JP4660956B2 - Monoclonal antibody and method for producing monoclonal antibody - Google Patents

Description

【０００５】
式（２）中、Ｒ−ＣＨ₂−ＸＨは蛋白質を示し、Ｘは、システイン、ヒスチジンあるいはリジン側鎖を示す。
イコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸等のω−３系高度不飽和脂肪酸と、リノール酸やアラキドン酸等のω−６系高度不飽和脂肪酸の両者に由来する生理活性物質、例えば、プロスタグランジンやロイコトリエンの作用は由来物質によって大きく異なる。また、これらの物質は血小板の抗凝固活性や抗血栓性等の作用等の臨床的に重要な作用を有する物質であることから、両高度不飽和脂肪酸の過酸化分解物を厳密に区別することは臨床上有用である。
したがって、４−ＨＨＥが蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識する抗血清を提供することは、生体内酸化ストレスの評価、或いはω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化等に関する生化学・医学的な研究に対して有用である。
そこで、発明者等は、鋭意検討した結果、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識する抗血清を提供する方法を見いだして開示し、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化等に関する生化学・医学的な研究に対する有用性を評価するための技術を提供した。（特開平１１−０７１４００号公報）。
このように、生体の疾病との相関が注目されている酸化ストレスに関連して、該抗血清は非常に有用であるものの、抗血清（ポリクローナル）であり、免疫する動物個体に由来するロット間差が生じたりする等の問題もあり、４−ＨＨＥが蛋白質と反応してなるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の開発が要望されていた。しかしながら、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生じたマイケル付加体に対するモノクローナル抗体は未だ報告されていない。
そこで、本発明者らは、４−ＨＨＥと蛋白質の付加体に関して着目し、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生ずるマイケル付加体構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体と、その製造方法の開発に取り組んだ。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、４−ＨＨＥと蛋白質の付加体に関して着目し、４−ＨＨＥが蛋白質と反応して生ずるマイケル付加体構造に対して認識特異性の高いモノクローナル抗体を提供することにある。
また、本発明の第２の目的は、前記の認識特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を提供することにある。
また、本発明の第３の目的は、前記の認識特異性の高いモノクローナル抗体の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み検討した結果、４−ＨＨＥで修飾した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を得て、その細胞が、４−ＨＨＥ−蛋白質複合体中の４−ＨＨＥ由来の次式（１）で示される、４−ＨＨＥが蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生じたマイケル付加体構造を特定的に認識することの知見を得て、本発明を完成した。
【０００８】
本発明によれば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）で寄託されたハイブリッド細胞が産生する下記式（１）
【０００９】
【化４】

【００１０】
（式中、Ｙ−ＣＨ₂−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。
また本発明によれば、前記モノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞が提供される。
【００１１】
更に本発明によれば、前記ハイブリッド細胞を培養して培養液中から、上記式（１）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法がて供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、下記式（１）
【００１６】
【化６】

【００１７】
（式中、Ｙ−ＣＨ₂−は、アミノ酸残基、ペプチド残基、蛋白質残基を示す。）で示されるマイケル付加体構造を特異的に認識する。
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識することを特徴とする。
本発明のハイブリッド細胞は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、即ち、独立行政法人産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所）に平成１３年４月１６日に寄託した、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）である。
該ハイブリッド細胞の製造方法は、４−ＨＨＥがアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を抗原として免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞と継代培養可能なマウスミエローマ細胞とをハイブリッドし、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を得る製造方法である。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前記ハイブリッド細胞を培養して培養液中から４−ＨＨＥが蛋白質中のヒスチジン残基と反応して生ずる４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とする。
本発明の前記モノクローナル抗体およびその製造方法において、４−ＨＨＥで修飾されるべき蛋白質がカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、前記ハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより、製造される。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いることができる抗原は、蛋白質と４−ＨＨＥの反応物であればよく、蛋白質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）などが挙げられ、好ましくはＫＬＨが用いられる。
抗原を調製するための蛋白質と４−ＨＨＥの反応は、両者を緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。例えば、前記蛋白質と４−ＨＨＥを緩衝液中で混合攪拌して得ることが可能である。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられる。その緩衝液としては、例えば１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料の４−ＨＨＥと反応していないアミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求めることができる。アミノ酸減少率としては、使用する蛋白質により異なるが、ヒスチジン減少率が１０％以上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。
このようなアミノ酸減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１〜７２時間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。
【００２１】
本発明で免疫される動物は恒温動物（ヒトを除く）が使用できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等であれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞として通常マウス由来の細胞を使用する場合には、好ましくはマウスが使用される。免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。投与量は、免疫される動物により異なるが、例えば、約０．０５〜２ｍｇ／１回程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔内、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔内注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくてもよい。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００２２】
次いで、上記の抗原を免疫した恒温動物（ヒトを除く）を７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により測定する。より簡便には酵素免疫測定法により測定することが望ましい。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む末梢リンパ系組織ならいずれでもよいが、好ましくは脾臓である。
【００２３】
得られた組織は、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤民衛ら １９９１年）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物（ヒトを除く）でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ ３９：２８５−３０８，１９８０年）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００２４】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を容易に製造することができる。
【００２５】
さらに、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体はヒトの４−ＨＨＥ修飾蛋白質の検出だけでなく、ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在する４−ＨＨＥ修飾蛋白質の検出にも応用することができる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
また、本発明のハイブリッド細胞は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する。また、本発明のモノクローナル抗体は、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化物等に由来する４−ヒドロキシ−２−ヘキセナールの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用することにより生体内での過酸化工程の知見が得られ、病巣等との関連性の調査手段として期待される。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
１．抗原の調製
１０ｍｇのカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬＨ）をガラスバイアルに秤量し、それに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）約８ｍＬを加えて溶解後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１００ｍＭの濃度に調製した４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール（略号：４−ＨＨＥ）溶液１００μＬを加え、さらに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて全量を１０ｍＬに調製した。この液を３７℃、２４時間インキュベートし、４−ＨＨＥとＫＬＨのコンジュゲート（以下、「ＨＨＥ−ＫＬＨ」と略す。）を得て、これを抗原とした。
【００２９】
２．免疫方法
ＨＨＥ−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍＬ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内に１００μＬ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、１００μＬを１回追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して１００μＬを１回最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００３０】
３．抗体価の確認方法
抗体価は、ウシ血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）の４−ＨＨＥ修飾物を固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様にＢＳＡと４−ＨＨＥを反応させて、４−ＨＨＥとＢＳＡのコンジュゲート（以下、「ＨＨＥ−ＢＳＡ」と略す。）を得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略す。）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略す。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（１００μＬ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μＬ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍＬ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μＬ／ウエル）（以下、「発色液」と略す。）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μＬ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００３１】
４．細胞融合
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、ハイブリッド細胞を調製した。
【００３２】
５．クローニング
前述の得られた細胞に３０ｍＬのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μＬずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて酵素免疫化学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行った。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用いる試料を血清の代わりに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことにより４−ＨＨＥ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン４株を得た。得られた４株のクローンのうち、抗体活性の強かった５２、５３および５７株のモノクローナル抗体についてマウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ、商品コード：ＲＰＮ２９，アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、５２、５３および５７株のいずれもＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガントとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００３３】
実施例２
前記実施例１で得られた４株クローンから得られた４−ＨＨＥ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５２、５３、５７株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該５２、５３および５７株は、独立行政法人産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所）に平成１３年４月１６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０２（５２株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０３（５３株）、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０４（５７株）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
１．モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μＬの蛋白質あるいはアルデヒド修飾蛋白質（４μｇ／ｍＬ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μＬのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印社製）をウエル当たり３００μＬ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳのみを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの酵素標識抗体溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの発色液を加えて室温で１５−２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μＬの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３４】
２．モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍＬ）に各種濃度の４−ＨＨＥ誘導体等を加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３５】
３．モノクローナル抗体の反応特異性−１
種々のアルデヒドで修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、２−ヘキサナール、２−ヘキセナール、２−ノネナール、クロトンアルデヒド（略号：ＣＲＡ）、アクロレイン（略号：ＡＣＲ）、ＭＤＡ、４−ＨＮＥおよび４−ＨＨＥなどのアルデヒドを修飾したＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。なお、ｎａｔｉｖｅは未修飾のＢＳＡそのものが固定化された場合を示す。
図１に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸は各種アルデヒド、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
図１からわかるように、本発明によるモノクローナル抗体は、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。なおまた図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００３６】
４．モノクローナル抗体の反応特異性−２
種々の２−ヒドロキシ−４−アルケナールを合成し、これらのアルデヒドで修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、２−ヒドロキシ−４−ペンテナール（略号：Ｃ５）、２−ヒドロキシ−４−ヘキセナール（略号：Ｃ６）、２−ヒドロキシ−４−ヘプテナール（略号：Ｃ７）、２−ヒドロキシ−４−オクテナール（略号：Ｃ８）、２−ヒドロキシ−４−ノネナール（略号：Ｃ９）、２−ヒドロキシ−４−デセナール（略号：Ｃ１０）のアルデヒドを修飾したＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。なお、ｎａｔｉｖｅは未修飾のＢＳＡそのものが固定化された場合を示す。
図２に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸は各種アルデヒド、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
図２に示されるように、本発明によるモノクローナル抗体は、Ｃ６以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さない、すなわち４−ＨＨＥで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
また図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、４−ＨＨＥ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００３７】
５．モノクローナル抗体の反応性−３
Ｎ−α−アセチルリジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ−α−アセチルヒスチジン（Ａｃ−Ｈｉｓ）、Ｎ−α−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）と４−ＨＨＥとのマイケル付加体をそれぞれ合成した。得られたマイケル付加体である、ＨＨＥ−Ｌｙｓを次の式（３）、ＨＨＥ−Ｃｙｓを次の式（４）、ＨＨＥ−Ｈｉｓを次の式（５）にそれぞれ示す。
【００３８】
【化７】

【００３９】
【化８】

【００４０】
【化９】

【００４１】
これらのマイケル付加体、並びにＮ−α−アセチルリジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ−α−アセチルヒスチジン（Ａｃ−Ｈｉｓ）、Ｎ−α−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）について、本発明によるモノクローナル抗体との反応特異性を前記「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２」に準拠した競合酵素免疫測定法に従って評価した。
図３に、５２株由来のモノクローナル抗体を用いて得られた結果を示す。
なお、縦軸はそれぞれ競合物質の存在下における吸光度、横軸は競合物質の濃度を示す。図３から明らかなように、ＨＨＥ−Ｈｉｓのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化された４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
また図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、ＨＨＥ−Ｈｉｓのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化された４−ＨＨＥ修飾ＢＳＡとの反応を阻害した。
【００４２】
実施例３
得られた４株クローンから得られた４−ＨＨＥ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の内、５２株のモノクローナル抗体を免疫組織染色応用にした。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。染色に使用する組織としては、ヒト粥状動脈硬化病巣を用い、一般的に免疫組織染色に用いられる方法、例えば、「染色法のすべて」（医歯薬出版株式会社 １５５−１６５ １９８８年）に記載の方法に従って免疫組織染色を行った。図４は、免疫組織染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）を示す。写真より明らかなようにヒト粥状動脈硬化病巣には本モノクローナル抗体で染色される部位が局在することが示された。（図４では、濃染部位が本発明のモノクローナル抗体の陽性部位であることを示している。）
なお図には示していないが、５３および５７株由来のモノクローナル抗体を用いた場合も同様の結果が得られ、ヒト粥状動脈硬化病巣には本モノクローナル抗体で染色される部位が局在することが示された。
【００４３】
以上の結果から、本発明の実施例１は、４−ＨＨＥと蛋白質中の構成アミノ酸であるヒスチジン側鎖が反応して生じた４−ＨＨＥ由来のマイケル付加体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかる。
また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前記のハイブリッド細胞を用いる方法であり、容易に特異的に認識するモノクローナル抗体が得られる方法であることがわかる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ω−３系高度不飽和脂肪酸の過酸化物等に由来する４−ヒドロキシ−２−ヘキセナールの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のアルデヒドをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】２−ヒドロキシ−４−アルケナールをＢＳＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体の認識部位について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のモノクローナル抗体を生体組織、粥状動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真（倍率１００倍）である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to monoclonal antibodies, hybrid cells.SpreadAnd a method for producing the monoclonal antibody. Specifically, in particular, a monoclonal antibody having high specificity for a reaction product of 4-hydroxy-2-hexenal (abbreviation: 4-HHE) and a protein and a hybrid antibody producing the monoclonal antibody.CystThe present invention relates to a method for producing the monoclonal antibody. More specifically, a monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure produced by the reaction of histidine residues in amino acids, peptides, or proteins with 4-HHE and a hybrid cell that produces the monoclonal antibody.Vesicles andThe present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody.
[0002]
[Prior art]
Known in vivo lipid components include triglycerides, phospholipids, cholesterol esters, free fatty acids, and the like. In particular, when these compounds have highly unsaturated fatty acid residues, they are susceptible to peroxidation due to various oxidative stresses acting on the living body, and degradation products generated by secondary oxidation are involved in various pathological conditions. This is being revealed recently.
Typical examples of the highly unsaturated fatty acid include linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, icosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and the like. As peroxidative degradation products of lipid compounds having these highly unsaturated fatty acid residues, 4-derived derived from omega-6 highly unsaturated fatty acids represented by malondialdehyde (abbreviation: MDA), linoleic acid and arachidonic acid. Hydroxy-2-nonenal (abbreviation: 4-HNE) and 4-hydroxy-2-hexenal (abbreviation: 4-HHE) derived from ω-3 highly unsaturated fatty acids such as linolenic acid and icosapentaenoic acid are known. Yes.
It is known that MDA binds to low density lipoprotein (abbreviation: LDL), which is a kind of lipoprotein in blood, to become MDA-modified low density lipoprotein (abbreviation: MDA-LDL). From this, a monoclonal antibody obtained using MDA-LDL as an antigen for the purpose of detecting MDA, or a method for measuring MDA-LDL using the monoclonal antibody is known (Science 241: 215-218, 1988). JP-A-4-17396).
[0003]
With respect to the 4-HNE, for the purpose of detecting 4-HNE, a monoclonal antibody that recognizes 4-HNE obtained by using 4-HNE-modified limpet hemocyanin as an antigen, and 4 using the monoclonal antibody A method for measuring -HNE is known (Japanese Patent Laid-Open No. 8-168394).
On the other hand, 4-HHE has been reported to react with proteins in the living body to form a complex of 4-HHE and protein (TOXICOLOGY LETTERS, Vol. 29, 1985, pages 43-49).
The reaction between 4-HHE and protein reacts with histidine, lysine, or cysteine side chain, which is one of the constituent amino acids of the protein, to form a compound having a five-membered ring structure represented by formula (2) (ie, Michael adduct). ). The reaction formula is shown in Formula (2).
[0004]
[Chemical 3]

[0005]
In formula (2), R—CH₂-XH represents a protein, and X represents a cysteine, histidine or lysine side chain.
Action of physiologically active substances derived from both omega-3 highly unsaturated fatty acids such as icosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, and omega-6 highly unsaturated fatty acids such as linoleic acid and arachidonic acid, such as prostaglandins and leukotrienes Vary greatly depending on the source material. In addition, since these substances have clinically important effects such as anticoagulant activity and antithrombotic activity of platelets, the peroxidative degradation products of both highly unsaturated fatty acids must be strictly distinguished. Is clinically useful.
Accordingly, providing an antiserum that specifically recognizes the Michael adduct structure formed by the reaction of 4-HHE with a protein can be used for evaluation of in vivo oxidative stress, peroxidation of ω-3 highly unsaturated fatty acids, etc. Useful for biochemical and medical research.
Thus, as a result of intensive studies, the inventors have found and disclosed a method for providing an antiserum that specifically recognizes the Michael adduct structure formed by the reaction of 4-HHE with an amino acid, peptide or protein. We have provided a technique for evaluating the usefulness of biochemical and medical research on the peroxidation of highly polyunsaturated fatty acids. (Japanese Patent Laid-Open No. 11-071400).
Thus, although the antiserum is very useful in relation to the oxidative stress that has been focused on the correlation with a disease in a living body, it is an antiserum (polyclonal), and lots derived from individual animals to be immunized. There are also problems such as differences, and there has been a demand for the development of a monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure formed by the reaction of 4-HHE with a protein. However, a monoclonal antibody against a Michael adduct produced by reacting 4-HHE with a protein has not yet been reported.
Therefore, the present inventors paid attention to the adduct of 4-HHE and protein, a monoclonal antibody having high recognition specificity for the Michael adduct structure produced by the reaction of 4-HHE with the protein, and a method for producing the same. Worked on development.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
  The first object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having high recognition specificity for the Michael adduct structure formed by reacting 4-HHE with a protein, focusing on the adduct of 4-HHE and protein. is there.
  A second object of the present invention is to provide a hybrid cell that produces a monoclonal antibody having a high recognition specificity.
  The third object of the present inventionSaidThe object is to provide a method for producing a monoclonal antibody with high recognition specificity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
  As a result of studying in view of the above problems, the present inventors have prepared a protein modified with 4-HHE as an antigen, and have been immunized with the antigen.(Excluding humans)A hybrid cell of an antibody-producing cell and a myeloma cell obtained from the above is obtained, and the cell is represented by the following formula (1) derived from 4-HHE in the 4-HHE-protein complex. 4-HHE is in the protein. Acquired the knowledge of specifically recognizing the Michael adduct structure produced by reacting with the histidine residue of the present invention, and completed the present invention.did.
[0008]
  According to the present invention,TrustNo. FERM P-18302 (52 shares),TrustNo. FERM P-18303 (53 strains), orTrustNo. FERM P-18304 (57 shares)Cells deposited inThe following formula (1) produced by
[0009]
[Formula 4]

[0010]
  (Where Y-CH₂-Represents an amino acid residue, a peptide residue, or a protein residue. Monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structureWill be provided.
  According to the present invention, the moduleHybrid cells capable of producing monoclonal antibodiesIs provided.
[0011]
  Furthermore, according to the present invention,Cultivate the hybrid cellA method for producing a monoclonal antibody comprising obtaining a monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure represented by the above formula (1) is provided.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The monoclonal antibody of the present invention has the following formula (1):
[0016]
[Chemical 6]

[0017]
  (Where Y-CH₂-Represents an amino acid residue, a peptide residue, or a protein residue. ) Is specifically recognized.
  That is, the monoclonal antibody of the present invention is characterized in that 4-HHE specifically recognizes the 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by the reaction of histidine residues in amino acids, peptides or proteins.
  The hybrid cell of the present invention is characterized in that it produces a monoclonal antibody that specifically recognizes 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by the reaction of 4-HHE with a histidine residue in an amino acid, peptide or protein. In other words, deposited on April 16, 2001 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (formerly the Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry)TrustNo. FERM P-18302 (52 shares),TrustNo. FERM P-18303 (53 strains), orTrustNo. FERM P-18304 (57 strains).
  TheA method for producing a hybrid cell is a constant temperature animal immunized with 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by reacting 4-HHE with a histidine residue in an amino acid, peptide or protein.(Excluding humans)And a mouse myeloma cell that can be subcultured to obtain a hybrid cell that produces the monoclonal antibody.
[0018]
  The method for producing the monoclonal antibody of the present invention comprises:TheA monoclonal antibody that specifically recognizes a 4-HHE-derived Michael adduct structure formed by culturing hybrid cells and reacting 4-HHE with a histidine residue in a protein is obtained from the culture medium. .
  In the monoclonal antibody and the method for producing the same according to the present invention, the protein to be modified with 4-HHE is preferably limpet hemocyanin (abbreviation: KLH).
[0019]
  Monoclonal antibody of the present inventionSaidIt is produced by screening hybrid cells, mass-culturing them in an environment where the hybrid cells produce antibodies, and obtaining them from the culture.
[0020]
The antigen that can be used for the production of the monoclonal antibody of the present invention may be a reaction product of protein and 4-HHE. Examples of the protein include bovine serum albumin (abbreviation: BSA), ovalbumin, lipoprotein, and key. The limpet hemocyanin (abbreviation: KLH) is exemplified, and KLH is preferably used.
The reaction of protein and 4-HHE for preparing an antigen can be performed by mixing and stirring both in a buffer solution. For example, the protein and 4-HHE can be obtained by mixing and stirring in a buffer solution. Examples of the buffer used include buffers such as Tris, phosphate, and carbonate. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution of 1 mM to 0.5 M, preferably 10 to 100 mM. The pH of the buffer solution is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but it is pH 6 to 11, preferably pH 7 to 9. This reaction process can be detected by the reduction rate of amino acids in the protein. The reduction rate of amino acids can be determined, for example, by measuring amino acids that have not reacted with 4-HHE in the sample before and after the reaction with an amino acid automatic analyzer. The amino acid reduction rate varies depending on the protein used, but it is desirable that the histidine reduction rate be reduced by 10% or more, preferably 20% or more.
As for the reaction conditions which become such an amino acid reduction rate, 1 to 72 hours are mentioned at 25-45 degreeC, for example, Preferably it is 5-40 hours at 30-40 degreeC.
[0021]
  The animal immunized in the present invention is a constant temperature animal(Excluding humans)Can be used. The immunized animal is not particularly limited as long as it is, for example, a mouse, hamster, rat, guinea pig, rabbit, dog, chicken or the like, but when a mouse-derived cell is usually used as a myeloma cell to fuse antibody-producing cells, Preferably a mouse is used. As a method for immunization, an ordinary known immunization method can be used. For example, administration of 2 or 3 times at intervals of 7 to 30 days, particularly 12 to 16 days is preferable. The dose varies depending on the animal to be immunized, but is, for example, about 0.05 to 2 mg / time. The route of administration can be selected from subcutaneous injection, intradermal injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, etc., but is preferably an administration form injecting into the peritoneal cavity, subcutaneously or intramuscularly. . More preferably, it is an administration form combining two or three administration routes, for example, all administration routes including intraperitoneal injection, subcutaneous injection and intramuscular injection. In this case, the antigen is contained in an appropriate buffer such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, sodium phosphate buffer containing one kind of commonly used adjuvants such as aluminum hydroxide, physiological saline and the like. Although it can be used by dissolving, it is not necessary to use an adjuvant as described above. Here, an adjuvant means a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances an immune response to the antigen.
[0022]
  Next, a constant temperature animal immunized with the above antigen(Excluding humans)Is left untreated for 7 to 30 days, then a small amount of serum from the homeostatic animal is collected, and the antibody titer is selected from Western blotting, agglutination, enzyme immunoassay, integrated radial immunodiffusion, etc. Measure with More simply, it is desirable to measure by enzyme immunoassay. If the antibody titer increases, additional administration of antigen can be performed as appropriate depending on the situation. For example, one or two additional administrations are performed at a dose of 0.01 to 1 mg, particularly 0.05 to 0.5 mg. From 1 to 30 days after the last administration, particularly preferably after 1 to 7 days, a tissue containing antibody-producing lymphocytes is removed from the immunized animal. The tissue to be removed may be any peripheral lymphoid tissue containing antibody-producing lymphocytes, but is preferably the spleen.
[0023]
  The obtained tissue can be obtained, for example, by using a method described in “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Manipulation” (Kodansha Scientific Ando et al., 1991), etc. Hybrid cells can be obtained by cell fusion with certain cancer cells in the presence of virus or polyethylene glycol. The cancer cells used here are the same isothermal animals(Excluding humans)However, it is desirable to use cancer cells of the same kind of constant temperature animal. For example, when a mouse is fused with a spleen cell obtained as an immunized animal, it is preferable to use a mouse myeloma cell. As a method of cell fusion actually used, a known technique (J Immunol Method 39: 285-308, 1980) can be used. For example, spleen obtained from an immunized mouse and mouse myeloma cells are fused in the presence of polyethylene glycol, and selectively by a HAT medium (medium supplemented with hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in which only hybrid cells can grow. After the hybrid cells are grown and the hybrid cells form colonies, the antibodies in the culture supernatant are screened to obtain hybrid cells that produce the target antibody.
[0024]
Examples of screening methods include Western blotting or enzyme immunochemical measurement. A hybrid cell producing the target antibody can be finally obtained as a single hybrid cell by repeating the limiting dilution method. Furthermore, the hybrid cells that produce these antibodies of interest can be easily produced by culturing them in large quantities in an antibody-producing environment.
[0025]
Furthermore, antibodies produced by hybrid cells that produce these desired antibodies include, for example, centrifugation, protein fractionation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, aqueous two-layer partitioning, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity The protein can be purified by using general biochemical separation methods such as chromatography and electrophoresis alone or in combination of several methods.
[0026]
The monoclonal antibody of the present invention not only detects human 4-HHE modified proteins but also heterogeneous non-human constant temperature animals such as mice, hamsters, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, cows, horses, chickens, etc. It can also be applied to the detection of 4-HHE modified proteins present in living organisms.
[0027]
【The invention's effect】
  The monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes the 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by the reaction of 4-HHE and the histidine side chain, which is a constituent amino acid in the protein.
  In addition, the hybrid cell of the present invention produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by the reaction of 4-HHE and the histidine side chain that is a constituent amino acid in the protein.The In addition, the module of the present inventionThe monoclonal antibody is very useful for clarifying the effects of 4-hydroxy-2-hexenal derived from peroxides of ω-3 polyunsaturated fatty acids on the living body. Clinical diagnosis, clinical pathology, analysis It is expected that it will be used as a means for investigating the relationship with lesions and the like.
[0028]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1
1. Antigen preparation
10 mg of limpet hemocyanin (abbreviation: KLH) was weighed into a glass vial, dissolved in about 8 mL of 50 mM phosphate buffer (pH 7.2), and then dissolved in 100 mM with 50 mM phosphate buffer (pH 7.2). 100 μL of a 4-hydroxy-2-hexenal (abbreviation: 4-HHE) solution prepared to a concentration of 5% was added, and 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) was further added to adjust the total volume to 10 mL. This solution was incubated at 37 ° C. for 24 hours to obtain a conjugate of 4-HHE and KLH (hereinafter abbreviated as “HHE-KLH”), which was used as an antigen.
[0029]
2. Immunization method
HHE-KLH (1 mg / mL) was mixed well with an equal volume of Freund's complete adjuvant to form an emulsion, which was immunized with 100 μL intraperitoneally in mice (BALB / c, male, 6-8 weeks old). Ten to 14 days after the first immunization, the antigen and Freund's incomplete adjuvant were mixed well to give an emulsion, and 100 μL was boosted once. Three weeks after the booster immunization, antigen and phosphate buffered saline (abbreviation: PBS) were mixed, and 100 μL was subjected to final immunization once. In addition, the antibody titer was confirmed that an antibody against the antigen was produced by an enzyme immunochemical method using blood obtained by collecting blood from the murine ocular vein one week after the booster immunization. In the enzyme immunochemical method, a relatively large antibody titer difference was observed between the serum obtained from the immunized mouse and the serum obtained from the pre-immunized mouse as a comparative control, confirming an increase in the antibody titer. It was.
[0030]
3. Confirmation method of antibody titer
The antibody titer was confirmed by an enzyme immunoassay using a 4-HHE modified product of bovine serum albumin (abbreviation: BSA) as a solid phase. That is, BSA and 4-HHE were reacted in the same manner as described in the preparation of the antigen to obtain a conjugate of 4-HHE and BSA (hereinafter abbreviated as “HHE-BSA”). This was physically adsorbed on a 96-well immunoplate, washed three times with 0.05% Tween 20-Tris buffer (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as “TTBS”), and then Tris buffer containing 1% BSA. Blocking was performed with (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as “blocking solution”). Serum obtained from a mouse (100 μL / well) was placed in the well of this plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the wells, a solution (100 μL / well) of a rabbit antibody against mouse antibody labeled with horseradish peroxidase diluted 5000 times with TTBS (hereinafter abbreviated as “enzyme-labeled antibody solution”) was added at 37 ° C. For 1 hour. After washing the well, 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5) (100 μL / well) containing O-phenylenediamine (0.4 mg / mL) and hydrogen peroxide (0.003%) (hereinafter, “ Abbreviated “coloring solution”) and allowed to react at room temperature for 15-20 minutes. The color reaction was stopped by adding 1 M sulfuric acid (50 μL / well) (hereinafter abbreviated as “reaction stop solution”), and the antibody titer was confirmed by measuring the absorbance at 492 nm with a microplate reader.
[0031]
4). Cell fusion
The mouse spleen was removed from the immunized mouse and loosened to obtain spleen cells. The obtained splenocytes were washed with RPMI-1640 medium. Similar to the washed spleen cells, mouse 653 cells (P3X63-Ag8,653: CRL · 1580), which are myeloma cells thoroughly washed with RPMI-1640 medium, were mixed so that the cell number was 7: 1. A 50 w / v% polyethylene glycol 1540 solution was gradually added to the medium and mixed for 5 minutes. RPMI-1640 medium was added thereto to stop the reaction, and then centrifuged for 5 minutes to discard the supernatant. After RPMI-1640 medium was added thereto, the mixture was centrifuged for 5 minutes and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice to wash the cells and prepare hybrid cells.
[0032]
5. Cloning
30 mL of HAT medium was added to the obtained cells to suspend the cells, and 100 μL was dispensed into each well of a 96-well microplate, and hybrid cells were selectively grown in the HAT medium. Ten days after the fusion, ½ volume of the culture supernatant in the well was replaced with HT medium (HAT medium minus aminopterin). This operation was repeated 2-3 times. Using this culture supernatant, the antibody titer was confirmed by an enzyme immunochemical method and screened. The method for confirming the antibody titer was the same as the method for confirming the antibody titer described above, but the culture supernatant obtained instead of serum was used as a sample for the test. Cells in wells that have been confirmed to have antibody activity by screening are cultured after limiting dilution, and finally have high antibody activity against 4-HHE-modified protein by repeating screening and limiting dilution. Four clones of cells were obtained. Of the 4 clones obtained, mouse IgG subclasses were examined for the 52, 53 and 57 monoclonal antibodies having strong antibody activity. When the antibody subclass was examined with a mouse IgG subclass assay kit (trade name: Mouse monoantibody isotyping kit, product code: RPN29, manufactured by Amersham) using the culture supernatant as a sample, all of 52, 53 and 57 strains were examined. It was IgG1, κ (kappa) chain. As a result of examining the purification of the antibody using a part of the culture supernatant, it is possible to purify the monoclonal antibody of the present invention by salting out with ammonium sulfate or affinity chromatography using protein A as a ligand as usual. did it.
[0033]
  Example 2
  Among the monoclonal antibodies recognizing the 4-HHE modified protein obtained from the 4 strain clone obtained in Example 1, the reaction specificity of the 52, 53, 57 monoclonal antibodies was confirmed. The 52, 53 and 57 shares were transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (formerly the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) on April 16, 2001.TrustNo. FERM P-18302 (52 shares),TrustNo. FERM P-18303 (53 strains), orTrustNo. FERM P-18304 (57 strains). The monoclonal antibody used for the study was used after diluting the culture supernatant.
  1. Evaluation Method of Reaction Specificity of Monoclonal Antibody-1
  The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated by enzyme immunoassay. That is, 100 μL of protein or aldehyde-modified protein (4 μg / mL) per well was added to a 96-well immunoplate, allowed to stand at 4 ° C. overnight, physically adsorbed on the plate, washed three times with 300 μL of TTBS per well, Blocking was performed by adding 300 μL per well of Block Ace (manufactured by Snow Brand Co., Ltd.) diluted 4-fold with TTBS containing 1% BSA or distilled water. The plate was washed 3 times with TTBS in the same manner as described above, and the monoclonal antibody solution (1 μg / mL) diluted with 100 μL of TTBS per well was added and incubated at 37 ° C. for 3 hours. As a control, only TTBS was added. The plate was washed 3 times with TTBS as described above, and then 100 μL of enzyme-labeled antibody solution was added per well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed 3 times with TTBS, and then 100 μL of color developing solution was added per well and incubated at room temperature for 15-20 minutes. After adding 50 μL of reaction stop solution per well, the absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader to evaluate the reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention.
[0034]
2. Method for evaluating reaction specificity of monoclonal antibody-2
The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated by enzyme immunoassay. That is, a well obtained by adding 4-HHE-modified BSA to a 96-well immunoplate and physically adsorbing the plate to the well of the monoclonal antibody (1 μg / mL) according to the present invention with various concentrations of 4-HHE derivatives and the like. Absorbance was measured in the same manner as in the previous section except that the sample was used, and the reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated.
[0035]
3. Reaction specificity of monoclonal antibody-1
The specificity of the antigen-antibody reaction of the monoclonal antibodies of the present invention for specific proteins modified with various aldehydes was evaluated. That is, using BSA modified with aldehydes such as 2-hexanal, 2-hexenal, 2-nonenal, crotonaldehyde (abbreviation: CRA), acrolein (abbreviation: ACR), MDA, 4-HNE and 4-HHE, The measurement was carried out by the enzyme immunoassay described in “Method for evaluating reaction specificity of monoclonal antibody-1”. “Native” indicates a case where unmodified BSA itself is immobilized.
FIG. 1 shows the results obtained using a monoclonal antibody derived from 52 strains.
In addition, a vertical axis | shaft shows various aldehyde and a horizontal axis | shaft shows a light absorbency (OD).
As can be seen from FIG. 1, it is clear that the monoclonal antibody according to the present invention does not show antigen-antibody reactivity with a protein modified with an aldehyde other than 4-HHE. Although not shown in the figure, similar results are obtained when monoclonal antibodies derived from 53 and 57 strains are used, and they do not show antigen-antibody reactivity with proteins modified with aldehydes other than 4-HHE. Is clear.
[0036]
4). Reaction specificity of monoclonal antibody-2
Various 2-hydroxy-4-alkenals were synthesized and the specificity of the antigen-antibody reaction of the monoclonal antibody of the present invention for specific proteins modified with these aldehydes was evaluated. That is, 2-hydroxy-4-pentenal (abbreviation: C5), 2-hydroxy-4-hexenal (abbreviation: C6), 2-hydroxy-4-heptenal (abbreviation: C7), 2-hydroxy-4-octenal (abbreviation) : C8), 2-hydroxy-4-nonenal (abbreviation: C9), and 2-hydroxy-4-decenal (abbreviation: C10) aldehyde-modified BSA, and the above-mentioned "Method for evaluating reaction specificity of monoclonal antibody- It was measured by the enzyme immunoassay method 1 ”. “Native” indicates a case where unmodified BSA itself is immobilized.
FIG. 2 shows the results obtained using a monoclonal antibody derived from 52 strains.
In addition, a vertical axis | shaft shows various aldehyde and a horizontal axis | shaft shows a light absorbency (OD).
As shown in FIG. 2, the monoclonal antibody according to the present invention does not show antigen-antibody reactivity with a protein modified with an aldehyde other than C6, that is, does not show antigen-antibody reactivity with a protein modified with 4-HHE. It is clear.
Although not shown in the figure, similar results were obtained when monoclonal antibodies derived from the 53 and 57 strains were used, and it did not show antigen-antibody reactivity with proteins modified with aldehydes other than 4-HHE. it is obvious.
[0037]
5. Monoclonal antibody reactivity-3
Michael adducts of N-α-acetyllysine (Ac-Lys), N-α-acetylhistidine (Ac-His), N-α-acetylcysteine (Ac-Cys) and 4-HHE were synthesized. As the obtained Michael adduct, HHE-Lys is represented by the following formula (3), HHE-Cys is represented by the following formula (4), and HHE-His is represented by the following formula (5).
[0038]
[Chemical 7]

[0039]
[Chemical 8]

[0040]
[Chemical 9]

[0041]
About these Michael adducts, N-α-acetyllysine (Ac-Lys), N-α-acetylhistidine (Ac-His), N-α-acetylcysteine (Ac-Cys), The reaction specificity was evaluated according to a competitive enzyme immunoassay based on the above-mentioned “Method for evaluating reaction specificity of monoclonal antibody-2”.
FIG. 3 shows the results obtained using a monoclonal antibody derived from 52 strains.
The vertical axis represents the absorbance in the presence of the competitor, and the horizontal axis represents the concentration of the competitor. As is clear from FIG. 3, only HHE-His inhibited the reaction between the monoclonal antibody according to the present invention and immobilized 4-HHE-modified BSA.
Although not shown in the figure, similar results were obtained when monoclonal antibodies derived from strains 53 and 57 were used, and only HHE-His was modified with 4-HHE modified with the monoclonal antibody according to the present invention. Inhibited reaction with BSA.
[0042]
Example 3
Of the monoclonal antibodies recognizing 4-HHE modified protein obtained from the obtained 4 strain clones, 52 monoclonal antibodies were used for immunohistochemical staining. The monoclonal antibody used for the study was used after diluting the culture supernatant. As a tissue to be used for staining, human atherosclerotic lesions are used, and generally used in immunohistological staining, for example, “All of staining methods” (Medical and Dental Publishing Co., Ltd. 155-165 1988). Immunohistochemical staining was performed according to the method described. FIG. 4 shows a micrograph (100 times magnification) of immunohistochemical staining. As is clear from the photograph, it was shown that the site stained with this monoclonal antibody was localized in the human atherosclerotic lesion. (FIG. 4 shows that the deeply stained site is a positive site of the monoclonal antibody of the present invention.)
Although not shown in the figure, similar results were obtained when monoclonal antibodies derived from strains 53 and 57 were used, and the site stained with this monoclonal antibody was localized in the human atherosclerotic lesion. It has been shown.
[0043]
From the above results, Example 1 of the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes the 4-HHE-derived Michael adduct structure produced by the reaction of 4-HHE and the histidine side chain that is a constituent amino acid in the protein. It can be seen that it is.
In addition, it can be seen that the method for producing a monoclonal antibody of the present invention is a method using the above-described hybrid cells, and a method for easily obtaining a monoclonal antibody that specifically recognizes.
Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is very useful for clarifying the influence of 4-hydroxy-2-hexenal derived from peroxides of ω-3 polyunsaturated fatty acids on the living body, and clinical diagnosis. It is expected to be used in clinical pathology and analysis.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the reactivity of a monoclonal antibody of the present invention with modified products obtained by modifying various aldehydes with BSA by an enzyme immunoassay.
FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the reactivity of the monoclonal antibody of the present invention with a modified product obtained by modifying 2-hydroxy-4-alkenal with BSA by an enzyme immunoassay.
FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the recognition site of the monoclonal antibody of the present invention by enzyme immunoassay.
FIG. 4 is a photomicrograph (magnification 100 times) showing the result of immunohistochemical staining of the monoclonal antibody of the present invention on living tissue and atherosclerotic lesions.

Claims (3)

Accession number FERM P-18302 (52 strains), accession number FERM P-18303 (53 strains), or accession number FERM P-18304 following hybrid cells produced deposited under (57 strains) (1)

(Wherein Y—CH ₂ — represents an amino acid residue, a peptide residue, or a protein residue), a monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure. Following formula (1)

(Wherein Y—CH ₂ — represents an amino acid residue, a peptide residue, or a protein residue), which produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure represented by Accession No. FERM P— Hybrid cells deposited with 18302 (52 strains), accession number FERM P-18303 (53 strains), or accession number FERM P-18304 (57 strains). The hybrid cell according to claim 2 is cultured, and the following formula (1)

(In the formula, Y—CH ₂ — represents an amino acid residue, a peptide residue, or a protein residue.) A monoclonal antibody that specifically recognizes the Michael adduct structure represented by Antibody production method.

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