝子のPDH活性部位についても、94-373番目のアミノ酸にPDHの活性部位、活性阻害部位があることまでは記載されているが（非特許文献７）、活性阻害部位がどの部位（ア
ミノ酸残基）に存在するか知られていない。
In Escherichia coli, PDH is on the tyrA gene and forms the same polypeptide as Chorismate mutase (CM) (SEQ ID NO: 1). Regarding the inhibition of PDH by L-tyrosine, there is a report that it is inhibited at a concentration of only 300 μM (Non-patent Document 6), and the PDH active site of the tyrA gene is also PDH at the 94th to 373rd amino acids. However, it is not known at which site (amino acid residue) the activity-inhibiting site is present (Non-patent Document 7).
３−フルオロ−チロシンはPDH活性を阻害することは知られていたが、同時にDS活性の阻害剤であり、そのDS発現抑制機能が広く知られていることから、３−フルオロ−チロシンはチロシンリプレッサー（tyrR）欠損株を単離する指標としては用いられてきた。しかし、３−フルオロ−チロシンを用いて変異型PDHを取得することはこれまでに報告されていなかった。
本発明は、Ｌ−チロシンを生産する新規なエシェリヒア属細菌を提供すること、およびエシェリヒア属細菌を用いて効率よくＬ−チロシンを製造する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel bacterium belonging to the genus Escherichia that produces L-tyrosine, and to provide a method for efficiently producing L-tyrosine using the bacterium belonging to the genus Escherichia.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌を用いることにより、効率よくＬ−チロシンを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have efficiently used L-tyrosine by using a bacterium belonging to the genus Escherichia that holds a mutant prefenate dehydrogenase in which feedback inhibition by L-tyrosine has been released. Has been found to be able to be produced, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
（２）Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、（１）のエシェリヒア属細菌。
（３）Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、（２）のエシェリヒア属細菌。
（４）２５０位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２５１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、２５３位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、２５４位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、２５５位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、２５７位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、ア
ラニン又はロイシンであり、２５８位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、２５９位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、２６０位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、２６１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又はロイシンであり、２６３位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、２６５位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、２６６位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、２６７位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、２６９位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである、（３）のエシェリヒア属細菌。
（５） 野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、（２）または（３）のエシェリヒア属細菌；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（６） さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、（１）〜（５）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（７） さらに、チロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、（１）〜（６）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（８） さらに、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、（１）〜（７）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（９） さらに、シキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変された、（１）〜（８）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（１０） （１）〜（９）のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する、Ｌ−チロシンの製造法。
（１１） プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、エシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する、Ｌ−チロシンの製造法。
（１２） プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、変異が導入された遺伝子を微生物に導入する工程、及び該微生物から３−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、選択された微生物からＬ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離する工程を含む、Ｌ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の取得方法。
（１３）野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ。
That is, the present invention is as follows.
(1) A bacterium belonging to the genus Escherichia having an ability to produce L-tyrosine and having a mutant prefenate dehydrogenase released from feedback inhibition by L-tyrosine.
(2) In the mutant prefenate dehydrogenase released from feedback inhibition by L-tyrosine, one or more amino acids selected from amino acids at positions 250 to 269 in the amino acid sequence of wild-type prefenate dehydrogenase are substituted with other amino acids. The bacterium belonging to the genus Escherichia according to (1), which is a mutant prefenate dehydrogenase.
(3) Mutant prefenate dehydrogenase in which feedback inhibition by L-tyrosine has been released is alanine at position 250, phenylalanine at position 251, glutamine at position 253, glutamine at position 253, alanine at position 254, 255 Leucine at position 257, histidine at position 257, phenylalanine at position 258, alanine at position 259, threonine at position 261, phenylalanine at position 261, tyrosine at position 263, leucine at position 265, histidine at position 266, leucine at position 267 and 269 The bacterium belonging to the genus Escherichia according to (2), which is a mutant prefenate dehydrogenase in which one or more amino acids selected from the glutamic acid at the position are substituted with other amino acids.
(4) The amino acid that substitutes alanine at position 250 is phenylalanine, the amino acid that substitutes phenylalanine at position 251 is serine, the amino acid that substitutes glutamine at position 253 is leucine, and the amino acid that substitutes alanine at position 254 Is serine, proline or glycine, the amino acid replacing leucine at position 255 is glutamine or glycine, the amino acid replacing histidine at position 257 is tyrosine, threonine, serine, alanine or leucine, and phenylalanine at position 258 is The amino acid substituted is cysteine, alanine, isoleucine or valine, the amino acid substituted for alanine at position 259 is leucine, valine or isoleucine, and the amino acid substituted for threonine at position 260 is glycine, alanine, valine Cysteine, isoleucine, phenylalanine, asparagine or serine, the amino acid replacing phenylalanine at position 261 is methionine or leucine, the amino acid replacing tyrosine at position 263 is cysteine, glycine, threonine or methionine, and leucine at position 265 Lysine, isoleucine, tyrosine or alanine, amino acid replacing histidine at position 266 is tryptophan or leucine, amino acid replacing leucine at position 267 is tyrosine or histidine, and glutamic acid at position 269 is substituted. The Escherichia bacterium according to (3), wherein the amino acid to be substituted is tyrosine, phenylalanine, glycine, isoleucine or leucine.
(5) The Escherichia bacterium according to (2) or (3), wherein the wild-type prefenate dehydrogenase is a protein shown in the following (a) or (b):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a prefenate dehydrogenase activity;
(6) The bacterium belonging to the genus Escherichia according to any one of (1) to (5), which is further modified so that expression of a gene encoding prefenate dehydratase is decreased.
(7) The bacterium belonging to the genus Escherichia according to any one of (1) to (6), which is further modified so that expression of a gene encoding a tyrosine repressor is decreased.
(8) The bacterium belonging to the genus Escherichia according to any one of (1) to (7), which further retains 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase that has been desensitized by L-phenylalanine.
(9) The Escherichia bacterium according to any one of (1) to (8), which is further modified so that expression of a gene encoding shikimate kinase II is enhanced.
(10) The Escherichia bacterium according to any one of (1) to (9) is cultured in a medium, and L-tyrosine is produced and accumulated in the medium or in the microbial cells. A method for producing L-tyrosine, wherein tyrosine is collected.
(11) Modified so that expression of a gene encoding a prefenate dehydratase and a gene encoding a tyrosine repressor is decreased, and expression of a gene encoding a prefenate dehydrogenase and a gene encoding shikimate kinase II are enhanced. Furthermore, Escherichia bacterium, which retains 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase, which has been released from inhibition by L-phenylalanine, is cultured in a medium, and L-tyrosine is contained in the medium or in the cells. Is produced and accumulated, and L-tyrosine is collected from the medium or from the cells.
(12) introducing a mutation into a gene encoding prephenate dehydrogenase, introducing the gene into which the mutation has been introduced into a microorganism, selecting a microorganism having 3-fluorotyrosine resistance from the microorganism, and selecting the selected microorganism A method for obtaining a gene encoding a prefenate dehydrogenase released from inhibition by L-tyrosine, comprising a step of isolating a gene encoding a prefenate dehydrogenase released from inhibition by L-tyrosine.
(13) A mutant prefenate dehydrogenase in which one or more amino acids selected from amino acids at positions 250 to 269 of the amino acid sequence of wild-type prefenate dehydrogenase are substituted with other amino acids.
本発明の細菌を用いることにより、効率よくＬ−チロシンを製造することが出来る。 By using the bacterium of the present invention, L-tyrosine can be produced efficiently.
以下、本発明について詳細に説明する
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. <1> Escherichia bacterium according to the present invention The bacterium belonging to the genus Escherichia according to the present invention has an ability to produce L-tyrosine and is a mutant prefen in which feedback inhibition by L-tyrosine is canceled. It is an Escherichia bacterium that retains acid dehydrogenase.
エシェリヒア属細菌は、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 12301 Parklawn Drive,Rockville Maryland 20852,United
States of America ）。
Examples of Escherichia bacteria include those listed in the book by Neidhardt et al. (Neidhardt, FCet.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, table 1), for example, Escherichia coli. Examples of wild strains of Escherichia coli include the K12 strain or derivatives thereof, Escherichia coli MG1655 strain (ATCC No. 47076), and W3110 strain (ATCC No. 27325). These can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC) at 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852, United
States of America).
本発明において「Ｌ−チロシン生産能」とは、細菌を培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−チロシンを蓄積する能力、又は菌体中のＬ−チロシン含量を野生株又は非形質転換株に比べて増加させる能力をいう。本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−チロシン生産能を本来的に有するものであってもよいが、変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼや阻害解除型３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼなどを保持することによって、Ｌ−チロシン生産能を有するようになったものでもよい。 In the present invention, “L-tyrosine-producing ability” refers to the ability to accumulate a significant amount of L-tyrosine in the medium or the L-tyrosine content in the cells when the bacterium is cultured in the medium. The ability to increase compared to a non-transformed strain. The bacterium belonging to the genus Escherichia of the present invention may inherently have an ability to produce L-tyrosine, but it may be a mutant prephenate dehydrogenase or an inhibitory 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphorus. It may have an ability to produce L-tyrosine by retaining acid synthase or the like.
プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）とは、プレフェン酸を脱水して4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記活性を有する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。ここで数個とは、具体的には２から２０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。なお、上記のうちの置換は、アミノ酸配列２中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。置換は上記活性が保持される限り特に制限されないが、例えば、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が例示される。
Prefenate dehydrogenase (PDH) refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction of dehydrating prefenic acid to produce 4-hydroxyphenylpyruvic acid. Examples of such a protein include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Moreover, as long as it has the said activity, the protein which has an amino acid sequence by which the 1 or several amino acid was substituted, deleted, or added in the amino acid sequence of
さらに、プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、上記活性を有する限り、配列番号２のアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
さらに、配列番号１の塩基配列を有するDNAによってコードされるタンパク質や、配列番号１の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、上記活性を有するタンパク質であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
なお、本発明においては、上記のような配列を有し、L−チロシンによってフィードバ
ック阻害を受けるプレフェン酸デヒドロゲナーゼを「野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ」と呼ぶ。
Further, the prefenate dehydrogenase is a protein having an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as it has the above activity. Good.
Further, a protein encoded by a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a protein encoded by a DNA that hybridizes with a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and having the above activity There may be. Here, as stringent conditions, for example, at a salt concentration corresponding to 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably once. Conditions for washing 2 to 3 times are mentioned.
In the present invention, a prefenate dehydrogenase having the above-described sequence and subjected to feedback inhibition by L-tyrosine is referred to as “wild-type prefenate dehydrogenase”.
一方、「L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ」とは、例えば、L−チロシンの存在下において、L−チロシン非存在下と同程度の活性を保持するプレフェン酸デヒドロゲナーゼをいう。具体的には、例えば、100μMのL−チロシンの存在下での活性が、Ｌ−チロシン非存在下での活性の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるプレフェン酸デヒドロゲナーゼをいう。このような変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼにアミノ酸置換を導入し、該アミノ酸置換型プレフェン酸デヒドロゲナーゼの中から、L−チロシンによるフィードバック阻害を受けないものを選択することによって得ることができる。具体的には、例えば、PCRなどによる部位特異的変異法を用いてPDHをコードするDNA（例えば、配列番号１）にアミノ酸置換を生じさせるような塩基置換を導入し、該塩基置換が導入されたDNAでエシェリヒア属細菌（野生型PDH遺伝子が破壊されたものが好ましい）を形質転換し、該細菌のPDH活性を、L−チロシンの存在下及び非存在下において測定し、その値を比較することによって、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたPDHを選択することができる。なお、PDH活性はBiochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54に記載の方法に従って測定することができる。
On the other hand, “mutant prefenate dehydrogenase in which feedback inhibition by L-tyrosine has been released” means, for example, prefenate dehydrogenase that retains the same level of activity in the presence of L-tyrosine as in the absence of L-tyrosine. Say. Specifically, for example, prefenic acid whose activity in the presence of 100 μM L-tyrosine is 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the activity in the absence of L-tyrosine Dehydrogenase. Such a mutant prefenate dehydrogenase is obtained by introducing an amino acid substitution into a wild-type prefenate dehydrogenase and selecting one that does not undergo feedback inhibition by L-tyrosine from the amino acid-substituted prefenate dehydrogenase. Can do. Specifically, for example, base substitution that causes amino acid substitution is introduced into DNA encoding PDH (eg, SEQ ID NO: 1) using a site-specific mutation method such as PCR, and the base substitution is introduced. E. coli bacteria (preferably those in which the wild type PDH gene is disrupted) are transformed with the obtained DNA, and the PDH activity of the bacteria is measured in the presence and absence of L-tyrosine and the values are compared. Thus, PDH in which feedback inhibition by L-tyrosine is released can be selected. The PDH activity can be measured according to the method described in Biochemistry. 1990
また、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたPDHをコードする遺伝子の取得は、３−フルオロチロシンを用いて行うこともできる。すなわち、野生型ＰＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、変異が導入された遺伝子を微生物に導入し、該微生物から３−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、さらに、選択された微生物のPDH活性をL−チロシンの存在下および非存在下で測定することによってＬ−チロシンによる阻害が解除されたＰＤＨを保持する微生物を選択し、得られた微生物からＬ−チロシンによる阻害が解除されたＰＤＨをコードする遺伝子を取得するという方法を採用することもできる。 Moreover, acquisition of the gene which codes PDH from which feedback inhibition by L-tyrosine was cancelled | released can also be performed using 3-fluorotyrosine. That is, a mutation is introduced into a gene encoding wild-type PDH, the introduced gene is introduced into a microorganism, a microorganism having 3-fluorotyrosine resistance is selected from the microorganism, and the PDH of the selected microorganism is further selected. A microorganism that retains PDH that has been desensitized by L-tyrosine is selected by measuring the activity in the presence and absence of L-tyrosine, and PDH that has been desensitized by L-tyrosine from the resulting microorganism. A method of obtaining a gene encoding can also be employed.
本発明のエシェリヒア属細菌が保持する変異型ＰＤＨとしては、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたものである限り特に制限されないが、好ましくは、野生型PDHのアミノ酸配列において２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。
２５０〜２６９位のアミノ酸の中で置換されるアミノ酸としてより好ましいものは、２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸である。
これらのアミノ酸を置換するアミノ酸の種類はＬ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型PDHを生じさせるものである限り特に制限されないが、特に好ましくは、２５０位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２５１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、２５３位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、２５４位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、２５５位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、２５７位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、アラニン又はロイシンであり、２５８位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、２５９位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、２６０位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、２６１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又は
ロイシンであり、２６３位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、２６５位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、２６６位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、２６７位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、２６９位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである。
なお、各アミノ酸の位置は配列番号２における位置を示している。ただし、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがあり、例えば、「260位のスレオニン」は、Ｎ末端側に１つのアミノ酸が挿入されれば本来260位のスレオニンはN末端から261番目のアミノ酸残基となるが、そのようなスレオニンも、本発明においては260位のスレオニンと呼ぶこととする。その他のアミノ酸についても同様である。
The mutant PDH retained by the bacterium belonging to the genus Escherichia of the present invention is not particularly limited as long as feedback inhibition by L-tyrosine is cancelled. Preferably, amino acids at positions 250 to 269 in the amino acid sequence of wild-type PDH are used. And those in which one or more amino acids selected from are substituted with other amino acids.
Among the amino acids substituted at positions 250 to 269, amino acids substituted at positions 250 to 269 are preferably alanine at position 250, phenylalanine at position 251, glutamine at position 253, alanine at position 254, leucine at position 255, histidine at position 257, 258 1 or more selected from phenylalanine at position 259, alanine at position 259, threonine at position 260, phenylalanine at position 261, tyrosine at position 263, leucine at position 265, histidine at position 266, leucine at position 267, and glutamic acid at position 269 Of amino acids.
The type of amino acid for substituting these amino acids is not particularly limited as long as it gives rise to mutant PDH in which feedback inhibition by L-tyrosine is canceled. Particularly preferably, the amino acid substituting alanine at position 250 is phenylalanine. The amino acid replacing phenylalanine at position 251 is serine; the amino acid replacing glutamine at position 253 is leucine; the amino acid replacing alanine at position 254 is serine, proline or glycine; and leucine at position 255 The amino acid to be substituted is glutamine or glycine, the amino acid to substitute histidine at position 257 is tyrosine, threonine, serine, alanine or leucine, and the amino acid to substitute phenylalanine at position 258 is cysteine, alanine, isoleucine or The amino acid replacing alanine at position 259 is leucine, valine or isoleucine, and the amino acid replacing threonine at position 260 is glycine, alanine, valine, cysteine, isoleucine, phenylalanine, asparagine or serine, and position 261 The amino acid replacing phenylalanine is methionine or leucine, the amino acid replacing tyrosine at position 263 is cysteine, glycine, threonine or methionine, and the amino acid replacing leucine at position 265 is lysine, isoleucine, tyrosine or alanine, The amino acid replacing histidine at position 266 is tryptophan or leucine, the amino acid replacing leucine at position 267 is tyrosine or histidine, and the amino acid replacing glutamic acid at position 269 There is a tyrosine, phenylalanine, glycine, isoleucine or leucine.
In addition, the position of each amino acid has shown the position in
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型PDHをエシェリヒア属細菌に保持させるためには、例えば、変異型PDHをコードするDNAを含むプラスミドでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。 In order to retain a mutant PDH in which feedback inhibition by L-tyrosine has been released in an Escherichia bacterium, for example, the Escherichia bacterium may be transformed with a plasmid containing a DNA encoding the mutant PDH.
変異型PDHをコードするＤＮＡ（変異型ｔｙｒＡ遺伝子ともいう）としては、ＰＤＨ活性を有し、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたＰＤＨをコードするものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにおいて、PDHの250〜269位のアミノ酸、好ましくは２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸に対応するコドンが、上述したような他のアミノ酸のコドンに置換された遺伝子を挙げることができる。 The DNA encoding mutant PDH (also referred to as mutant tyrA gene) is not particularly limited as long as it encodes PDH having PDH activity and desensitized to feedback inhibition by L-threonine. In the DNA having the base sequence of No. 1 or the DNA hybridizing with the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID No. 1 under stringent conditions, amino acids at positions 250 to 269 of PDH, preferably alanine at position 250, 251 Position phenylalanine, position 253 glutamine, position 254 alanine, position leucine, position 257 histidine, position 258 phenylalanine, position 259 alanine, position 260 threonine, position 261 phenylalanine, position 263 tyrosine, 265 Leucine, 266, histidine Codon corresponding to one or more amino acids selected from the 267 leucine and position 269 of glutamic acid, it may be mentioned genes replaced with codons for other amino acids as described above.
変異型ｔｙｒＡ遺伝子を導入するために使用できるベクターとしては、エシェリヒア属細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができるが、具体的には、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。 Examples of vectors that can be used to introduce the mutant tyrA gene include vectors that can replicate autonomously in cells of the genus Escherichia. Specifically, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (PHSG and pACYC are available from Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW is available from Nippon Gene Co., Ltd.) and the like.
変異型ｔｙｒＡ遺伝子を含むプラスミドを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970) ）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C.H., Wilson, G.A.and Young,
F.E., Gene, 1, 153 (1977) ）がある。
In order to introduce a plasmid containing a mutated tyrA gene into a microorganism, any known transformation method may be used. For example, there is a method (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) that treats recipient cells with calcium chloride to increase the DNA permeability, and Bacillus subtilis. A method for preparing competent cells from cells in a growth stage and introducing DNA as reported in (Duncan, CH, Wilson, GAand Young,
FE, Gene, 1, 153 (1977)).
さらに、変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入は、変異型ｔｙｒＡ遺伝子をエシェリヒア属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に変異型ｔｙｒＡ遺伝子を多コピーで導入するには、例えば、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、変異型ｔｙｒＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。変異型ｔｙｒＡ遺伝子を導入する際には、強力なプロモーターの下流に該遺伝子を連結して導入してもよい。例えば、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
Furthermore, the introduction of the mutant tyrA gene can also be achieved by allowing multiple copies of the mutant tyrA gene to be present on the chromosomal DNA of Escherichia bacteria. In order to introduce a mutant tyrA gene in multiple copies on the chromosomal DNA of a microorganism, for example, homologous recombination can be performed using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, a mutant tyrA gene can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA. When the mutant tyrA gene is introduced, the gene may be linked and introduced downstream of a strong promoter. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters.
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記のような変異型ＰＤＨを保持し、さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌であることが好ましい。プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈｅＡ遺伝子ともいう）としては、例えば、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ活性は、Biochemica Biophysica Acta (BBA) 1965 (100)76-88に記載の方法に従って測定することができる。ｐｈｅＡ遺伝子の発現量は野生株などの非改変株に比べて１０％以下に低下していることが好ましい。なお、低下とは完全に発現量が消失した場合も含む。ｐｈｅＡ遺伝子の発現量を低下させるための改変は、遺伝子破壊や、プロモーターなどの発現調節領域の改変によって行うことができる。具体的には、以下の方法によって行うことができる。
The Escherichia bacterium of the present invention is preferably an Escherichia bacterium that retains the mutant PDH as described above and is further modified so that expression of a gene encoding prefenate dehydratase is reduced. Examples of the gene encoding prefenate dehydratase (also referred to as pheA gene) include a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 3. Moreover, as long as it encodes the protein which has prefenic acid dehydratase activity, the gene may hybridize with the polynucleotide which has the base sequence of
相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。エシェリヒア・コリ用の温度感受性複製起点を含むプラスミドとしては、例えばpMAN031（Yasueda, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)）、pMAN997（WO 99/03988号）、及びpEL3（K. A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347）が挙げられる。 Gene disruption by gene replacement using homologous recombination has already been established, and there are a method using linear DNA and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin. Examples of plasmids containing a temperature-sensitive replication origin for Escherichia coli include pMAN031 (Yasueda, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)), pMAN997 (WO 99/03988), and pEL3 (KA Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347).
内部配列が欠失したような欠失型ｐｈｅＡ遺伝子を、宿主染色体上のｐｈｅＡ遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と、欠失型ｐｈｅＡ遺伝子と、アンピシリン又はクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とをベクターに挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するｐｈｅＡ遺伝子配列との組換えを起こし、染色体（内因性）ｐｈｅＡ遺伝子と欠失型ｐｈｅＡ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。 In order to replace a deletion-type pheA gene in which the internal sequence is deleted with a pheA gene on the host chromosome, for example, the following may be performed. A recombinant DNA is prepared by inserting a temperature-sensitive replication origin, a deletion-type pheA gene, and a marker gene resistant to drugs such as ampicillin or chloramphenicol into a vector, and the recombinant DNA is used to produce an Escherichia bacterium. And culturing the transformed strain at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin does not function, and then culturing the transformed strain in a medium containing a drug to obtain a transformed strain in which the recombinant DNA is incorporated into the chromosomal DNA. It is done. In this way, the strain in which the recombinant DNA is integrated into the chromosome undergoes recombination with the pheA gene sequence originally present on the chromosome, and two fusion genes of the chromosome (endogenous) pheA gene and the deleted pheA gene are assembled. It is inserted into the chromosome with the other part of the replacement DNA (vector part, temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker) in between.
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子のみを残すために、２個のｐｈｅＡ遺伝子の組換えにより１コピーのｐｈｅＡ遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なｐｈｅＡ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なｐｈｅＡ遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のｐｈｅＡ遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が残った株を選択することによって、ｐｈｅＡ遺伝子が破壊された株を取得することができる。 Next, in order to leave only the deleted pheA gene on the chromosomal DNA, one copy of the pheA gene is recombined by recombination of the two pheA genes together with the vector portion (including the temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker). Remove from DNA. At that time, the normal pheA gene is left on the chromosomal DNA and the deleted pheA gene is excised, and conversely, the deleted pheA gene is left on the chromosomal DNA and the normal pheA gene is excised. is there. In either case, if the cells are cultured at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin functions, the excised DNA is retained in the cell in the form of a plasmid. Next, when cultured at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin does not function, the pheA gene on the plasmid is removed from the cell together with the plasmid. Then, a strain in which the pheA gene is disrupted can be obtained by selecting a strain in which the deletion-type pheA gene remains on the chromosome by PCR or Southern hybridization.
ところで、チロシンリプレッサーは発現をｔｙｒＡ遺伝子などの発現を抑制する（Ｊ Biol Chem, 1986, vol 261, p403-410）。したがって、本発明の微生物はさらに、チロシ
ンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌であってもよい。チロシンリプレッサーをコードする遺伝子（ｔｙｒＲ遺伝子ともいう）としては、例えば、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、チロシンリプレッサー活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。ｔｙｒＲ遺伝子の発現量は野生株などの非改変株に比べて１０％以下に低下していることが好ましい。なお、低下とは完全に発現量が消失した場合も含む。ｔｙｒＲ遺伝子の発現量を低下させるための改変は、遺伝子破壊や、プロモーターなどの発現調節領域の改変によって行うことができる。具体的には、上述したｐｈｅＡ遺伝子の破壊と同様の方法によって行うことができる。
By the way, the tyrosine repressor suppresses the expression of the tyrA gene and the like (J Biol Chem, 1986, vol 261, p403-410). Therefore, the microorganism of the present invention may further be an Escherichia bacterium modified so that expression of a gene encoding a tyrosine repressor is decreased. Examples of a gene encoding a tyrosine repressor (also referred to as a tyrR gene) include a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 5. Moreover, as long as it encodes a protein having tyrosine repressor activity, it may be a gene that hybridizes with the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5 under stringent conditions. Here, as stringent conditions, for example, at a salt concentration corresponding to 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably once. Conditions for washing 2 to 3 times are mentioned. It is preferable that the expression level of the tyrR gene is reduced to 10% or less compared to an unmodified strain such as a wild strain. The term “decrease” includes the case where the expression level is completely lost. The modification for decreasing the expression level of the tyrR gene can be performed by gene disruption or modification of an expression regulatory region such as a promoter. Specifically, it can be performed by the same method as the above-described disruption of the pheA gene.
本発明の微生物は、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３-デオキシ-D-アラビノヘプツロン酸-7-リン酸シンターゼ（ＤＳとも呼ぶ）を保持するものであってもよい。Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除されたＤＳとしては、例えば、ａｒｏＧ遺伝子（例えば、配列番号７）にコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号８）の１５０位のプロリンがロイシンに置換されたタンパク質、２０２位のアラニンがスレオニンに置換されたタンパク質、１４６位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されたタンパク質、１４７位のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ３３２位のグルタミン酸がリジンに置換されたタンパク質、１４７位のメチオニンがイソロイシンに置換されたタンパク質、１５７位のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ２１９位のアラニンがスレオニンに置換されたタンパク質などが挙げられる（特開平05-344881または特開平05-236947参照）。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入することによって、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除されたＤＳを保持するエシェリヒア属細菌が得られる。なお、遺伝子導入は、上述した変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入と同様にして行うことができる。 The microorganism of the present invention may further retain 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase (also referred to as DS) that has been desensitized by L-phenylalanine. Examples of the DS in which inhibition by L-phenylalanine is canceled include, for example, a protein in which the proline at position 150 in the amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 8) encoded by the aroG gene (eg, SEQ ID NO: 7) is substituted with leucine, Protein in which alanine at position 202 is substituted with threonine, protein in which aspartic acid at position 146 is replaced with asparagine, methionine at position 147 is replaced with isoleucine, and protein at position 332 in which glutamic acid is replaced with lysine And a protein in which methionine at position 157 is replaced with isoleucine and alanine at position 219 is replaced with threonine (see Japanese Patent Laid-Open No. 05-344881 or Japanese Patent Laid-Open No. 05-236947). . By introducing a gene encoding any of these proteins into a bacterium belonging to the genus Escherichia, a bacterium belonging to the genus Escherichia that retains DS in which inhibition by L-phenylalanine has been released can be obtained. In addition, gene introduction can be performed in the same manner as the introduction of the mutant tyrA gene described above.
本発明の微生物は、さらにシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｒｏＬ）の発現量が上昇するように改変されたものであってもよい。シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号９の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、シキミ酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。この遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入することによって、シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変されたエシェリヒア属細菌が得られる。なお、遺伝子導入は、上述した変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入と同様にして行うことができる。
The microorganism of the present invention may be further modified so that the expression level of a gene encoding a shikimate kinase (aroL) is increased. Examples of the gene encoding shikimate kinase include a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 9. Moreover, as long as it codes the protein which has shikimate kinase activity, the gene which hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide which has a base sequence of
以上、本発明のエシェリヒア属細菌について述べたが、本発明のエシェリヒア属細菌の育種に当たっては、変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持させるための改変、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるための改変などの各種改変は、どのような順序で行ってもよい。 As mentioned above, the Escherichia bacterium of the present invention has been described. In breeding the Escherichia bacterium of the present invention, the modification for retaining the mutant prefenate dehydrogenase, the expression of the gene encoding the prefenate dehydratase are reduced. Various modifications such as modification may be performed in any order.
＜２＞本発明のＬ−チロシンの製造法
本発明のＬ−チロシンの製造法は、本発明のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する方法である。本発明のエシェリヒア属細菌を培養する方法は、従来のＬ−チロシン生産菌の培養方法と同様にして行うことができる。即ち、培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものを使用することができる。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつつ、実質的にＬ−チロシンの生産蓄積が停止するまで行うことが好ましい。培養終了後の培養液中には著量のＬ−チロシンが生成蓄積される。培養液よりＬ−チロシンを採取するには、通常の方法が適用できる。
<2> Method for Producing L-Tyrosine of the Present Invention The method for producing L-tyrosine of the present invention comprises culturing the Escherichia bacterium of the present invention in a medium, and producing and accumulating L-tyrosine in the medium or in the cell body. In this method, L-tyrosine is collected from the medium or from the fungus body. The method for culturing the Escherichia bacterium of the present invention can be carried out in the same manner as the conventional method for culturing L-tyrosine producing bacteria. That is, as a medium, a carbon source,
Usual ones containing a nitrogen source, inorganic ions, and, if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins can be used. As the carbon source, glucose, sucrose, lactose and the like, starch hydrolyzate containing them, whey, molasses and the like are used. As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and the like can be used. The culture is preferably carried out under aerobic conditions until the production and accumulation of L-tyrosine is substantially stopped while appropriately adjusting the pH and temperature of the medium. A significant amount of L-tyrosine is produced and accumulated in the culture broth after completion of the culture. A normal method can be applied to collect L-tyrosine from the culture solution.
本発明はまた、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、エシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンまたはその誘導体を生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンまたはその誘導体を採取する、Ｌ−チロシンまたはその誘導体の製造法を提供する。この方法に用いるエシェリヒア属細菌の作製に用いる各遺伝子は、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（tyrＡ遺伝子）を変異型ではなく、通常型（例えば、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子）を用いる以外は、上述したものと同じものを用いることができる。なお、ここでいうＬ−チロシン誘導体とは、E.coli中において１つまたは２つ以上の遺伝子を発現増強させることによってＬ−チロシンから生成させうることが知られている化合物を指し、例えばメラニン(欧州特許第0547065B1号明細書)や、L-DOPA(特開昭62-259589号公報)などが挙げられる。 The present invention also reduces expression of a gene encoding a prefenate dehydratase and a gene encoding a tyrosine repressor, and increases expression of a gene encoding a prefenate dehydrogenase and a gene encoding shikimate kinase II. A bacterium belonging to the genus Escherichia, which retains 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase, which has been modified and released from inhibition by L-phenylalanine, is cultured in a medium. Provided is a method for producing L-tyrosine or a derivative thereof, in which tyrosine or a derivative thereof is produced and accumulated, and L-tyrosine or a derivative thereof is collected from the medium or from the fungus body. Each gene used for the production of Escherichia bacterium used in this method is not a mutant type gene (tyrA gene) encoding prefenate dehydrogenase but a normal type (for example, a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1). Can be the same as those described above. Here, the L-tyrosine derivative refers to a compound that is known to be produced from L-tyrosine by enhancing expression of one or more genes in E. coli, for example, melanin. (European Patent No. 0547065B1) and L-DOPA (Japanese Patent Laid-Open No. 62-259589).
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下のものには限定されない。
[Example]
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following.
[LB培地]
バクト・トリプトン（ディフコ社製） 10g/L
酵母エキス（ディフコ社製） 5g/L
塩化ナトリウム 10g/L
pH7.0
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
[LB medium]
Bacto Trypton (Difco) 10g / L
Yeast extract (Difco) 5g / L
Sodium chloride 10g / L
pH7.0
[Steam sterilization was performed at 120 ° C for 20 minutes. ]
［LB寒天培地］
L培地
バクトアガー 15g/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
[LB agar medium]
L Medium Bactoagar 15g / L
Steam sterilization was performed at 120 ° C. for 20 minutes.
［最小培地］
グルコース 0.2%
硫酸マグネシウム 1mM
リン酸2水素カリウム 4.5g/L
クエン酸ナトリウム 0.5g/L
硫酸アンモニウム 1g/L
リン酸2ナトリウム 10.5g/L
thiamine hydrochloride 5mg/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
[Minimum medium]
Glucose 0.2%
Magnesium sulfate 1mM
Potassium dihydrogen phosphate 4.5g / L
Sodium citrate 0.5g / L
Ammonium sulfate 1g / L
Disodium phosphate 10.5g / L
thiamine hydrochloride 5mg / L
Steam sterilization was performed at 115 ° C. for 10 minutes.
［最小寒天培地］
最小培地
バクトアガー 15g/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
[Minimum agar medium]
Minimum medium bacto agar 15g / L
Steam sterilization was performed at 115 ° C. for 10 minutes.
［エシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地］
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 16g/L
リン酸２水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩 10mg/L
硫酸マンガン４・７水塩 8mg/L
イーストエキストラクト 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
適宜、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンを添加した。
抗生物質として、クロラムフェニコール25mg/Lやアンピシリン100mg/Lを添加した。
[Escherichia coli L-tyrosine production medium]
Glucose 40g / L
Ammonium sulfate 16g / L
Potassium dihydrogen phosphate 1.0g / L
Magnesium sulfate heptahydrate 1.0g / L
East Extract 2.0g / L
Pharmacopeia calcium carbonate 30g / L
The pH was adjusted to 7.0 with potassium hydroxide, and autoclaved at 115 ° C. for 10 minutes. However, glucose and MgSO 4 .7H 2 O were sterilized separately.
L-phenylalanine and L-tyrosine were added as appropriate.
As antibiotics, chloramphenicol 25 mg / L and ampicillin 100 mg / L were added.
＜フィードバック阻害が解除されたPDHをコードする新規遺伝子の取得〜その１＞
（１）エシェリヒア・コリのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
エシェリヒア・コリK-12 W3110株から通常の方法に従って染色体DNAを抽出した。一方、公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているtyrA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号11及び12に示すような合成DNAプライマー2本を通常の方法で合成した。これらは、それぞれtyrA遺伝子の上流及び下流に相同な配列を持つ。この染色体DNAとプライマーを用いて、PCRを行い、約1kbpのDNA断片を得た。以下、図1に示すようにこの断片をEcoRIとSalIで切断した後、同じくEcoRIとSalIで切断したpSTV28(タカラバイオ社製)にLigation Kit Ver.2(タカラバイオ社製)を用いて連結した。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ K-12 JM109株(タカラバイオ社製)を形質転換し、クロラムフェニコールを含むLB培地上で選択した。クロラムフェニコール耐性株にtyrA遺伝子が挿入されたかどうかをPCRで確認し、野生型tyrA遺伝子を保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラスミドpSTVtyrA(W)を取得した。
<Acquisition of a novel gene encoding PDH for which feedback inhibition has been released-
(1) Acquisition of Escherichia coli tyrA-derived mutant PDH gene Chromosomal DNA was extracted from Escherichia coli K-12 W3110 strain according to a conventional method. On the other hand, based on the base sequence of the tyrA gene described in known literature [J. Mol. Biol. 180 (4), 1023 (1984)], two synthetic DNA primers as shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 Was synthesized in the usual way. These have homologous sequences upstream and downstream of the tyrA gene, respectively. PCR was performed using this chromosomal DNA and primers to obtain a DNA fragment of about 1 kbp. Hereinafter, as shown in FIG. 1, this fragment was cleaved with EcoRI and SalI, and then ligated to pSTV28 (Takara Bio) cut with EcoRI and SalI using Ligation Kit Ver.2 (Takara Bio). . Escherichia coli K-12 JM109 strain (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with this ligation solution and selected on an LB medium containing chloramphenicol. Whether or not the tyrA gene was inserted into the chloramphenicol resistant strain was confirmed by PCR, and a plasmid was extracted from a strain carrying the wild type tyrA gene to obtain plasmid pSTVtyrA (W).
次に、Gene Morph（登録商標） Random mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)を用いて、配列番号１１,１2のプライマーによるPCRでランダムに変異が導入されたtyrA遺伝子断片を得た後、再びpSTV28に連結し、内因性のtyrR遺伝子及びtyrA遺伝子が破壊されたW3110ΔtyrR,tyrA株を形質転換し、クロラムフェニコール、0.1mM 3‐fluoro‐Tyrosineの入った最少培地で生育してきた耐性株を５株W3110ΔtyrR,tyrA/pSTV28tyrA-1,2,5,10,24を選択し、この中からPDHの活性がＬ−チロシンによる阻害を受けないものを選択した。W3110ΔtyrR,tyrAはAJ12741(FERM BP-4796)株よりプラスミドpMGAL1（脱感作型aroG4、野生型aroL及び野生型pheAを含むプラスミド）を脱落させることにより得られる。 Next, using a Gene Morph (registered trademark) Random mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE), a tyrA gene fragment into which mutations were randomly introduced was obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOS: 11 and 12, and then ligated to pSTV28 again. Then, transform the W3110ΔtyrR, tyrA strains in which the endogenous tyrR gene and tyrA gene are disrupted, and develop 5 resistant strains that have grown in a minimal medium containing chloramphenicol and 0.1 mM 3-fluoro-Tyrosine. , tyrA / pSTV28tyrA-1,2,5,10,24 were selected, from which PDH activity was not inhibited by L-tyrosine. W3110ΔtyrR and tyrA can be obtained by removing plasmid pMGAL1 (a plasmid containing desensitized aroG4, wild type aroL and wild type pheA) from AJ12741 (FERM BP-4796) strain.
（２）PDH活性の測定
JM109/pSTV28tyrA-1,2,5,10,24の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて２回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NADを含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図2に示すように、選択
した5株のうち1株が阻害解除型のPDHを保持していた。野生型PDHでは100μMのL-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、変異型PDHは800μMのＬ−チロシンでもほとんど阻害を受けなかった。以後、このフィードバック阻害解除型tyrAをtyrA(mut)と表記する。
(2) Measurement of PDH activity
The culture solution obtained by culturing the cells of JM109 / pSTV28tyrA-1,2,5,10,24 using LB medium at 37 ° C. for 15 hours was centrifuged and collected. Next, the cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 20% glycerol under ice cooling, and then 80 times for 30 seconds. A crude enzyme solution was prepared by ultrasonic crushing. PDH activity was measured according to [Biochemistry. 1990
（３）フィードバック阻害が解除されたPDHを導入したエシェリヒア・コリの培養評価
pSTVtyrA(W)またはpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ、生育してきた菌体を1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のエシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、12,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンの測定は残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにＫＯＨを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で行った。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1
% トリフルオロ酢酸を用いた。結果を表1及び図３に示す。tyrAが脱感作されたことによって、L-チロシンの蓄積が8〜10倍に向上することが明らかとなった。
(3) Cultivation evaluation of Escherichia coli introduced with PDH for which feedback inhibition has been released
Transform W3110ΔtyrR, tyrA with pSTVtyrA (W) or pSTVtyrA (mut), spread it on LB medium containing 25 mg / L chloramphenicol, scrape the grown
% Trifluoroacetic acid was used. The results are shown in Table 1 and FIG. It was revealed that the accumulation of L-tyrosine was improved 8 to 10 times by desensitization of tyrA.
（４）フィードバック阻害が解除されたPDHの変異点の決定
フィードバックが解除されたPDHの遺伝子である、tyrA(mut)の配列を通常の方法に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位及びその対応塩基配列上の変異点を図４（Ａ）に示す。この株で100位のプロリンがセリンに、260位のスレオニンがイソロイシンに置換していた。このどちらが、変異型PDHの脱感作に効果を示しているのかを確認するために、以下のような実験を行った(図４（Ｂ）)。pSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)をtyrAの上流側のマルチクローニングサイトにあるEcoRIと100位の置換部位と260位の置換部位のあいだに位置するCpoIで消化した。ここで得られた、100位の置換部位のみを含む断片をpSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)の対応する断片それぞれにつなぎ変え、100位のみが置換されたpSTVtyrA(P100S)、および260位のみが置換されたpSTVtyrA(T260I)を作製した。これらプラスミドでW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、得られた株をW3110ΔtyrR,tyrA / pSTVtyrA(P100S)、W3110ΔtyrR,tyrA /pSTVtyrA(T260I)と名づけた。この二つの株を培養した結果を表２及び図５に示す。結果、２６０位の置換が脱感作に効果を示しているということが明らかになった。以後の実験にはtyrA(T260I)を使用した。
(4) Determination of mutation point of PDH whose feedback inhibition was canceled The sequence of tyrA (mut), which is a PDH gene whose feedback was canceled, was determined according to a conventional method. FIG. 4 (A) shows a specific substitution site on the amino acid sequence and a mutation point on the corresponding base sequence. In this strain, proline at position 100 was replaced with serine and threonine at position 260 was replaced with isoleucine. In order to confirm which of these has an effect on the desensitization of mutant PDH, the following experiment was performed (FIG. 4B). pSTVtyrA (mut) and pSTVtyrA (W) were digested with EcoRI at the multiple cloning site upstream of tyrA and CpoI located between the substitution site at positions 100 and 260. The obtained fragment containing only the substitution site at position 100 was transferred to the corresponding fragment of pSTVtyrA (mut) and pSTVtyrA (W), respectively, and pSTVtyrA (P100S) in which only position 100 was substituted, and only position 260 PSTVtyrA (T260I) was substituted. W3110ΔtyrR, tyrA was transformed with these plasmids, and the resulting strains were named W3110ΔtyrR, tyrA / pSTVtyrA (P100S) and W3110ΔtyrR, tyrA / pSTVtyrA (T260I). The results of culturing these two strains are shown in Table 2 and FIG. As a result, it became clear that the substitution at position 260 had an effect on desensitization. In subsequent experiments, tyrA (T260I) was used.
フィードバック阻害が解除されたPDHをコードする新規遺伝子の取得〜その２
（１）E.coliのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
tyrAの250番目から270番目のアミノ酸それぞれに対して、ランダムに変異が入るプライマーを設計した(配列番号15〜35)。
これらのプライマー及び配列番号11,12のプライマーを用いて次のような変異導入PCRを行った（図８）。
1stPCR：pSTVtyrA(W)をテンプレートとし、配列番号15〜35のいずれかのプライマーとT2プライマー（配列番号１２）を用いて変異導入部位から下流の配列をpyrobestDNAポリメラーゼ（Takara）で増幅する。
2ndPCR：1stPCRと一連のサイクルで行う。1stPCRで増幅したPCR産物がプライマーとしてtyrA(W)にアニールし、1stPCRで増幅されていないtyrAの上流側に向かって伸長する。
＜1st/2nd PCR cycle＞
96℃2min.→〔94℃30s.・60℃30s.・72℃30s.〕×20→〔94℃1min.・37℃1min.・72℃30s.〕×10→4℃
3rdPCR：2ndPCR産物をすべて混合したものをテンプレートにT1（配列番号11）とT２（配列番号12）で変異点の入ったtyrA全長を増幅する。
＜3rdPCR cycle＞96℃2min.→〔94℃30s.・55℃30s.・72℃1min.〕×30→4℃
増幅された変異型tyrA のPCR断片をpSTV28のSmaIサイトにライゲーションし、pSTVtyrA(mut)を得た。このプラスミドを用いて、W3110ΔtyrR,tyrA株を形質転換した。形質転換した株はクロラムフェニコール、0.1mM 3-fluoro-Tyrosineの入った最少培地に塗布し、37℃、24時間目に生育してきた株から、50株を候補株として取得した。
Acquisition of a novel gene encoding PDH that is desensitized to feedback inhibition (2)
(1) Acquisition of TyrA-derived mutant PDH gene from E. coli
Primers with random mutations were designed for each of the 250th to 270th amino acids of tyrA (SEQ ID NOs: 15 to 35).
The following mutation-introducing PCR was performed using these primers and the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 (FIG. 8).
1st PCR: Using pSTVtyrA (W) as a template, a sequence downstream from the mutation introduction site is amplified with probest DNA polymerase (Takara) using any primer of SEQ ID NOs: 15 to 35 and T2 primer (SEQ ID NO: 12).
2nd PCR: 1st PCR and a series of cycles. The PCR product amplified by 1st PCR anneals to tyrA (W) as a primer, and extends toward the upstream side of tyrA that has not been amplified by 1st PCR.
<1st / 2nd PCR cycle>
96 ℃ 2min. → [94 ℃ 30s ・ 60 ℃ 30s ・ 72 ℃ 30s] × 20 → [94 ℃ 1min. ・ 37 ℃ 1min. ・ 72 ℃ 30s.] × 10 → 4 ℃
3rdPCR: A mixture of all 2nd PCR products is used as a template to amplify the entire length of tyrA containing mutation points at T1 (SEQ ID NO: 11) and T2 (SEQ ID NO: 12).
<3rd PCR cycle> 96 ℃ 2min. → [94 ℃ 30s ・ 55 ℃ 30s.72 ℃ 1min.] × 30 → 4 ℃
The amplified PCR fragment of mutant tyrA was ligated to the SmaI site of pSTV28 to obtain pSTVtyrA (mut). Using this plasmid, the W3110ΔtyrR, tyrA strain was transformed. The transformed strains were applied to a minimal medium containing chloramphenicol and 0.1 mM 3-fluoro-Tyrosine, and 50 strains were obtained from the strains grown at 37 ° C. for 24 hours as candidate strains.
（２）フィードバック阻害が解除されたPDHを導入したE.coliの培養評価
pSTVtyrA(W)とpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のE.coli L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、1
2,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。一方、Ｌ−チロシンの蓄積は、残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにＫＯＨを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で測定した。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1 % トリフルオロ酢酸を用いた。各置換体（変異型PDH）導入株のL-チロシンの蓄積を表３に示す。tyrAへの変異導入によって、L-チロシンの蓄積が1.5〜14倍に向上した株が取得されたことが明らかとなった。
(2) Culture evaluation of E.coli introduced with PDH that has been desensitized to feedback inhibition
Transform W3110ΔtyrR, tyrA with pSTVtyrA (W) and pSTVtyrA (mut), spread on LB medium containing 25 mg / L chloramphenicol, spread 1 cm 2 and contain 25 mg / L chloramphenicol Was inoculated into 5 ml of E. coli L-tyrosine production medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours. After the culture, 1 ml of the culture solution was sampled and the glucose concentration in the culture solution was measured. Glucose concentration is 1
Centrifugation was performed at 2,000 rpm for 2 minutes, and a supernatant obtained by diluting the supernatant with water at an appropriate magnification was measured with a Biotech Analyzer (Sakura Seiki). On the other hand, for accumulation of L-tyrosine, KOH was added to the remaining culture solution to a final concentration of 0.3 M, and shaken at 37 ° C. for about 1 hour to dissolve L-tyrosine. After dilution and passing through an Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit (Millipore) to remove impurities, measurement was performed by HPLC (HITACHI). Chromolith (MERCK) was used as the HPLC column, and 5% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid was used as the buffer. Table 3 shows the accumulation of L-tyrosine in each substitution product (mutant PDH) -introduced strain. It was clarified that a strain with an accumulation of L-tyrosine 1.5 to 14 times improved was obtained by introducing a mutation into tyrA.
（３）フィードバック阻害が解除されたPDHの変異点の決定
フィードバック阻害が解除された各置換体の塩基配列を通常の方法に従って決定した。置換部位のアミノ酸及びコドンの配列を表３に示す。
(3) Determination of mutation point of PDH in which feedback inhibition was released The base sequence of each substitution product in which feedback inhibition was released was determined according to a usual method. The amino acid and codon sequences at the substitution sites are shown in Table 3.
（４）PDH活性の測定
（３）で取得された株のうち、もっとも収率の高かった257/265、2番目に収率の高かった254/269(収率5.5%、2.5%)、実施例１で取得したT260I(収率3.5%)の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて２回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NAD+を含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図９に示すように、野生型PDHでは100μML-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、T260I、254/269では800μMのチロシンでもほとんど阻害を受けなかった。しかし、257/265に変異の入った株に関しては、収率が高いにもかかわらず活性は測定できなかった。
(4) Measurement of PDH activity Among the strains obtained in (3), the highest yield was 257/265, and the second highest yield was 254/269 (yield 5.5%, 2.5%). The culture solution obtained by culturing the cells of T260I (yield 3.5%) obtained in Example 1 using LB medium at 37 ° C. for 15 hours was centrifuged and collected. Next, the cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 20% glycerol under ice cooling, and then 80 times for 30 seconds. A crude enzyme solution was prepared by ultrasonic crushing. PDH activity was measured according to [Biochemistry. 1990
E.coliのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得〜その３
実施例２とほぼ同様の方法を用いて変異型tyrA 株を取得した。異なる点は、1st/2nd PCR後、PCRプロダクトを混合せずに、各プライマーを用いて得られたPCRプロダクトに対し個別に3rd PCRを行った点である。各プライマーを用いて得られたクローンからそれぞれ3〜10個の株を候補株として取得した。これらの株を（２）と同様の方法で培養、塩基配列分析を行った結果を表４に示す。それぞれ、1種類〜8種類のアミノ酸に置換され、チロシン収率の向上した株が取得できたことが明らかとなった。
Acquisition of TyrA-derived mutant PDH gene from E.coli-3
A mutant tyrA strain was obtained in the same manner as in Example 2. The difference is 1st / 2nd After PCR, the 3rd PCR was individually performed on the PCR products obtained using each primer without mixing the PCR products. 3 to 10 strains were obtained as candidate strains from the clones obtained using each primer. Table 4 shows the results of culturing and base sequence analysis of these strains in the same manner as in (2). It was clarified that each strain was substituted with 1 to 8 amino acids and improved in tyrosine yield.
＜W3110ΔtyrR,tyrAのpheA破壊株の作製＞
プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（pheA）の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] によって行った。この方法によれば、目的とする遺伝子を合成オリゴヌクレオチドの5'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することが出来る。公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているpheA遺伝子塩基配列と [Gene. 1982 Oct; 19(3): 327-36.] に記載されているpCE1134のカナマイシン耐性遺伝子NptII遺伝子の配列に基づいて、pheA遺伝子及び鋳型プラスミドに抗生物質耐性を付与する遺伝子のそれぞれに近接する領域に、それぞれ相補的なプライマーを設計した。配列番号13および14に示すような合成DNAプライマーを2本通常の方法で合成した。このプライマーを用いてpCE1134をテンプレートに、PCRを行った。
<Preparation of W3110ΔtyrR, tyrA pheA disrupted strain>
Deletion of the prefenate dehydratase gene (pheA) is a method called “Red-driven integration” originally developed by Datsenko and Wanner [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645]. According to this method, a target gene is designed on the 5 ′ side of a synthetic oligonucleotide, and a PCR product obtained using a synthetic oligonucleotide designed on the 3 ′ side of an antibiotic resistance gene is used in one step. A gene-disrupted strain can be constructed. PheA gene nucleotide sequence described in publicly known literature [J. Mol. Biol. 180 (4), 1023 (1984)] and [Gene. 1982 Oct; 19 (3): 327-36.] Based on the sequence of the kptamine resistance gene NptII gene of pCE1134, complementary primers were designed in the regions adjacent to the pheA gene and the gene conferring antibiotic resistance to the template plasmid, respectively. Two synthetic DNA primers as shown in SEQ ID NOs: 13 and 14 were synthesized by a usual method. Using this primer, PCR was performed using pCE1134 as a template.
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むW3110ΔtyrR,tyrA(以下W3110ΔtyrR,tyrA／pKD46と表記する)をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドpKD46[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRedシステムの遺伝子（λ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459, 第31088番目〜33241番目）を含む
。プラスミドpKD46はPCR産物をW3110ΔtyrR,tyrAに組み込むために必要である。
The amplified PCR product was purified on an agarose gel and used to electroporate W3110ΔtyrR, tyrA (hereinafter referred to as W3110ΔtyrR, tyrA / pKD46) containing plasmid pKD46 having temperature-sensitive replication ability. Plasmid pKD46 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] is a gene of λRed system (λ, β, exo gene) controlled by arabinose-inducible ParaB promoter 2154 base DNA fragment (GenBank / EMBL accession number J02459, 31088 th to 33241 th) of λ phage containing. The plasmid pKD46 is necessary to incorporate the PCR product into W3110ΔtyrR, tyrA.
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で30℃、一晩培養したW3110ΔtyrR,tyrA/pKD46を、アンピシリンとL-アラビノース（1mM）を含んだ5mLのLB培地で100倍希釈した。得られた希釈物を30℃で通気しながらOD600が約0.6になるまで生育させた後、氷冷した1mM HEPES(pH7.0)で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは50μＬのコンピテントセルと約100ngのPCR産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのSOC培地[モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年）]を加えて37℃で1時間培養した後、LB寒天培地上、37℃で平板培養し、カナマイシン耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、カナマイシン入りのLB寒天培地上、37℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。カナマイシン耐性遺伝子によって識別できるpheA遺伝子の欠失を含む変異体を、PCRによって確認した。pheA遺伝子欠損株W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::NptIIの細胞のＤＮＡを鋳型にして得られたPCR産物の長さは野生株より長く、pheA遺伝子内部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、pheA遺伝子が欠損されていることを確認できた。カナマイシン耐性遺伝子が挿入されたpheA破壊株をW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km株と名づけた。 A competent cell for electroporation was prepared as follows. W3110ΔtyrR, tyrA / pKD46 cultured overnight at 30 ° C. in LB medium containing 100 mg / L ampicillin was diluted 100-fold with 5 mL of LB medium containing ampicillin and L-arabinose (1 mM). The obtained dilution was grown until the OD600 was about 0.6 while aerated at 30 ° C., and then washed three times with ice-cold 1 mM HEPES (pH 7.0) so that it could be used for electroporation. . Electroporation was performed using 50 μL of competent cells and approximately 100 ng of PCR product. The cell after electroporation was added with 1 mL of SOC medium [Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and cultured at 37 ° C. for 1 hour. Plated on LB agar at 37 ° C to select kanamycin resistant recombinants. Next, in order to remove the pKD46 plasmid, the cells were subcultured on an LB agar medium containing kanamycin at 37 ° C., and the resulting colonies were tested for ampicillin resistance to obtain an ampicillin sensitive strain from which pKD46 had been removed. Mutants containing a deletion of the pheA gene that can be distinguished by the kanamycin resistance gene were confirmed by PCR. The length of the PCR product obtained using the pheA gene-deficient strain W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: NptII cell DNA as a template was longer than that of the wild type, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene was inserted inside the pheA gene. It was confirmed that the pheA gene was deleted. The pheA-disrupted strain into which the kanamycin resistance gene was inserted was named W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km strain.
＜Ｌ−チロシンの発酵生産＞
（１）pMGLの作製
FERM BP-4796に搭載されているpMGAL1（脱感作型aroG4、野生型aroL及び野生型pheAを含むプラスミド）をHindIIIで消化してpheA遺伝子を切り出し、再度ライゲーションを行うことで、脱感作型aroG4と野生型aroLのみがpM119に組み込まれたプラスミドを作製しpMGLと名づけた(図６)。
<Fermental production of L-tyrosine>
(1) Preparation of pMGL
PMGAL1 (plasmid containing desensitized aroG4, wild type aroL and wild type pheA) loaded in FERM BP-4796 is digested with HindIII, and the pheA gene is excised and deligated again, A plasmid in which only aroG4 and wild type aroL were incorporated into pM119 was prepared and named pMGL (FIG. 6).
（２）菌株の作製
実施例４で作製したW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Kmに実施例1で作製したpSTVtyrA(T260I)、pSTVtyrA(W)、またはpSTV28を導入してW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/ pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTV28を作製した。さらに、pMGLでこれらの株を形質転換して、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGLを作製した。
(2) Preparation of strains W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: K3 prepared by introducing pSTVtyrA (T260I), pSTVtyrA (W), or pSTV28 prepared in Example 1 into W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km prepared in Example 4 Km / pSTVtyrA (T260I), W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km / pSTVtyrA (W), and W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km / pSTV28 were prepared for these controls. Further, transforming these strains with pMGL, W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km / pMGL / pSTVtyrA (T260I), W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km / pMGL / pSTVtyrA (W), and their comparative controls W3110ΔtyrR, tyrA, and pheA :: Km / pMGL were prepared.
（３）Ｌ−チロシンの製造
形質転換株W3110ΔtyrR,tyrA,pheA/pMGL/pSTV28-tyrAをエシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地を用いて37度で28時間培養した。その結果を表５及び図７に示す。
分析は、実施例１−（３）と同様の方法で行った。W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km株では、変異型tyrAを導入することで0.8〜1.0g/Lが3.3〜3.5g/Lと約5倍になり、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL株では、変異型tyrAを導入することで3.9g/Lが5.7〜6.0g/Lと約1.5倍の収率向上効果が見られた。さらに、変異型tyrAを導入することで副生物のL-フェニルアラニンが生成されなくなるということが明らかになった。
(3) Production of L-tyrosine Transformants W3110ΔtyrR, tyrA, pheA / pMGL / pSTV28-tyrA were cultured at 37 ° C. for 28 hours using Escherichia coli L-tyrosine production medium. The results are shown in Table 5 and FIG.
Analysis was performed in the same manner as in Example 1- (3). In the W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km strain, introduction of mutant tyrA increases 0.8 to 1.0 g / L to 3.3 to 3.5 g / L, approximately 5 times, and W3110ΔtyrR, tyrA, pheA :: Km / pMGL strain. Then, by introducing the mutant tyrA, 3.9 g / L was 5.7 to 6.0 g / L, which was about 1.5 times higher yield improvement effect. Furthermore, it became clear that by introducing mutant tyrA, the by-product L-phenylalanine was not produced.
Claims (10)
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（但し、配列番号２のアミノ酸配列において２５７位のヒスチジンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するもの、および配列番号２のアミノ酸配列において２６６位のヒスチジンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するものを除く）であり、
野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、エシェリヒア属細菌；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 A bacterium belonging to the genus Escherichia having a mutant prefenate dehydrogenase having an ability to produce L-tyrosine and desensitized to feedback inhibition by L-tyrosine ,
Mutant prefenate dehydrogenase in which feedback inhibition by L-tyrosine is released is wild-type prefenate dehydrogenase, in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is alanine at position 250, phenylalanine at position 251, glutamine at position 253, alanine at position 254 Leucine at position 255, histidine at position 257, phenylalanine at position 258, alanine at position 259, threonine at position 260, phenylalanine at position 261, tyrosine at position 263, leucine at position 265, histidine at position 266, leucine at position 267 And a mutant prefenate dehydrogenase in which one or more amino acids selected from glutamic acid at position 269 are substituted with other amino acids (however, histidine at position 257 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was substituted with alanine) Those having amino acid sequences, and histidine at position 266 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is excluding those having the amino acid sequence replaced with alanine),
A bacterium belonging to the genus Escherichia, wherein wild-type prefenate dehydrogenase is a protein shown in the following (a) or (b):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a prefenate dehydrogenase activity ;
野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 In wild-type prefenate dehydrogenase , the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at position 250 alanine, position 251 phenylalanine, position 253 glutamine, position 254 alanine, position 255 leucine, position 257 histidine, position 258 phenylalanine, 259 One or more amino acids selected from alanine at position 260, threonine at position 260, phenylalanine at position 261, tyrosine at position 263, leucine at position 265, histidine at position 266, leucine at position 267, and glutamic acid at position 269 ; mutant prephenate dehydrogenase of which feedback inhibition by substituted L- tyrosine amino acids are released (however, those having an amino acid sequence histidine position 257 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been substituted with alanine, and SEQ ID NO: A 266-position histidine in the amino acid sequence of excluding those having the amino acid sequence replaced with alanine),
A mutant prefenate dehydrogenase, wherein the wild-type prefenate dehydrogenase is a protein shown in the following (a) or (b):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a prefenate dehydrogenase activity ;
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（但し、配列番号２のアミノ酸配列において２５７位のヒスチジンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するもの、および配列番号２のアミノ酸配列において２６６位のヒスチジンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するものを除く）であり、 Mutant prefenate dehydrogenase in which feedback inhibition by L-tyrosine is released is wild-type prefenate dehydrogenase, in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is alanine at position 250, phenylalanine at position 251, glutamine at position 253, alanine at position 254 Leucine at position 255, histidine at position 257, phenylalanine at position 258, alanine at position 259, threonine at position 260, phenylalanine at position 261, tyrosine at position 263, leucine at position 265, histidine at position 266, leucine at position 267 And a mutant prefenate dehydrogenase in which one or more amino acids selected from glutamic acid at position 269 are substituted with other amino acids (however, histidine at position 257 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was substituted with alanine) Those having amino acid sequences, and histidine at position 266 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is excluding those having the amino acid sequence replaced with alanine),
野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、ＤＮＡ； DNA whose wild-type prefenate dehydrogenase is a protein shown in the following (a) or (b);
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a prefenate dehydrogenase activity;
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