JP4659252B2

JP4659252B2 - Flow cytometer

Info

Publication number: JP4659252B2
Application number: JP2001094878A
Authority: JP
Inventors: 正継小篠
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: JP2002296170A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の血球や尿中に含まれる有形成分等の粒子を光学的に検出・分析するためのフローサイトメータに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の赤血球・白血球・血小板といった各種血球や、尿中に含まれる細菌・赤血球・白血球・上皮細胞・円柱などの有形成分等、検体中に含まれる粒子を自動的に検出・分析するための装置が各種開発されている。このような粒子分析装置としてフローサイトメータを用いたものが公知である。一般的なフローサイトメータの検出部では、分析対象となる粒子を含有する試料液をシース液で包んでフローセル内で細く絞り込み、粒子を整列させて通過させる。そこにレーザ光を照射し、各粒子から光学的情報を得る。光学的情報には前方散乱光・側方散乱光・後方散乱光等の散乱光や蛍光などがあり、分析対象に応じて適宜選択される。これらの光学的情報は光電変換素子によりパルス状の電気信号として検出される。
【０００３】
こうして得られた信号の波形を処理することによって粒子の特徴を表すパラメータが算出され、それに基づいて分析対象の粒子が分類・計数される。
【０００４】
光の強度は信号波形の高さとして認識され、また同時に発光時間が計時される。これらのことを利用して、信号波形の高さ（ピークレベル）や信号波形の幅（パルス幅）等が各粒子の特徴を反映するパラメータとして算出される。例えば、前方散乱光信号の中で粒子を検出していると目される部分（以下、「粒子信号」という。）の、ピークレベルは粒子の大きさを表すものである。またパルス幅は粒子長を表す。一方、予め粒子、例えば有核細胞に蛍光染色を施した場合などには、被検粒子から蛍光信号が得られるが、その中で粒子信号のピークレベルは核等の染色度合いを表し、パルス幅は蛍光染色部分長を表す。このような各粒子の特徴を表すパラメータをもとにヒストグラムを作成したり、複数のパラメータを組合わせて粒子の分布を示すスキャッタグラムを作成したりして、試料に含まれる粒子の種類・数などを統計的に解析することが行われている。
【０００５】
近年、上記のようなフローサイトメータでは、フローセルに照射するレーザ光の光源にアルゴンレーザ等の気体レーザ光源の他、レーザダイオードを用いることが一般的となっている。
【０００６】
図１は、光源にレーザダイオードを用いたフローサイトメータの光学系の一例を示す略図である。被検粒子を含む試料液がフローセル６中に吐出され、その周囲を包むようにシース液が流される。すると試料液が流体力学的効果により細く絞り込まれ、粒子が整列した状態でフローセル６中を通過する。レーザダイオード１から発せられた放射状のレーザ光はコリメータレンズ３を経て平行光に形成され、シリンドリカルレンズ４、コンデンサレンズ５を経てフローセル６中の試料液流でビームスポットを形成する。なお、レーザダイオードから発せられるレーザ光は放射状であり、またその光の断面は楕円形であるという性質を有する（図２参照）。すなわちレーザダイオードが発するレーザ光の広がり角度は、楕円形の長径方向に大きく、短径方向に小さいということになる。
【０００７】
ところで図１において、コリメータレンズ３に対し、レーザ光の広がり角度θを大きくし、レーザ光幅ｄの値をより大きくすると（ここで広がり角度θ・レーザ光幅ｄはいずれも試料液流れ方向についてのものである）、▲１▼ビームスポットにおける光量を増やすことができ、また▲２▼粒子の検出領域となるビームスポットの試料液流れ方向における径φをより小さくすることができる、というメリットがある。これらには、検出感度の向上や、検出領域を複数の粒子が同時に通過することの防止、といった効果がある。そのため、従来のフローサイトメータにおいてレーザダイオードは、発せられるレーザ光の断面における楕円形の長径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置されていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし上記のような配置では重大なデメリットが生じる場合があった。図３は、上記のレーザーダイオード配置向きでの光学系配置と前方散乱光信号の検出との関係を示すものである。図３において、レーザ光は縦方向（試料液流れ方向と平行な方向）に広がり角度が広いため、コリメータレンズ３の上部や下部のコバでレーザ光の一部が蹴られ、迷光が発生する。このため、フローセル６中の試料液流においては、主光線によるビームスポットの上部や下部に、迷光が焦点を結び、主光線による粒子信号の他、迷光に起因する信号（以下、「迷光信号」という。）が検出されることがあった。
【０００９】
迷光信号が発生すると、それが粒子信号として検出されてしまうために粒子の計数・分類結果に影響を与えてしまう。このデメリットは前方散乱光信号の検出のみならず、側方散乱光信号や後方散乱光信号、蛍光信号の検出においてもあてはまる。
【００１０】
上記課題に対し、信号処理系からのアプローチとしては次のような対策が考えられる。粒子信号を検出するための閾値を、粒子信号は検出するが迷光信号は検出しない高さに設定する、といった方法である。ここで「閾値」とは、一連の信号の中で粒子を検出したか否かを判別するためのものであり、信号強度がその閾値を超えた部分につき、粒子を検出した信号として信号強度（すなわちピークレベル）や発光時間（すなわちパルス幅）の算出がなされる（図４参照）。
【００１１】
粒子信号とそれに付随して発生する迷光信号とはパルスの大きさがかけ離れている（迷光信号の方が小さなパルスである）。そこで血球など比較的大型の粒子のみを検出対象とする場合であれば、この閾値を高めに設定することで、粒子信号のみを検出し、迷光信号を検出しないようにすることが可能である。そのため従来の一般的なフローサイトメータにおいては、レーザダイオードを、発せられるレーザ光の断面における楕円形の長径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置して前記のメリット（▲１▼ビームスポットにおける光量を増やすことができ、また▲２▼粒子の検出領域となるビームスポットの試料液流れ方向における径φをより小さくすることができる、というメリット）を享受しつつ、閾値を高めに設定することによって迷光信号によるデメリットを回避することが可能であった。
【００１２】
しかし、検体中に様々な大きさの粒子（例えば直径０．５μｍ〜１００μｍ程度）が含まれ、それぞれを検出するためにフローサイトメータを用いる場合には、最小の粒子の信号に応じて閾値を低めに設定する必要がある。そのため、大型の粒子による粒子信号に付随して発生する迷光信号が閾値を上回り、小型粒子と間違って検出され、計数値を狂わせたり、他の粒子信号のパルス幅情報に悪影響を及ぼすことがある。例えば、尿中には、細菌・赤血球・白血球・円柱・上皮細胞などが含まれることがある。これらの粒子は種類によってサイズが様々であり、特に細菌は他の粒子よりもはるかに小さいことが多い。これらを被検粒子とした場合、粒子信号を検出するための閾値は細菌も検出できるように低めに設定する必要がある。そのため、例えば白血球の粒子信号に付随して迷光信号が発生した場合、本来白血球のみが検出されるべきところを、更に細菌をも検出したかのような分析結果が出たり、あるいは白血球の粒子信号のパルス幅が本来よりも大きくなり、別の種類の粒子サイズであると分析されてしまうことが有り得る。
【００１３】
このように、迷光信号の悪影響は、小型の粒子をも検出する必要のあるフローサイトメータにおいて特に顕著となる。
【００１４】
上記課題への対策として光学系からのアプローチを試みるのであれば、発せられるレーザ光の広がり角度が狭いレーザダイオードを選択することにより、コリメータレンズ３の上部や下部のコバにレーザ光が当たらないようにすることが考えられる。しかし、レーザ光の広がり角度はレーザ光の波長によってある程度決まるものであり、また被検粒子の性質や測定項目によって使用に適したレーザ光の波長が決定されるため、レーザ光の広がり角度が狭いレーザダイオードを自由に選択することはできない。
【００１５】
例えば、血液中の血球や尿中の有形成分に予め蛍光染色を施し、各粒子の染色部分から発せられる蛍光情報を得るためには、比較的短い波長（例えばλ＝７００ｎｍ以下程度）のレーザ光を照射する必要がある。しかし、一般にレーザダイオードには、発せられるレーザ光の波長が短くなるほど、広がり角度が広くなってしまうという性質がある。そこで、比較的短い波長のレーザ光を発するレーザダイオードを用いざるを得ない場合には、必然的に広がり角度の大きなレーザ光を照射することとなり、前述の通りコリメータレンズの上部や下部のコバでレーザ光の一部が蹴られ、迷光が発生するという問題が生じるのである。
【００１６】
別の対策として、レーザダイオードとコリメータレンズの距離を近づけたり、より径の大きなコリメータレンズを用いることで、コリメータレンズの上部や下部のコバにレーザ光が当たらないようにすることが考えられる。
【００１７】
以下、コリメータレンズに球面レンズを用いることを前提として説明するに、レーザダイオードとコリメータレンズの距離を近づける場合、よりＮＡの大きなコリメータレンズの使用が要求されるが、一定のレンズ径を保ったままＮＡを大きくするには物理的に限界がある。また、より径の大きなコリメータレンズを用いる場合には、同じ曲率でレンズ径を大きくすることとなる（すなわちＮＡのより大きなレンズを用いることとなる）が、曲率を変えずにレンズ径を大きくするのにも物理的に限界がある。
【００１８】
一方、フローサイトメータの光学系において非球面レンズをコリメートに用いることは好ましくない。現在のレンズ加工技術水準上の問題から、非球面レンズはコリメートに適さないためである。このような背景の下では、光学性能の確保の観点からすれば更なるＮＡの向上には限界がある。よって、レーザダイオードとコリメータレンズの距離を近づけたり、より径の大きなコリメータレンズを用いる、という上記各対策をとることにより前記課題を完全に解決することはできない。
【００１９】
レーザダイオードとコリメータレンズの間にスリットを設けてレーザ光の広がりを制限し、コリメータレンズの上部や下部のコバにレーザ光が当たらないようにする、という方法も考えられる。しかしこの方法では光量のロスが大きく、またスリットの縁に当たったレーザ光が蹴られることにより迷光が発生し、Ｓ／Ｎ比を悪化させるおそれがある。
【００２０】
本発明は上記課題に鑑み、フローセルの試料液流に、水平方向に長径を有し、垂直方向に短径を有するビームスポットを照射した際に、迷光が焦点を結び、受光素子で粒子信号とともに検出されてしまう迷光信号の発生を簡単な構成で防ぎ、主光線による粒子信号のみを検出することを可能としたフローサイトメータを提供するものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために、被検粒子を含む試料液を垂直方向に流すフローセルと、断面が楕円形である放射状のレーザ光を発するレーザダイオードと、前記レーザダイオードから発せられる放射状のレーザ光を平行光に形成する平行光形成手段と、前記平行光を収斂させ、前記フローセルの位置に合わせて、水平方向に長径を有し、垂直方向に短径を有するビームスポットを形成するビームスポット形成手段と、前記被検粒子から光学的情報を検出する受光手段と、を備えたフローサイトメータであって、前記レーザダイオードから発せられるレーザ光の断面における楕円形の短径および長径の方向が、前記ビームスポットの短径および長径の方向と一致するように前記レーザダイオードを配置したことを特徴とする、フローサイトメータを提供するものである。
【００２２】
本発明は、従来のフローサイトメータと異なり、レーザダイオードを、発せられるレーザ光の断面における楕円形の短径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置したことを特徴とする。そのため従来のレーザダイオード配置向きにより得ていた前記メリット（▲１▼ビームスポットにおける光量を増やすことができ、また▲２▼粒子の検出領域となるビームスポットの試料液流れ方向における径φをより小さくすることができる、というメリット）は享受しないことになる。しかしこれらは光学系の調整等によりある程度のカバーが可能である。一方、特に細菌等の小型粒子を被検粒子に含むフローサイトメータにおいて、コリメータレンズのコバで生じた迷光による信号の悪影響は、高めに閾値を設定することによって回避できるものではなかったため、何よりもまず、迷光信号の影響を受けない光学系の構成が望まれていた。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明において被検粒子とは、主に血液中に含まれる赤血球・白血球・血小板といった各種血球や、尿中に含まれる細菌・赤血球・白血球・上皮細胞・円柱などの有形成分等を指すが、これらに限られるわけではない。試料液は、測定対象が例えば血液や尿等の検体である場合は、希釈・染色等の処理を適宜施すことによって調製される。
【００２４】
本発明に用いられるフローセルは、その内部を通過する粒子から光学的情報を得るため、透明で表面が滑らかなものが好適であり、ガラス等の材質が用いられる。また本発明に用いられるレーザダイオードは、被検粒子の性質や測定項目によって適した波長のレーザ光を発するものが選択される。
【００２５】
平行光形成手段とは、レーザダイオードから発せられる放射状のレーザ光を平行光に形成するものであり、コリメータレンズが好適に用いられる。またビームスポット形成手段とは、平行光形成手段により形成された平行光を収斂させ、フローセルの位置に合わせてビームスポットを形成するものであり、コンデンサレンズなどが用いられる。ここでフローセルの位置に合わせて形成されるビームスポットの径は、被検粒子の大きさに合わせることが好ましい。それは例えば、測定対象に尿検体を用いる場合は試料液流れ方向に１０μｍ程度である。
【００２６】
本発明に用いられる受光手段とは、試料液中の被検粒子が前記ビームスポットを通過する際に生じる散乱光や蛍光の光強度分布の変化を光学的情報として検出するものであるが、そのような光学的情報を光電変換し、パルス状の電気信号として検出するものが好ましい。フォトダイオードやフォトトランジスタ、フォトマルチプライヤチューブ等が好適に用いられる。
【００２７】
本発明においては、レーザダイオードを、発せられるレーザ光の断面における楕円形の短径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置した。すなわち、従来に比べレーザダイオードを９０度回転させて配置した。このレーザーダイオード配置向きでの光学系配置と前方散乱光信号の検出との関係を図５に示す。
【００２８】
図５において、レーザーダイオード１から発せられるレーザ光の広がり角度は縦方向（試料液流れ方向と平行な方向）に狭く、横方向（試料液流れ方向と垂直な方向）に広い。これにより、コリメータレンズ３の上部や下部のコバ部でレーザ光の一部が蹴られることがなくなり、迷光の発生を防止できる。よってフローセル６中の試料液流において、主光線によるビームスポットの上部や下部に迷光が焦点を結ばなくなるので迷光信号が検出されなくなる。
【００２９】
コリメータレンズ３の右部や左部のコバでレーザ光の一部が蹴られ、迷光が発生する可能性はある。しかし、その迷光は試料液流上に焦点を結ぶことはなく、主光線によるビームスポットの左右（試料液の流れ方向と垂直な方向）に焦点を結ぶため、信号として検出されることはない。
【００３０】
なお、本発明のようなレーザダイオードの配置が特に効果的なのは、比較的短い波長のレーザ光（＝広がり角度の大きいレーザ光）を照射する必要がある場合であり、λ＝７００ｎｍ以下程度、例えばλ＝６３５ｎｍといった波長のレーザ光を発するレーザダイオードを用いる場合などである。こういったレーザダイオードを用いる場合に、発せられるレーザ光の断面における楕円形の長径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置すると、コリメータレンズの上部や下部のコバに強度のレーザ光が当たり、迷光を生じさせるからである。
【００３１】
本発明のフローサイトメータは、以上に説明してきた本発明特有の光学系を公知のフローサイトメータに応用することで実施可能である。その構成例の概略を図６に示す。検出部２００は、以上に説明してきた光学系で構成されるものであり、粒子毎にパルス状の電気信号を検出する。その信号は信号処理部３００に送られる。信号処理部３００は、検出部２００により得られた信号の波形を処理して各種パラメータを算出する回路からなる。パラメータとしては、例えばピークレベル、パルス幅等が算出される。これらは公知のピークホールド回路やカウンタ回路等によって算出できる。
【００３２】
信号処理部３００によって算出された各種パラメータに関するデータは分析部４００に送られる。分析部４００は、各種パラメータに関するデータを統計解析することで試料液中に存在する粒子を分析するものであり、マイクロコンピュータ等によって構成できる。統計解析の際にはヒストグラムや、複数のパラメータを組合わせてなるスキャッタグラム等が作成されてもよい。
【００３３】
また分析部４００による分析結果を出力するため、本発明のフローサイトメータはさらに出力手段５００を備えてもよい。出力手段５００にはＣＲＴやＬＣＤ等の表示手段、あるいはプリンタ等を用いることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明のフローサイトメータの実施例について詳述する。なお、本発明は、この実施例に限定されるわけではない。
【００３５】
本実施例のフローサイトメータは尿中有形成分を被検粒子として分析するものであり、被検粒子を含む試料液は尿検体に希釈・染色等の処理を施すことにより調製される。装置の構成は前述図６に示したものと同様、検出部２００、信号処理部３００、分析部４００、出力手段５００からなる。
【００３６】
図７は、本実施例の検出部２００の光学系構成を示す。レーザ光源であるレーザダイオード１には赤色レーザダイオード（日立製作所ＨＬ６３１２Ｇ）を用いる。発せられるレーザ光の波長は６３５ｎｍであり、レーザ光の広がり角度は、レーザ光断面における楕円形の長径方向には３１度、短径方向には８度である。
【００３７】
またフローセル６は、図８に示すように、断面が内部流路は一辺２００μｍの正方形、外壁は一辺４ｍｍの正方形となるよう構成されており、材質にはガラスが用いられている。
【００３８】
図７のａは、検出部２００の構成を、試料液の流れ方向に対し垂直な方向から観察して示すものである。被検粒子を含む試料液がノズル１１からフローセル６中に吐出され、試料液流を形成する。レーザダイオード１から発せられた放射状のレーザ光はウインド２、平行光形成手段であるコリメータレンズ３を経て平行光に形成され、シリンドリカルレンズ４、コンデンサレンズ５を経てフローセル６中の試料液流に合わせて第１焦点を結ぶ。
【００３９】
図７のｂは、検出部２００の構成を、試料液の流れ方向に対し平行な方向から観察して示すものである。レーザダイオード１から発せられた放射状のレーザ光はウインド２、平行光形成手段であるコリメータレンズ３を経て平行光に形成され、シリンドリカルレンズ４により光路径が調整された後、コンデンサレンズ５を経てフローセル６中の試料液流と集光レンズ７の間に第２焦点を結ぶ。
【００４０】
上記のような光学配置とすることでフローセル６には楕円形のビームスポットが形成される。図９はフローセルにビームスポットが形成される様子を示す模式図であり、レーザ光の進行方向に向かってフローセルを観察したものである。このビームスポットにおいては、試料液の流れ方向に対しては楕円形の短径方向を合わせることで複数の粒子が検出領域を同時に通過することを極力防ぎ、試料液の流れ方向に対し垂直な方向には楕円形の長径方向を合わせることで試料液中で流れと垂直方向にぶれて通過する粒子も十分カバーして検出できるようにしている。本実施例では、各光学系を調整することにより、この楕円形のビームスポットがフローセル６中の試料液流の位置（すなわち第１焦点の位置）において長径が２２０μｍ、短径が１０μｍとなるよう設定してある。
【００４１】
レーザ光の照射により、フローセル６中を流れる被検粒子からは前方散乱光が発生する。この前方散乱光は集光レンズ７によって集められ、フォトダイオード８によって光電変換され、パルス状の電気信号として検出される。直接光はビームストッパ９によりカットし、また外部光はピンホール１０によりカットすることで、検出される電気信号のＳ／Ｎ比を稼いでいる。
【００４２】
検出部２００で検出された信号は信号処理部３００に送られる。ここで信号波形が処理され、ピークレベル、パルス幅等のパラメータが算出される。
【００４３】
信号処理部３００によって算出された各種パラメータに関するデータは分析部４００に送られ、統計解析される。ここでは前方散乱光信号のピークレベル、およびパルス幅、の二つのパラメータを組合わせてなるスキャッタグラム等が作成され、被検粒子の計数・分類がなされる。
【００４４】
分析の結果は出力手段５００により出力される。本実施例では、各種測定項目に関するデータがプリンタによりプリントアウトされる。また前記分析部４００により作成されたスキャッタグラムがＬＣＤによって表示される。
【００４５】
本実施例においては前方散乱光の検出のみに言及してきたが、蛍光の検出を行なうよう構成することも当然に可能である。その場合は、蛍光信号を検出するための受光部、その他必要な光学系を付加すればよい。それらは公知のものを利用できる。例えば、受光部にはフォトマルチプライヤチューブなどが好適に用いられる。
【００４６】
以下、本発明の効果を実証するための実験について説明する。用いたのは従来の構成のフローサイトメータ、および本発明上記実施例のフローサイトメータであり、いずれも尿中有形成分分析用のフローサイトメータである。またいずれも、粒子検出のための閾値は細菌を検出できるよう低めに設定されている。両者の相違点は、検出部におけるレーザダイオードの配置の向きである。すなわち、従来の構成のフローサイトメータにおいてレーザダイオードは、発せられるレーザ光の断面における楕円形の長径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置されている。一方、本発明上記実施例のフローサイトメータにおいてレーザダイオードは、発せられるレーザ光の断面における楕円形の短径方向と、フローセル中の試料液の流れ方向とが平行になるように配置されている。なお、ここでは被検粒子として７μｍ径ラテックス粒子を用いた。尿中に含まれる白血球を想定したものである。これらを用いて前方散乱光信号を検出し、信号波形およびスキャッタグラムの観察・比較を行なう。
【００４７】
信号波形の比較
図１０のａは従来の構成のフローサイトメータにより検出された７μｍ径ラテックス粒子の前方散乱光における信号波形である。これを観察するに、ラテックス粒子自体の信号（粒子信号）の左右に、迷光に起因する信号（迷光信号）が現れていることが見て取れる。この場合、粒子信号の左側に出現した迷光信号によって、本来ラテックス粒子の信号のみが検出された場合におけるパルス幅とは異なったパルス幅が算出されてしまう。実際の尿検体を測定した場合に同様のことが起これば、本来白血球として検出されるべき粒子が、他の種類の粒子として検出されることになりかねない。また、粒子信号の右側に出現した迷光信号は、７μｍ径ラテックス粒子とは別に、小型の粒子が検出されたものとしてピークレベルやパルス幅が計測されてしまうため、粒子の計数結果に狂いが生じる。実際の尿検体を測定した場合に同様のことが起これば、白血球のみが検出されるべきところを、より小型の粒子、例えば細菌をも検出したかのような分析結果が出ることとなってしまう。
【００４８】
図１０のｂは、本発明上記実施例のフローサイトメータにより検出された７μｍ径ラテックス粒子の前方散乱光における信号波形である。ここでは迷光信号が生じず、７μｍ径ラテックス粒子を検出した単一のパルス信号のみが生じている。このことから、迷光信号による分析結果への悪影響が無くなっていることがわかる。
【００４９】
スキャッタグラムの比較
図１１は、７μｍ径ラテックス粒子の前方散乱光信号を検出した際のスキャッタグラムであり、パラメータとして縦軸にはピークレベル、すなわち前方散乱光信号強度（ＦＳＣ）を、横軸には前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）を用いたものである。スキャッタグラムにおいて細菌・白血球の各粒子は図中に楕円で示したような領域に分布すると予め想定される。このような粒子の種類毎の分布領域は、予め同種の粒子を測定した結果などを踏まえて決定することが可能である。
【００５０】
図１１においてａのスキャッタグラムは、従来の構成のフローサイトメータにより計測した結果である。ここでの被検粒子径は７μｍである（これが白血球を想定したものであることは前述した。）ので、本来であれば図中の白血球領域のみに粒子が分布すべきである。しかし迷光信号の影響によりそれ以外の領域にも分布していることがわかる。すなわち、パルス幅の値が迷光信号の影響によって本来よりも大きく検出された場合には、白血球領域の右側に分布することがある。また、誤って小型粒子の信号として検出された迷光信号は、細菌領域付近に分布することがある。
【００５１】
図１１においてｂのスキャッタグラムは、本発明上記実施例のフローサイトメータにより計測したものである。この場合は迷光信号による影響を受けていないため、粒子の分布は白血球領域に集中したものとなる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明のフローサイトメータによれば、従来コリメータレンズのコバによって生じていた迷光による信号を生じさせることなく、主光線による粒子信号のみを検出することが可能となる。そのため、より正確な分析結果を求めることができる。
【００５３】
特に、細菌のような小型の粒子を被検粒子に含む場合には、迷光信号による悪影響を閾値の設定によって回避できなかったため、光学系からのアプローチによる本発明の効果が顕著である。
【００５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のフローサイトメータの光学系の一例を示す略図である。
【図２】レーザダイオードから発せられるレーザ光の様子を示す図である。
【図３】フローサイトメータの光学系において前方散乱光信号を検出する様子を示す図である。
【図４】粒子を検出したパルス状の電気信号において閾値、ピークレベル、パルス幅の関係を示す図である。
【図５】フローサイトメータの光学系において前方散乱光信号を検出する様子を示す図である。
【図６】本発明実施例のフローサイトメータの構成の概略を示すブロック図である。
【図７】本発明実施例のフローサイトメータの検出部の光学系構成を示す図である。
【図８】本発明実施例に用いられるフローセルの断面図である。
【図９】フローセルにビームスポットが形成される様子を示す模式図である。
【図１０】ラテックス粒子を検出した信号波形を示す図である。
【図１１】ラテックス粒子を検出したスキャッタグラムを示す図である。
【符号の説明】
１レーザダイオード
２ウインド
３コリメータレンズ
４シリンドリカルレンズ
５コンデンサレンズ
６フローセル
７集光レンズ
８フォトダイオード
９ビームストッパ
１０ピンホール
１１ノズル
１００フローサイトメータ
２００検出部
３００信号処理部
４００分析部
５００出力手段[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a flow cytometer for optically detecting and analyzing particles such as formed components contained in blood cells and urine in blood.
[0002]
[Prior art]
To automatically detect and analyze various blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets in blood, and formed components such as bacteria, red blood cells, white blood cells, epithelial cells, and cylinders contained in urine Various devices have been developed. A device using a flow cytometer is known as such a particle analyzer. In a detection unit of a general flow cytometer, a sample liquid containing particles to be analyzed is wrapped with a sheath liquid, narrowed down in a flow cell, and the particles are aligned and passed. Laser light is irradiated there to obtain optical information from each particle. Optical information includes scattered light such as forward scattered light, side scattered light, and back scattered light, fluorescence, and the like, and is appropriately selected according to the analysis target. Such optical information is detected as a pulsed electric signal by the photoelectric conversion element.
[0003]
The parameters representing the characteristics of the particles are calculated by processing the waveform of the signal thus obtained, and the particles to be analyzed are classified and counted based on the parameters.
[0004]
The light intensity is recognized as the height of the signal waveform, and at the same time, the light emission time is timed. Using these things, the height (peak level) of the signal waveform, the width (pulse width) of the signal waveform, and the like are calculated as parameters reflecting the characteristics of each particle. For example, the peak level of the portion (hereinafter referred to as “particle signal”) that is considered to detect particles in the forward scattered light signal represents the size of the particles. The pulse width represents the particle length. On the other hand, when a particle, for example, a nucleated cell is fluorescently stained in advance, a fluorescent signal is obtained from the test particle. Among them, the peak level of the particle signal indicates the degree of staining of the nucleus and the like, and the pulse width Represents the length of the fluorescent staining part. Create a histogram based on such parameters that represent the characteristics of each particle, or create a scattergram that shows the distribution of particles by combining multiple parameters. Such as statistical analysis is performed.
[0005]
In recent years, in the flow cytometer as described above, it is common to use a laser diode in addition to a gas laser light source such as an argon laser as a light source of laser light irradiated to the flow cell.
[0006]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of an optical system of a flow cytometer using a laser diode as a light source. A sample liquid containing the test particles is discharged into the flow cell 6, and the sheath liquid is flowed so as to wrap around the sample liquid. Then, the sample liquid is narrowed down by the hydrodynamic effect, and passes through the flow cell 6 in a state where the particles are aligned. Radial laser light emitted from the laser diode 1 is formed into parallel light through the collimator lens 3, and forms a beam spot by the sample liquid flow in the flow cell 6 through the cylindrical lens 4 and the condenser lens 5. Note that the laser light emitted from the laser diode has a property of being radial, and the cross section of the light is elliptical (see FIG. 2). That is, the spread angle of the laser light emitted from the laser diode is large in the major axis direction of the ellipse and small in the minor axis direction.
[0007]
In FIG. 1, when the laser beam spread angle θ is increased with respect to the collimator lens 3 and the value of the laser beam width d is increased (where the spread angle θ and the laser beam width d are both in the sample liquid flow direction). (1) It is possible to increase the amount of light at the beam spot, and (2) to reduce the diameter φ of the beam spot, which is the particle detection area, in the sample liquid flow direction. is there. These have the effects of improving detection sensitivity and preventing a plurality of particles from passing through the detection region at the same time. For this reason, in the conventional flow cytometer, the laser diode is arranged so that the major axis direction of the ellipse in the section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
However, a serious disadvantage may occur in the above arrangement. FIG. 3 shows the relationship between the arrangement of the optical system in the laser diode arrangement direction and detection of the forward scattered light signal. In FIG. 3, since the laser beam spreads in the vertical direction (direction parallel to the sample liquid flow direction) and has a wide angle, a part of the laser beam is kicked by the upper and lower edges of the collimator lens 3 and stray light is generated. For this reason, in the sample liquid flow in the flow cell 6, stray light is focused on the upper and lower portions of the beam spot by the chief ray, and in addition to the particle signal by the chief ray, a signal caused by stray light (hereinafter referred to as “stray light signal”). Was sometimes detected.
[0009]
When a stray light signal is generated, it is detected as a particle signal, which affects the particle count / classification result. This demerit applies not only to detection of forward scattered light signals, but also to detection of side scattered light signals, back scattered light signals, and fluorescent signals.
[0010]
The following countermeasures can be considered as an approach from the signal processing system for the above problems. The threshold for detecting the particle signal is set to a height at which the particle signal is detected but the stray light signal is not detected. Here, the “threshold value” is used to determine whether or not particles are detected in a series of signals, and signal intensity (signal intensity (particle detection signal) for a portion where the signal intensity exceeds the threshold value. That is, the peak level) and the light emission time (that is, the pulse width) are calculated (see FIG. 4).
[0011]
The particle signal and the stray light signal generated accompanying it are far from each other in magnitude (the stray light signal is a smaller pulse). Therefore, if only relatively large particles such as blood cells are to be detected, it is possible to detect only the particle signal and not to detect the stray light signal by setting this threshold value high. Therefore, in the conventional general flow cytometer, the laser diode is arranged so that the major axis direction of the ellipse in the section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell. While enjoying the advantages ((1) the amount of light at the beam spot can be increased, and (2) the diameter φ of the beam spot as the particle detection region in the sample liquid flow direction can be made smaller). It is possible to avoid the disadvantages caused by the stray light signal by setting the threshold value higher.
[0012]
However, when particles of various sizes (for example, about 0.5 μm to 100 μm in diameter) are included in the specimen and a flow cytometer is used to detect each, a threshold value is set according to the signal of the smallest particle. Must be set lower. Therefore, the stray light signal generated along with the particle signal due to the large particles exceeds the threshold, and is erroneously detected as a small particle, which may cause the count value to be distorted or adversely affect the pulse width information of other particle signals. . For example, urine may contain bacteria, red blood cells, white blood cells, columnar cells, epithelial cells, and the like. These particles vary in size, especially bacteria, which are often much smaller than other particles. When these are the test particles, the threshold for detecting the particle signal needs to be set low so that bacteria can be detected. For this reason, for example, when a stray light signal is generated in association with a leukocyte particle signal, an analysis result appears as if only a white blood cell should be detected, but also bacteria, or a leukocyte particle signal. It is possible that the pulse width becomes larger than the original width and is analyzed as a different type of particle size.
[0013]
Thus, the adverse effect of the stray light signal is particularly noticeable in a flow cytometer that needs to detect even small particles.
[0014]
If an approach from the optical system is attempted as a countermeasure to the above problem, by selecting a laser diode having a narrow spread angle of the emitted laser beam, the laser beam does not hit the upper or lower edge of the collimator lens 3. Can be considered. However, the spread angle of the laser beam is determined to some extent by the wavelength of the laser beam, and the wavelength of the laser beam suitable for use is determined by the properties of the test particles and the measurement items, so the spread angle of the laser beam is narrow. The laser diode cannot be freely selected.
[0015]
For example, in order to obtain fluorescent information emitted from a stained portion of each particle by preliminarily fluorescently staining blood cells in blood or tangible components in urine, a laser having a relatively short wavelength (for example, about λ = 700 nm or less) It is necessary to irradiate light. However, laser diodes generally have the property that the spread angle becomes wider as the wavelength of emitted laser light becomes shorter. Therefore, when it is necessary to use a laser diode that emits a laser beam having a relatively short wavelength, the laser beam inevitably is irradiated with a large spread angle. This causes a problem that a part of the laser light is kicked and stray light is generated.
[0016]
As another countermeasure, it is conceivable to prevent the laser light from hitting the upper or lower edge of the collimator lens by reducing the distance between the laser diode and the collimator lens or using a collimator lens having a larger diameter.
[0017]
In the following description, it is assumed that a spherical lens is used as the collimator lens. When the distance between the laser diode and the collimator lens is shortened, the use of a collimator lens having a larger NA is required, but a constant lens diameter is maintained. There is a physical limit to increasing NA. Further, when a collimator lens having a larger diameter is used, the lens diameter is increased with the same curvature (that is, a lens having a larger NA is used), but the lens diameter is increased without changing the curvature. There are also physical limitations.
[0018]
On the other hand, it is not preferable to use an aspheric lens for collimation in the optical system of the flow cytometer. This is because aspherical lenses are not suitable for collimation due to problems in the current lens processing technology level. Under such circumstances, there is a limit to further improving NA from the viewpoint of securing optical performance. Therefore, the above-mentioned problem cannot be completely solved by taking the above-mentioned measures of reducing the distance between the laser diode and the collimator lens or using a collimator lens having a larger diameter.
[0019]
A method is also conceivable in which a slit is provided between the laser diode and the collimator lens to limit the spread of the laser light so that the laser light does not strike the upper or lower edge of the collimator lens. However, in this method, the loss of light amount is large, and the stray light is generated by kicking the laser beam that hits the edge of the slit, which may deteriorate the S / N ratio.
[0020]
In view of the above problems, the present invention When the sample liquid flow in the flow cell is irradiated with a beam spot having a major axis in the horizontal direction and a minor axis in the vertical direction, stray light is focused and detected together with the particle signal by the light receiving element. Generate stray light signals With simple configuration The present invention provides a flow cytometer capable of preventing and detecting only a particle signal due to a chief ray.
[0021]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention provides a sample liquid containing test particles. Vertically A flow cell to flow, Radial with an elliptical cross section A laser diode that emits laser light, parallel light forming means that forms radial laser light emitted from the laser diode into parallel light, and converging the parallel light, so as to match the position of the flow cell Has a major axis in the horizontal direction and minor axis in the vertical direction A flow cytometer, comprising: a beam spot forming means for forming a beam spot; and a light receiving means for detecting optical information from the test particles, wherein the laser diode From Ellipse short in cross section of emitted laser light The direction of the diameter and major axis coincides with the direction of the minor axis and major axis of the beam spot. like The laser diode The present invention provides a flow cytometer characterized by being arranged.
[0022]
In the present invention, unlike a conventional flow cytometer, the laser diode is arranged so that the minor axis direction of the ellipse in the cross section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell. Features. Therefore, the advantages obtained by the conventional laser diode orientation ((1) The amount of light in the beam spot can be increased, and (2) The diameter φ of the beam spot in the sample liquid flow direction as the particle detection region is made smaller. The benefits of being able to do so will not be enjoyed. However, these can be covered to some extent by adjusting the optical system. On the other hand, especially in flow cytometers that contain small particles such as bacteria in the test particles, the adverse effect of the signal due to stray light generated at the edge of the collimator lens could not be avoided by setting a high threshold, so above all First, an optical system configuration that is not affected by stray light signals has been desired.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the test particles mainly refer to various blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets contained in blood, and formed components such as bacteria, red blood cells, white blood cells, epithelial cells, and cylinders contained in urine. However, it is not limited to these. When the measurement target is a sample such as blood or urine, the sample solution is prepared by appropriately performing a process such as dilution and staining.
[0024]
The flow cell used in the present invention is preferably transparent and has a smooth surface in order to obtain optical information from particles passing through the inside thereof, and a material such as glass is used. As the laser diode used in the present invention, a laser diode that emits laser light having a wavelength suitable for the properties of the test particles and measurement items is selected.
[0025]
The parallel light forming means forms a radial laser beam emitted from a laser diode into parallel light, and a collimator lens is preferably used. The beam spot forming means is a means for converging the parallel light formed by the parallel light forming means to form a beam spot in accordance with the position of the flow cell, and a condenser lens or the like is used. Here, the diameter of the beam spot formed in accordance with the position of the flow cell is preferably matched to the size of the test particle. For example, when a urine sample is used as a measurement target, it is about 10 μm in the sample liquid flow direction.
[0026]
The light receiving means used in the present invention is a means for detecting, as optical information, changes in the light intensity distribution of scattered light and fluorescence generated when a test particle in a sample liquid passes through the beam spot. Such optical information is preferably photoelectrically converted and detected as a pulsed electric signal. A photodiode, a phototransistor, a photomultiplier tube, or the like is preferably used.
[0027]
In the present invention, the laser diode is arranged so that the elliptical minor axis direction in the cross section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell. That is, the laser diode was rotated 90 degrees compared to the conventional case. FIG. 5 shows the relationship between the arrangement of the optical system in the laser diode arrangement direction and the detection of the forward scattered light signal.
[0028]
In FIG. 5, the spread angle of the laser light emitted from the laser diode 1 is narrow in the vertical direction (direction parallel to the sample liquid flow direction) and wide in the horizontal direction (direction perpendicular to the sample liquid flow direction). Thereby, a part of the laser beam is not kicked by the upper and lower edge portions of the collimator lens 3, and the generation of stray light can be prevented. Therefore, in the sample liquid flow in the flow cell 6, the stray light is not focused on the upper and lower portions of the beam spot by the chief ray, so that the stray light signal is not detected.
[0029]
There is a possibility that a part of the laser light is kicked by the right or left edge of the collimator lens 3 and stray light is generated. However, the stray light does not focus on the sample liquid flow, and is focused on the left and right of the beam spot by the principal ray (in the direction perpendicular to the flow direction of the sample liquid), so that it is not detected as a signal.
[0030]
The arrangement of the laser diode as in the present invention is particularly effective when it is necessary to irradiate a laser beam having a relatively short wavelength (= a laser beam having a large spread angle), for example, about λ = 700 nm or less. For example, a laser diode that emits laser light having a wavelength of λ = 635 nm is used. When such a laser diode is used, if the elliptical major axis direction in the cross section of the emitted laser light and the flow direction of the sample liquid in the flow cell are arranged parallel to each other, the collimator lens upper or lower cover is arranged. This is because the laser beam of high intensity hits and generates stray light.
[0031]
The flow cytometer of the present invention can be implemented by applying the optical system unique to the present invention described above to a known flow cytometer. An outline of the configuration example is shown in FIG. The detection unit 200 includes the optical system described above, and detects a pulsed electric signal for each particle. The signal is sent to the signal processing unit 300. The signal processing unit 300 includes a circuit that processes the waveform of the signal obtained by the detection unit 200 and calculates various parameters. As parameters, for example, a peak level, a pulse width, and the like are calculated. These can be calculated by a known peak hold circuit or counter circuit.
[0032]
Data relating to various parameters calculated by the signal processing unit 300 is sent to the analysis unit 400. The analysis unit 400 analyzes particles present in the sample liquid by statistically analyzing data relating to various parameters, and can be configured by a microcomputer or the like. In statistical analysis, a histogram, a scattergram combining a plurality of parameters, or the like may be created.
[0033]
Further, in order to output the analysis result by the analysis unit 400, the flow cytometer of the present invention may further include an output means 500. The output means 500 can be a display means such as a CRT or LCD, or a printer.
【Example】
[0034]
Hereinafter, embodiments of the flow cytometer of the present invention will be described in detail. The present invention is not limited to this example.
[0035]
The flow cytometer of the present example analyzes urine particles as test particles, and a sample solution containing the test particles is prepared by subjecting a urine sample to treatment such as dilution and staining. The configuration of the apparatus includes a detection unit 200, a signal processing unit 300, an analysis unit 400, and an output unit 500, similar to that shown in FIG.
[0036]
FIG. 7 shows an optical system configuration of the detection unit 200 of the present embodiment. A red laser diode (Hitachi Ltd. HL6312G) is used for the laser diode 1 which is a laser light source. The wavelength of the emitted laser beam is 635 nm, and the spread angle of the laser beam is 31 degrees in the major axis direction of the ellipse in the laser beam section and 8 degrees in the minor axis direction.
[0037]
Further, as shown in FIG. 8, the flow cell 6 is configured such that the cross section is a square with a side of 200 μm and the outer wall is a square with a side of 4 mm, and the material is glass.
[0038]
FIG. 7 a shows the configuration of the detection unit 200 observed from a direction perpendicular to the flow direction of the sample liquid. A sample liquid containing the test particles is discharged from the nozzle 11 into the flow cell 6 to form a sample liquid flow. Radial laser light emitted from the laser diode 1 is formed into parallel light through a window 2, a collimator lens 3 which is a parallel light forming means, and is matched with the sample liquid flow in the flow cell 6 through a cylindrical lens 4 and a condenser lens 5. To establish the first focus.
[0039]
FIG. 7 b shows the configuration of the detection unit 200 observed from a direction parallel to the flow direction of the sample liquid. Radial laser light emitted from the laser diode 1 is formed into parallel light through a window 2 and a collimator lens 3 which is a parallel light forming means. After the optical path diameter is adjusted by a cylindrical lens 4, the flow cell passes through a condenser lens 5. A second focal point is formed between the sample liquid flow in 6 and the condenser lens 7.
[0040]
By adopting the optical arrangement as described above, an elliptical beam spot is formed in the flow cell 6. FIG. 9 is a schematic view showing a state where a beam spot is formed in the flow cell, and the flow cell is observed in the traveling direction of the laser beam. In this beam spot, by aligning the minor axis direction of the ellipse with the flow direction of the sample liquid, a plurality of particles are prevented from passing through the detection region as much as possible, and the direction perpendicular to the flow direction of the sample liquid By aligning the major axis direction of the ellipse, particles passing through the sample solution in a direction perpendicular to the flow are sufficiently covered and detected. In this embodiment, by adjusting each optical system, the elliptical beam spot has a major axis of 220 μm and a minor axis of 10 μm at the position of the sample liquid flow in the flow cell 6 (ie, the position of the first focal point). It is set.
[0041]
Due to the laser light irradiation, forward scattered light is generated from the test particles flowing in the flow cell 6. This forward scattered light is collected by the condensing lens 7, photoelectrically converted by the photodiode 8, and detected as a pulsed electric signal. Direct light is cut by the beam stopper 9, and external light is cut by the pinhole 10 to increase the S / N ratio of the detected electrical signal.
[0042]
The signal detected by the detection unit 200 is sent to the signal processing unit 300. Here, the signal waveform is processed, and parameters such as peak level and pulse width are calculated.
[0043]
Data relating to various parameters calculated by the signal processing unit 300 is sent to the analysis unit 400 for statistical analysis. Here, a scattergram or the like is created by combining the two parameters of the peak level of the forward scattered light signal and the pulse width, and the test particles are counted and classified.
[0044]
The result of the analysis is output by the output means 500. In this embodiment, data relating to various measurement items is printed out by a printer. The scattergram created by the analysis unit 400 is displayed on the LCD.
[0045]
In the present embodiment, only the detection of the forward scattered light has been mentioned, but it is of course possible to configure to detect fluorescence. In that case, a light receiving unit for detecting the fluorescence signal and other necessary optical systems may be added. Those known in the art can be used. For example, a photomultiplier tube or the like is suitably used for the light receiving unit.
[0046]
Hereinafter, experiments for verifying the effects of the present invention will be described. A flow cytometer having a conventional configuration and a flow cytometer according to the above-described embodiment of the present invention were used, both of which are flow cytometers for analyzing urine particles. In both cases, the threshold for particle detection is set low so that bacteria can be detected. The difference between the two is the orientation of the laser diode in the detection unit. That is, in the conventional flow cytometer, the laser diode is arranged so that the major axis direction of the ellipse in the section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell. On the other hand, in the flow cytometer of the above embodiment of the present invention, the laser diode is arranged so that the minor axis direction of the ellipse in the section of the emitted laser light is parallel to the flow direction of the sample liquid in the flow cell. . Here, 7 μm diameter latex particles were used as the test particles. It assumes white blood cells contained in urine. These are used to detect the forward scattered light signal, and the signal waveform and scattergram are observed and compared.
[0047]
Comparison of signal waveforms
FIG. 10a shows a signal waveform in forward scattered light of 7 μm-diameter latex particles detected by a conventional flow cytometer. In observing this, it can be seen that signals (stray light signals) due to stray light appear on the left and right of the signal (particle signal) of the latex particles themselves. In this case, a pulse width different from the pulse width when only the latex particle signal is originally detected is calculated by the stray light signal that appears on the left side of the particle signal. If the same thing happens when an actual urine sample is measured, particles that should be detected as white blood cells may be detected as other types of particles. In addition, the stray light signal that appears on the right side of the particle signal has a peak level and a pulse width measured as small particles detected separately from the 7 μm-diameter latex particles. . If the same thing happens when measuring an actual urine sample, an analysis result will appear as if only small white particles, such as bacteria, were detected where only white blood cells should be detected. End up.
[0048]
FIG. 10b is a signal waveform in forward scattered light of 7 μm diameter latex particles detected by the flow cytometer of the above embodiment of the present invention. Here, no stray light signal is generated, and only a single pulse signal in which 7 μm diameter latex particles are detected is generated. From this, it can be seen that there is no adverse effect on the analysis result by the stray light signal.
[0049]
Comparison of scattergrams
FIG. 11 is a scattergram when a forward scattered light signal of 7 μm diameter latex particles is detected. As a parameter, the vertical axis indicates the peak level, that is, the forward scattered light signal intensity (FSC), and the horizontal axis indicates the forward scattered light. The signal pulse width (FSCW) is used. In the scattergram, it is assumed in advance that each particle of bacteria and leukocytes is distributed in a region shown by an ellipse in the figure. Such a distribution region for each type of particle can be determined based on the result of measuring the same type of particle in advance.
[0050]
In FIG. 11, the scattergram a is the result of measurement with a conventional flow cytometer. Since the test particle size here is 7 μm (this was assumed to be leukocytes as described above), the particles should be distributed only in the leukocyte region in the figure. However, it can be seen that it is also distributed in other regions due to the influence of the stray light signal. That is, when the pulse width value is detected to be larger than the original due to the influence of the stray light signal, it may be distributed on the right side of the white blood cell region. In addition, stray light signals that are erroneously detected as small particle signals may be distributed near the bacterial region.
[0051]
In FIG. 11, the scattergram b is measured by the flow cytometer of the above embodiment of the present invention. In this case, since it is not affected by the stray light signal, the particle distribution is concentrated in the leukocyte region.
[0052]
【The invention's effect】
According to the flow cytometer of the present invention, it is possible to detect only the particle signal due to the chief ray without generating a signal due to stray light that has been generated by the edge of the collimator lens. Therefore, a more accurate analysis result can be obtained.
[0053]
In particular, when small particles such as bacteria are included in the test particles, the adverse effect due to the stray light signal could not be avoided by setting the threshold value, and thus the effect of the present invention by the approach from the optical system is remarkable.
[0054]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of an optical system of a conventional flow cytometer.
FIG. 2 is a diagram showing a state of laser light emitted from a laser diode.
FIG. 3 is a diagram showing a state in which a forward scattered light signal is detected in an optical system of a flow cytometer.
FIG. 4 is a diagram illustrating a relationship among a threshold value, a peak level, and a pulse width in a pulsed electric signal in which particles are detected.
FIG. 5 is a diagram illustrating a state in which a forward scattered light signal is detected in an optical system of a flow cytometer.
FIG. 6 is a block diagram showing an outline of the configuration of a flow cytometer according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing an optical system configuration of a detection unit of a flow cytometer according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a cross-sectional view of a flow cell used in an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a schematic diagram showing how a beam spot is formed in a flow cell.
FIG. 10 is a diagram showing a signal waveform in which latex particles are detected.
FIG. 11 is a diagram showing a scattergram in which latex particles are detected.
[Explanation of symbols]
1 Laser diode
2 Wind
3 Collimator lens
4 Cylindrical lens
5 Condenser lens
6 Flow cell
7 Condensing lens
8 Photodiode
9 Beam stopper
10 pinhole
11 nozzles
100 Flow cytometer
200 detector
300 Signal processor
400 analysis unit
500 output means

Claims

A flow cell for flowing a sample solution containing test particles in the vertical direction ;
A laser diode that emits a radial laser beam having an elliptical cross section ; and
Parallel light forming means for forming radial laser light emitted from the laser diode into parallel light;
Beam spot forming means for converging the parallel light and forming a beam spot having a major axis in the horizontal direction and a minor axis in the vertical direction according to the position of the flow cell;
A light receiving means for detecting optical information from the test particles, and a flow cytometer comprising:
The flow is characterized in that the laser diode is arranged so that the directions of the minor axis and the major axis of the ellipse in the cross section of the laser light emitted from the laser diode coincide with the directions of the minor axis and the major axis of the beam spot. Cytometer.

The flow cytometer according to claim 1, wherein the light receiving means is a photodiode and includes a beam stopper that cuts light directly between the flow cell and the photodiode .

The flow cytometer according to claim 1, wherein the parallel light forming unit is a collimator lens.

The sample liquid state, and are not prepared with urine specimen, the test particles, wherein bacteria der Rukoto, flow cytometer according to any one of claims 1-3.

The flow cytometer according to any one of claims 1 to 4, wherein the beam spot forming means includes at least a cylindrical lens and a condenser lens.