JP4635273B2 - 神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞増殖促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、神経疾患の治療に用いることができる神経幹細胞、神経前駆細胞のインビトロでの培養の増殖率を増大させる新規な増殖促進剤、及びこれを有効成分として含む培養培地に関する。

神経疾患の治療として、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を移植し、損傷された中枢神経を再生する再生医療が注目されている。
神経疾患治療用の一定品質の神経幹細胞、神経前駆細胞を、必要量供給し続けるためには、安全性が担保された方式でのインビトロでの大量培養が必要となる。

このような移植用の細胞の培養には、組成が明らかでない血清を含んだ培地より、配合成分の種類と量が判明した無血清培地で培養することが、安全性確保の観点から望まれる。また、血清には、成分の同定できない未知の分化誘導剤が含まれているので、この点からも、無血清培地で培養することが望まれる。

神経幹細胞の無血清培地としては、例えば、特許文献１に開示されているように、細胞の生存に必要な基本培地、すなわち糖類、無機塩類、微量元素、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミンを含む培地（例えばＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）に、神経幹細胞の増殖を刺激する増殖因子を含有させたものが用いられる。
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＦＧＦ２が必要であると認識されており、増殖率の増大のために、例えば、特許文献１に開示されてように、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ＬＩＦ又はこれらの組合わせが添加されることが好ましい。

さらに、近年では、増殖率を上げるための成分として、その他の増殖因子やグリコサミノグリカンを添加した培地で培養することが提案されている。例えば、特表平１０−５０９５９２（特許文献２）に、インビトロにおける神経幹細胞の増殖調節方法として、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパラン硫酸を添加することを開示している。また、特許文献１には、ＥＧＦ、ＦＧＦ２に加えて、さらに白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を添加することが提案されている。さらに、特許文献１には、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＬＩＦに加えて、ヘパリンを添加することが提案されている。

特表２００２−５１８９９０ 特表平１０−５０９５９２

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖率を増大させることができる新たな増殖促進剤を提供することにある。

本発明者らは、一般に増殖因子として認識されていないＭＣＰ−１が、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（以下、これらを区別することなくいうときは、「神経幹細胞／前駆細胞」という）の増殖促進に寄与することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の神経幹細胞／前駆細胞増殖促進剤は、ヒト由来のＭＣＰ−１を有効成分とする。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞増殖促進剤は、インビトロでの培養に好適に用いられる。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞の培養方法は、インビトロの培養方法であって、１ｎｇ／ｍｌ以上のＭＣＰ−１存在下で培養することを特徴とする。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞用培養培地は、細胞の生存に必要な基本培地に、ＭＣＰ−１が１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以上添加されているものである。ＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＬＩＦの少なくともいずれか１つが含有されていなくてもよいし、さらにいずれも含有されていなくてもよい。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞増殖促進剤は、基本培地に添加するだけで、神経幹細胞／前駆細胞の増殖率を促進することができる。しかも従来より必要と考えられていた増殖因子であるＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＬＩＦのいずれも含有していない培地であっても、本発明の神経幹細胞／前駆細胞増殖促進剤を添加することにより増殖率を増大させることが可能である。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞の増殖促進剤は、ＭＣＰ−１を有効成分とする。インビトロでＭＣＰ−１存在下で培養すると、神経幹細胞／前駆細胞の増殖が促進され、特にＭＣＰ−１の濃度が１ｎｇ／ｍｌ以上のときには、従来より増殖促進に必要と考えられている増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＬＩＦ）不在下であっても増殖を促進することができる。

ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は、塩基性でヘパリン結合性の高い９２〜９９アミノ酸からなるペプチドタンパク質群であるケモカインの１種で、最初の２つのシステイン残基が隣接してＣ−Ｃ構造をとっているＣ−Ｃケモカイン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に分類される。その受容体であるＣＣＲ２（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＣＣＲ１１が知られており、これらは、７回膜貫通型Ｇ蛋白質共役型受容体として知られている。

このようなＭＣＰ−１は、従来より、単球、マクロファージ、繊維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞から産生されることが知られている。さらに、今回、本発明者らにより、神経幹細胞又は神経前駆細胞から産生されることが見出された。

本発明に用いられるＭＣＰ−１は、産生細胞の種類は限定しない。従って、単球、マクロファージといった免疫担当細胞；繊維芽細胞、血管内皮細胞、尿細胞管上皮細胞といった上皮細胞；平滑筋細胞、さらには神経幹細胞／前駆細胞から産生されるＭＣＰ−１いずれであってもよい。また、神経幹細胞／前駆細胞から産生されるＭＣＰ−１の場合、脳由来であっても、脊髄由来であってもよいが、脊髄由来の神経幹細胞／前駆細胞は少量であるから、脳由来神経幹細胞から産生されるＭＣＰ−１が好ましく用いられる。

増殖促進剤に用いられるＭＣＰ−１は、従来より公知の遺伝子組み換えの手法を利用して大量生産したものを用いることができる。例えば、プラスミド等のベクターを用いて、これに、ヒトＭＣＰ−１に対応するｃＤＮＡ、このＤＮＡの転写に必要なプロモータを組み入れて発現ベクターを作成し、大腸菌等を宿主細胞として培養、分泌させることにより、本発明に用いるＭＣＰ−１を大量生産することができる。尚、培養液からＭＣＰ−１を採取するにあたっては、孔サイズ０．２２μｍ程度以下のフィルターを用いて濾過すればよい。

尚、ＭＣＰ−１が神経系の細胞から分泌されているとの報告としては、脳損傷時、アストロサイトからＭＣＰ−１が分泌される（Ｇｌａｂｉｎｓｋｉ ＡＲ，Ｂａｌａｓｉｎｇａｍ Ｖ，Ｔａｎｉ Ｍ，Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ，Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ＲＭ，Ｙｏｎｇ ＶＷ，Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ＲＭ，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４３６３−８，１９９６）。また、β−アミロイドが脳腫瘍細胞のＵ３７３ＭＧ細胞を刺激して、ＭＣＰ−１を発現することが報告されている（Ｐｒａｔ Ｅ，Ｂａｒｏｎ Ｐ，Ｍｅｄａ Ｌ，Ｓｃａｒｐｉｎｉ Ｅ，Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ Ｄ，Ａｒｄｏｌｉｎｏ Ｇ，Ｃａｔａｎｉａ Ａ，Ｓｃａｒｌａｔｏ Ｇ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｕ３７３ＭＧ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）−１ ｕｐｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２８３：１７７−８０，２０００）。ヒト胚性癌細胞（Ｎｔｅｒａ ２、以下「ＮＴ２細胞」と略記）とそれを分化させて作成した神経細胞（ＮＴ２−Ｎ細胞）、ヒト胎児脳組織から樹立した正常ヒト神経細胞（１２−１５週齢由来）、正常アストロサイト（１０−１７週齢由来）を用いて検討した結果、ＮＴ２−Ｎとヒト正常アストロサイトからＭＣＰ−１が分泌されるが、未分化のＮＴ２細胞からはＭＣＰ−１が分泌されなかったこと、ＭＣＰ−１のレセプターのＣＣＲ２に関してはＮＴ２−２Ｎ、ヒト正常神経細胞の両方に発現していることが報告されている（Ｃｏｕｇｈｌａｎ ＣＭ，ＭｃＭａｎｕｓ ＣＭ，Ｓｈａｒｒｏｎ Ｍ，Ｇａｏ Ｚ，Ｍｕｒｐｙ Ｄ，Ｊａｆｆｅｒ Ｓ，Ｃｈｏｅ Ｗ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ Ｊ，Ｇａｙｌｏｒｄ Ｈ，Ｋａｌｙｕｚｈｎｙ Ａ，Ｌｅｅ ＶＭ，Ｗｏｌｆ Ｂ，Ｄｏｍｓ ＲＷ，Ｋｏｌｓｏｎ ＤＬ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．９７：５９１−６００．２０００）が、神経幹細胞からの分泌の可能性、およびその増殖との関連は、報告されていない。

一方、ヒト神経幹細胞が分泌するサイトカインについて検討した論文（Ｋｌａｓｓｅｎ ＨＪ，Ｉｍｆｅｌｄ ＫＬ，Ｋｉｒｏｖ ＩＩ，Ｔａｉ Ｌ，Ｇａｇｅ ＦＨ，Ｙｏｕｎｇ ＭＪ，Ｂｅｒｍａｎ ＭＡ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２００３ Ｍａｙ；２２（３−４）：１０１−６）において、ＭＣＰ−１が発現されることは報告されていない。

また、ヒト胎児由来の神経幹細胞／前駆細胞を発現しているケモカインレセプターについては、ＣＣＲ３（リガンドはｅｏｔａｘｉｎ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−４）とＣＸＣＲ４（リガンドはＳＤＦ−１）が報告されており、これらのレセプターのリガンドは、ヒト神経幹細胞／前駆細胞の増殖を抑えて分化を抑制して、ヒト神経幹細胞／前駆細胞の状態維持に貢献することが記載されている（Ｋｒａｔｈｗｏｈｌ ＭＤ、Ｋａｉｓｅｒ ＪＬ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｑｕｉｅｓｃｅｎｅｃｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２２：１０９−１８，２００４）。また、ＣＣＲ２がラットの神経細胞とアストロサイトに発現していること、その発現が脳内に誘起させた炎症反応で上昇すること、脳室内にＭＣＰ−１を注入した場合、ラットの運動、行動に対する影響が見られたことが報告されている（Ｂａｎｉｓａｄｒ Ｇ，Ｑｕｅｒａｕｄ−Ｌｅｓａｕｘ Ｆ，Ｂｏｕｔｔｅｒｉｎ ＭＣ，Ｐｅｌａｐｒａｔ Ｄ，Ｚａｌｃ Ｂ，Ｒｏｓｔｅｎｅ Ｗ，Ｈａｏｕｒ Ｆ，Ｐａｒｓａｄａｎｉａｎｔｚ ＳＭ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＣＲ２ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８１巻：２５７−２６９，２００２）が、神経幹細胞での発現状態やその機能に関する記載はない。また、２１−２３週齢のヒト胎児脳より樹立したＧＦＡＰ陽性のアストロサイトにＭＣＰ−１のレセプターのＣＣＲ２が発現していること、１ｎＭの濃度を最高点として、アストロサイトの走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）を促進すること、アストロサイトがＭＣＰ−１に反応してカルシウム排泄が変動することが記載されている（Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃ ＡＶ．Ｓｏｎｇ Ｌ，Ｄｚｅｎｋｏ ＫＡ，Ｃｏｎｇ Ｈ，Ｐａｃｈｔｅｒ ＪＳ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ２ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７０巻、２１９−２３１頁，２００２）。また、ヒトアストロサイトにＣＣＲ２が発現していて、ヒトアストロサイトはＭＣＰ−１に反応して増殖することが報告されている（Ｒｅｚａｉｅ Ｐ，Ｔｒｉｌｌｏ−Ｐａｚｏｓ Ｇ，Ｅｖｅｒａｌｌ ＩＰ，Ｍａｌｅ ＤＫ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ＣＮＳ．Ｇｌｉａ．３７：６４−７５．２００２）。

このように、ＭＣＰ−１が神経幹細胞又は前駆細胞から分泌されるとの報告はない。また、ＭＣＰ−１の生理活性としても、単球／マクロファージ浸潤、活性化による炎症選延；Ｔｈ１／Ｔｈ２制御；血管内皮細胞の遊走からの血管新生作用；流血中の探求と血管内皮細胞との接着などが報告されている。また、ＭＣＰ−１発現は動脈硬化の危険因子である高脂血症はじめ動脈硬化が生じやすい動脈分岐部などにおける乱流や層流、ずり応力の変化により亢進すること；ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩＬ−１、ＴＮＦ刺激により線維芽細胞様の滑膜細胞がＭＣＰ−１を産生することなどが報告されている。しかしながら、神経幹細胞、神経前駆細胞との関係は報告されていない。

本発明の神経幹細胞／前駆細胞の増殖培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩類、糖類、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン、微量元素）を含む基本培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ−１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）に、本発明の増殖促進剤であるＭＣＰ−１を含むものである。

ＭＣＰ−１は、１ｎｇ／ｍｌ以上含有することが好ましい。１ｎｇ／ｍｌ以上含有することで、従来より増殖に必要であると認識されていた増殖因子（塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ））の増殖効果を増強することが可能であり、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度では、これらの増殖因子が不在下であっても、これらが存在するときと同程度に増殖することができる。

尚、本発明の増殖培地には、基本培地に、ＭＣＰ−１を含有するものであればよいが、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を含有してもよい。これらが共存する場合には、ＭＣＰ−１の含有濃度を減らすことができる。さらにこれらの増殖因子を併用することにより、ＭＣＰ−１単独で培養するときよりも増殖率が増大する。

また、増殖率を増大させるために、さらにインスリン、プロゲステロン、プタレッシン、トランスフェリン、セレナイトの添加物、あるいは神経細胞培養用添加物が含まれているＢ２７添加物やＮ２添加物と、必要に応じて、ヘパリンやヘパラン硫酸又はこれらの脱硫酸化グリコサミノグリカンが含有されていてもよい。また、必要に応じて、抗生物質が含有されていてもよい。

〔神経幹細胞／前駆細胞〕
ヒト神経幹細胞／前駆細胞は、国立病院大阪医療センター倫理委員会及び産業技術総合研究所の倫理委員会承認の下、ヒト胎児前脳ならびに脊髄部より取り出した神経幹細胞及び神経前駆細胞（以下、これらをまとめて「ｈＮＳＰＣ」という）を神経幹細胞増殖培地で継代培養して得られたニューロスフェアを測定に用いた。

〔神経幹細胞培養培地〕
下記実施例で使用した培地組成は、以下の通りである。
（ａ）増殖因子入り神経幹細胞培養培地
ＤＭＥＭ ／Ｆ１２（１：１混合物、シグマ社）
ヒト組換え（以下「ｈｒ−」と略記する）ＥＧＦ（Pepro Tech社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＦＧＦ２（Pepro Tech社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＬＩＦ（ケミコン・インターナショナル社）１０ｎｇ／ｍｌ
ヘパリン（シグマ社）５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ２７（インビトロジェン社）
ＨＥＰＥＳ１５ｍＭ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロジェン社）

（ｂ）増殖因子無添加神経幹細胞培養培地
ＤＭＥＭ ／Ｆ１２（１：１混合物、シグマ社）
ヘパリン（シグマ社）５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ２７（インビトロジェン社）
ＨＥＰＥＳ１５ｍＭ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロジェン社）

〔細胞増殖評価法〕
ｈＮＳＰＣの増殖評価は、ＡＴＰ測定法にて、実施した。ｈＮＳＰＣを１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で、９６ウェルに播種後、ＡＴＰ法の発光試薬（ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧＬＯプロメガ）を加えて、それぞれの発光量を発光プレートリーダーにより測定し、細胞増殖を評価した。

〔ｈＮＳＰＣの培養上清に発現する液性因子の探索〕
脳由来ｈＮＳＰＣ（ＮＳＣ１２）を前述の増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地（ａ）で７５Ｔフラスコに１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で播種後、１週間培養した後、培養液を回収した。この培養液を、孔サイズが０．２２μｍのフィルターで濾過、細胞及び細胞くずを除去して、培養上清を得た。この培養上清について、ＲａｙＢｉｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、以下の方法により、培養上清中に発現しているサイトカインを検出した。

各種サイトカインが貼付けられたメンブレンをブロッキングバッファー（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）で１時間、室温でゆるやかに振盪しながら培養した。ブロッキングバッファーの除去後、培養上清サンプルを１ｍｌ添加し、４℃でゆるやかに振盪しながら、一晩、インキュベートして、培養上清に含まれるサイトカインをメンブレン上の抗体に結合させた。培養上清サンプルを除去した後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を２ｍｌを用いて５分間で３回振盪しながら洗浄し、次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を２ｍｌ用いて、５分間で２回振盪しながら洗浄した。

メンブレン上の抗体に結合したサイトカインの二次抗体として、ビオチン結合抗体を２時間室温でゆるやかに振盪しながら、反応させた。未反応のビオチン結合抗体を除去し、洗浄した後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを１時間室温でゆるやかに振盪しながら、インキュベートし、洗浄後、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を１ｍｌ添加し、室温で５分間ゆるやかに２回振盪しながら反応させ、水分を軽く除去した後、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いて、シグナルを検出した。

コントロールとして、細胞を培養しなかった培地のみについて、ＲａｙＢｉｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙを用いて、同様に、インキュベートした後、洗浄後、ビオチン結合抗体と反応させ、洗浄後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンと反応させ、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いて、シグナルを検出した。

コントロール及びＮＳＰＣ培養上清のＸ−Ｒａｙフィルムのうち、ＭＣＰ−１部分の結果を図１に示す。コントロール（図１（ａ））では、何等シグナルが検出されなかったのに対し、ｈＮＳＰＣの培養上清ではシグナルが検出され、ＭＣＰ−１が存在することが判明した。

〔ｈＮＳＰＣの培養上清によるＭＣＰ−１産生の経時変化の測定〕
ｈＮＳＰＣを前述の増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地（ａ）で７５Ｔフラスコに１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で播種し、培養開始直後、１日目、３日目、６日目、９日目と経時的に培養液を回収した。回収した培養液を、孔サイズが０．２２μｍのフィルターで濾過して、細胞及び細胞くずを除去して、各培養時の培養上清を得た。

これらの培養上清１０μｌづつ、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル濃度勾配ゲル（第１化学薬品製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった後、セミドライトランスファー法により、ニトロセルロース膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にゲル中のタンパク質を転写した。抗体の膜への非特異的吸着を抑止するため、５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、リン酸緩衝液入り生理食塩水（ＰＢＳ）にて処理した後、抗ヒトＭＣＰ−１抗体（ｒａｂｉｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＭＣＰ−１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＰＥＲＰＲＯＴＥＣＨ社製）と反応させ、さらにＰＢＳにて洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。バンドの検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いたＥＣＬ法にて一次抗体が認識結合した蛋白質のバンドを検出した。ＭＣＰ−１は、８．６ｋＤａのバンドとして現れる。

図２より、ｈＮＳＰＣの培養上清には、８．６ｋＤａの位置に、培養日数が経るにつれて、濃くなっていくことがわかる。つまり、ＭＣＰ−１が培養によりｈＮＳＰＣから分泌され、培養上清中に蓄積されたことがわかった。

〔他の細胞の培養上清におけるＭＣＰ−１の分泌測定〕
脳由来ｈＮＳＰＣ（ＮＳＣ１２）以外で、同じヒト脳由来の２つのｈＮＳＰＣ（ＮＳＣ５、ＮＳＣ６）及び脊髄由来ｈＮＳＰＣの３細胞（ＮＳＣ８、ＮＳＣ９、ＮＳＣ１３）も、同様にして培養開始直後、１週間後の培養液を回収した。回収した培養液を０．２２μｍのフィルターで濾過して、細胞及び細胞くずを除去して、培養上清を得た。

この培養上清について、前述と同様にして、アクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ニトロセルロース膜に転写させた。非特異吸着をブロックして、抗ヒトＭＣＰ−１抗体、続いてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体と反応させ、ＭＣＰ−１のバンドを検出した。結果を図３に示す。

図３から、ヒト脳由来の神経幹細胞、神経前駆細胞（ＮＳＣ５、ＮＳＣ６、ＮＳＣ１２）の培養上清では、８．６ｋＤａのバンドが穀現れ、ＭＣＰ−１が分泌されたことが確認できた。一方、脊髄由来の神経幹細胞、前駆細胞（ＮＳＣ８、ＮＳＣ９、ＮＳＣ１３）では、あまり濃いバンドは得られなかった。従って、インビトロ培養中におけるＭＣＰ−１の分泌は、脳由来のｈＮＳＰＣからが顕著であると考えられる。

〔神経幹細胞の培養に対するＭＣＰ−１添加の影響〕
前述の増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地（ａ）で培養されている脳由来ｈＮＳＰＣに、様々な濃度のヒト組換えＭＣＰ−１（ｒｈ−ＭＣＰ−１、ＰＥＲＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加し、各濃度における細胞増殖をＡＴＰ法で評価した。

結果を図４に示す。図４から、ＭＣＰ−１の添加濃度が高い程、脳由来ｈＮＳＰＣの増殖率が高くなっていた。従って、ＭＣＰ−１は増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＬＩＦ）の作用を増強させて、脳由来ｈＮＳＰＣの増殖促進に役立つことがわかる。

〔神経幹細胞に対する抗ＭＣＰ−１抗体の添加の影響〕
増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地（ａ）に、様々な濃度の抗ＭＣＰ−１抗体（ＰＥＲＰＲＯＴＥＣＨ社製）を添加して、脳由来ヒト神経幹細胞／前駆細胞を培養し、各濃度における細胞増殖をＡＴＰ法で評価した。結果を図５に示す。

図５より、抗ＭＣＰ−１抗体の添加濃度に依存して、脳由来ｈＮＳＰＣの増殖が抑制されることがわかった。従って、培養上清中にｈＮＳＰＣから分泌されたＭＣＰ−１が、脳由来ｈＮＳＰＣの増殖に関与していることがわかる。

〔ＭＣＰ−１のｈＮＳＰＣの増殖因子としての評価〕
増殖因子無添加の神経幹細胞培地（ｂ）に、種々の濃度でＭＣＰ−１を添加して、脳由来ｈＮＳＰＣを６日間培養し、増殖率を測定した。結果を図６に示す。参考のために、前述の増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地（ａ）の増殖率の測定結果を併せて図６に示す。

ＭＣＰ−１を添加することで、増殖因子を全く含有していないコントロールよりもｈＮＳＰＣの増殖率は上昇することが判明した。さらに、１０００ｎｇ／ｍｌを添加した場合には、３つの増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＬＩＦ）のいずれも存在しなくても、増殖因子入りｈＮＳＰＣ用培養培地を用いた培養と同程度の増殖率を示した。従って、ＭＣＰ−１は、単一で従来の３種類のの増殖因子の配合に匹敵する増殖促進効果を有することがわかる。

〔脊髄由来ｈＮＳＰＣに対するＭＣＰ−１添加の効果〕
増殖因子添加の培地（ａ）に、ＭＣＰ−１を種々の濃度で添加して、脊髄由来ｈＮＳＰＣを培養し、増殖率を測定した。参考のために、脳由来のｈＮＳＰＣを増殖因子添加の培地（ａ）で培養した場合の増殖率の測定結果を、併せて図７に示す。図７中、ＦＢｒが脳由来ｈＮＳＰＣの場合であり、縦軸は、ＭＣＰ−１を含まないときのＦＢｒの増殖率を１００％としたときの増殖率を示している。

脊髄由来のｈＮＳＰＣは、ＭＣＰ−１を含有しない場合には、脳由来のｈＮＳＰＣの４０％程度の増殖率しか示さないが、ＭＣＰ−１を添加すると、濃度依存的に増殖率が増大していることがわかる。従って、ＭＣＰ−１は、増殖率が一般に劣っている脊髄由来ｈＮＳＰＣの増殖促進剤としても有効である。

本発明の神経幹細胞増殖促進剤は、従来より増殖促進に必要と考えられてきた増殖因子ＥＧＦ、ＦＧＦ２、及びＬＩＦの同時添加と同等の増殖効率を、単独で得ることができるので、他の増殖因子との作用を考慮することなく、ｈＮＳＰＣの増殖を促進することができる。従って、神経幹細胞のインビトロでの培養を効率よく行なうための増殖促進剤として利用できる。

コントロール及びＮＳＰＣの培養上清のＭＣＰ−１検出の有無の測定結果を示すＸレイフィルムである。 培養ｈＮＳＰＣのＭＣＰ−１分泌に関する経時変化をウエスタンブロット法で測定した結果である。 他の細胞のＭＣＰ−１分泌についてウエスタンブロット法で測定した結果である。 ＭＣＰ−１濃度と増殖率との関係を示すグラフである。 抗ＭＣＰ−１抗体濃度と増殖率との関係を示すグラフである。 増殖因子の存在及び不在下における増殖率を示すグラフである。 脊髄由来の神経幹細胞／前駆細胞におけるＭＣＰ−１濃度と増殖率との関係を示すグラフである。

Claims (7)

1. ヒト由来のＭＣＰ−１を有効成分とする神経幹細胞／前駆細胞の増殖促進剤。
2. インビトロでの培養に用いられる請求項１に記載の神経幹細胞／前駆細胞の増殖促進剤。
3. １ｎｇ／ｍｌ以上のＭＣＰ−１存在下で培養する神経幹細胞／前駆細胞のインビトロ培養方法。
4. 細胞の生存に必要な基本培地に、ＭＣＰ−１が１ｎｇ／ｍｌ以上添加されている神経幹細胞／前駆細胞用培養培地。
5. ＭＣＰ−１を１０００ｎｇ／ｍｌ以上含有する請求項４に記載の神経幹細胞／前駆細胞用培養培地。
6. ＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＬＩＦの少なくともいずれか１つを含有しない請求項４又は５に記載の神経幹細胞／前駆細胞用培養培地。
7. ＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＬＩＦのいずれも含有しない請求項６に記載の神経幹細胞／前駆細胞用培養培地。