JP4639168B2 - Biological substance interaction detection / recovery method and apparatus - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
本発明は、試料中に含まれる生体物質を検出し、回収する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting and recovering a biological material contained in a sample.
生命現象に関わる物質は多種多様で、様々な化学的特性を有している。従来、物質ごとの特性を利用した多種多様な検出、分離方法が考案され利用されてきた。 There are a wide variety of substances involved in life phenomena and various chemical properties. Conventionally, a wide variety of detection and separation methods using the characteristics of each substance have been devised and used.
アミノ酸や糖の分離に最も用いられている方法として、液体クロマトグラフィーが挙げられる。この方法では、形状のバリエーションだけではなく、分離単体の種類や分離溶媒の種類が多様であるので、最適な条件下で実行することで多くの生化学物質や化学物質を分離することが可能である。あるいはこれに類似の技術で、溶液の搬送を電気浸透流で行う方法も利用されている。また、タンパク質やポリヌクレオチド（ＤＮＡやＲＮＡ）などの、電荷を持った高分子の分離には一般的に電気泳動が用いられる。電気泳動においても、分離単体の選択と、溶媒の選択（多くの場合、ｐＨと静電力のコントロールを行う）により、一般的には、サイズの２％くらいまでの違いを識別し分離できる。あるいはチャージの違いで分ける等電点電気泳動では０．０２ｐＨの違いに対応する等電点の違いでタンパク質を分離できる。ポリヌクレオチドの分野で、ＤＮＡシーケンサーに用いられている技術では、類似配列のＤＮＡに限れば、７００ｂｐと７０１ｂｐのＤＮＡを長さの差で分離することも可能である。 The most used method for separating amino acids and sugars is liquid chromatography. In this method, not only variations in shape but also various types of separation units and types of separation solvents are available, so it is possible to separate many biochemical substances and chemical substances by executing them under the optimum conditions. is there. Alternatively, a method in which the solution is transported by electroosmotic flow using a similar technique is also used. Electrophoresis is generally used to separate charged polymers such as proteins and polynucleotides (DNA and RNA). Also in electrophoresis, the difference of up to about 2% in size can be generally identified and separated by selecting a single unit of separation and selecting a solvent (in many cases, controlling pH and electrostatic force). Alternatively, in isoelectric focusing separated by charge difference, proteins can be separated by isoelectric point differences corresponding to 0.02 pH differences. In the field of polynucleotides, in the technique used for DNA sequencers, it is possible to separate 700 bp and 701 bp DNAs by the difference in length, as long as the DNAs have similar sequences.
分離された物質を同定する方法として、質量分析やＤＮＡシーケンサーを用いた方法が挙げられる。質量分析法は、試料に高電圧を印加、真空中でイオン化し質量数電荷比（ｍ／ｚ）によって電気、磁気的な作用により分離、検出する手法である。質量数電荷比（ｍ／ｚ）とその検出強度からマススペクトが得られ、既知物質おもにタンパク質の同定や未知物質の構造決定および構成分子を決定することができる。 Examples of a method for identifying the separated substance include mass spectrometry and a method using a DNA sequencer. Mass spectrometry is a technique in which a high voltage is applied to a sample, ionized in a vacuum, and separated and detected by an electric or magnetic action based on a mass number charge ratio (m / z). A mass spectrum can be obtained from the mass-to-charge ratio (m / z) and its detected intensity, and identification of known substances and proteins, determination of unknown substances, and constituent molecules can be determined.
タンパク質を高感度に検出する方法として、イムノアッセイが挙げられる。この方法は臨床検査にも応用されており、タンパク質だけではなく抗体が認識することができる化合物の検出も可能である。細胞中で発現しているｍＲＮＡを解析する方法としては網羅的に解析するＤＮＡチップやｍＲＮＡがＰＣＲにて増幅する速度から被検出対象ｍＲＮＡの濃度を検出するリアルタイムＰＣＲ法が有効である。 An immunoassay is mentioned as a method for detecting a protein with high sensitivity. This method is also applied to clinical tests, and it is possible to detect not only proteins but also compounds that can be recognized by antibodies. As a method for analyzing mRNA expressed in cells, a real-time PCR method for detecting the concentration of mRNA to be detected from the speed of amplification of the DNA chip or mRNA to be comprehensively analyzed by PCR is effective.
上記したように、生化学研究の分野は様々な分離法や検出法に支えられて発展してきた。生命の構成要素を成分ごとに分離し、それらの特性を明らかにすることで、生命現象全体が再構築できると考えられていたからである。 As described above, the field of biochemical research has been developed supported by various separation methods and detection methods. This is because it was thought that the whole life phenomenon could be reconstructed by separating the components of life into components and clarifying their characteristics.
一方で、近年のゲノム研究をはじめとするオーミクス研究では、生体の構成要因は遺伝子だけでも数万に及び、それ以外に、ゲノム情報によらずに関係し合う化学物質や物質間の相互作用は膨大な数にのぼることが明らかになりつつある。このため、生命現象は物質の複雑な相互作用の結果であるという古典的な解釈が再浮上している。 On the other hand, in recent omics research such as genome research, there are tens of thousands of components of living organisms alone, and in addition to this, there are no relations between chemical substances and interrelated substances regardless of genomic information. It is becoming clear that the number is enormous. For this reason, the classical interpretation that life phenomena are the result of complex interactions of matter has resurfaced.
前記生体物質の相互作用を検出する方法としては、溶液系の反応場で検出する方法と固相表面を反応場として検出する方法がある。
前者の方法では、物質間が相互作用した際に生じる熱量を測定する等温滴定カロリメトリー法や核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によって分子の構造変化をモニターする方法、蛍光共鳴エネルギー転移法が挙げられる。
後者の方法では、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子を利用した方法が挙げられる。表面プラズモン共鳴センサーは、金属薄膜に全反射する光を入射した際に生じる微弱なエネルギー波（エバネッセント波）が誘電体と接触している金属表面における粗密波と共鳴することで全反射光が減衰する現象（ＳＰＲ現象）を応用し、生体物質間の相互作用による金属薄膜表面の誘電率変化をＳＰＲ現象の減衰ピークの生じる角度変化によって検出する。水晶振動子は、水晶板の圧電効果を利用し、水晶板に一定の電圧を印加することで一定の周波数で発振する素子を用いる。水晶板表面に負荷される質量や粘性および弾性の変化によって周波数が変化し、生体物質が相互作用した際に生じる質量負荷の変化を周波数として検出することができる。この他に、表面の屈折率を計測するエリプソメーター、二面編波式干渉法、表面弾性波を利用した方法がある。
As a method for detecting the interaction of the biological substance, there are a method for detecting in a solution reaction field and a method for detecting a solid phase surface as a reaction field.
Examples of the former method include an isothermal titration calorimetry method for measuring the amount of heat generated when substances interact with each other, a method for monitoring molecular structural changes by nuclear magnetic resonance (NMR), and a fluorescence resonance energy transfer method.
Examples of the latter method include a surface plasmon resonance method and a method using a crystal resonator. The surface plasmon resonance sensor attenuates the total reflected light by resonating the weak energy wave (evanescent wave) generated when the light totally reflected on the metal thin film is incident on the metal surface in contact with the dielectric. By applying the phenomenon (SPR phenomenon), the change in the dielectric constant on the surface of the metal thin film due to the interaction between biological materials is detected by the change in the angle at which the SPR phenomenon decay peak occurs. The crystal resonator uses an element that oscillates at a constant frequency by applying a constant voltage to the crystal plate using the piezoelectric effect of the crystal plate. The frequency changes due to changes in mass, viscosity, and elasticity loaded on the quartz plate surface, and a change in mass load that occurs when a biological substance interacts can be detected as a frequency. In addition, there are an ellipsometer for measuring the refractive index of the surface, a two-sided knitting wave interferometry, and a method using surface acoustic waves.
上記生体物質の相互作用の検出、さらに、先に述べた物質の検出、同定及び分離方法には各種のものがあるが、次のような問題点がある。 There are various methods for detecting the interaction of the biological substances, and the methods for detecting, identifying and separating the substances described above, but have the following problems.
生体物質の分離方法において、電気泳動では担体と相互作用をする物質を分離し、クロマトグラフィーは分離部（カラム）にてその担体と溶媒界面における媒質の分配に依存し分離される。このため、分離する媒質の物質数が少ないと、媒質が担体に吸着されてしまい、回収できないことが頻繁に起きる。クロマトグラフィーや電気泳動の担体体積と表面積を小さくすることである程度解決できるが、分離する試料体積も少なくする必要があり、限界がある。この限界に挑んでいるのがナノクロマトグラフィーやナノ電気泳動である。分子数が数分子まで少なくなると、吸着の問題以外にも、確率論的なエラーも増えるので確実に分子を分離することが更に難しくなる。特にクロマトグラフィーは統計的に十分な分子が統計的に十分な数の相互作用積とインタラクションすることを前提としており、分離すべき分子の数が少なくなったからといって担体の相互作用積すなわちカラム表面積を少なくしたのでは、分離すべき分子と担体の相互作用積の衝突確率が低下してしまい、分離が不正確になる。 In the method of separating biological materials, substances that interact with a carrier are separated by electrophoresis, and chromatography is separated by a separation unit (column) depending on the distribution of the medium at the interface between the carrier and the solvent. For this reason, if the number of substances in the medium to be separated is small, the medium is frequently adsorbed on the carrier and cannot be recovered frequently. This can be solved to some extent by reducing the carrier volume and surface area of chromatography and electrophoresis, but there is a limit because it is necessary to reduce the volume of the sample to be separated. Nanochromatography and nanoelectrophoresis are challenging this limitation. If the number of molecules decreases to a few, in addition to the problem of adsorption, probabilistic errors also increase, making it more difficult to reliably separate the molecules. Chromatography, in particular, assumes that a statistically sufficient molecule interacts with a statistically sufficient number of interaction products, and because the number of molecules to be separated decreases, the carrier interaction product or column. If the surface area is reduced, the collision probability of the interaction product between the molecule to be separated and the carrier is lowered, and the separation becomes inaccurate.
また、検出、同定又は分離された生体物質の機能解析は別の手法を用いて解析されてきた。例えば物質間相互作用を解析する場合、表面プラズモン共鳴や水晶振動子といった手法によって行われてきた。 Moreover, the functional analysis of the detected, identified or separated biological material has been analyzed using another method. For example, when analyzing the interaction between substances, methods such as surface plasmon resonance and a crystal resonator have been used.
このような問題に対して、表面プラズモン共鳴センサーを用いて、認識物質に対し相互作用した物質の活性を測定した後、センサー上で捕捉した物質を回収して質量分析法にて同定する報告がされている（非特許文献１）。
しかし、固相表面と液相間との反応はLangmuirの法則に従う平衡反応であると同時に、ごく限られた領域の検出部で物質を捕捉、回収したのでは元の試料中に被検出対象分子濃度が濃くない限り、他の分析に耐えうるサンプル量を得ることは困難となる。また、物質間相互作用反応は平衡であることから、抗原抗体反応、ＤＮＡの相補鎖同士のハイブリダイゼーションおよび一般的にアプタマーと呼ばれているある特定分子に対し特異的に結合するポリヌクレオチドであれば結合定数も強く、非常に安定した結合体を形成するが、結合能が低い物質間相互作用においてはほとんどが試料中に未反応で残ってしまい、回収が困難である。
In response to these problems, there is a report that uses a surface plasmon resonance sensor to measure the activity of a substance that interacts with a recognition substance, then collects the substance captured on the sensor and identifies it by mass spectrometry. (Non-Patent Document 1).
However, the reaction between the solid phase surface and the liquid phase is an equilibrium reaction according to Langmuir's law. At the same time, if the substance is captured and recovered by a very limited area, the target molecule is detected in the original sample. Unless the concentration is high, it is difficult to obtain a sample amount that can withstand other analyses. In addition, since the interaction reaction between substances is in equilibrium, it may be an antigen-antibody reaction, hybridization between complementary strands of DNA, and a polynucleotide that specifically binds to a specific molecule generally called an aptamer. For example, the binding constant is strong and a very stable conjugate is formed. However, in the interaction between substances having low binding ability, most remains unreacted in the sample and is difficult to recover.
また、極性脂質を基本構成成分とする生体物質、たとえば脂質膜やそれに含まれる糖鎖、脂質膜中に存在することで正常に機能する膜タンパク質などは成分ごとに単離してしまうことによって、本来の機能を示さない。さらに脂質膜にはそれ自体を反応場とすることが知られており、脂質膜と相互作用している状態で初めて機能を発現する生体物質がある。このように極性脂質を基本構成成分とする認識物質に機能を持つ生体物質を解析する場合には、相互作用解析、具体的には結合の有無やその親和性を解析し、それと同時に構造解析などの機能解析を行う必要がある。
脂質膜以外にもDDS技術や医療用デバイス、人工臓器といった技術分野において細胞膜を構成するphosphatidylcholineの極性基と同一の構造をもつ2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（以下「MPCポリマー」とする。）のような生体適合性ポリマーやミセル、リポソーム試薬が開発されており、その生体物質の非特異的吸着や適合性を評価する方法が求められている。
In addition, biological substances that have polar lipids as basic constituents, such as lipid membranes, sugar chains contained in them, and membrane proteins that function normally when present in lipid membranes are isolated for each component. Does not show the function. Furthermore, it is known that the lipid membrane itself serves as a reaction field, and there is a biological substance that exhibits a function only when it interacts with the lipid membrane. In this way, when analyzing biological substances that have a function as a recognition substance with polar lipids as the basic component, analyze the interaction, specifically the presence or absence of binding and its affinity, and at the same time, structural analysis, etc. It is necessary to perform functional analysis.
In addition to lipid membranes, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (hereinafter referred to as “MPC polymer”) having the same structure as the polar group of phosphatidylcholine that constitutes cell membranes in technical fields such as DDS technology, medical devices, and artificial organs. ) Have been developed, and a method for evaluating nonspecific adsorption and compatibility of the biological substance is required.
そこで、本発明は、標的物質を含む試料溶液の選択とその試料溶液中の標的物質の回収を効率良く行うことができる生体物質相互作用検出・回収方法およびその装置を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a biological substance interaction detection / recovery method and apparatus capable of efficiently selecting a sample solution containing a target substance and recovering the target substance in the sample solution. .
本発明の生体物質検出・回収方法は、請求項１に記載の通り、標的物質を含む試料溶液の検出を、固相表面に固定化された認識物質と前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、微粒子担体に前記認識物質を備えた認識素子により前記標的物質を含むことが検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程、前記認識素子を回収し前記認識素子に捕捉された前記標的物質を回収する工程を有することを特徴とする。
また、請求項２に記載の本発明は、請求項１記載の生体物質検出・回収方法において、前記生体物質間相互作用を水晶振動子の周波数変化によって検出することを特徴とする。
また、請求項３に記載の本発明は、請求項１記載の生体物質検出・回収方法において、前記生体物質間相互作用を表面プラズモン共鳴法センサ表面の誘電率変化により検出することを特徴とする。
また、請求項４に記載の本発明は、請求項１記載の生体物質検出・回収方法において、前記認識素子を遠心分離によって回収することを特徴とする。
また、請求項５に記載の本発明は、請求項１記載の生体物質検出・回収方法において、前記微粒子担体を常磁性微粒子であり、磁場を用いて前記認識素子とともに捕捉された前記標的物質を回収することを特徴とする。
また、本発明の生体物質解析方法は、請求項６に記載の通り、請求項１記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記認識素子に捕捉された前記標的物質を解離させ前記標的物質を分離する工程及び分離された前記標的物質を質量分析方法によって解析する工程からなることを特徴とする。
また、本発明の生体物質解析方法は、請求項７に記載の通り、請求項１記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記標的物質が捕捉された前記認識素子を分光学的手法によって構造解析を行う工程からなることを特徴とする。
また、本発明の生体物質検出・回収装置は、請求項８に記載の通り、試料溶液中の標的物質と相互作用する認識物質を固定化するための固相表面より構成される検出部を備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が含まれることを検出された前記試料溶液を、認識素子担体である微粒子から構成される認識素子と混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質が捕捉された認識素子を回収するための遠心分離手段を備えたことを特徴とする。
また、本発明の生体物質検出・回収装置は、請求項９に記載の通り、試料溶液中の標的物質と相互作用する認識物質を固定化するための固相表面を備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が含まれることを検出された前記試料溶液を、常磁性体の微粒子担体に認識物質を固定化した認識素子と混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質を捕捉した認識素子を磁力により回収するための磁力分離手段を備えたことを特徴とする。
また、請求項１０に記載の本発明は、請求項８又は９記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段は、水晶振動子のセンサーであることを特徴とする。
また、請求項１１に記載の本発明は、請求項８又は９記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段は、表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする。
また、請求項１２に記載の本発明は、請求項８又は９に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段の前記検出部と前記混合手段とは、前記試料溶液を搬送するための流路により接続されていることを特徴とする。
また、請求項１３に記載の本発明は、請求項８又は９に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段の前記検出部と前記混合手段との間に、前記試料溶液を排出するための他の流路を備えたことを特徴とする。
According to the biological substance detection / recovery method of the present invention, the detection of the sample solution containing the target substance is performed between the biological substance and the recognition substance immobilized on the solid surface and the target substance. A step of performing based on a change in physical properties of the solid phase surface caused by an action, the target substance in the sample solution detected to contain the target substance by a recognition element having the recognition substance on a fine particle carrier; The method includes a step of capturing, and a step of recovering the recognition element and recovering the target substance captured by the recognition element.
The present invention according to claim 2 is characterized in that in the biological material detection / recovery method according to claim 1, the interaction between the biological materials is detected by a frequency change of a crystal resonator.
The present invention according to claim 3 is characterized in that in the biological material detection / recovery method according to claim 1, the interaction between the biological materials is detected by a change in dielectric constant of the surface plasmon resonance sensor surface. .
According to a fourth aspect of the present invention, in the biological material detection / recovery method according to the first aspect, the recognition element is recovered by centrifugation.
The present invention according to claim 5 is the biological material detection / recovery method according to claim 1, wherein the particulate carrier is a paramagnetic fine particle, and the target substance captured together with the recognition element using a magnetic field is detected. It collects.
Moreover, the biological material analysis method of the present invention, as described in claim 6, dissociates the target material captured by the recognition element recovered by the biological material detection / recovery method according to claim 1. And a step of analyzing the separated target substance by a mass spectrometry method.
Further, according to the biological material analysis method of the present invention, as described in claim 7, the recognition element in which the target substance recovered by the biological material detection / recovery method according to claim 1 is captured by a spectroscopic technique. It is characterized by comprising a step of performing structural analysis.
In addition, the biological material detection / recovery device of the present invention comprises a detection unit comprising a solid phase surface for immobilizing a recognition substance that interacts with a target substance in a sample solution as described in claim 8. Detection means for detecting the target substance based on a change in physical properties of the solid phase surface, and the sample solution detected to contain the target substance is composed of microparticles that are recognition element carriers A mixing means for mixing with a recognition element and a centrifuge means for collecting the recognition element in which the target substance is captured from the sample solution are provided.
The biological substance detection / recovery device of the present invention comprises a solid phase surface for immobilizing a recognition substance that interacts with a target substance in a sample solution, as defined in claim 9, Detection means for detecting the target substance based on a change in physical characteristics, the sample solution detected to contain the target substance, a recognition element having a recognition substance immobilized on a paramagnetic fine particle carrier, A mixing means for mixing and a magnetic separation means for recovering the recognition element capturing the target substance from the sample solution by magnetic force are provided.
The present invention described in claim 10 is the biological material detection / recovery device according to claim 8 or 9, wherein the detection means is a sensor of a crystal resonator.
The present invention according to claim 11 is the biological substance detection / recovery device according to claim 8 or 9, wherein the detection means is a surface plasmon resonance sensor.
Moreover, the present invention according to claim 12 is the biological substance detection / recovery device according to claim 8 or 9, wherein the detection unit and the mixing unit of the detection unit are configured to convey the sample solution. It is connected by a flow path.
The invention according to claim 13 is the biological material detection / recovery device according to claim 8 or 9, wherein the sample solution is discharged between the detection part of the detection means and the mixing means. The other flow path for this is provided.
本発明により、生命機能の一端を担う生化学物質の相互作用が検出できると同時に、回収することができる。これにより、生体物質間の相互作用を検出した条件と同等に調整された試料によって、様々な分析を行う事が可能となる。
また、粒子により構成された認識素子を使用することにより、固相表面と液相の平衡状態において捕捉できる標的物質を使用する場合に比べ、結合積が増えより効率的に試料溶液中の標的物質を回収することができる。この結果、相互作用の測定と標的物質の回収を効率的に行うことができ、回収された標的試料は他の分析手段に使用することができる。
また、標的物質を捕捉した認識素子は遠心分離により容易に回収することができる。また、認識素子を構成する微粒子担体として、常磁性粒子を用いるようにすれば磁場を用いて回収することができる。
認識物質と相互作用する標的物質を検出し効率的に標的物質を回収できるので、標的物質を質量分析によって同定標的物質の同定、解析が可能となる。
固相表面での生体物質間相互作用は、水晶振動子センサーや表面プラズモンセンサーを利用できるため、容易にシステムを構築することが可能となる。
According to the present invention, the interaction of biochemical substances that play a part in vital functions can be detected and recovered at the same time. This makes it possible to perform various analyzes using the sample adjusted to be equivalent to the conditions under which the interaction between biological substances is detected.
In addition, by using a recognition element composed of particles, the binding product increases more efficiently than when using a target substance that can be captured in an equilibrium state between the solid phase surface and the liquid phase. Can be recovered. As a result, interaction measurement and target substance recovery can be performed efficiently, and the recovered target sample can be used for other analysis means.
In addition, the recognition element that has captured the target substance can be easily recovered by centrifugation. If paramagnetic particles are used as the fine particle carrier constituting the recognition element, the particles can be recovered using a magnetic field.
Since the target substance that interacts with the recognition substance can be detected and the target substance can be efficiently recovered, the target substance can be identified and analyzed by mass spectrometry.
Since the interaction between biological materials on the solid phase surface can use a quartz crystal sensor or a surface plasmon sensor, a system can be easily constructed.
上述の通り、本発明は、標的物質を含む試料溶液の検出を、固相表面（本明細書において、固相表面あるいは固相表面に設けられた電極を含む。）に固定化された認識物質と前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、微粒子担体に前記認識物質を備えた認識素子により前記標的物質を含むことが検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程、前記認識素子を回収する工程及び前記認識素子に捕捉された前記標的物質を回収する工程を有するものである。
尚、本明細書において、生体物質というのは、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる物質をいうものとする。この中には、近年急速に発展しているDrug Delivery System（以下「DDS」とする。）と呼ばれる技術や人工臓器および医療用デバイスの開発によって、様々な高子ポリマー修飾薬剤や脂質分子やそのアナログ分子、生体適合性ポリマーなども含む。
As described above, the present invention detects a sample solution containing a target substance on a solid phase surface (in this specification, including a solid phase surface or an electrode provided on the solid phase surface). Detecting the presence of the target substance by a recognition element including the recognition substance on a fine particle carrier, a step performed based on a change in physical properties of the solid phase surface caused by interaction between the biological substance and the target substance A step of capturing the target substance in the sample solution, a step of recovering the recognition element, and a step of recovering the target substance captured by the recognition element.
In this specification, biological substances include nucleic acids, RNA such as mRNA, oligopeptides such as amino acids, dipeptides and tripeptides, polypeptides such as proteins, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, etc. These include substances related to life phenomena such as hormones such as saccharides and steroids, neurotransmitters such as noradrenaline, dopamine and serotonin, other endocrine disruptors, various drugs, potassium, sodium, chloride ions and hydrogen ions. These include the development of a technology called Drug Delivery System (DDS), which has been rapidly developing in recent years, and the development of artificial organs and medical devices. Also includes analog molecules, biocompatible polymers, and the like.
以下に、各工程について説明する。
（標的物質を含む試料溶液の検出工程）
本発明における検出手段は、固相表面を反応検出場とし、標的物質と認識物質との生体物質間の相互作用により生じる固相表面の物理的特性を測定することができるセンサーであればよく、水晶振動子、表面プラズモン、エリプソメトリー、二面編波式干渉法および表面弾性波を利用したセンサーを使用することができる。
検出手段として水晶振動子を使用する場合には、水晶板の両面に設けられた電極のうちの一方の電極に、認識物質を固定化し、認識物質が固定化されている水晶板の片側を試料溶液に浸し、前記両電極に電圧を所定周波数で印加するようにし、その際に、電極上の認識物質と標的物質との相互作用による水晶板の周波数変動を両電極を介して測定すればよい。
また、検出手段として、表面プラズモンセンサーを使用する場合には、プリズム底面に金属層を設け、認識物質を積層し、プリズム底面を試料溶液を浸漬させ誘電率の変化を測定する。具体的には、表面プラズモン共鳴現象の減衰ピークの生じる角度変化を測定すればよい。
Below, each process is demonstrated.
(Detection process of sample solution containing target substance)
The detection means in the present invention may be any sensor that can measure the physical characteristics of the solid phase surface caused by the interaction between the biological substance of the target substance and the recognition substance, using the solid phase surface as a reaction detection field, It is possible to use a sensor utilizing a quartz oscillator, surface plasmon, ellipsometry, two-surface knitting wave interferometry, and surface acoustic wave.
When using a crystal resonator as the detection means, the recognition substance is fixed to one of the electrodes provided on both sides of the crystal plate, and one side of the crystal plate on which the recognition substance is fixed is sampled. Immerse it in a solution and apply a voltage to both electrodes at a predetermined frequency. At that time, the frequency fluctuation of the quartz plate due to the interaction between the recognition substance on the electrode and the target substance may be measured via both electrodes. .
When a surface plasmon sensor is used as the detecting means, a metal layer is provided on the bottom surface of the prism, a recognition substance is laminated, and a sample solution is immersed in the bottom surface of the prism to measure a change in dielectric constant. Specifically, it is only necessary to measure an angle change in which an attenuation peak of the surface plasmon resonance phenomenon occurs.
前記検出手段の固相表面に、被検出対象である標的物質を特異的に認識する認識物質を固定化しておき、標的物質を含む試料溶液が認識物質と相互作用することにより、検出手段の物理的特性が変化し、認識物質と標的物質の相互作用、即ち、試料溶液中に標的物質を含むことを検出することができる。この際、試料溶液中の標的物質と認識物質との反応は平衡であるために、標的物質のほとんどが未反応で試料中に残っているため後の工程により回収することができる。尚、本明細書における認識物質は生体物質とする。そして、この認識物質に結合し得る物質を標的物質とする。
上記検出手段における試料溶液中の標的物質の有無や濃度等の閾値は測定目的や標的物質の種類に応じて適宜設定する。
A recognition substance that specifically recognizes the target substance to be detected is immobilized on the solid phase surface of the detection means, and the sample solution containing the target substance interacts with the recognition substance, thereby allowing the physical properties of the detection means. It is possible to detect an interaction between the recognition substance and the target substance, that is, the inclusion of the target substance in the sample solution. At this time, since the reaction between the target substance and the recognition substance in the sample solution is in equilibrium, most of the target substance remains unreacted in the sample and can be recovered in a later step. Note that the recognition substance in this specification is a biological substance. A substance that can bind to the recognition substance is used as a target substance.
The thresholds such as the presence and concentration of the target substance in the sample solution in the detection means are appropriately set according to the measurement purpose and the type of the target substance.
また、上記工程の後に、標的物質を含まない試料溶液についてはドレイン等を介して排出する工程を設けることが好ましい。複数の試料溶液を連続して検出する場合に、標的物質を含まない溶液を排出すれば作業効率が高めることができるからである。 Moreover, it is preferable to provide the process of discharging | emitting via a drain etc. about the sample solution which does not contain a target substance after the said process. This is because when a plurality of sample solutions are continuously detected, the working efficiency can be improved by discharging a solution that does not contain the target substance.
（標的物質を捕捉する工程）
認識物質と標的物質の相互作用をセンサーで検出後、標的物質を回収するために微粒子を担体とし認識物質をこれに固定化した認識素子を添加する。認識素子は微粒子が担体であることから標的物質との衝突確率が高く、試料中の標的物質のほとんどが認識素子に捕捉される。認識素子を捕捉した微粒子の特性によって磁場、遠心もしくは電気泳動等の方法で容易に回収することができる。微粒子の担体として、金属やポリマー粒子を用いることができる。また、その大きさは、認識物質を固定化できる程度の大きさであれば特に制限はないが、その外径として10nm〜10μmのものを使用することが好ましい。
(Step of capturing the target substance)
After the interaction between the recognition substance and the target substance is detected by a sensor, a recognition element having fine particles as a carrier and a recognition substance immobilized thereon is added to collect the target substance. Since the recognition element has a fine particle as a carrier, the probability of collision with the target substance is high, and most of the target substance in the sample is captured by the recognition element. Depending on the characteristics of the microparticles that have captured the recognition element, they can be easily recovered by a method such as magnetic field, centrifugation, or electrophoresis. Metal or polymer particles can be used as the fine particle carrier. Further, the size is not particularly limited as long as the recognition substance can be immobilized, but it is preferable to use one having an outer diameter of 10 nm to 10 μm.
（標的物質を回収する工程）
回収された認識素子から、認識物質と標的物質の結合を解離させ、認識素子を回収することで残った標的物質を得ることができる。これによって、標的物質は質量分析、電気泳動、ＤＮＡシーケンサーまたはアミノ酸配列分析等を使用して測定するために十分なサンプル量を確保することができる。
(Step of collecting target substance)
The remaining target substance can be obtained by dissociating the binding between the recognition substance and the target substance from the collected recognition element and collecting the recognition element. As a result, a sufficient amount of sample can be secured for measuring the target substance using mass spectrometry, electrophoresis, DNA sequencer, amino acid sequence analysis, or the like.
次に、上述した固相表面に認識物質を固定化する方法および微粒子担体への認識物質の装飾方法を説明する。 Next, a method for immobilizing the recognition substance on the solid phase surface and a method for decorating the recognition substance on the fine particle carrier will be described.
固相表面の検出部に認識物質を固定化する方法として、化学的もしくは生物学的に特異的な結合によって固定化する方法と非特異吸着を用いて固定化する方法がある。非特異吸着は硫酸と過酸化水素水の混合液であるピランハ溶液での酸洗浄やプラズマアッシングによって洗浄化した固相表面に、認識物質溶液をキャストして表面に認識物質を直接固定化する。
化学的な結合によって固定化する方法としては、固相表面に様々な官能基を導入して、認識物質を固定化する。代表的な固定化方法を下記に挙げる。
（ｉ）アミド結合：カルボキシル基が導入されている固相表面をカルボジイミドで処理し、カルボキシル基を活性エステルの形にして認識物質中のアミノ基を反応させて固定化する。
（ｉｉ）アルデヒド結合：カルボキシル基が導入された固相表面に、カルボジイミドにてカルボキシル基を活性エステルの形にした後、ヒドラジンを反応させる。この表面に認識物質中のアルデヒド基が反応し、アルデヒド結合により固定化する。
（ｉｉｉ）ジスルフィド結合：チオール基がされている固相表面に2,2-Dipyridyl disulfideを反応させる事でdithiopyridyl基を導入する。この後、チオール基を有する分子が反応するとジスルフィド結合が形成され、固定化することができる。
表面に官能基を導入する方法としては、Ｓｉを主体とする基板であればシランカップリング処理を用い、金属である場合にはアルキルチオール化合物による自己組織化膜を形成することで可能となる。また、BIACORE社から販売されている表面プラズモンセンサーのチップSensor Chip CM5（商品名）のようにデキストランのような高物質中に各官能基を導入しておき、表面をコートする方法や、官能基を導入してあるポリマーをフィルムとして表面をコートする方法もある。
また、上記方法にてアビジンもしくはストレプトアビジンを固定化し、認識物質にビオチンを導入したものを用いれば、アビジン−ビオチン相互作用にて認識物質を固定化することができる。脂質膜基本構成とした認識物質を検出器固相表面に固定化する方法としては、リポソームに調整した認識物質を固定化する方法（非特許文献２：Biochemistry 38,15659-15665(1999)、非特許文献３：Journal of Medical Chemistry 43,2083-2086(2000)、）、Langmuir-Blodgett膜を形成し固定化する方法や疎水性表面にSmall Unilamellar Vesicle（以下「SUV」とする。）に調整したリポソームを接触させることによる単層膜での固定化方法（非特許文献４：Biochimica et Biophysica Acta 1462,89-108(1999)、非特許文献５：Analytical Biochemistry 226,342-348(1995)）、SiO2といった親水性表面やBiacore社の表面プラズモンチップでSensor Chip L1（登録商標）を用いて二重膜として固定化する方法（非特許文献６：Langmuir 20,7526-7513(2004)、非特許文献７：FEBS Letter 559,96-98(2004)）、脂質膜をフィルムで固定化する方法（非特許文献８：Analytical Chemistry 62,1431-1438(1990)）が挙げられる。
この他に、固相表面が金属である場合、認識物質中のチオール基を用いて金属表面に固定化することも可能である。
上記方法にてポリヌクレオチドを認識物質として固定化する場合には、化学合成時に５’末端に各官能基を導入しておけばよい。
As a method for immobilizing the recognition substance on the detection part on the solid surface, there are a method for immobilizing by chemical or biological specific binding and a method for immobilizing by using non-specific adsorption. Non-specific adsorption involves directly immobilizing the recognition substance on the surface by casting the recognition substance solution on the solid phase surface cleaned by acid washing or plasma ashing with a Piranha solution that is a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide.
As a method of immobilization by chemical bonding, various functional groups are introduced on the solid surface to immobilize the recognition substance. Typical immobilization methods are listed below.
(I) Amide bond: A solid phase surface into which a carboxyl group has been introduced is treated with carbodiimide, the carboxyl group is converted into an active ester, and the amino group in the recognition substance is reacted and immobilized.
(Ii) Aldehyde bond: After the carboxyl group is converted into an active ester form with carbodiimide on the solid phase surface into which the carboxyl group has been introduced, hydrazine is reacted. The aldehyde group in the recognition substance reacts with this surface and is immobilized by aldehyde bond.
(Iii) Disulfide bond: A dithiopyridyl group is introduced by reacting 2,2-Dipyridyl disulfide with a solid phase surface on which a thiol group is formed. Thereafter, when a molecule having a thiol group reacts, a disulfide bond is formed and can be immobilized.
As a method for introducing a functional group on the surface, a silane coupling treatment is used for a substrate mainly made of Si, and in the case of a metal, a self-assembled film made of an alkylthiol compound can be formed. In addition, the surface plasmon sensor chip sold by BIACORE, such as Sensor Chip CM5 (trade name), each functional group is introduced into a high substance such as dextran, and the surface is coated. There is also a method of coating the surface using a polymer into which a polymer is introduced as a film.
In addition, if avidin or streptavidin is immobilized by the above method and biotin is introduced into the recognition substance, the recognition substance can be immobilized by the avidin-biotin interaction. As a method of immobilizing a recognition substance having a basic lipid membrane structure on the surface of a detector solid phase, a method of immobilizing a recognition substance prepared on a liposome (Non-patent Document 2: Biochemistry 38, 15659-15665 (1999), non-patent document 2). Patent Document 3: Journal of Medical Chemistry 43, 2083-2086 (2000)), a method for forming and immobilizing a Langmuir-Blodgett film, and a small unilamellar vesicle (hereinafter referred to as “SUV”) on a hydrophobic surface. Immobilization method in a monolayer membrane by contacting liposomes (Non-patent Document 4: Biochimica et Biophysica Acta 1462,89-108 (1999), Non-patent Document 5: Analytical Biochemistry 226,342-348 (1995)), SiO 2 And a method of immobilizing as a double membrane using Sensor Chip L1 (registered trademark) on a hydrophilic surface such as Biacore's surface plasmon chip (Non-Patent Document 6: Langmuir 20,7526-7513 (2004), Non-Patent Document 7) : FEBS Letter 559,96-98 (2004)), a method of immobilizing lipid membranes with films ( Patent Document 8: Analytical Chemistry 62,1431-1438 (1990)), and the like.
In addition, when the solid phase surface is a metal, it can be immobilized on the metal surface using a thiol group in the recognition substance.
When a polynucleotide is immobilized as a recognition substance by the above method, each functional group may be introduced at the 5 ′ end during chemical synthesis.
認識物質を微粒子担体に修飾して認識素子を形成する方法について説明する。
本発明において使用する粒子はポリスチレンビーズのような樹脂由来の粒子や、主に希土類の常磁性粒子、そして金属微粒子が挙げられる。微粒子担体に認識物質を装飾する方法として、上述した固相表面への固定化方法を用いることができる。また、これらの粒子の一例として、Polyscience社、DYNAL BIOTECH社等から一般的に販売もされており、入手することが可能である。
脂質膜を基本構成とする認識物質を微粒子担体に修飾する方法としては、前記した固相表面への固定化方法を用いても良いが、（非特許文献９：Langmuir 17,2283-2286(2001)）記載の方法や、リポソーム形成時に微粒子溶液を用いて形成し、微粒子をリポソームに内包される方法を用いることもできる。
A method of forming a recognition element by modifying a recognition substance with a fine particle carrier will be described.
The particles used in the present invention include resin-derived particles such as polystyrene beads, mainly rare earth paramagnetic particles, and metal fine particles. As a method of decorating the recognition substance on the fine particle carrier, the above-described immobilization method on the solid surface can be used. As an example of these particles, they are generally sold by Polyscience, DYNAL BIOTECH, etc., and can be obtained.
As a method for modifying a recognition substance having a lipid membrane as a basic component to a fine particle carrier, the above-described immobilization method on a solid surface may be used (Non-Patent Document 9: Langmuir 17,2283-2286 (2001). )) Or a method in which a fine particle solution is used at the time of liposome formation and the fine particles are encapsulated in the liposome.
また、本発明の生体物質解析方法は、上述した生体物質検出・回収方法の後に、認識素子に捕捉された標的物質を解離させ標的物質を分離する工程と、分離された標的物質を質量分析方法によって解析する工程を行うか、或いは、標的物質が捕捉された認識素子を分光学的手法によって構造解析を行うものである。これにより、少量の試料を有効に活用して生体物質の解析を行うことができる。 Further, the biological material analysis method of the present invention includes a step of dissociating a target substance by dissociating a target substance captured by a recognition element after the biological substance detection / recovery method described above, and a mass spectrometry method for separating the target substance Or a structural analysis of the recognition element in which the target substance is captured by a spectroscopic technique. Thereby, a biological material can be analyzed by effectively using a small amount of sample.
次に、本発明の生体物質検出・回収装置について説明する。
本発明は、試料溶液中の標的物質と相互作用する認識物質を固定化するための検出部を固相表面に備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が含まれることを検出された前記試料溶液を、認識素子担体である微粒子から構成される認識素子と混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質が捕捉された認識素子を回収するための遠心分離手段を備えるものである。
前記検出手段は、生体物質検出・回収方法のところで説明した検出手段と同じである。尚、検出手段を試料溶液の量によっては容器内に設けるようにしてもよい。前記混合手段は、認識素子を試料溶液に加え混合できるものであればよく、また、遠心分離手段についても、遠心分離により認識素子を回収できるものであればよく、いずれも市販されているものを使用することができる。
上記検出手段の検出部から混合手段への試料溶液の移動は、手作業によっても行うことができるが好ましくは検出手段を容器内に設け、この容器と混合手段とを流路により接続してポンプ等を利用して移動できるように構成することが好ましい。検出を行った試料溶液をそのまま混合手段に移動することができ、作業効率がよいからである。また、前記容器又は前記流路をドレインに接続するようにしてもよい。検出により、不要と判断した試料溶液を排出できるからである。更に、電磁弁等により、前記ドレインへの切換ができるようにすれば、操作がより簡便となるため好ましい。
Next, the biological material detection / recovery device of the present invention will be described.
The present invention includes a detection unit for immobilizing a recognition substance that interacts with a target substance in a sample solution on a solid phase surface, and detects the target substance based on a change in physical characteristics of the solid phase surface. Detection means, a mixing means for mixing the sample solution detected to contain the target substance with a recognition element comprising fine particles as a recognition element carrier, and the target substance is captured from the sample solution. A centrifuge for collecting the recognition element is provided.
The detection means is the same as the detection means described in the biological material detection / recovery method. The detecting means may be provided in the container depending on the amount of the sample solution. The mixing means may be any means as long as it can add the recognition element to the sample solution and mix, and the centrifugation means may be any means capable of recovering the recognition element by centrifugation, and all of them are commercially available. Can be used.
The sample solution can be moved manually from the detection part of the detection means to the mixing means. Preferably, the detection means is provided in a container, and the container and the mixing means are connected by a flow path to pump. It is preferable to configure so as to be able to move using the above. This is because the detected sample solution can be directly moved to the mixing means, and the working efficiency is good. Moreover, you may make it connect the said container or the said flow path to a drain. This is because the sample solution determined to be unnecessary can be discharged by detection. Furthermore, it is preferable that switching to the drain can be performed by an electromagnetic valve or the like because the operation becomes simpler.
また、前記生体物質検出・回収装置において、認識素子として常磁性体を使用する場合には、上記装置の遠心分離手段に代えて磁場発生手段を設けるようにすればよい。これにより、磁場により認識素子を分離できるからである。 In the biological material detection / recovery device, when a paramagnetic material is used as a recognition element, a magnetic field generation means may be provided instead of the centrifugal separation means of the device. This is because the recognition element can be separated by the magnetic field.
次に、本発明の実施例について図面を参照して説明する。 Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
（実施例１）
ＢＳＡを被測定対象物質のモデルタンパク質とし、相互作用の検出、回収後に質量分析法にて同定する例を示す。
具体的には抗ＢＳＡ抗体を認識物質とし、水晶振動子微小天秤（以下、「ＱＣＭ」とする。）センサーを相互作用の検出手段として採用し、粒径が１．０μｍの常磁性粒子を認識素子担体としＢＳＡを回収する。
ＱＣＭは基本周波数が２７ＭＨｚのセンサーで、感度が0.64ng/cm2である。このＱＣＭセンサー表面は発振するのに必要な金電極が配置され、検出部となっている。金電極検出部をオゾンプラズマにて洗浄後、10mMの10-Carboxy-1-decanethiolエタノール溶液で自己組織化膜を形成させ、カルボキシル基を導入する。カルボキシル基導入表面に100mg/mLの1-Ethyl-3-[3-dimethylamino]propyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)と100mg/mL N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS)を等量ずつ混合した溶液を反応させ、活性化エステルの形にする。続いて、10mM phosphate, 0.15M NaCl(pH7.5)溶液で1mg/mL 抗ＢＳＡ抗体溶液を作成し、この抗ＢＳＡ抗体溶液を表面に反応させアミド結合により抗ＢＳＡ抗体を固定化する。
認識素子担体に用いる常磁性粒子もカルボキシル基が導入されているのを用いる。ＱＣＭセンサー表面に抗ＢＳＡ抗体を固定化した方法と同様に、常磁性粒子にも抗ＢＳＡ抗体を修飾し、認識素子とする。
Example 1
An example will be shown in which BSA is used as a model protein of the substance to be measured, and identification is performed by mass spectrometry after detection and recovery of the interaction.
Specifically, an anti-BSA antibody is used as a recognition substance, and a quartz crystal microbalance (hereinafter referred to as “QCM”) sensor is used as an interaction detection means to recognize paramagnetic particles having a particle size of 1.0 μm. BSA is recovered as an element carrier.
QCM is a sensor with a fundamental frequency of 27 MHz and a sensitivity of 0.64 ng / cm 2 . A gold electrode necessary for oscillation is arranged on the surface of the QCM sensor, which serves as a detection unit. After washing the gold electrode detection part with ozone plasma, a self-assembled film is formed with 10 mM 10-Carboxy-1-decanethiol ethanol solution, and carboxyl groups are introduced. Activated by reacting an equivalent amount of 100 mg / mL 1-Ethyl-3- [3-dimethylamino] propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and 100 mg / mL N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) on the carboxyl group-introduced surface. Establish an ester. Subsequently, a 1 mg / mL anti-BSA antibody solution is prepared with 10 mM phosphate, 0.15 M NaCl (pH 7.5) solution, and this anti-BSA antibody solution is reacted with the surface to immobilize the anti-BSA antibody by amide bond.
Paramagnetic particles used for the recognition element carrier also have a carboxyl group introduced therein. Similar to the method of immobilizing the anti-BSA antibody on the surface of the QCM sensor, the anti-BSA antibody is also modified on the paramagnetic particles to form a recognition element.
図１は、実施例１の方法の説明及び使用する装置の概念図である。
図１の最上段部に符号１０１で示す容器には、試料溶液と洗浄および希釈用の緩衝液が導入される。この容器（１０１）内には、認識物質である抗ＢＳＡ抗体（１１７）が検出部に固定化された水晶振動子（１１８）が設けられており、この水晶振動子（１１８）の検出部に試料溶液が導入される。
試料溶液として、標的物質であるＢＳＡを含まない試料溶液Ａ（１１１）とＢＳＡを含む試料溶液Ｂ（１１４）の２種類を用いる。各試料溶液は10mM Phosphate，0.1M NaCl，0.01mg/mL SDS（pH7.5）緩衝液に懸濁された細胞抽出液とする。
FIG. 1 is a conceptual diagram of an apparatus used and description of the method of the first embodiment.
A sample solution and a buffer solution for washing and dilution are introduced into a container denoted by reference numeral 101 in the uppermost part of FIG. The container (101) is provided with a crystal resonator (118) in which an anti-BSA antibody (117) as a recognition substance is immobilized on the detection unit. The detection unit of the crystal resonator (118) includes A sample solution is introduced.
Two types of sample solutions are used: sample solution A (111) not containing BSA as a target substance and sample solution B (114) containing BSA. Each sample solution should be a cell extract suspended in 10 mM Phosphate, 0.1 M NaCl, 0.01 mg / mL SDS (pH 7.5) buffer.
試料溶液Ａ（１１１）を水晶振動子（１１８）と接触させた結果、同溶液（１１１）中には抗ＢＳＡ抗体に結合する物質（１１２、１１３）が存在していなかったため、ＱＣＭの周波数変化は生じない。このため試料溶液Ａ（１１１）は、容器（１０１）の下流側に接続された流路（１２４）から試料ポンプ（１０２）を介して排出する。
一方、試料溶液Ｂ（１１４）にはＢＳＡ（１１５）が含まれているため、認識物質抗ＢＳＡ抗体（１１７）と結合し（１１９）、ＱＣＭの周波数が減少する。
上記周波数変動について具体的に図２を用いて説明する。
図２は、認識物質と被検出対象標的物質の相互作用を水晶振動子（１１８）によって検出した場合の水晶振動子（１１８）の周波数変動の模式図である。
標的物質であるＢＳＡを含まない試料Ａ（１１１）５０μｌと、ＢＳＡを含む試料Ｂ（１１４）５０μｌとのそれぞれを抗ＢＳＡ抗体固定化水晶振動子（１１８）により測定すると、試料Ａ（１１１）においては周波数が変化しない（２０１）。これに対し、ＢＳＡを含む試料Ｂ（１１４）では符号２０２に示すように、抗ＢＳＡ抗体と相互作用することによって周波数が減少する。つまり、試料Ｂ（１１４）にはＢＳＡが含まれていることが確認できることになる。
As a result of bringing the sample solution A (111) into contact with the quartz crystal resonator (118), the substance (112, 113) that binds to the anti-BSA antibody was not present in the solution (111). Does not occur. Therefore, the sample solution A (111) is discharged from the flow path (124) connected to the downstream side of the container (101) via the sample pump (102).
On the other hand, since the sample solution B (114) contains BSA (115), it binds to the recognition substance anti-BSA antibody (117) (119) and the frequency of QCM decreases.
The frequency fluctuation will be specifically described with reference to FIG.
FIG. 2 is a schematic diagram of the frequency fluctuation of the crystal unit (118) when the interaction between the recognition substance and the target substance to be detected is detected by the crystal unit (118).
When 50 μl of sample A (111) not containing BSA as a target substance and 50 μl of sample B (114) containing BSA were each measured by an anti-BSA antibody-immobilized crystal resonator (118), sample A (111) Does not change in frequency (201). On the other hand, in the sample B (114) containing BSA, as shown by reference numeral 202, the frequency decreases by interacting with the anti-BSA antibody. That is, it can be confirmed that the sample B (114) contains BSA.
上記検出手段におけるＱＣＭの周波数減少が飽和した後、試料溶液Ｂ（１１４）を流路（１２３）を介して混合手段である第一撹拌（混合）槽（１０３）に移動した。
この第一撹拌槽（１０３）において、ＱＣＭ測定後の試料溶液Ｂ（１１４’）と常磁性粒子（１２０）と認識物質である抗ＢＳＡ抗体（１１７）から構成される認識素子（１２１）を懸濁する。ここで、認識素子（１２１）の濃度を100nMとなるようにした。第一撹拌槽（１０３）において、緩やかに撹拌し、十分な時間後には標的物質のＢＳＡ（１１５）と認識素子上に装飾された認識物質である抗ＢＳＡ抗体（１１７）が結合し、認識素子（１２１）と標識物質ＢＳＡ（１１５）が複合体を形成する。
After the QCM frequency reduction in the detection means was saturated, the sample solution B (114) was moved to the first stirring (mixing) tank (103) as the mixing means via the flow path (123).
In this first stirring vessel (103), a recognition element (121) composed of the sample solution B (114 ′) after the QCM measurement, the paramagnetic particles (120), and the anti-BSA antibody (117) as a recognition substance is suspended. It becomes cloudy. Here, the concentration of the recognition element (121) was set to 100 nM. In the first stirring tank (103), the mixture is gently stirred, and after a sufficient time, the target substance BSA (115) and the anti-BSA antibody (117), which is a recognition substance decorated on the recognition element, bind to each other, and the recognition element (121) and the labeling substance BSA (115) form a complex.
次に、認識素子１２１に標的物質ＢＳＡ（１１５）が捕捉された状態の試料溶液（１１４）を、磁力分離手段（第一分離槽）（１０４）に流路（１２５）を介して移動する。磁力分離手段（１０４）は、希土類のネオジウム磁石の磁力発生手段（１０５）をその側方に設けて構成する。
これにより標的物質であるＢＳＡ（１１５）と認識素子（１２１）で形成された複合体（１２２）は磁場によってトラップすることができる。また、認識素子（１２１）と結合していない物質（１１６）は、第一分離槽の下流側の流路（１２６）から分岐された流路（１２７）及びポンプ（１０２）を介して排出するようにする。
Next, the sample solution (114) in which the target substance BSA (115) is captured by the recognition element 121 is moved to the magnetic separation means (first separation tank) (104) via the flow path (125). The magnetic force separating means (104) is configured by providing a magnetic force generating means (105) of a rare earth neodymium magnet on the side thereof.
Thereby, the complex (122) formed by the target substance BSA (115) and the recognition element (121) can be trapped by the magnetic field. Moreover, the substance (116) which is not combined with the recognition element (121) is discharged through the flow path (127) branched from the flow path (126) on the downstream side of the first separation tank and the pump (102). Like that.
磁場発生手段（１０５）の磁場を所定の時間経過後に開放し、ＢＳＡ（１１５）を捕捉した認識素子（１２１）を流路（１２６）を介して第二撹拌槽（１０６）に移動する。第二撹拌槽（１０６）には、10mMのGly-HCl緩衝液（pH2.0)が導入され、抗原抗体反応が解離され、ＢＳＡ（１１５）は認識素子（１２１）から解離する。 The magnetic field of the magnetic field generating means (105) is released after a lapse of a predetermined time, and the recognition element (121) that has captured the BSA (115) is moved to the second stirring tank (106) through the flow path (126). A 10 mM Gly-HCl buffer (pH 2.0) is introduced into the second stirring tank (106), the antigen-antibody reaction is dissociated, and BSA (115) is dissociated from the recognition element (121).
試料溶液Ｂ（１１４）は、次に流路（１２８）を介して第二分離槽（１０７）に移動する。第二分離槽（１０７）も、第一分離槽（１０４）同様に側方に磁力分離手段（１０５）を備えており、磁力分離手段（１０５）により解離された認識素子（１２１）のみがトラップされ、標的物質であるＢＳＡ（１１５）を純粋に回収することができる。 The sample solution B (114) then moves to the second separation tank (107) via the flow path (128). Similarly to the first separation tank (104), the second separation tank (107) includes a magnetic separation means (105) on the side, and only the recognition element (121) dissociated by the magnetic separation means (105) is trapped. Thus, the target substance BSA (115) can be recovered purely.
回収されたＢＳＡをトリプシン分解酵素により、１２時間分解後MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）-TOF（飛行時間型）マススペクトルを測定し、ペプチドマップフィンガープリントを行った結果を図３に示す。
符号３０１で示すスペクトルは、単に水晶振動子センサーの表面で捕捉したＢＳＡを回収し、測定した結果である。この方法では十分なサンプル量を確保できずスペクトルを得ることができないことがわかる。
これに対し、本実施例の方法によって回収されたＢＳＡを測定した結果、符合３０２に示すように各ペプチドを同定することができる。符号３０２のスペクトルにおいて、各番号はアミノ酸配列からのフラグメント由来のピークであることを示し、＊のピークはジスルフィド架橋により結合されたタンパク質溶解フラグメントであることがわかる。
このように、本実施例により、物質間相互作用をモニターすると同時に被検出対象標的物質を他の手法解析に使用することができる十分量を回収できることがわかる。
Fig. 3 shows the results of peptide map fingerprinting by measuring MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization) -TOF (Time of Flight) mass spectrum after 12 hours degradation of recovered BSA with trypsin-degrading enzyme .
The spectrum indicated by reference numeral 301 is a result of simply collecting and measuring BSA captured on the surface of the quartz resonator sensor. It can be seen that this method cannot secure a sufficient amount of sample and cannot obtain a spectrum.
On the other hand, as a result of measuring the BSA recovered by the method of this example, each peptide can be identified as indicated by reference numeral 302. In the spectrum of reference numeral 302, each number indicates a peak derived from a fragment from the amino acid sequence, and it can be seen that the * peak is a protein lysis fragment bound by a disulfide bridge.
As described above, according to this example, it is understood that a sufficient amount that can be used for analysis of another method can be recovered while simultaneously monitoring the interaction between substances.
尚、本実施例１では標的物質を回収するための認識素子担体を常磁性粒子とし、磁場を用いて回収を行う例を示したが、ポリスチレンや金属粒子を用いる場合、その回収方法は遠心分離法、電気泳動法およびクロマトグラフィーを用いることで同様の結果を得ることができる。
本実施例１では相互作用解析は単純化するために検出のみとしたが、様々な濃度の試料をセンサー上にアプライすることによって結合（解離）定数を求めるアフィニティー解析やその結合および解離速度から速度論解析を行うこともできる。
In the first embodiment, the recognition element carrier for recovering the target substance is a paramagnetic particle and recovery is performed using a magnetic field. However, when polystyrene or metal particles are used, the recovery method is centrifugation. Similar results can be obtained using methods, electrophoresis and chromatography.
In this Example 1, the interaction analysis is performed only for detection in order to simplify the analysis. However, by applying various concentrations of the sample on the sensor, the binding (dissociation) constant is obtained, and the rate is determined based on the binding and dissociation rates. A theoretical analysis can also be performed.
（実施例２）
次に、標的物質をMellitinとし、認識物質として中性脂質であるDimyristoyl phosphatidylcholine（以下、「DMPC」とする。）と酸性脂質であるDimyristoyl phosphatidylglycerol（以下、「DMPG」とする。）を採用し、標的物質を含む試料溶液を表面プラズモン共鳴（以下、「SPR」とする。）センサーによって検出し、標的物質が検出された試料溶液から標的物質を各認識物質の脂質膜のリポソームにより回収後、円偏光二色性法および固体高分解能核磁気共鳴法（以下、「NMR」とする。）によってMellitinおよび各脂質膜の構造解析を行った。Melittinはミツバチ毒の主成分で脂質膜の融合や破壊を引き起こすアミノ酸残基２６の両親媒性ペプチドである。
(Example 2)
Next, the target substance is Melellitin, the neutral substance Dimyristoyl phosphatidylcholine (hereinafter referred to as “DMPC”) and the acidic lipid Dimyristoyl phosphatidylglycerol (hereinafter referred to as “DMPG”) are employed. After the sample solution containing the target substance is detected by a surface plasmon resonance (hereinafter referred to as “SPR”) sensor, the target substance is recovered from the sample solution in which the target substance is detected by liposomes of the lipid membrane of each recognition substance, The structure analysis of Mellitin and each lipid membrane was performed by the dichroism method and the solid high-resolution nuclear magnetic resonance method (hereinafter referred to as “NMR”). Melittin is an amphipathic peptide with amino acid residue 26 that is a main component of bee venom and causes fusion and destruction of lipid membranes.
図４は、本実施例の方法の説明及び使用する装置の概念図装置である。
図４の上部に示される流路（４２１）には測定用の緩衝液と試料溶液を導入できるように構成される。流路（４２１）は、流路（４２１）及び流路（４２２）に分岐され、一方はSPRセンサー（４１１）を備えた検出手段（４０１）に接続され、他方は混合手段である混合槽（４０３）に接続される。尚、流路の分岐箇所には図示しないが電磁切換弁が設けられ、流路（４２１）又は流路（４２２）への試料溶液の移動を任意に切り換えることができるように構成される。標的物質（４１４）が検出された試料溶液は、認識素子を混合するための混合槽（４０３）に移動できるように構成される。
混合槽（４０３）は、流路（４２３）を介して遠心分離手段（４０４）に接続される。
遠心分離手段（４０４）は、流路（４２４）を介して回収手段（４０２）に接続し、上清がポンプ（４０２）とドレインを介して外部に排出できるようにするとともに、沈殿物を試料として回収できるように構成される。
FIG. 4 is a conceptual diagram of an apparatus used for explaining the method of this embodiment.
The flow path (421) shown in the upper part of FIG. 4 is configured so that a measurement buffer solution and a sample solution can be introduced. The flow path (421) is branched into a flow path (421) and a flow path (422), one is connected to the detection means (401) provided with the SPR sensor (411), and the other is a mixing tank (mixing means) 403). In addition, although not shown in the figure, an electromagnetic switching valve is provided at a branch point of the flow path so that the movement of the sample solution to the flow path (421) or the flow path (422) can be arbitrarily switched. The sample solution in which the target substance (414) is detected is configured to be able to move to the mixing tank (403) for mixing the recognition element.
The mixing tank (403) is connected to the centrifugal separation means (404) via the flow path (423).
The centrifugal separation means (404) is connected to the recovery means (402) via the flow path (424) so that the supernatant can be discharged to the outside via the pump (402) and the drain, and the precipitate is sampled. Configured to be recovered as
検出手段（４０１）において認識物質（４１６）であるDMPCもしくはDMPG膜に対して、標的物質であるMellitin（４１４）の相互作用を動力学的解析により検出が行われる。
検出手段（４０１）について以下に詳述する。
SPRセンサー（４１１）表面に認識物質（４１６）であるDMPCもしくはDMPGを単層膜として固定化する。固定化の方法は次の通りである。
SPRセンサー（４１１）の固相表面が金であるため、これをオゾンプラズマで１０秒間処理し、さらにピランハ溶液（30%過酸化水素水と濃硫酸の混合溶液）で１０分間洗浄する。続いて、トルエンに溶解した5mMのn-Octadecanethiol溶液をセンサー表面に置き、１時間室温で放置することで、n-Octadecanethiolの自己組織化膜（４１２）が形成される。n-Octadecanethiolの自己組織化膜（４１２）ではメチル基が表面側にあるためSPRセンサー（４１１）表面が疎水性に改質される。次に認識物質（４１６）であるDMPCもしくはDMPGは、50nmのサイズのSUVに調整しておき、0.5mMのSUV濃度で疎水性に改質されたSPRセンサー（４１１）表面に反応させることで、認識物質（４１６）である各極性脂質の単相膜（４１６）としてSPRセンサー（４１１）表面に固定化することができる。
尚、SUVのサイズの調整は、各極性脂質を有機溶媒（DMPCの場合はクロロホルム、DMPGではクロロホルムとエタノールの混合溶液）に溶解し、極性脂質溶液をガラス上で真空乾燥させることで各脂質のフィルムを作製する。このフィルムを測定緩衝液で懸濁すると、各脂質の多重ベシクル小胞（以下、「MLV」とする。）を得ることができる。MLVを超音波処理することでSUVにし、所望のフィルターを通すことにより行うことができる。
In the detection means (401), the interaction of the target substance Melellitin (414) is detected by kinetic analysis with respect to the DMPC or DMPG film as the recognition substance (416).
The detection means (401) will be described in detail below.
DMPC or DMPG as a recognition substance (416) is immobilized as a single layer film on the surface of the SPR sensor (411). The immobilization method is as follows.
Since the solid phase surface of the SPR sensor (411) is gold, it is treated with ozone plasma for 10 seconds, and further washed with a piranha solution (mixed solution of 30% hydrogen peroxide and concentrated sulfuric acid) for 10 minutes. Subsequently, a 5 mM n-Octadecanethiol solution dissolved in toluene is placed on the sensor surface and allowed to stand at room temperature for 1 hour, whereby an n-Octadecanethiol self-assembled film (412) is formed. In the n-Octadecanethiol self-assembled film (412), since the methyl group is on the surface side, the surface of the SPR sensor (411) is modified to be hydrophobic. Next, the recognition substance (416), DMPC or DMPG, is adjusted to an SUV having a size of 50 nm and reacted with the surface of the SPR sensor (411) modified to be hydrophobic at an SUV concentration of 0.5 mM. It can be immobilized on the surface of the SPR sensor (411) as a single phase membrane (416) of each polar lipid as a recognition substance (416).
The size of the SUV can be adjusted by dissolving each polar lipid in an organic solvent (chloroform in the case of DMPC, or a mixed solution of chloroform and ethanol in DMPG), and vacuum drying the polar lipid solution on glass. Make a film. When this film is suspended in a measurement buffer, multiple vesicle vesicles (hereinafter referred to as “MLV”) of each lipid can be obtained. MLV can be sonicated to SUV and passed through the desired filter.
次に、認識物質としてDMPCを固定化したSPRセンサー（４１１）により、認識物質DMPC（４１６）とMelittin（４１４）との相互作用を測定し動力学解析を行った結果の模式図を図５に示す。
同図（ａ）は、SPRセンサー（４１１）に20μM，40μM，60μM，80μMのMellitin（４１４）の試料溶液（４１３）を導入してその経時変化を表している。
Mellitin濃度が20μMのシグナル変化（５０１）に比べ、40μMのシグナル変化（５０２）、60μMのシグナル変化（５０３）、80μMのシグナル変化（５０４）では濃度が高くなるにつれ、DMPCとMelittinとの相互作用が平衡に達し、シグナル変化が収束するまでの時間が短い事が分かる。
Next, FIG. 5 is a schematic diagram showing the result of measuring the interaction between the recognition substance DMPC (416) and Melittin (414) and performing the kinetic analysis using the SPR sensor (411) in which DMPC is immobilized as the recognition substance. Show.
FIG. 4A shows the change over time when a sample solution (413) of 20 μM, 40 μM, 60 μM, and 80 μM of Mellitin (414) is introduced into the SPR sensor (411).
The interaction between DMPC and Melittin increases with increasing concentrations of 40 μM signal change (502), 60 μM signal change (503), and 80 μM signal change (504) compared to 20 μM signal change (501). It can be seen that the time to reach equilibrium and the signal change converges is short.
このシグナル変化を用いて動力学解析を行ったものを同図（ｂ）に概念図として示す。
動力学解析方法は１対１の結合モデルで行う。SPRセンサー（４１１）上に固定化されている認識物質（Ａ）とそれと相互作用する標的物質（Ｂ）は結合し複合体（Ｃ）を形成する過程はＡ＋Ｂ⇔Ｃに従う平衡であり、その親和性は下記数１で定義される結合（解離）定数Ka(Kd)で定量化することができる（ここで、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］はそれぞれのモル濃度を示す）。
The dynamic analysis method is performed by a one-to-one coupled model. The recognition substance (A) immobilized on the SPR sensor (411) and the target substance (B) that interacts with the recognition substance (B) bind to each other to form a complex (C). sex can be quantified in binding as defined by the following Expression 1 (dissociation) constant K a (K d) (where, [a], [B] , [C] indicates the respective molar concentrations) .
図５（ｂ）は図５（ａ）のシグナル変化を数（３）でフィットし、各Melittin濃度における1/τを求め、Melittin濃度に対してプロット（５０５）した図である。このプロットの回帰直線（５０６）の切片および傾きから、DMPCとMelittinの相互作用における結合速度定数k+、解離速度定数k-および結合(解離)定数Ka(Kd)を求めることができる。
図５で示した方法と同様、DMPGとMelittin間の結合速度定数k+、解離速度定数k-を求めた結果、Melittinの親和性は酸性脂質であるDMPGの方が中性脂質であるDMPCに比べ高いことがわかる。
FIG. 5B is a diagram obtained by fitting the signal change of FIG. 5A with the number (3), obtaining 1 / τ at each Melittin concentration, and plotting (505) against the Melittin concentration. From the intercept and the slope of the regression line of the plot (506), + binding rate constant k in the interaction of DMPC and Melittin, dissociation rate constants k - can be determined and binding (dissociation) constant K a (K d).
Similar to the method shown in FIG. 5, the binding rate constant k + and the dissociation rate constant k − between DMPG and Melittin were determined, and as a result, the affinity of Melittin was more favorable for DMPG, which is an acidic lipid, than DMPC, which is a neutral lipid. You can see that it is expensive.
次に、混合手段（４０３）における工程について説明する。
混合手段（４０３）において、粒径20nmの金製ナノ粒子（４１７）を担体とし、これをDMPCもしくはDMPGのリポソーム（４１６）内に含有することにより構成された認識素子（４１８）と試料溶液が混合される。この混合手段（４０３）において認識素子（４１８）と標的物質であるMelittin（４１４）が相互作用により結合し、複合体（４１９）を形成する。
具体的には、20μMのMelittin試料溶液（４１３）を混合槽（４０３）に導入し、各脂質の認識物質（４１６）と金ナノ微粒子の担体（４１７）で構成される認識素子（４１８）と混合し、認識素子（４１８）により標的物質Melittin（４１４）を捕捉して複合体（４１９）を形成させる。
認識素子（４１８）は、認識物質（４１６）の前記SUV作成方法において、認識物質（４１６）の脂質膜フィルムを緩衝液で懸濁しMLVを調製する工程において、緩衝液の代わりに20nmの粒径の金ナノ微粒子（４１７）溶液を用いることで調整することができる。その他の工程は前記方法と同じである。
Next, steps in the mixing means (403) will be described.
In the mixing means (403), a recognition element (418) constituted by containing gold nanoparticles (417) having a particle diameter of 20 nm as a carrier and containing them in DMPC or DMPG liposomes (416) and a sample solution are obtained. Mixed. In this mixing means (403), the recognition element (418) and the target substance Melittin (414) are bonded by interaction to form a complex (419).
Specifically, a 20 μM Melittin sample solution (413) is introduced into the mixing vessel (403), and a recognition element (418) composed of a lipid recognition substance (416) and a gold nanoparticle carrier (417) is provided. After mixing, the target substance Melittin (414) is captured by the recognition element (418) to form a complex (419).
In the SUV preparation method of the recognition substance (416), the recognition element (418) is prepared by suspending the lipid membrane film of the recognition substance (416) in a buffer solution to prepare MLV. It can adjust by using the gold nanoparticle (417) solution. The other steps are the same as in the above method.
これらの混合液は遠心分離手段（４０４）に移動し、認識素子−標的物質複合体（４１９）が遠心によって沈殿物として分離する。
具体的には、認識素子−Mellitin複合体（４１９）を13,000rpmで３０分遠心後、沈殿物を緩衝液で再懸濁することで複合体（４１９）を回収する。
These mixed liquids move to the centrifugal separation means (404), and the recognition element-target substance complex (419) is separated as a precipitate by centrifugation.
Specifically, the recognition element-Mellitin complex (419) is centrifuged at 13,000 rpm for 30 minutes, and the precipitate is resuspended with a buffer solution to recover the complex (419).
遠心分離後、上清液はドレインへ回収され、沈殿物は緩衝液に再懸濁される。再懸濁された認識素子−標的物質複合体（４１９）を回収する。 After centrifugation, the supernatant is collected into the drain and the precipitate is resuspended in buffer. The resuspended recognition element-target substance complex (419) is recovered.
上記方法によって回収されたDMPCおよびDMPGと粒径20nmの金ナノ微粒子から構成される認識素子とMelittinとの結合複合体を円偏光二色性法および固体NMR法によって構造解析を行った。円偏光二色性法によって、Melittinの二次構造解析を行った結果、222nmにおけるellipticityから、DMPG膜に結合したMelittinではαへリックス構造をとっていることが確認できるのに対し、DMPC膜に結合したMelittinでは二次構造が溶液状態と変化がないことが分かる。また、固体NMR法は、Biochimica et Biophysica Acta 1558,34-44(2002)（非特許文献１１）記載の方法にしたがって、31Pを観測核として測定した。結果、DMPCおよびDMPGの相転移点温度(Tm)がMelittinが結合した場合に変化していることがわかる。また、マジック角回転（MAS）法を用いて等方化学シフト値を比較すると、DMPCとDMPGともにMelittinが結合することで変化し、また、その変化量はDMPG膜のほうが大きいことが分かる。このことから、Melittinは酸性脂質であるDMPGに対して２次構造変化を伴うより安定した結合を行い、より大きな構造変化を誘起していることが示唆される。 The structure of the combined complex of the recognition element composed of DMPC and DMPG collected by the above method and gold nanoparticles with a particle size of 20 nm and Melittin was analyzed by the circular dichroism method and the solid state NMR method. As a result of the secondary structure analysis of Melittin by the circular dichroism method, it can be confirmed from the ellipticity at 222 nm that Melittin bonded to the DMPG film has an α-helical structure, whereas the DMPC film has It can be seen that the bound melittin has no change in secondary structure from the solution state. Moreover, solid-state NMR was measured using 31 P as an observation nucleus according to the method described in Biochimica et Biophysica Acta 1558, 34-44 (2002) (Non-patent Document 11). As a result, it can be seen that the phase transition temperature (T m ) of DMPC and DMPG changes when Melittin is bound. In addition, when the isotropic chemical shift values are compared using the magic angle rotation (MAS) method, it can be seen that both DMPC and DMPG change when Melittin binds, and that the amount of change is larger in the DMPG film. This suggests that Melittin binds more stably with secondary structure change to DMPG, which is an acidic lipid, and induces a larger structure change.
このように、本発明を用いることで、脂質膜を認識物質とした物質間相互作用をモニターすると同時に被検出対象標的物質を認識物質のリポソームである認識素子に捕捉したサンプルによって円偏光二色性法および固体NMR法によって詳細な構造解析に使用することができる。また、動的光散乱やゼータ電位によって認識素子であるリポソームのサイズを計測し、Melittinの脂質膜に対する機能を知ることも可能である。
実施例２では相互作用解析は単純化するために検出のみとしたが、様々な濃度の試料をセンサー上にアプライすることによって結合（解離）定数を求めるアフィニティー解析やその結合および解離速度から速度論解析を行うこともできる。
As described above, by using the present invention, the circular dichroism is detected by the sample in which the target substance to be detected is captured by the recognition element which is the liposome of the recognition substance while monitoring the interaction between substances using the lipid membrane as the recognition substance. And can be used for detailed structural analysis by solid state NMR. It is also possible to know the function of Melittin on lipid membranes by measuring the size of the liposome as a recognition element by dynamic light scattering or zeta potential.
In Example 2, the interaction analysis is performed only for the sake of simplicity, but the kinetics based on the affinity analysis for obtaining the binding (dissociation) constant by applying various concentrations of the sample on the sensor and the binding and dissociation rates. Analysis can also be performed.
また、水晶振動子の計測では、特願2005-192612に示されるような水晶振動子の基本波の共振点付近のコンダクタンスの最大値の1/2になる周波数（Ｆ１、Ｆ２）およびこのオーバートーンのＦ１、Ｆ２を用いて質量負荷、粘性負荷および粘弾性負荷を解析する方法や、Q-sence AB社が提案しているQCM-Dと呼ばれる測定方法により、質量付加の正確な測定、固定化されたフィルム膜の粘弾性変化および溶液の粘性変化を測定することにより、より正確な相互作用解析が行えることは言うまでもない。また、その他の手法、例えばエリプソメーターや二面編波式干渉法といった方法でも計測は可能である。 Further, in the measurement of the crystal resonator, the frequencies (F1, F2) which are half the maximum conductance near the resonance point of the fundamental wave of the crystal resonator as shown in Japanese Patent Application No. 2005-192612 and this overtone Accurate measurement and immobilization of mass addition using the method of analyzing mass load, viscous load and viscoelastic load using F1 and F2, and the measurement method called QCM-D proposed by Q-sence AB It goes without saying that a more accurate interaction analysis can be performed by measuring the viscoelastic change of the film film and the viscosity change of the solution. Measurement can also be performed by other methods such as an ellipsometer or a two-sided knitting wave interferometry.
本発明は、生化学研究等の研究・開発分野やこれに関する製品の分野において広く利用することができる。 The present invention can be widely used in research / development fields such as biochemical research and related product fields.
１０１ 容器
１０２ 試料ポンプ
１０３ 第一撹拌槽（混合手段）
１０４ 第一分離槽
１０５ 磁力発生手段
１０７ 第二分離槽
１１１ 試料溶液Ａ
１１２，１１３ 抗ＢＳＡに結合する物質
１１４ 試料溶液Ｂ
１１５ ＢＳＡ
１１７ 抗ＢＳＡ抗体
１１８ 水晶振動子
１２０ 常磁性粒子
１２１ 認識素子
１２３，１２４，１２５，１２６，１２７，１２８ 流路
４０１ 検出手段
４０２ 回収手段
４０３ 混合槽（混合手段）
４０４ 遠心分離手段
４１１ SPRセンサー
４１２ 自己組織化膜
４１３ 試料溶液
４１４ 標的物質
４１６ 認識物質
４１７ 微粒子担体
４１９ 複合体
４２１，４２２，４２３，４２４ 流路
101 Container 102 Sample pump 103 First stirring tank (mixing means)
104 First separation tank 105 Magnetic force generating means 107 Second separation tank 111 Sample solution A
112,113 Substance that binds to anti-BSA 114 Sample solution B
115 BSA
117 Anti-BSA antibody 118 Crystal resonator 120 Paramagnetic particle 121 Recognition element 123, 124, 125, 126, 127, 128 Flow path 401 Detection means 402 Collection means 403 Mixing tank (mixing means)
404 Centrifugal Means 411 SPR Sensor 412 Self-assembled Membrane 413 Sample Solution 414 Target Substance 416 Recognizing Substance 417 Fine Particle Carrier 419 Complex 421,422,423,424
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