JP4644198B2 - 超音波細菌破壊装置 - Google Patents

Description

本発明は、全般に、径方向に収束した超音波にさらすことによって細菌を破壊する装置に関する。特に、本発明は、病原性のバクテリアの検出および分析を支援するのに用いるのに適した、コンパクトな装置を対象としているが、これに限られない。

超音波キャビテーションによって微生物を破壊する市販の装置は、典型的には、２０ｋＨｚで共振するアプリケータを備える。半波長（最大伝達）プローブは、しばしば長さが約１５ｃｍであり、従って、サンプル量の少ない病原性のバクテリアが破壊される場合の使用には、嵩張ると共に不便である。さらに、プローブが、これらのバクテリアの液体サンプル内に浸漬されなければならないので、有害なエアロゾルを形成する本質的なリスクがある。

より高い周波数で作動する、さらにコンパクトな細胞破壊装置が知られている。例えば、液体と接する可撓性薄膜を介してホーンから伝達された超音波エネルギーを使用する、バクテリア細胞破壊器（Ｔａｙｌｏｒ、Ｍ．Ｔ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、７３、４９２−４９６）は、４０ｋＨｚで作動する。加えて、プラスチック細管内の胞子懸濁液に水を介して音を収束させる、厚さ１ＭＨｚの管状トランスデューサの１６０°セグメントを備える、細胞破壊器（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、ｉｂｉｄ、２００１、７３、３７８４−３７８９）が知られている。

しかしながら、これらの装置各々は、高い音圧を介してバクテリアを効率的に破壊するが、それらはかなりの熱を発生して、サンプルの温度を５０℃から９０℃まで実質的に上昇させる。そのような高温は、破壊の目的がＰＣＲ分析のためにＤＮＡを抽出することである場合は許容されるが、例えば、タンパク質の抗原の抗原性に対しては有害である。

しかしながら、タンパク質および細胞壁断片の免疫学的検定を容易にするバクテリアの破壊は、数多くの潜在的な断片が、潜在的に検出可能であるという十分な利点をもたらす。

従って、本発明は、一般に、液体サンプル中の細菌、例えばバクテリアを最小の温度上昇で迅速に破壊する、コンパクトな装置を提供することを探求するものである。

従って、本発明は、超音波細菌破壊装置を提供し、超音波細菌破壊装置は、少なくとも内側長手方向表面の一部に沿って配置された熱伝導固体伝達層を有する円筒状トランスデューサを備え、前記熱伝導固体伝達層、または前記円筒状トランスデューサおよび熱伝導固体伝達層は、液体サンプルを受容するチャネルを画定し、超音波細菌破壊装置はさらに、共振を励起すると共に前記液体サンプル内にキャビテーションを引き起こす周波数および電圧で、前記トランスデューサに交流電位を送出することができる手段を備える。

本明細書では、「液体サンプル」という用語は、液体、通常は水の中の細菌、例えばバクテリアや胞子の懸濁液を示す。

一つ以上の共振を励起するのに必要な駆動周波数は、トランスデューサの壁および伝達層の材料および厚さや、チャネルの直径または幅（即ち、サンプル層の厚さ）に応じることが理解されよう。

トランスデューサの壁は、通常、該壁における音の半波長の約奇数整数倍の厚さを有する。その厚さは、コンパクトな共振装置の要求によるものを除いては、限定されない。

好ましくは、伝達層は、音波の伝達を最大にするように、伝達層における音の半波長の約整数倍（奇数または偶数）の厚さを有する。最も好ましくは、伝達層は、伝達層における音の約半波長の厚さを有する。この厚さは、コンパクトな共振装置の要求によるものを除いては、限定されない。

チャネルの幅または直径は、また、共振を可能にするように選択される。好ましくは、幅または直径は、適度な容積の液体サンプル内でキャビテーションを促進して、その間、トランスデューサの収束領域内にキャビテーションを維持する。さらにより好ましくは、チャネルの幅または直径は、バルク液体サンプルから伝達層への良好な熱伝達を支援する。

その収束領域（長手軸上でまたはその近傍で）内に高い音圧を提供するために、半径方向モードで駆動される円筒状のトランスデューサの能力は、その外径に応じる。従って、特に伝達層の厚さが大きいところでは、直径はできる限り大きく、コンパクトな装置の要求に合致しているのが好ましい。

本発明によっては、トランスデューサの長手方向長さは、コンパクト性に対する要求以外には限定されない。好ましくは、その長さは、そのインピーダンスを損失することなく、チャネルに沿ってエネルギー密度の一様性の程度を提供する。

好ましい円筒状トランスデューサ（ＰＺＴ４Ｄ、２９８ｋＨｚ、英国サウザンプトン市バーミトロン）は、壁厚さ約６．５ｍｍ、外径約６３．７ｍｍ、長さ約２５．６ｍｍを有する管状の圧電セラミックを備える。

伝達層は、円筒状トランスデューサの内面の部分またはセグメントに沿って配置されてもよい。特に、伝達層は、この内面の半分に亘って配置された半円筒を備えてもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、伝達層は、全円筒状チューブを備える。好ましい実施形態は、キャビテーションが回避される点において、液体または部分液体伝達層と比較して最大限に効率的である。

伝達層単独、またはトランスデューサおよび伝達層の双方は、チャネルを画定することが明らかであろう。好ましい実施形態では、チャネルは、伝達層によって画定されると共に、断面が円形であり、円筒状トランスデューサの長手方向軸と同軸である。この実施形態では、収束領域に対して導入された液体サンプルが良好に重なる。しかしながら、チャネルが、円筒状のトランスデューサおよび／または非円形のトランスデューサの長手方向軸からオフセットしている、他の配置が予想される。

伝達層は、任意の適切な熱伝導材料を含んでもよい。その材料は、そのような高圧でサンプルの迅速な加熱を制御するように、サンプルから熱を導いて逃す。好ましくは、伝達層の長手方向長さは、収束領域から熱を十分に導いて逃すことを確実にするように、トランスデューサの長手方向長さを超えている。適切な伝達および伝導材料は、金属または鋼のような合金を含む。

好ましい伝達層は、外径約５０．５ｍｍ、内径約３．８ｍｍ、長さ３１．９ｍｍの鋼製シリンダを備える。伝達層の壁厚さは、約２０．５ｍｍ（半波長）である。

伝達層は、通常、エポキシ樹脂のような適切な接着剤によって円筒状トランスデューサの内面に固定される。特に、好ましい鋼製シリンダは、銀含有導電性エポキシ樹脂で被覆されてもよく、円筒状のトランスデューサが穏やかに押し込まれている。

好ましい円筒状のトランスデューサと好ましい伝達層は、立体観察によって決定される三つの周波数で、液体サンプルにかなりのキャビテーションを提供する。最低周波数２６６ｋＨｚは、一次元伝達マトリックス、多層共振モデルによる共振周波数予測に近接して生じる。２９７ｋＨｚおよび３１４ｋＨｚでは、かなりのキャビテーションがまた発生し、測定された電気的共振と一致し、トランスデューサの厚さの公称２９８ｋＨｚの共振に近接している。

比較し得るバクテリア細胞破壊が、２９７ｋＨｚで得られるが、好ましい駆動周波数は２６６ｋＨｚである。

一実施形態において、この装置はさらに、チューブおよびポンプ装置のような、チャネルを介してサンプルの流れを送出する手段を備える。代替の実施形態において、この装置は、チャネル内に液体サンプルを保持すると共にバッチ処理を可能するように、例えば閉鎖手段またはバルブ手段によって構成される。

他の実施形態において、装置は、液体サンプルから熱の取り除きを容易にする冷却手段をさらに備えている。冷却手段は、例えば、適切なグリースによって伝達層に結合された格子状ヒートシンク、および一つ以上のブロワを備えてもよい。

使用時に円筒状トランスデューサが鉛直である、バッチ処理に適した一実施形態では、第１のブロワが、装置を横切り且つ鋼製シリンダに熱的に接触するように配置されたヒートシンクを通して、空気を吹き付ける。第２のブロワは、空気を装置の上から下方に吹き付ける。

本発明は、また細胞破壊方法を提供し、この細胞破壊方法は、ｉ）装置に液体サンプルを導入することを含み、この装置は、少なくとも内側長手方向表面の一部に沿った熱伝導固体伝達層を有する円筒状トランスデューサを備え、前記伝達層、または前記トランスデューサおよび伝達層は、前記液体サンプルを受容するチャネルを画定し、細胞破壊方法はさらに、ｉｉ）共振を励起すると共に前記液体サンプル内にキャビテーションを引き起こす周波数および電圧で、前記トランスデューサに交流電位を印加することを含む。

この方法は、前記した本発明の装置の実施形態のいずれかによって実行される。交流電位の周波数は、実際上は、特定の電位でのコンピューター制御された掃引、およびキャビテーションの光学的／聴覚的観察によって決定される。強い共振を得るために適切に印加された電位は、３０Ｖ_ｒｍｓから１００Ｖ_ｒｍｓの範囲である。

好ましい実施形態では、この方法は、約８０Ｖ_ｒｍｓで２６４ｋＨｚから３１４ｋＨｚの範囲、最適には２６６ｋＨｚの駆動周波数で実行される。

本発明の方法は、バッチまたは連続処理として実行されてもよい。バッチ処理では、装置は、鉛直に配置され、例えば、薄いプラスチックフィルムおよびグロメットによってサンプル液をチャネル内に保持する。次いで、液体サンプルは、一以上の時間周期の間、定められた最適な周波数で超音波処理される。時間周期の数および範囲は、液体サンプルの加熱を最小化すると共に細胞の破壊を最大化するように選択される。

短い時間周期の間で、細胞破壊の程度が高いところでは、連続処理が望ましい。好ましい装置では、バクテリア胞子を含有する液体サンプルの約１ｍｌ／分の流量が予測される。従って、連続処理は、流れ技術を採用する検出技術への細胞破壊の統合の可能性を提供する。

本発明は、次の例および図面を参照して、単に例として以下に説明する。

図１および図２ａ、図２ｂを参照すると、本発明の好ましい実施形態は、外径６３．７６ｍｍ、壁厚さ６．５２ｍｍ、長さ２５．５８ｍｍの円筒状セラミックトランスデューサ１１（ＰＺＴ４Ｄ、２９８ｋＨｚ、英国サウザンプトン市バーミトロン）を備える。円筒状トランスデューサには、外径５０．５０ｍｍ、内径３．８ｍｍ、長さ３１．９１ｍｍの鋼製シリンダ１２が装着されている。シリンダは、鋼製シリンダの上面と下面に配置された突出管状部１４を介して液体サンプル１５を受容する、チャネル１３（図１の破線）を画定している。

鋼製シリンダは、銀含有の導電性エポキシ樹脂１６によって円筒状トランスデューサに固定されている。波発生器（Ａｇｉｌｉｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ ＨＰ ３３１２０Ａ）および増幅器（Ｍｏｄｅｌ ２４０Ｌ、ＥＮＩ、ニューヨーク州ロチェスタ市）を備える交流電位源（図示せず）は、約３０Ｖ_ｒｍｓから１００Ｖ_ｒｍｓの範囲の交流電位をトランスデューサに送出する。

一次元伝送マトリックス共振器モデル（Ｈａｗｋｅｓ Ｊ．Ｊ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、２００２、４０、３８５−３９２）による、平面システム（水含有）としての円筒状の音響多層システムの電気インピーダンス測定および処理により、周波数を予測し、この周波数で、キャビテーションが、実験的に見出されたものとよく一致する。

図３は、電気アドミッタンス測定結果（点線）、およびモデルによってシミュレートされた平面波スペクトラムの周波数依存を示す。高キャビテーション活性（矢印で示されている）は、中心が２６６ｋＨｚ、約２９７ｋＨｚ、および約３１４ｋＨｚである、４ｋＨｚバンドに見ることができる。

人間の赤血球の希薄された緩衝懸濁液の破壊における周波数依存は、２６６ｋＨｚ≧２９７ｋＨｚ＞３１４ｋＨｚのオーダーを有している。最も高い周波数が最も低い破壊を示した事実は、この周波数における低インピーダンスに対する増幅器への、より低効率のマッチングのためであり得る。

（例１）
酵母菌株サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｄ１の水中懸濁液を含む、液体サンプル０．６ｍｌのバッチ処理を、８０Ｖ_ｒｍｓで２６６ｋＨｚの駆動周波数で実施した。

サンプルは、オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍ、２５℃で４８時間、Ｍｋ Ｘインキュベータシェーカ、ＬＨ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ）中で、酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）培地（脱イオン水１ｌ中、酵母抽出物１０ｇ、細菌用ペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、アデニン０．１ｇ、およびウラシル０．１ｇ）で酵母を培養することにより調製した。細胞を、３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により２回洗浄した後、蒸留水中に再懸濁した。

改良ローリー法フォリン−チオカルト（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）検定を用いて、サンプル上澄み中に遊離したタンパク質の蓄積を測定した。メチレンブルー染色した細胞を、顕微鏡（２０倍および４０倍）により観察して生存細胞の数を決定し、破壊された任意の細胞壁材料を可視化した。

これらの酵母サンプルの経時的破壊を、図４に示す。図に示されるように、タンパク質の遊離は、超音波処理の最初の３０秒間において急速である。顕微鏡による観察（４０倍）では、６０秒で破裂した細胞が示された。３分後に温度上昇を１３Ｋと測定した。破壊は、液体サンプル２．４ｍｌで、市販の２０ｋＨｚ超音波の細菌破壊器を用いて達成されるものに匹敵した。

（例２）
滅菌蒸留水中に懸濁した洗浄済みＢＧ胞子の保存懸濁液を調製した（１０^１０ｃｆｕ／ｍｌから１０^１１ｃｆｕ／ｍｌ）。

この溶液のバッチ処理を、ａ）２６６ｋＨｚ、８０Ｖ_ｒｍｓで０．６ｍｌ、ｂ）２０ｋＨｚで２．４ｍｌ（６０Ｗで駆動される直径９．５４ｍｍのチタンプローブを用いる氷上ガラスビーカー、ＭＳＥ Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、およびｃ）０．５ｍｇの酸洗浄済みビーズの懸濁液１０６μＭを含む１００μｌについて、スマートサイクラー管で、２０ｋＨｚで振幅１００％で駆動される直径６ｍｍのチタンプローブ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実施した。

胞子抗原の有効性を、種々の時間間隔で、全ＢＧ胞子に対して作製されたポリクローナルα−ＢＧウサギ抗体を利用する直接ＥＬＩＳＡに基づく免疫測定法により決定した。胞子のサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレート、Ｉｍｍｕｎｌｏｎ２へ被覆し、重炭酸緩衝液ｐＨ９中に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し（０．０５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ２０３回およびＰＢＳ１回）、次にブロッキングした（１％粉乳、０．０５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ２０、室温で２時間以上）。抗体を加えて各ウェル中の終濃度を１０μｇ／ｍｌとし、インキュベーション（室温にて１時間）、および洗浄（前記の通り）の後、ウサギＨＲＰコンジュゲートを加えた。インキュベーション（室温にて１時間）の後、プレートを洗浄し（０．０５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ４回およびＰＢＳ１回）、ＡＢＴＳ顕色緩衝液を加えた。顕色させるのに十分な時間のインキュベーションの後、波長４０５ｎｍでサンプルの吸収を測定した。

図５ａ〜図５ｃから、ａからｃの各装置に対する３０秒の超音波処理の後の、ＢＧ抗原に対する分析感度の向上が明確に分かる（分析感度は、３０秒後に最大となることが見出され、超音波処理時間が長いと変性が生じることを示唆している）。

図５ａ〜図５ｃの各グラフを参照すると、Ａ^４０５０．１単位での曲線間に引かれた水平線は、２６６ｋＨｚでの超音波処理後の分析感度が１５倍増加していることを示唆する。この向上は、ｃで得られたもの（２０倍）には幾分遅れるが、少なくともｂに従って得られたものと同じである。

また、タンパク質遊離も、前に説明したように超音波処理された胞子サンプルから測定した。ａおよびｂにおける遊離のパターンは、ｂにおいて著しくより多い量のタンパク質が遊離されたにもかかわらず、概して類似している。遊離されたタンパク質の量が、経時的に着実に増加するにもかかわらず、免疫測定は、サンプルの抗原性が低下することを示すことに留意されたい。基本装置における温度上昇、超音波処理自体、またはその他の胞子成分の遊離が、この損失の一因である可能性がある。

本発明によるコンパクトな装置は、市販のより大きな装置に匹敵する結果を収める。さらに、この装置は、本質的に、従来技術と比べて高い周波数および超音波の径方向集束に関連する、サンプルの有害な加熱を減少させる。

基本装置におけるサンプルの加熱の制御は、前記のようにブロワを用いて冷却を補助することによって、さらに改善することができる。特に、サンプルの温度の上昇は、２６６ｋＨｚ、８０Ｖ_ｒｍｓでの連続超音波処理の１０分後の４０℃から１時間後の１１℃まで改善することができる。

本発明の好ましい実施形態による装置の正面立面図である。 図１の装置の端面図である。 図１の装置の断面図である。 図１の装置に対して、周波数に対してプロットされた電気インピーダンスを示すグラフである。 図１の装置を使用する時間に亘るサッカロミセス・セレビシエ（出芽酵母）の破壊の程度を示すグラフである。 図１の装置を使用して、吸光光度法によって測定された、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｎｉｇｅｒ）（ＢＧ）胞子抗原の検出を示すグラフである。 市販の２０ｋＨｚ超音波細菌破壊器を使用して、吸光光度法によって測定された枯草菌（ＢＧ）胞子抗原の検出を示すグラフである。 市販の２０ｋＨｚ超音波細菌破壊器を使用して、吸光光度法によって測定された枯草菌（ＢＧ）胞子抗原の検出を示すグラフである。

Claims (21)

1. 細菌破壊装置であって、少なくとも内側長手方向表面の一部に沿って配置された熱伝導固体伝達層を有する円筒状トランスデューサを備え、前記熱伝導固体伝達層、または前記円筒状トランスデューサおよび熱伝導固体伝達層が、液体サンプルを受容するチャネルを画定し、細菌破壊装置がさらに、共振を励起すると共に前記液体サンプル内にキャビテーションを引き起こす周波数および電圧で、前記円筒状トランスデューサに交流電位を送出することができる手段を備える、細菌破壊装置。
2. 熱伝導固体伝達層が、該熱伝導固体伝達層における音の半波長の整数倍の厚さを有する、請求項１に記載の装置。
3. 円筒状トランスデューサが、６．５ｍｍの壁厚さを有する、請求項１または２に記載の装置。
4. 円筒状トランスデューサが、６３．７ｍｍの外径を有する、請求項３に記載の装置。
5. 熱伝導固体伝達層が、鋼を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
6. 熱伝導固体伝達層が、円筒状トランスデューサより長い長手方向長さ、５０．５ｍｍの外径、および２０．５ｍｍ壁厚さを有する円筒状チューブを備える、請求項５に記載の装置。
7. チャネルが、３．８ｍｍの幅または直径を有する、請求項６に記載の装置。
8. 前記チャネルを閉鎖する手段を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
9. サンプルを前記チャネルに送出する手段をさらに備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
10. 冷却手段をさらに備える、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
11. 細胞破壊方法であって、ｉ）液体サンプルを装置に導入することを含み、前記装置が、少なくとも内側長手方向表面の一部に沿う熱伝導固体伝達層を有する円筒状トランスデューサを備え、前記熱伝導固体伝達層、または前記円筒状トランスデューサおよび熱伝導固体伝達層が、前記液体サンプルを受容するチャネルを画定し、前記細胞破壊方法がさらに、ｉｉ）共振を励起すると共に液体層内にキャビテーションを引き起こす周波数および電圧で、前記円筒状トランスデューサに交流電位を印加することを含む、細胞破壊方法。
12. 熱伝導固体伝達層が、該熱伝導固体伝達層において音の半波長の整数倍の厚さを有する、請求項１１に記載の方法。
13. 円筒状トランスデューサが、６．５ｍｍの壁厚さを有する、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 円筒状トランスデューサが、６３．７ｍｍの外径を有する、請求項１３に記載の方法。
15. 熱伝導固体伝達層が、鋼を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 熱伝導固体伝達層が、円筒状トランスデューサより大きな長手方向長さ、５０．５ｍｍの外径、および２０．５ｍｍの壁厚みを有する円筒状チューブを備える、請求項１５に記載の方法。
17. チャネルが、３．８ｍｍの幅または直径を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 交流電位の周波数が、２６４ｋＨｚから３１４ｋＨｚの範囲であり、電位の振幅が、８０Ｖ_ｒｍｓである、請求項１７に記載の方法。
19. バッチ処理として実行される、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 連続処理として実行される、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 装置を冷却することを含む、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の方法。

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