JP4649671B2

JP4649671B2 - 酵素センシングにおける検出セル、及び酵素センシングシステム

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Publication number: JP4649671B2
Application number: JP2001000271A
Authority: JP
Inventors: 哲彌逢坂
Original assignee: Waseda University
Current assignee: Waseda University
Priority date: 2001-01-05
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2021-01-05
Also published as: JP2002202284A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素センシングシステムにおいて用いる検出セルに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、医療や食品関係で高感度で、選択性の高いセンサーの開発が望まれている。バイオセンサーは、その有力な候補である。たとえば、尿素を例に取ると、酵素を用いたバイオセンサーの研究開発が活発に行われている。検出の方法としては、酵素ウレアーゼとの特異反応を利用したときのｐＨ変化を検出する電位検出型が一般的である。しかし、近年電流検出型の尿素センサーについても検討されている。両者の一般的な特性を比較すると、表１に示す通りである。
【０００３】
【表１】

【０００４】
従って、両者とも、理想的ではなく、満足できるものは得られていない。
【０００５】
センサーにとって感度は最も重視しなくてはならないものであり、その観点からは電流検出型が望ましい。さらに電流型にすれば、緩衝液の濃度にも依存されずに最終的な数値の取り扱いも容易になる。しかし、妨害物質の影響を受け、さらに尿素の電流検出を行う際酵素を２種類以上用いた複雑な系を用いなければならない。
【０００６】
このような点から、本発明者らは、ｐＨ応答性の電解重合絶縁性ポリピロール被覆電極を用いたバイオセンサーについて検討を行ってきている。特に、酵素をポリイオンコンプレックス中に固定化し、電解重合膜を複合化した電極において高感度電位検出型尿素センサーを報告しているが、このセンサーの今後の発展のためには、下記の技術課題がある。
▲１▼尿素の電位応答が緩衝液濃度に依存する。
▲２▼酵素反応に伴い電極付近のｐＨが大きく変化し、酵素の変性・失活が起こり、センサーの劣化および長期間安定性に欠ける。
▲３▼電位応答が尿素濃度対数値に比例するため扱いにくい。
【０００７】
このため、上記の問題点を解決するためのアプローチとしてｐＨ変化を電流応答に変換するｐＨスタット法に着目し、電流検出型への転換を行った。また、一般的に電流検出型は電極活性物質の影響を受けやすいという問題があるため、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）法を用いその影響を排除するセンシングシステムを構築し、尿素検出の可能性の確認を報告している。これによれば、種々の緩衝液濃度においてほぼ同一の電流応答が得られ、尿素濃度に対して直線的な応答を得ることができ、また電極活性物質（妨害物質）の影響を受けにくく、妨害電流が生じないことが確認された。
【０００８】
しかしながら、上記方法を実用化する上で、ｐＨ測定を行うセルの構造をできるだけコンパクトにし、またセルの選定によっては、応答値の再現信頼性に劣る場合もあることから、常に確実な応答再現性を与えるセル構造が要望された。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、上記要望に応えるために鋭意検討を行った結果、ｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムに最適なセル構造を見出したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、試料液が流れている流路に所用物質を注入し、試料液を酵素に接触させて、この試料液中の所用物質を酵素反応させると共に、この試料液流路とは別の流路において所用の電解液を電気分解することにより水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を発生させた電解液を流し、上記酵素反応によりｐＨ変化が生じた試料液と、上記水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を含む電解液とを混合し、上記ｐＨ変化が生じた試料液を中和して、上記ｐＨ変化が生じた試料液のｐＨを初期のｐＨで一定に保つのに要する上記電気分解の電流値を指標として上記試料液中の所用物質の濃度を測定するフローインジェクション分析による酵素センシングにおける検出セルであって、上記試料液が流れる流路と、上記水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を含む電解液が流れる流路と、これら両流路と連通し、上記両液が乱流状態で混合される混合ゾーンと、この混合ゾーンと連通し、上記両液の混合液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、このｐＨ測定部に連通し、上記混合液をｐＨ測定部から排出する排出流路とを備えたことを特徴とする検出セル、及び
上記検出セルと、上記検出セルの試料液流路と連通する試料流路部と、該試料流路部の一端と連通する試料液容器と、上記検出セルの電解液流路と連通する電解液流路部と、該電解液流路部の一端と連通する電解液容器とを備え、
上記試料流路部が、一端が上記試料液容器に連通し、他端が上記検出セルに連結された試料液管に、上流側から下流側にかけてポンプ、インジェクションバルブ、及び酵素固定化カラムが介装されてなり、
上記電解液流路部が、一端が上記電解液容器に連通し、他端が上記検出セルに連結された電解液管に、上流側から下流側にかけてポンプ及び電解セルが介装されてなることを特徴とする酵素センシングシステムを提供する。
【００１１】
ｐＨスタット法に基づいた新規バイオセンシングシステムの実用化には、システムの心臓部であるｐＨ検出用セルの構造の最適化と再現性に富む計測特性の向上が肝要となる。前述のように本システムでは二流路を用いているために、その二流路の接合部において合流液が瞬時に均一、混合化されることが要求される。従って、セル構造を最適に設計するため、セルの精密加工、作製も必須とされる。また、本システムにおけるキャリヤー（緩衝液）と電解液流の各通液速度も高精度で制御されることが肝心である。その上、分析時間の短縮化、および検査試料量の大幅な削減も課題とされるが、上記セル構造によれば、かかる課題を確実に達成し得るものである。
【００１２】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
【００１３】
図１は、本発明に係るｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムの一例を示す説明図で、図中Ａは試料流路部、Ｂは電解液流路部である。試料流路部Ａは、一端が試料液容器１０に連通していると共に、他端が検出セル（ＦＥＴセル）Ｃに連結された試料液管１１に、上流側から下流側にかけて順次ポンプ１２、インジェクションバルブ１３、酵素固定化カラム１５が介装され、上記試料液容器１０内の試料液が、ポンプ１２、インジェクションバルブ１３の作動によりサンプルループ１４に保持された試料が酵素固定化カラム１５内に導入され、このカラム１５内の酵素により上記試料液中の所用の物質、例えば尿素が酵素反応し、この酵素反応によって試料液のｐＨ変動が生じ、このｐＨ変動が生じた試料液が上記セルＣ内に供給される。また、電解液流路部Ｂは、一端が電解液容器２０に連通し、他端が上記セルＣに連結された電解液管２１に、上流側から下流側にかけてポンプ２２、電解セル２３が介装されているものである。ここで、上記電解セル２３は、塩橋或いは隔膜２４等によって２室（イオン発生室２５と対極室２６）に分離され、イオン発生室２５にはジェネレーション電極（Ｇ．Ｅ．）２７が配設され、対極室２６にはカウンター電極（Ｃ．Ｅ．）２８が配設されているもので、図示していないが、これら電極２７、２８はポテンショスタットに接続され、上記電解液容器２０内の電解液がポンプ２２によって電解セル２３内に導入され、電気分解されるようになっている。この場合、ジェネレーション電極（Ｇ．Ｅ．）２７を陰極とした際、水の電気分解であれば、ここで水素イオン（Ｈ⁺）が発生し、水酸化物イオン（ＯＨ^-）は対極室２６に移行し、上記電気分解によって発生した水素イオン（Ｈ⁺）を含む電解液が上記検出セルＣに供給される。
【００１４】
図２は、この検出セルＣの一実施例の概略を示す分解斜視図であり、図３〜６は検出セルＣ構成図を示す。図中３１がセル本体を示す。このセル本体３１には、上記試料液管１１の他端と連通する試料液流路孔３２及び電解液管２１の他端と連通する電解液流路孔３３がそれぞれ形成されている。ここで、セル本体３１は略図角ブロック状に形成され、上記試料液流路孔３２は、セル本体３１の一側面から側方に伸び、途中で上向きに折曲してセル本体３１の上面に達するＬ字状に穿孔された状態に形成されていると共に、電解液流路孔３３は、セル本体３１の他の側から側方に伸び、途中で上向きに折曲してセル本体３１の上面に達する同様のＬ字状に穿孔された状態に形成されており、これら両流路孔３２、３３の上端開口部は互いに近接している。
【００１５】
図４１は天板であり、この天板４１は、セル本体３１と天板４１との間に内部連通空間を有する通液性多孔板４２が介在した状態でセル本体３１上面に取り付けられるようになっている。なお、セル本体３１と天板４１との間には、ガスケット４４が介装され、セル本体３１と天板４１とは液密に保持される。上記多孔体４２は、この多孔体４２がセル本体３１と天板４１との間に介装された状態において混合ゾーン４３を形成し、その一端側は上記両流路３２、３３の上端開口部と連通し、多孔体４２（混合ゾーン４３）の一端側に試料液と電解液とがそれぞれ流入し、この多孔体４２内を他端側に流動するようになっており、多孔体４２内を流れる際、上記試料液と電解液とが十分に混合されるものである。
【００１６】
上記多孔体４２（混合ゾーン４３）の他端側に位置して、上記セル本体３１には、上下方向に貫通する流下路孔３４が形成され、上記試料液と電解液との混合液が流下すると共に、セル本体３１の下面には、長孔５２が形成され、この長孔５２が混合液流通路５３とされたガスケット５１を介してｐＨ測定用のＩＳＦＥＴ（ＩｏｎＳｅｎｓｉｔｉｖｅＦｉｅｌｄＥｆｆｅｃｔＴｒａｎｓｉｓｔｏｒ）５４が配設された支持板５５が液密に取り付けられるようになっている。この場合、上記長孔５２（混合液流通路５３）の一端側は、上記流下路孔３４が連通していると共に、上記ＩＳＦＥＴ５４は混合液流通路５３内に露呈し、混合液と接触し得るようになっている。
【００１７】
更に、上記セル本体３１には、上記長孔５２（混合流通路５３）の他端側と連通して、上記セル本体３１の下面から側面に上向傾斜して貫通する混合液排出流路孔３５が形成されていると共に、セル本体３１の別の側面から側方に向けて先端が上記排出流路孔３５と連通する参照電極挿入孔３６が形成され、この挿入孔３６に参照電極（Ｒ．Ｅ．）５６が挿入、配設されるようになっている。なお、図中３７は取付孔であり、これに図示していない支柱が挿入される。
【００１８】
上記システムはフローインジェクション分析を利用して試料を注入し、「酵素反応を専用に行う流路」と「酵素反応の結果生ずるｐＨ変化を打ち消すための、水の電気分解専用流路」の２流路から構成され、ｐＨ検出部手前において合流し、検出するものである。２流路を構成することにより目的物質以外の卑な酸化還元電位を持つ妨害物質の影響を抑制できるという利点がある反面、溶液の流れ分布に問題が生じる。そこで、検出部セルの作製においてはそれを考慮した混合層を設置することが肝要である。また、測定の迅速化には検出部セルの容積を可及的に小さくし、セル中の流路を細くすればよい。電気分解セルの作製において応答の再現性を得るには、電気分解により生成される水素イオン（Ｈ⁺）および水酸化物イオン（ＯＨ^-）を確実に分離し、水素イオン（Ｈ⁺）の再現性の良い形成が可能である。
【００１９】
上記システムにより、例えば尿素を定量する場合、尿素は、酵素（例えばウレアーゼ）固定化カラムにおいて次のように酵素反応すると共に、電解セルにて次のようなアノード電解反応が生じる。
【００２０】

【００２１】
酵素反応における水素イオン（Ｈ⁺）の消費量を（２）式の水のアノード電解により生ずる水素イオン（Ｈ⁺）で補うことでｐＨを一定に保ち、そのときに要した電流値を指標として尿素濃度の測定を行うもので、図１に示す測定システムは実試料を用いた尿素測定時の電極活性物質（妨害物質）の影響を排除するため、電気分解のみを行う電解液流路部と試料のみが流れる試料液流路部とに分けられる。試料及び電気分解により生成した水素イオン（Ｈ⁺）とＦＥＴセルにて混合される。セル中に設置されたＩＳＦＥＴにおいて試料ｐＨを検出し、初期ｐＨ値になるようにジェネレーション電極（Ｇ．Ｅ．：Ｐｔｔｕｂｅ）にて水の電気分解を行い、水素イオン（Ｈ⁺）を供給している。ここで、試料は電解液流路部に流入しないので妨害物質はＧ．Ｅ．にて酸化されず妨害電流応答は検出されない。
【００２２】
即ち、上記酵素反応によりｐＨが上昇した試料液に、上記水素イオン（Ｈ⁺）を含む電解液を混合し、この混合液のｐＨをＩＳＦＥＴにおいて検出し、このｐＨが初期のｐＨ値になるに要する水素イオン（Ｈ⁺）補充量、従ってポテンショスタットの印加電流量から尿素濃度を算出する。この場合、ｐＨ変化（この場合はｐＨ上昇）が生じた試料液に電気分解後の電解液（この場合は水素イオン（Ｈ⁺）を含む電解液）を混合する際、両液が十分に混合されないと、検出値にばらつきが生じ、再現性が低下するが、上記検出セルによれば、両液の混合は通液多孔板を混合ゾーンとしてこの多孔体内を流れるときに行われるので、両液は十分に混じり合い、確実に混合される。従来のセル構造は、この混合ゾーンが単に長溝とされていたため、上記両液が長溝に導入され、この長溝内を流れるときに層流となるため、両液が十分に混ざり合わない場合が生じ、検出の再現性、精度に劣る場合があった。この場合、長溝をより長くすれば、両液が十分に混合される可能性が高くなるが、そうすると検出セルが長くなり、或いは大型化する。これに対し、上記検出セル構造によれば、混合ゾーンが通液性多孔体によって形成されるため、多孔体自体の長さが短くても両液が十分に混合し、検出セルもコンパクトになる。しかも、単に通液性多孔体を介装するだけで混合ゾーンを形成し得るので、セル本体を含む検出セルの構造も簡単なものとなる上、安価に製作し得るものである。
【００２３】
本発明において、混合ゾーンは、上記多孔体の配設によって形成される場合に限られず、混合ゾーンを両液が乱流状態で流れることが可能である構成であればよく、例えばセル本体上面又は天板下面に長溝を形成すると共に、この長溝の両内側壁にそれぞれ側方に向けて突出する突出部を交互に設け、長溝流路を液がジグザク状に流れるように構成するようにしてもよいが、製作的には面倒である上、コストも高くなるおそれがあることから、上記多孔体の使用も混合性、製作性、コスト等の点で最も優れている。
【００２４】
なお、上記多孔体としては、内部連通空間を有し、通液性のあるものであれば、材質は制限されず、試料液、電解液に不活性である限り、セラミックスでもプラスチックでもよい。また、多孔体の代りに不織布を用いることも効果があり、場合によっては織布でもよいが、親水性を有するものが好ましい。
【００２５】
また、上記検出セルは、排出路孔がセル本体の下面より上向傾斜した状態に形成されているので、他の流路、混合ゾーンに対し若干の背圧がかかり、この点から混合ゾーンを流れる両液の十分な混合がより保障されるものである。
【００２６】
本発明は、加水分解に係わる酵素触媒反応の全てに適用できる特徴を持ち、尿素の測定に限られず、酵素を選定することにより、酵素反応可能な種々の物質の測定を行うことができる。この場合、酵素反応でｐＨが低下するような物質であれば、電解セルのＧＥをポテンショスタットの陽極に接続し、ｐＨの低下した試料液に水酸化物イオン（ＯＨ^-）を供給し、上記と同様に操作すればよく、上記と同様の妨害電流応答のない測定が可能である。
【００２７】
以上のように、本発明においては、ｐＨスタット法を用いることにより、単純な１酵素を用いる電流検出が可能になる。さらに、フローインジェクション法を用いて２経路にすることで妨害物質の影響も受けなくなった。更にシステム化を行うことで大量サンプル連続測定が可能である。したがって、表１の理想的な検出を行うことができる。
【００２８】
本発明における適用デバイスとして、緊急用のアナライザーやパーソナル用のアナライザーに照準を措いている。本センシングシステムは、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）によりセンシングを行っていることから、バッチシステムのような不連続操作とは異なり、定常状態のほか非定常状態でも測定を行うことが可能である。従って、より迅速な測定を実現出来るシステムになりうると考えられる。さらに自動化も行えるので、実用性の高いシステムであると言える。
【００２９】
また、実用化のためには、検査時間の短縮と検査サンプルの少量化である。例えば、現在は１０から１５分間要してしまう検査時間を２から３分程度に短縮する必要があるが、上記検出セルによれば、上記混合ゾーンにおいて瞬時の均一混合が行われることから、検査時間の短縮化が可能である。さらに、２ｍｌのサンプルのみならず、数１０μｌ程度の少量でも検出できるものである。
【００３０】
本発明のセンシングシステムは、酵素カラムを用いているためにメンテナンスフリーで長期安定性に優れた分析システムとなり得、さらに専門的な知識・操作が必要でないことに利点がある。ＦＩＡによりセンシングを行っていることから、緊急な場合でも迅速に測定ができ、バックアップ用のセンシングシステムとしての優れた利点も有している。また、小型、軽量、安価なシステム構築が可能なことからパーソナルユース用にも最適である。
【００３１】
一方で、従来の尿素分析は吸光光度計による分析が一般的なために、サンプル測定に際して前処理を施す必要があり、さらに、装置も大きく、重く、高価であることが挙げられる。このため、多くのサンプルを一度に測定する病院や分析センターのような場所での使用には最適であるが、緊急用の測定や専門的な知識や技術を有していない個人的な使用には適していない。それゆえ、医療や食品等の各分野において、尿素等のセンシングを緊急かつ簡便に測定可能なシステム構築が望まれている。しかしながら、従来の尿素分析システムではその要求には応じられない。これに対し、本発明のシステムによれば、以上のような尿素のセンシングに対する要求に応じるばかりでなく、今後高まるセンシングに対する要望に応えることが可能で、酵素カラムの固定化酵素を変えることによりｐＨ変動を伴う反応すべてに適応可能な、汎用性の高いバイオセンシングシステムといえるものである。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例により本発明につき更に具体的に説明する。なお、以下の実験は図２〜６の検出セルを用いて図１に示すシステムで行った。この場合、セル本体としては、５７ｍｍ×５０ｍｍ×高さ２５ｍｍの大きさのものを用い、内部が透視し得るようにアクリル樹脂を用いて作製した。また、多孔体としてはポリエチレン系のものを用いた。その大きさは、長さ約２５ｍｍ、幅約４ｍｍ、厚さ１．６ｍｍであった。
【００３３】
[実施例１]
電解液として０．１ＭＮａ₂ＳＯ₄水溶液を用いると共に、試料液として０．１ＭＮａ₂ＳＯ₄を含む１０ｍＭＰＢＳを用い、疑似尿素としてＮａＯＨをアルカリ試料とした。このため、この実験では固定化酵素カラムは使用していない。
【００３４】
上記検出セル（ＦＥＴセル）を用いてシステムの最適化の検討を行い、電解液２００μｌ／ｍｉｎ、試料液２００μｌ／ｍｉｎが最適流量であることがわかった。最適化した流量値にてアルカリ試料を用いてｐＨスタットシステムの動作確認を行った結果、アルカリ濃度に対する電流応答は図７に示すように直線性を示した（相関係数０．９９１）。これよりｐＨスタットシステムが予期したとおりに機能することを確認でき、本システムヘの尿素測定の適用が可能であると考えられた。
【００３５】
尿素の長期間測定には固定化酵素が長期間測定可能であること及び本システムの安定性が必要とされる。そこで、図８に示すように１２６μＭアルカリ試料を繰り返し注入し、本システムのｐＨスタット応答再現性について調べた。その結果、３０回の連続アルカリ電流応答に対し、一定した応答を示し（相対標準偏差４．３５％）、本システムが長期間測定において安定して動作することを確認できた。以上の結果より、開発したｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムは、固定化酵素が長期間に活性を保持するのであれば、尿素の長期間測定が可能であることがわかった。
【００３６】
以上のように、ｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムの開発を行い、下記の知見を得た。
（１）溶液の混合を十分に行うために混合ゾーンを設け信頼性を向上した。
（２）アルカリ濃度に対する電流応答は直線性を示した（相関係数０．９９１）のでセンシングシステムとして十分な特性を得ることができた。
（３）３０回の繰り返しアルカリ電流応答に対し、一定した応答を示し（相対標準偏差４．３５％）、長期間安定であることを確認した。
【００３７】
[実施例２]
酵素固定化カラムとして、内部に開発したｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステム〔４〕内の酵素固定化カラム中には、ウレアーゼ（９９ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、ナタ豆由来）が多孔質ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ：ＭｅａｎＰｏｒｅＤｉａ．２４６Å）に固定化され、充填されているものを用いた。尿素の加水分解時の水素イオン（Ｈ⁺）の消費量を、ジェネレーション電極（Ｇ．Ｅ．）において水の電気分解により生じる水素イオン（Ｈ⁺）を供給することにより、下流のＩＳＦＥＴに流入する溶液のｐＨすなわち電位を一定に保ち、このようにＩＳＦＥＴにて感知される電位を一定に保つために必要である電気分解量（印加電流値）を尿素電流応答とみなし、尿素濃度との比例関係を利用して試料中の尿素を検出した。
【００３８】
図９に、センシングシステム中の酵素カラムに充填した固定化酵素の長期間安定性について調べた結果を示す。図９より、酵素ウレアーゼは尿素試料２０４回の測定を行った後も、尿素電位応答が一定（相対標準偏差：５．６１％、ｎ＝２０４）であることから、尿素連続測定において酵素が活性を保っていることが分かった。
【００３９】
電流応答の再現性を調べた結果、図１０のように、１５回の連続尿素電流応答に対し、４０μＡの一定した応答を示した（相対標準偏差：５．６４％、ｎ＝１５）。前述のように２０４回の連続測定において酵素活性が失活しないことから、連続尿素電流応答も非常に再現性よく、長期的に安定して得られると考えられる。
【００４０】
そこで、次に尿素濃度を１００〜８００μＭに変化させて電流応答を測定した（図１１）。これより、尿素−電流応答間に良好な直線性が得られていることが分かった。尿素含有生体試料を２０倍希釈して用いると、１００〜８００μＭの直線範囲内で定量可能である。
【００４１】
次に、尿素の電流応答を妨害する物質の代表例として考えられるアスコルビン酸について検討を行った。アスコルビン酸の生体中濃度は、上限値約４００μＭであるが、本検討では約２０倍希釈したものを試料として用いるため、約２０μＭのアスコルビン酸共存下において尿素電流応答に影響を受けなければよいことになる。表２より、１００μＭ尿素＋２０μＭアスコルビン酸試料において、アスコルビン酸は尿素電流応答に影響を及ぼさないことが確認できた。
【００４２】
【表２】

【００４３】
そこで、１００μＭ尿素サンプル中のアスコルビン酸濃度を増大させていき、尿素電流応答に影響を与えない上限値を調べた。その結果、表３のようにアスコルビン酸は尿素との共存濃度を５０μＭまで上昇させても、尿素電流応答に影響を与えないことが分かった。
【００４４】
【表３】

【００４５】
６０μＭ以上の濃度における尿素電流応答の減少は、アスコルビン酸を添加することで試料のｐＨが下がるために、アルカリ側への尿素電流応答が妨害されるものと考えられる。
【００４６】
リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の緩衝作用により、アスコルビン酸の添加による試料ｐＨの低下を軽減する、という観点から、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の濃度を５０ｍＭに変え、１０ｍＭの場合との検出応答電位上限値との比較を行った。
【００４７】
表４の結果より、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の場合、アスコルビン酸濃度が６０μＭで電位変化を生じてしまうが、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）においては、緩衝液の緩衝作用により９０μＭまで、電位変化を生じないことが明らかとなった。よって、表２、３、４の結果より、作製した尿素センサーは実試料の測定においても、妨害物質の影響を受けることなく、尿素の検出が可能であると考えられる。
【００４８】
【表４】

【００４９】
以上のことから、ｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムの尿素分析への応用を検討した結果、尿素濃度１００−８００μＭで直線性が保たれ、妨害物質の影響も受けないことが確認された。本システムを用いることにより、有効な尿素の検出が行なえることを確認した。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の検出セルは、ｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムに好適に用いられ、優れた応答信頼性を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るｐＨスタット型フローアンペロメトリックセンシングシステムの説明図である。
【図２】本発明の一実施例に係る検出セルの概略を示す分解斜視図である。
【図３】同検出セルの平面図である。
【図４】同検出セルの底面図である。
【図５】同検出セルの右側面図である。
【図６】同検出セルの正面図である。
【図７】アルカリ試料液に対する電流応答値を示すグラフである。
【図８】１２６μＭＮａＯＨに対するｐＨスタット応答の長期安定性を示すグラフである。
【図９】固定化ウレアーゼの長期安定性を示すグラフである。
【図１０】１００μＭ尿素に対する電流応答の長期安定性を示すグラフである。
【図１１】尿素濃度に対する電流応答を示すグラフである。
【符号の説明】
Ａ試料流路部
Ｂ電解液流路部
Ｃ検出セル
１０試料液容器
１１試料液管
１２ポンプ
１３インジェクションバルブ
１４サンプルループ
１５酵素固定化カラム
２０電解液容器
２１電解液管
２２ポンプ
２３電解セル
２４塩橋又は隔膜
２５イオン発生室
２６対極室
２７ジェネレーション電極
２８カウンター電極
３１セル本体
３２試料液流路孔
３３電解液流路孔
３４流下路孔
３５混合液排出流路孔
３６参照電極挿入孔
３７取付孔
４１天板
４２通液性多孔板
４３混合ゾーン
５１ガスケット
５２長孔
５３混合液流通路
５４ＩＳＦＥＴ
５５支持板
５６参照電極

Claims

試料液が流れている流路に所用物質を注入し、試料液を酵素に接触させて、この試料液中の所用物質を酵素反応させると共に、この試料液流路とは別の流路において所用の電解液を電気分解することにより水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を発生させた電解液を流し、上記酵素反応によりｐＨ変化が生じた試料液と、上記水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を含む電解液とを混合し、上記ｐＨ変化が生じた試料液を中和して、上記ｐＨ変化が生じた試料液のｐＨを初期のｐＨで一定に保つのに要する上記電気分解の電流値を指標として上記試料液中の所用物質の濃度を測定するフローインジェクション分析による酵素センシングにおける検出セルであって、
上記試料液が流れる流路と、上記水素イオン（Ｈ⁺）又は水酸化物イオン（ＯＨ^-）を含む電解液が流れる流路と、これら両流路と連通し、上記両液が乱流状態で混合される混合ゾーンと、この混合ゾーンと連通し、上記両液の混合液のｐＨを測定するｐＨ測定部と、このｐＨ測定部に連通し、上記混合液をｐＨ測定部から排出する排出流路とを備えたことを特徴とする検出セル。
混合ゾーンが、内部連通空間を有する通液性の多孔体、不織布又は織布の配設により形成されている請求項１記載の検出セル。
上記ｐＨ測定部に、混合液のｐＨを測定するためのＩＳＦＥＴを備える請求項１又は２記載の検出セル。
請求項１乃至３のいずれか１項記載の検出セルと、上記検出セルの試料液流路と連通する試料流路部と、該試料流路部の一端と連通する試料液容器と、上記検出セルの電解液流路と連通する電解液流路部と、該電解液流路部の一端と連通する電解液容器とを備え、
上記試料流路部が、一端が上記試料液容器に連通し、他端が上記検出セルに連結された試料液管に、上流側から下流側にかけてポンプ、インジェクションバルブ、及び酵素固定化カラムが介装されてなり、
上記電解液流路部が、一端が上記電解液容器に連通し、他端が上記検出セルに連結された電解液管に、上流側から下流側にかけてポンプ及び電解セルが介装されてなることを特徴とする酵素センシングシステム。
上記電解セルが、イオン発生室と対極室とに分離され、上記イオン発生室に電解液を電気分解するジェネレーション電極が配設され、上記対極室にカウンター電極が配設されて、両電極がポテンショスタットに接続されると共に、上記検出セルのｐＨ測定部に参照電極が配設されて、上記ポテンショスタットの印加電流値を上記電気分解の電流値として上記試料液中の所用物質の濃度を測定するように構成してなる請求項４記載の酵素センシングシステム。