JP4644363B2

JP4644363B2 - Cellulase preparation stabilized by inorganic salt and method for producing the same

Info

Publication number: JP4644363B2
Application number: JP2000390180A
Authority: JP
Inventors: 弘一郎村島; 智子西村; 右一佐藤; 仁一郎古賀; 敏明河野
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2011-03-02
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: JP2002186479A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、加工、貯蔵時においてセルラーゼが安定化された固体セルラーゼ
調製物とその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セルラーゼは、その特性を活かしてさまざまな産業分野で利用されている。具体的な利用分野の一つは繊維加工分野であり、特にセルロース含有繊維に所望の特性を与えるための処理がなされている。すなわち、セルロース含有繊維の肌ざわり及び外観を改善するために、そして、着色されたセルロース含有繊維に色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」様外観を与える「バイオウオッシュ」のためにセルラーゼが使用されている。また、近年では木材パルプ由来のセルロースを有機溶媒に溶解して紡糸する再生セルロース系繊維であるリヨセルが、その強度や吸水性等の性質、さらには環境汚染を起こしにくい製造法から注目を集めているが、その製造工程で発生する織物表面の毛羽を除く加工にセルラーゼが用いられている。
【０００３】
従来、セルラーゼは複数の酵素の共同作用によりセルロースを分解する作用があるとされてきた。近年、蛋白分離技術や遺伝子技術の進展により、複合酵素であるセルラーゼから、上記の繊維加工に適した酵素成分を分離し製造する試みがなされている。とりわけ、糸状菌のトリコデルマ(Trichoderma)属、フミコーラ(Humicola)属由来のセルラーゼについては研究が進み、フミコーラ属では、ＣＢＨＩ、ＥＧＶ、ＮＣＥ４、ＮＣＥ２などが、トリコデルマ属では、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩなどの成分が単離され、遺伝子操作によって過剰発現酵素やモノコンポーネント酵素などを調製することにより、種々の特定セルラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物が製造されるようになってきた。
【０００４】
また、従来からセルラーゼを利用するためにさまざまな手法の製剤化が行われてきた。一般的には、セルロースを分解する能力を有する微生物を液体培養し、その培養濾過液や膜濾過液を噴霧乾燥や凍結乾燥などの手法により粉末製剤としたり、添加物を加えて液体製剤とする方法などがある。さらに、粉末製剤を無機塩や土などに混ぜ込んで造粒加工して粒状製剤とする方法もある。
【０００５】
さらに、製剤化した酵素を安定化する方法についても検討され、培養濾過液や膜濾過液に合成高分子等を主成分とする酵素安定化剤や防腐剤を添加する試みがなされている。例えば、特許３００９６９２号では、水溶性ポリマーを用いた安定化水性酵素分散液を開示しているが、多種類セルラーゼ成分を含む混合セルラーゼ液状製剤を安定化させるものであって、特定のセルラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物の安定化については何ら開示がない。また、特開平９−１５４５７６号では塩で安定化させた酵素配合物を開示しているが、添加する塩の種類によっては酵素の加工安定性や貯蔵安定性は低下している。そのため、添加物による酵素の安定化においては、各々の酵素成分ごとに適切な添加物の組合せを十分に検討する必要がある。
【０００６】
近年の技術の進展により得られるようになった特定のセルラーゼ成分を多量に含有するセルラーゼ調製物は、従来の混合セルラーゼ製剤と比較して著しく安定性が低い。そのため、製剤化する工程中、あるいは製剤後や製剤をさらに加工した後の貯蔵期間中における酵素活性の損失が特に問題となっている。そのため、商業的に安定なセルラーゼ酵素製剤を調製するために、従来よりも高い安定性が得られ、かつ簡便で経済的な安定化法の開発が望まれてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特定のセルラーゼ成分を含有するセルラーゼ調製物を、簡便かつ経済的に安定化する手法の開発を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、種々の化合物を液体状態のセルラーゼの溶液に添加後、噴霧乾燥して得られたセルラーゼ粉末調製物の加工安定性と貯蔵安定性を評価した。その結果、フミコーラ属セルラーゼの繊維加工に有効な酵素成分である国際公開第ＷＯ９８／０３６４０に記載されたエンドグルカナーゼＮＣＥ４を多量に含む溶液に、塩化カルシウムなどの二価のカチオンからなる無機塩を特定量添加することによって安定性が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は
(１)下記の成分を含む安定化された固体セルラーゼ調製物。
ａ）エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の10重量％以上含有する。
ｂ）ニ価カチオンと塩化物からなる無機塩をエンドグルカナーゼ重量の90重量％以上含有する。
(２)二価のカチオンと塩化物からなる無機塩が、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化ストロンチウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛のいずれかである、(１)記載の固体セルラーゼ調製物。
【００１０】
(３)エンドグルカナーゼがフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ４もしくはＮＣＥ５、接合菌由来のエンドグルカナーゼRCE I、RCE II、RCEIII、MCE I、MCE II、もしくはPCEIのいずれかである、(１)または(２)のいずれか一項に記載の固体セルラーゼ調製物。
【００１１】
(４)エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の10重量％以上含有するセルラーゼ溶液に、二価カチオンと塩化物からなる無機塩をエンドグルカナーゼ重量に対して9０重量％以上添加し、乾燥することを特徴とする安定化された固体セルラーゼ調製物の製造方法
に関する。
【００１２】
本発明は、繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされるセルラーゼの安定性を高める方法を提供するものである。本発明は、繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされるセルラーゼの培養濃縮液及び加工液に二価カチオンの塩化物塩を有効量添加することを特徴とし、その後乾燥させて得られたセルラーゼ酵素乾燥粉末は、乾燥工程での失活が抑制され、保存安定性が向上する。また、得られた乾燥粉末を原料にして加工操作性に優れる粒状製剤を製造する際は、製造工程での失活が抑制され、貯蔵時の安定性が向上する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明が適用できるセルラーゼ酵素は、繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされる特定の成分、及び特定の成分を多量に含むものである。特定の成分とは、例えば国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号記載の成分、国際公開第ＷＯ９４／２１８０１号記載の成分、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号記載の成分などで、糸状菌やグラム陽性棹菌由来のセルラーゼ成分であるエンドグルカナーゼ（以下ＥＧと略す）、セロビオヒドラーゼ（以下ＣＢＨと略す）を挙げることができる。
【００１４】
更に詳しくは、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号記載のフミコーラ属由来のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４、特願２０００−１５０４６３記載のＮＣＥ５、国際公開第ＷＯ00/24879号記載の接合菌由来のエンドグルカナーゼであるRCE I、RCE II、RCEIII、MCE I、MCE II、及びPCEIなどである。
【００１５】
ＮＣＥ４については、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号の記載に従い、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１にＮＣＥ４エンドグルカナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＥＧＤ０１(図１)を導入することによって得られた形質転換体を培養することにより得られる。なお、上記プラスミドｐＥＧＤ０１を導入した大腸菌はＦＥＲＭ BP−5973(原寄託：ＦＥＲＭ P−１５７２９、原寄託日：1996年7月12日)の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１６】
また、上記フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１は、ＦＥＲＭ BP−5977(原寄託：ＦＥＲＭ P−１５７３６、原寄託日：1996年7月15日) の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１７】
ＮＣＥ５については、特願２０００−１５０４６３の記載に従い、前述のフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）ＭＮ２００−１の培養液から精製することにより得られる。すなわち、(Ｎ)培地でフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を培養し、得られた培養液をSource PHEカラム、Source ISOカラム、SP SepharoseFFカラム、Mono Sカラムを用いて分画し、綿毛羽除去活性を示す画分を採取する。最終的に、SDS−PAGEにて約25kDaを示す単一成分であるＮＣＥ５が得られる。またはフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１にＮＣＥ５エンドグルカナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドpJND−c5を導入することによって得られた形質転換体を培養することにより得られる。すなわち、特願２０００−３５４２９６号に記載のように、プラスミドpM21を用いて、遺伝子組換えによりプラスミドpM21−m−A1を作製し、プラスミドpMKD01(pMKD01で形質転換された大腸菌JM109株：FERM BP−5974)と連結したpJD01を作製する。特願２０００−１５０４６３の記載に従い、pJD01とプラスミドpNCE5Bam(pNCE5Bamで形質転換された大腸菌JM109株：FERM BP−7138)とを連結した発現プラスミドpJND−c5を作製し、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１に導入した形質転換体を得る。この形質転換体を培養し、ＮＣＥ５増強品が得られる。
【００１８】
このフミコーラ・インソレンス由来のエンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、セルロース含有繊維の毛羽立ち、肌触りや外観を改善する活性、及び着色セルロースの色の澄明化や色の局所的変化を提供する活性、紙パルプの濾水性を改善する活性を有する。また、分子量が約２５ kDaと小さく、かつ、セルロース結合部位(CBD)が構造中に存在しないというフミコーラ由来のファミリ−45に属するエンドグルカナーゼとしては例がない構造を有している。
【００１９】
接合菌としては、国際公開第ＷＯ00/24879号に記載されているように、リゾプス・オリゼー(ＦＥＲＭＢＰ−６８８９の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託)、ムコール・サーシネロイデス(ＦＥＲＭＢＰ−６８９０の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託)及びファイコマイセス・ニテンス(ＦＥＲＭＢＰ−６８９１の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託)が代表的である。
【００２０】
また、セルラーゼは分子構造上共通の組成を持つことが知られている。すなわち、セルラーゼを基質であるセルロース上に集中させて反応の効率を向上させるセルロースバインディングドメイン（以下ＣＢＤと略す）、セルロースを加水分解する活性部位（以下ＣＡＤと略す）、ＣＡＤとＣＢＤを連結させるリンカー部位である。また、一次構造の共通性から、糖分解酵素を分類したアンリサットらの分類（Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 280:309-316(1991).、Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293:781-788(1993).等）に従えば、以上のエンドグルカナーゼ群は、ファミリー４５のエンドグルカナーゼに属する。すなわち、本発明の安定化方法は、特にファミリー４５に属するエンドグルカナーゼに有効である。
【００２１】
本発明において、エンドグルカナーゼはエンド−β−１，４−Ｄ−グルカナーゼを指すものである。
上述の繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされる高活性エンドグルカナーゼを多量に含むセルラーゼは、遺伝子操作による過剰発現により、培養、調製することができ、本発明で好ましいエンドグルカナーゼの含有量は、全蛋白質重量の１0重量％以上といえる。また、セルラーゼ調製物に含まれる好ましいエンドグルカナーゼの含有量は、全蛋白質重量の１0重量％以上といえる。
【００２２】
例えば、ＮＣＥ４含有セルラーゼ培養物の場合、エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の１０重量％未満の場合は、貯蔵により活性がほとんど失活しないために、二価カチオンの塩化物塩の安定化効果がほとんど認められない。しかしながら、エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の１０重量％以上になると、貯蔵による活性の失活が生じてくるために、二価カチオンの塩化物塩の安定化効果が認められてくる。
【００２３】
セルラーゼを含む溶液中、およびセルラーゼ調製物中におけるエンドグルカナーゼの全蛋白質重量中の重量％は以下の方法により決定することができる。まず、全蛋白質重量は、蛋白質量標準として牛血清アルブミンを用いたブラッドフォード法で決定することができる。より具体的には、バイオラッドラボラトリー社より販売されているプロテインアッセイキットを用い決定することが好ましい。
【００２４】
次に、セルラーゼ調製物に含まれるエンドグルカナーゼの重量は、例えば前述のＮＣＥ４においては、セルラーゼ調製物のCMCアーゼ活性を精製ＮＣＥ４のCMCアーゼ活性で割った値に精製ＮＣＥ４の重量を乗じた値として求めることができる。ここで、精製ＮＣＥ４の蛋白質重量は、国際公開第WO98/03640号記載の方法でフミコーラ・インソレンス培養液から単離精製したものを、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）により求めることができる。（蛋白質量標準として牛血清アルブミンを用いる。）また、CMCアーゼ活性は、セルラーゼ酵素、１％のカルボキシメチルセルロース（CMC、東京化成工業株式会社製）、および５０ｍM酢酸ナトリウムバッファー（ｐH６）を含んだ１ｍｌの溶液にて、５０℃で３０分間反応させた後、遊離してくる還元糖量を測定することにより求めることができる。この場合、１分間に１μmolのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
【００２５】
本発明が適用できるセルラーゼ調製物は、その製造過程により定義することが可能である。微生物由来セルラーゼ調製物は、通常、以下の方法で調製できる。セルラーゼ生産微生物や繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされる特定のセルラーゼ成分の遺伝子を過剰発現させた形質転換体を、前記セルラーゼ成分の製造に適した培地で培養し、得られた培養液を適切な方法で除菌する。除菌方法の一例として、フィルタープレスなどの濾過機を用いた濾過や遠心分離機を用いた除菌を挙げることが出来る。得られた除菌液に適切な防腐剤や酵素安定化剤などの化学物質を加えた後、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、流動層乾燥、及びマイクロ波乾燥などの手法を用いて水分を除去、乾燥させ、セルラーゼ酵素粉末を得ることが出来る。除菌液は、一般的な限外濾過法等の手法を用いて濃縮した後、以降の操作を行うことも可能である。得られたセルラーゼ酵素粉末は、ベントナイトなどの鉱物や硫酸曹達に代表される無機の塩類、セルロース末、スターチなどの天然高分子などと混合し、水、天然高分子、合成高分子などを結着剤やバインダーとして用いて、押し出し造粒、熱溶融造粒、転動造粒など一般的に粒剤を製造する際に用いられる方法を用いて粒剤や造粒剤に加工することができる。さらに、このようにして得られたセルラーゼ酵素粉末、及び粒剤、造粒剤に他の添加物を混合し、それぞれの産業用途に適した組成、形態に加工した組成物を調製することができる。本発明における固体セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素粉末、粒剤、造粒剤、及びこれらに添加物を混合してさらに加工した組成物をいう。
【００２６】
本発明では、上述の培養液、除菌液（濾過液、遠心分離上清、濃縮液含む）及び酵素粉末を再溶解させた溶液のようなセルラーゼを含む溶液に対して、二価カチオンの塩化物塩を添加することにより、噴霧乾燥、凍結乾燥する際に生じる繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされる特定成分セルラーゼの失活を防止し、貯蔵安定性が向上する。
【００２７】
本発明に用いることのできる二価カチオンの塩化物塩は、使用目的により安定化度合い、毒性、溶解性を勘案し、通常入手可能な化合物を選択して使用することができる。また、無水塩、結晶水を含む塩いずれをも用いることが可能である。詳しくは、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化ストロンチウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛をあげることができる。
【００２８】
本発明でセルラーゼを含む溶液中に添加される二価カチオンの塩化物塩の濃度は、好ましくは、エンドグルカナーゼ重量の90重量％以上といえる。また、セルラーゼ調製物に含まれる好ましい二価カチオンの塩化物塩の濃度は、エンドグルカナーゼ重量の90重量％以上といえる。
【００２９】
本発明の固体セルラーゼ調製物の安定性は、以下のようにして確認することができる。すなわち、前述のセルラーゼ調製物をビニール袋を二重にした袋に封入し、40℃で３ヶ月間保存し、残存する酵素活性をデニム染めセルロース繊維の脱色活性により評価する。デニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価方法は、20kgワッシャー（三洋電機株式会社製全自動洗濯機 SCW5101）中に、糊抜きした 12オンスのブルージーンズパンツを入れ、水道水を用いて調製した6.7mMリン酸緩衝液(pH6.2)15Ｌと前記セルラーゼ調製物からなる処理液、ゴムボールを適当量加え、55℃、60分間脱色処理を行う。処理後のブルージーンズパンツの脱色度は、分光測色計（ミノルタ社製 CM-5251）を用い、Lａｂ表示系のＬ値（明度）で評価する。コントロール（脱色処理をしていないブルージーンズパンツ）に対する脱色処理後のブルージーンズパンツのＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価する。すなわち、各試験区につき10点のΔＬ値を測定し（ｎ＝10）、その平均値を算出し、ΔＬ値＝７となるのに必要なセルラーゼの重量を基準に、脱色度からセルラーゼ活性の残存度％を算出する。
（活性の残存度％）＝（保存前サンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラーゼ重量）／（保存後サンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラーゼ重量）×100
活性の残存度％の数値が高い試験区は、安定性が高いといえる。
【００３０】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
(実施例１) 非組換え株由来のセルラーゼと特定成分酵素を過剰発現させたセルラーゼの安定性比較
フミコーラ・インソレンスＭＮ200−１株（非組換え株）と国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号に記載のエンドグルカナーゼNCE4を過剰発現させたフミコーラ・インソレンス株それぞれを5.0 ％アビセル、2.0 ％酵母エキス、0.1 ％ポリペプトン、0.03 ％塩化カルシウム、0.03 ％硫酸マグネシウムを含むpH 6.8に調整した液体培地に接種し、培養し得られた培養液を、遠心分離（7,000 r.p.m.、20分間）し除菌体後、培養上清液を限外濾過機を用いＢｒｉｘ15 %まで濃縮した。
それぞれの膜濃縮液に、膜濃縮液固形重量と同じ重量の乳糖を溶解添加し、凍結乾燥し酵素粉末を得た。得られた粉末各々を、ビニール袋を２重にした袋に封入し、40℃で３ヶ月間保存し、残存する酵素活性をデニム染めセルロース繊維の脱色活性により評価した。
【００３１】
デニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価方法：
糊抜きした 12オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理をした。
試験機械：20kgワッシャー（三洋電機株式会社製全自動洗濯機 SCW5101）
温度：55℃
時間：60分
pH：6.2
処理液：水道水を用いて調製した6.7mMリン酸緩衝液15Ｌに、セルラーゼ調製液とともにゴムボールを適当量加えた。
【００３２】
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製 CM-5251）を用い、Lａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（脱色処理をしていないブルージーンズパンツ）に対する脱色処理後のブルージーンズパンツのＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき10点のΔＬ値を測定し（ｎ＝10）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝７となるのに必要なセルラーゼの重量を基準に、脱色度からセルラーゼ活性の残存度％を算出した。
（活性の残存度％）＝（保存前サンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラーゼ重量）／（保存後サンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラーゼ重量）×100
【００３３】
以上の値を用い、フミコーラ・インソレンスＭＮ200−１株由来のセルラーゼ（非組換え株由来）と、国際公開第WO９８／０３６４０号記載のフミコーラ・インソレンス株をホストとし特定成分酵素(具体的にはＮＣＥ４)を過剰発現させたセルラーゼの安定性を比較した結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】

【００３５】
以上表１に示したように、同様の製造過程を経た非組換え株由来セルラーゼと過剰発現ＮＣＥ４では、40℃、３ヶ月保存でのジーンズ脱色活性の残存活性に約39 ％の差異を生ずることがわかった。すなわち、繊維加工に有用な成分であるＮＣＥ４を多量に含む調製品(エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の約３３重量％)は、複数のセルラーゼ成分を含む非組換え株酵素(エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の１０重量％未満)よりも保存安定性が著しく低い傾向がみられた。
【００３６】
(実施例２) 無機塩を添加したNCE4セルラーゼの粉末の保存安定性
国際公開第WO９８／０３６４０号記載のＮＣＥ４を過剰発現させたフミコーラ・インソレンスを5.0 ％アビセル、2.0 ％酵母エキス、0.1 ％ポリペプトン、0.03 ％塩化カルシウム、0.03 ％硫酸マグネシウムを含むpH 6.8に調整した液体培地に接種し、培養し得られた培養液を、遠心分離（7,000 r.p.m.、20分間）し除菌体後、培養上清液を限外濾過機を用いＢｒｉｘ15 %まで濃縮し、得られた濃縮液を用い試験を行った。無機塩を含有する酵素粉末は、上の濃縮液１mlに0.1M各種無機塩溶液１ml、脱イオン水３mlを混合後、凍結乾燥を行い調製した。得られた酵素粉末を密閉容器に入れ、120℃、24時間保存後、ジーンズ脱色活性を測定し、保存前後のΔLを測定し、セルラーゼの安定化効果を評価した。この結果を表２に示した。ここで、120℃、24時間の保存試験は常温での長期保存試験を加速するために行った。
【００３７】
【表２】

【００３８】
表２より、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化ストロンチウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛など二価カチオンの塩化物塩に顕著なセルラーゼ安定化効果が確認できた。
【００３９】
(実施例３) 保存安定性の増したＮＣＥ４セルラーゼ調製に必要な塩化カルシウム量
実施例２記載の方法に基づき、ＮＣＥ４セルラーゼの培養濃縮液を得た。得られた濃縮液１mlに、濃縮液の含有するセルラーゼ重量を基準に、種々の濃度の塩化カルシウム溶液１mlと脱イオン水３mlを混合後凍結乾燥し、種々の濃度の塩化カルシウムを含有するＮＣＥ４セルラーゼ酵素粉末を得た。得られたセルラーゼ酵素粉末は、密封後120℃、24時間保存し残存ジーンズ脱色活性を評価した。この結果を表３に示した。
【００４０】
【表３】

【００４１】
この結果、塩化カルシウムをＮＣＥ４セルラーゼ重量の90％以上添加し得られたＮＣＥ４セルラーゼ粉末は、無添加セルラーゼに比べ格段に安定性に優れると結論できる。
【００４２】

【００４３】
上記の原材料を混合後、10 ％の水を添加し混錬する。混錬物をディスクペレッターに送り成形加工する。得られた射出物をマルメライザー（不二パウダル社製）を用い粒状とし、乾燥、篩かけし造粒物を得た。上記調製物中には、二価カチオンの塩化物塩として塩化マグネシウムをエンドグルカナーゼ重量に対して約110重量％、エンドグルカナーゼを全タンパク質重量中約33％含有する。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によって、エンドグルカナーゼの含量が多い固形セルラーゼ調製物の貯蔵安定性を改善することができ、流通や在庫中の貯蔵における失活を抑制し、経済的損失を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発現プラスミドｐＥＧＤ０１を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a solid cellulase preparation in which cellulase is stabilized during processing and storage, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Cellulase is used in various industrial fields by taking advantage of its characteristics. One specific application field is the fiber processing field, and in particular, a treatment for imparting desired properties to cellulose-containing fibers is performed. Cellulase for improving the texture and appearance of cellulose-containing fibers and for “biowash” that gives colored cellulose-containing fibers a “stone wash” -like appearance that provides local changes in color Is used. In recent years, lyocell, a regenerated cellulosic fiber in which wood pulp-derived cellulose is dissolved and spun in an organic solvent, has attracted attention because of its strength and water absorption properties, as well as the manufacturing method that is less likely to cause environmental pollution. However, cellulase is used for processing to remove the fluff on the surface of the fabric generated in the manufacturing process.
[0003]
Conventionally, cellulase has been considered to have an action of decomposing cellulose by the joint action of a plurality of enzymes. In recent years, attempts have been made to separate and produce enzyme components suitable for fiber processing from cellulase, which is a complex enzyme, with the progress of protein separation technology and genetic technology. In particular, cellulases from the genus Trichoderma and Humicola have been studied. In the genus Humicola , CBHI, EGV, NCE4, NCE2 and the like are in genus Trichoderma. Thus, cellulase preparations containing a large amount of various specific cellulase components have been produced by preparing overexpressed enzymes, monocomponent enzymes and the like by genetic manipulation.
[0004]
Conventionally, various techniques have been formulated to use cellulase. In general, a microorganism having the ability to decompose cellulose is liquid-cultured, and the culture filtrate or membrane filtrate is made into a powder preparation by a technique such as spray drying or freeze drying, or an additive is added to make a liquid preparation. There are methods. Furthermore, there is also a method in which a powder preparation is mixed with an inorganic salt or soil and granulated to form a granular preparation.
[0005]
Furthermore, a method for stabilizing a formulated enzyme has also been studied, and an attempt has been made to add an enzyme stabilizer or preservative mainly composed of a synthetic polymer to a culture filtrate or a membrane filtrate. For example, Japanese Patent No. 3009692 discloses a stabilized aqueous enzyme dispersion using a water-soluble polymer, which stabilizes a mixed cellulase liquid preparation containing many types of cellulase components. There is no disclosure of stabilization of cellulase preparations containing large amounts. JP-A-9-154576 discloses an enzyme compound stabilized with a salt, but depending on the type of salt added, the processing stability and storage stability of the enzyme are reduced. Therefore, in stabilization of the enzyme by an additive, it is necessary to fully consider an appropriate combination of additives for each enzyme component.
[0006]
Cellulase preparations containing a large amount of specific cellulase components that have become available as a result of recent technological advances are significantly less stable than conventional mixed cellulase preparations. Therefore, the loss of enzyme activity is particularly problematic during the preparation process, or after storage or during the storage period after further processing of the preparation. Therefore, in order to prepare a commercially stable cellulase enzyme preparation, it has been desired to develop a stabilization method that is more stable than before and that is simple and economical.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object to develop a method for stabilizing a cellulase preparation containing a specific cellulase component conveniently and economically.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The inventors evaluated the processing stability and storage stability of cellulase powder preparations obtained by spray drying after adding various compounds to a solution of cellulase in a liquid state. As a result, an inorganic salt composed of a divalent cation such as calcium chloride is identified in a solution containing a large amount of endoglucanase NCE4 described in International Publication No. WO 98/03640, which is an enzyme component effective for fiber processing of Humicola cellulase. It was found that the stability was remarkably improved by adding the amount, and the present invention was completed.
[0009]
That is, the present invention
(1) A stabilized solid cellulase preparation comprising the following components:
a) The endoglucanase is contained at 10% by weight or more of the total protein weight.
b) An inorganic salt composed of a divalent cation and a chloride is contained at 90% by weight or more of the endoglucanase weight.
(2) The solid cellulase preparation according to (1), wherein the inorganic salt composed of a divalent cation and a chloride is any one of calcium chloride, cobalt chloride, nickel chloride, strontium chloride, magnesium chloride, and zinc chloride.
[0010]
(3) The endoglucanase is any of endoglucanase NCE4 or NCE5 derived from Humicola insolens , endoglucanase RCE I, RCE II, RCEIII, MCE I, MCE II or PCEI derived from zygomycetes ( The solid cellulase preparation according to any one of 1) or (2).
[0011]
(4) It is characterized by adding 90% by weight or more of an inorganic salt composed of a divalent cation and chloride to a cellulase solution containing 10% by weight or more of endoglucanase based on the weight of the total protein and drying. It relates to a process for the preparation of a stabilized solid cellulase preparation.
[0012]
The present invention provides a method for enhancing the stability of cellulase, which is effective in fiber processing, paper pulp processing, and detergent applications. The present invention is characterized by adding an effective amount of a divalent cation chloride salt to a cellulase culture concentrate and processing solution that is effective in fiber processing, paper pulp processing and detergent applications, and is obtained by subsequent drying. In addition, the cellulase enzyme dry powder is inhibited from being deactivated in the drying step, and the storage stability is improved. Moreover, when manufacturing the granular formulation which is excellent in processing operativity using the obtained dry powder as a raw material, the deactivation in a manufacturing process is suppressed and the stability at the time of storage improves.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The cellulase enzyme to which the present invention can be applied contains a specific component effective for fiber processing, paper pulp processing and detergent use, and a large amount of a specific component. The specific component is, for example, a component described in International Publication No. WO91 / 17243, a component described in International Publication No. WO94 / 21801, a component described in International Publication No. WO98 / 03640, etc. Endoglucanase (hereinafter abbreviated as EG) and cellobiohydrase (hereinafter abbreviated as CBH).
[0014]
More specifically, NCE4, which is an endoglucanase derived from the genus Humicola described in International Publication No. WO 98/03640, NCE5 described in Japanese Patent Application No. 2000-150463, and RCE, an endoglucanase derived from a zygote described in International Publication No. WO00 / 24879. I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II, and PCEI.
[0015]
For NCE4, culturing the transformant obtained by introducing the expression plasmid pEGD01 (FIG. 1) containing the NCE4 endoglucanase gene into Humicola insolens MN200-1 according to the description in International Publication No. WO 98/03640. Is obtained. Escherichia coli introduced with the plasmid pEGD01 was transferred to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number of FERM BP-5973 (original deposit: FERM P-15729, original deposit date: July 12, 1996). It has been deposited.
[0016]
In addition, the above-mentioned Humicola Insolens MN200-1 is based on the accession number of FERM BP-5977 (original deposit: FERM P-15736, original deposit date: July 15, 1996). Has been deposited.
[0017]
NCE5 can be obtained by purifying from the above-mentioned culture medium of Humicola insolens MN200-1 according to the description in Japanese Patent Application No. 2000-150463. That is, Humicola insolens MN200-1 was cultured in (N) medium, and the obtained culture solution was fractionated using a Source PHE column, Source ISO column, SP Sepharose FF column, Mono S column, and had fluff removal activity. Collect the fractions shown. Finally, NCE5, which is a single component showing about 25 kDa on SDS-PAGE, is obtained. Alternatively, it is obtained by culturing a transformant obtained by introducing the expression plasmid pJND-c5 containing the NCE5 endoglucanase gene into Humicola insolens MN200-1. That is, as described in Japanese Patent Application No. 2000-354296, plasmid pM21 was prepared by gene recombination using plasmid pM21, and plasmid pMKD01 (E. coli JM109 strain transformed with pMKD01: FERM BP- 5974) and pJD01 is prepared. According to the description in Japanese Patent Application No. 2000-150463, an expression plasmid pJND-c5 ligated with pJD01 and plasmid pNCE5Bam (E. coli JM109 strain transformed with pNCE5Bam: FERM BP-7138) was prepared and introduced into Humicola Insolens MN200-1. Obtained transformants. This transformant is cultured to obtain an NCE5-enhanced product.
[0018]
This Humicola insolens-derived endoglucanase enzyme NCE5 is an activity that improves the fluffing, feel and appearance of cellulose-containing fibers, and provides the clarification and local change in color of colored cellulose. Has the activity of improving In addition, it has a structure that is unprecedented as an endoglucanase belonging to Family 45 derived from Humicola, in which the molecular weight is as small as about 25 kDa and the cellulose binding site (CBD) does not exist in the structure.
[0019]
As zygomycetes, as described in International Publication No. WO 00/24879, Rhizopus oryzae (deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology under the accession number of FERM BP-6889), Mucor Sarcineroides (Deposited with the Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology under the accession number of FERM BP-6890) and Phycomyces nitens (under the accession number of FERM BP-6891 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Deposit) is representative.
[0020]
Cellulases are known to have a common composition in terms of molecular structure. That is, a cellulose binding domain (hereinafter abbreviated as CBD) that concentrates cellulase on cellulose as a substrate to improve reaction efficiency, an active site that hydrolyzes cellulose (hereinafter abbreviated as CAD), and a linker that links CAD and CBD. It is a part. Moreover, from the common primary structure, the classification of Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316 (1991). Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788 (1993). It belongs to 45 endoglucanases. That is, the stabilization method of the present invention is particularly effective for endoglucanases belonging to family 45.
[0021]
In the present invention, endoglucanase refers to endo-β-1,4-D-glucanase.
Cellulase containing a large amount of highly active endoglucanase that is effective in fiber processing, paper pulp processing, and detergent applications described above can be cultured and prepared by overexpression by genetic manipulation, and preferably contains endoglucanase in the present invention. The amount can be said to be 10% by weight or more of the total protein weight. Moreover, it can be said that the preferable endoglucanase content contained in the cellulase preparation is 10% by weight or more of the total protein weight.
[0022]
For example, in the case of an NCE4-containing cellulase culture, when the endoglucanase content is less than 10% by weight of the total protein weight, the activity is hardly inactivated by storage. Is hardly recognized. However, when the content of endoglucanase is 10% by weight or more of the total protein weight, the activity is deactivated by storage, and the stabilizing effect of the divalent cation chloride salt is recognized.
[0023]
The weight% of endoglucanase in the total protein weight in the solution containing cellulase and in the cellulase preparation can be determined by the following method. First, the total protein weight can be determined by the Bradford method using bovine serum albumin as a protein mass standard. More specifically, the determination is preferably performed using a protein assay kit sold by Bio-Rad Laboratories.
[0024]
Next, the weight of the endoglucanase contained in the cellulase preparation is, for example, the value obtained by multiplying the CMCase activity of the cellulase preparation by the CMCase activity of the purified NCE4 by the weight of the purified NCE4 in the aforementioned NCE4. Can be sought. Here, the protein weight of purified NCE4 can be obtained by protein assay kit (manufactured by Bio-Rad Laboratories), which is isolated and purified from the Humicola insolens culture solution by the method described in International Publication No. WO98 / 03640. (Bovine serum albumin is used as a protein mass standard.) The CMCase activity was 1 ml containing cellulase enzyme, 1% carboxymethylcellulose (CMC, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), and 50 mM sodium acetate buffer (pH 6). In this solution, after reacting at 50 ° C. for 30 minutes, the amount of reducing sugar released can be measured. In this case, the amount of enzyme that produces a reducing sugar equivalent to 1 μmol of glucose per minute is defined as one unit.
[0025]
A cellulase preparation to which the present invention can be applied can be defined by its production process. A microorganism-derived cellulase preparation can be usually prepared by the following method. Cellulase-producing microorganism, fiber processing, paper pulp processing, obtained by culturing a transformant overexpressing a specific cellulase component gene that is effective for detergent use in a medium suitable for the production of the cellulase component The culture solution is sterilized by an appropriate method. Examples of the sterilization method include filtration using a filter such as a filter press and sterilization using a centrifuge. After adding chemicals such as preservatives and enzyme stabilizers to the obtained sterilization solution, moisture is removed using techniques such as spray drying, freeze drying, reduced pressure drying, fluidized bed drying, and microwave drying. The cellulase enzyme powder can be obtained by removing and drying. The sterilization liquid can be concentrated using a technique such as a general ultrafiltration method, and then the subsequent operation can be performed. The resulting cellulase enzyme powder is mixed with minerals such as bentonite, inorganic salts such as sulfate sulfate, and natural polymers such as cellulose powder and starch to bind water, natural polymers, and synthetic polymers. It can be processed into a granule or a granulating agent by using a method generally used for producing a granule such as extrusion granulation, hot melt granulation, rolling granulation, etc. Furthermore, the cellulase enzyme powder obtained in this way, and granules and granulating agents can be mixed with other additives to prepare compositions processed into compositions and forms suitable for each industrial application. . The solid cellulase preparation in the present invention refers to a cellulase enzyme powder, a granule, a granulating agent, and a composition further processed by mixing these with additives.
[0026]
In the present invention, divalent cation chlorination is performed on a solution containing cellulase such as the above-described culture solution, sterilization solution (including filtrate, centrifugal supernatant, and concentrated solution) and a solution obtained by re-dissolving enzyme powder. By adding a physical salt, inactivation of a specific component cellulase effective in fiber processing, paper pulp processing, and detergent use, which occurs during spray drying and freeze drying, is prevented, and storage stability is improved.
[0027]
The divalent cation chloride salt that can be used in the present invention can be selected from compounds that are usually available in consideration of the degree of stabilization, toxicity, and solubility depending on the purpose of use. In addition, both anhydrous salts and salts containing crystal water can be used. Specifically, calcium chloride, cobalt chloride, nickel chloride, strontium chloride, magnesium chloride, and zinc chloride can be exemplified.
[0028]
The concentration of the divalent cation chloride salt added to the cellulase-containing solution in the present invention is preferably 90% by weight or more of the endoglucanase weight. Moreover, the preferable concentration of the divalent cation chloride salt contained in the cellulase preparation is 90% by weight or more of the endoglucanase weight.
[0029]
The stability of the solid cellulase preparation of the present invention can be confirmed as follows. That is, the above-mentioned cellulase preparation is sealed in a double plastic bag, stored at 40 ° C. for 3 months, and the remaining enzyme activity is evaluated by the decolorization activity of the denim-dyed cellulose fiber. Denim-dyed cellulose-containing fibers were evaluated for decolorization activity in a 20kg washer (Sanyo Electric Co., Ltd. fully automatic washing machine SCW5101). An appropriate amount of a treatment solution consisting of 15 L of a phosphate buffer (pH 6.2) and the cellulase preparation and a rubber ball are added, and decolorization is performed at 55 ° C. for 60 minutes. The degree of decolorization of the blue jeans pants after the treatment is evaluated by the L value (brightness) of the Lab display system using a spectrocolorimeter (CM-5251 manufactured by Minolta). The increase in L value (increase in whiteness) = ΔL value of the blue jeans pants after decoloring treatment relative to the control (blue jeans pants not subjected to decoloring treatment) is obtained, and the degree of decoloration is evaluated based on this ΔL value. That is, 10 ΔL values were measured for each test section (n = 10), the average value was calculated, and the cellulase activity was calculated from the degree of decolorization based on the weight of cellulase necessary to achieve ΔL value = 7. Residuality% is calculated.
(Activity remaining%) = (cellulase weight necessary for ΔL value in sample before storage = 7) / (cellulase weight necessary for ΔL value in sample after storage = 7) × 100
It can be said that the test plot having a high value of the activity remaining% is highly stable.
[0030]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
(Example 1) Stability comparison of cellulase derived from non-recombinant strain and cellulase overexpressing specific component enzyme Fumicola insolens MN200-1 strain (non-recombinant strain) and International Publication No. WO98 / 03640 Inoculate each Humicola insolens strain overexpressing endoglucanase NCE4 in a liquid medium adjusted to pH 6.8 containing 5.0% Avicel, 2.0% yeast extract, 0.1% polypeptone, 0.03% calcium chloride, 0.03% magnesium sulfate. The culture broth thus obtained was centrifuged (7,000 rpm, 20 minutes) and sterilized, and then the culture supernatant was concentrated to Brix 15% using an ultrafilter.
Lactose having the same weight as the solid weight of the membrane concentrate was dissolved and added to each membrane concentrate, and freeze-dried to obtain enzyme powder. Each of the obtained powders was sealed in a double plastic bag, stored at 40 ° C. for 3 months, and the remaining enzyme activity was evaluated by the decolorizing activity of the denim-dyed cellulose fiber.
[0031]
Denim-dyed cellulose-containing fiber decolorization activity evaluation method :
The 12-oz blue jeans pants that had been desizing were decolorized under the following conditions.
Test machine: 20kg washer (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd. fully automatic washing machine SCW5101)
Temperature: 55 ° C
Time: 60 minutes
pH: 6.2
Treatment liquid: An appropriate amount of rubber balls was added together with the cellulase preparation liquid to 15 L of 6.7 mM phosphate buffer solution prepared using tap water.
[0032]
Using a spectrocolorimeter (Minolta CM-5251), the Lab display system L value (brightness) was measured. The increase in L value (increase in whiteness) = ΔL value of the blue jeans pants after decoloring treatment relative to the control (blue jeans pants not subjected to decoloring treatment) was determined, and the degree of decoloration was evaluated based on this ΔL value. That is, 10 ΔL values were measured for each test section (n = 10), and the average value was calculated. Then, based on the weight of cellulase necessary to achieve ΔL value = 7, the residual degree% of the cellulase activity was calculated from the degree of decolorization.
(Activity remaining%) = (cellulase weight necessary for ΔL value in sample before storage = 7) / (cellulase weight necessary for ΔL value in sample after storage = 7) × 100
[0033]
Using the above values, a specific component enzyme (specifically, NCE4) using as a host a cellulase derived from Humicola insolens MN200-1 strain (derived from a non-recombinant strain) and a Humicola insolens strain described in International Publication No. WO98 / 03640. Table 1 shows the results of comparing the stability of cellulases overexpressing).
[0034]
[Table 1]

[0035]
As shown in Table 1 above, cellulase derived from non-recombinant strains and overexpressed NCE4 that had undergone the same production process produced a difference of about 39% in the residual activity of jeans decolorization activity after storage at 40 ° C for 3 months. I understood. That is, a preparation containing a large amount of NCE4 which is a component useful for fiber processing (the content of endoglucanase is about 33% by weight of the total protein weight) is a non-recombinant strain enzyme containing a plurality of cellulase components (endoglucanase There was a tendency that the storage stability was significantly lower than the content of less than 10% by weight of the total protein ) .
[0036]
(Example 2) Storage stability of powder of NCE4 cellulase to which inorganic salt was added Humicola insolens overexpressing NCE4 described in International Publication No. WO 98/03640 was 5.0% Avicel, 2.0% yeast extract, 0.1% polypeptone, Inoculate a liquid medium adjusted to pH 6.8 containing 0.03% calcium chloride and 0.03% magnesium sulfate, and culture the resulting culture solution by centrifugation (7,000 rpm, 20 minutes), and after sterilization, the culture supernatant Was concentrated to Brix 15% using an ultrafilter, and the resulting concentrate was tested. The enzyme powder containing inorganic salt was prepared by mixing 1 ml of the above concentrated solution with 1 ml of various 0.1M inorganic salt solutions and 3 ml of deionized water, followed by lyophilization. The obtained enzyme powder was put in a closed container and stored at 120 ° C. for 24 hours, and then the decolorization activity of jeans was measured. The results are shown in Table 2. Here, a storage test at 120 ° C. for 24 hours was performed in order to accelerate the long-term storage test at room temperature.
[0037]
[Table 2]

[0038]
From Table 2, a remarkable cellulase stabilizing effect was confirmed for divalent cation chloride salts such as calcium chloride, cobalt chloride, nickel chloride, strontium chloride, magnesium chloride and zinc chloride.
[0039]
(Example 3) Amount of calcium chloride required for preparation of NCE4 cellulase with increased storage stability Based on the method described in Example 2, a culture concentrate of NCE4 cellulase was obtained. Based on the weight of cellulase contained in the concentrate, 1 ml of the obtained concentrate was mixed with 1 ml of calcium chloride solution of various concentrations and 3 ml of deionized water, and then freeze-dried, and NCE4 cellulase containing calcium chloride of various concentrations Enzyme powder was obtained. The obtained cellulase enzyme powder was sealed and stored at 120 ° C. for 24 hours, and the remaining jeans decolorization activity was evaluated. The results are shown in Table 3.
[0040]
[Table 3]

[0041]
As a result, it can be concluded that NCE4 cellulase powder obtained by adding calcium chloride to 90% or more of the weight of NCE4 cellulase is much more stable than additive-free cellulase.
[0042]

[0043]
After mixing the above ingredients, add 10% water and knead. The kneaded material is sent to a disk pelleter for molding. The obtained injection was granulated using a Malmerizer (Fuji Paudal), dried and sieved to obtain a granulated product. In the above preparation, magnesium chloride is contained as a divalent cation chloride salt in an amount of about 110% by weight based on the endoglucanase weight, and endoglucanase is contained in an amount of about 33% in the total protein weight.
[0044]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to improve the storage stability of a solid cellulase preparation having a high endoglucanase content, suppress inactivation during distribution and storage in stock, and reduce economic loss.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the expression plasmid pEGD01.

Claims

A stabilized solid cellulase preparation comprising the following components:
a) The endoglucanase is contained in an amount of 10% to 33% by weight based on the total protein weight.
b) An inorganic salt composed of any one of calcium chloride, cobalt chloride, nickel chloride, strontium chloride, magnesium chloride and zinc chloride is contained in an amount of 90 to 225% by weight of the endoglucanase.

Endoglucanase Humicola insolens (Humicola insolens) derived from endoglucanase NCE4 or NCE5, either of endoglucanase RCE I derived from Zygomycetes, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II or PCE I,, claim A solid cellulase preparation according to 1 .

Cellulase solution containing 10% to 33% by weight of the total protein weight of endoglucanase is mixed with an inorganic salt composed of any one of calcium chloride, cobalt chloride, nickel chloride, strontium chloride, magnesium chloride and zinc chloride with respect to the endoglucanase weight. A method for producing a stabilized solid cellulase preparation, comprising adding 90% to 225% by weight and drying.