JP4632791B2 - Cell culture vessel - Google Patents
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Description
本発明は、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換されてなるプラスチック製細胞培養容器に関する。 The present invention relates to a plastic cell culture vessel in which a part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting a polymer is substituted with fluorine atoms.
近年、機能障害や機能不全に陥った生体組織および臓器に対して、細胞を積極的に利用して、その機能の再生をはかることを目的とした再生医療の分野が発展してきた。哺乳動物から健常な細胞取り出し、該細胞を生体外で培養した後、再び生体に戻す技術もこの一環である。 In recent years, the field of regenerative medicine has been developed in which cells are actively used for biological tissues and organs that have become dysfunctional or dysfunctional to regenerate their functions. Part of this is a technique in which healthy cells are removed from mammals, cultured in vitro, and then returned to the living body.
従来、哺乳動物の付着細胞や懸濁細胞を生体外で行う培養は、ポリスチレン製のシャーレの中で行われてきた。しかし、このような容器はガス透過性が低いため、細胞増殖に必要な酸素や二酸化炭素の交換を十分行うために、培養液の液厚を３ｍｍ程度とし、容器中に空気層を設けなくては、十分な細胞増殖が得られなかった。従って、細胞を大量に培養するときには、無駄な空間があるため、多くのスペースを必要としていた。 Conventionally, culture in which mammalian adherent cells and suspension cells are performed in vitro has been performed in a petri dish made of polystyrene. However, since such a container has low gas permeability, in order to sufficiently exchange oxygen and carbon dioxide necessary for cell growth, the thickness of the culture solution is about 3 mm, and an air layer is not provided in the container. Did not provide sufficient cell growth. Therefore, when culturing a large amount of cells, a lot of space is required because there is a useless space.
かかる問題を解決すべく、アイオノマーで形成された細胞培養容器（特許文献１）、ポリエチレンシートで形成された細胞培養容器（特許文献２〜４）、ポリ−４−メチルペンテン−１樹脂とポリ−４−メチルペンテン−１樹脂以外のポリオレフィン樹脂で形成された細胞培養容器（特許文献５）、含フッ素溶融樹脂からなる培養器（特許文献６，７）等が報告されている。これらの細胞培養容器は、ガス透過性が高く、容器一杯に培養液を充填し、培養することが可能である。従ってポリスチレン製のシャーレで培養するよりも培養スペースを小さくできるため、大量培養に適している。 In order to solve such a problem, a cell culture vessel formed of ionomer (Patent Document 1), a cell culture container formed of polyethylene sheet (Patent Documents 2 to 4), poly-4-methylpentene-1 resin and poly- A cell culture vessel (Patent Document 5) formed of a polyolefin resin other than 4-methylpentene-1 resin (Patent Document 5), an incubator made of a fluorine-containing molten resin (Patent Documents 6 and 7), and the like have been reported. These cell culture containers have high gas permeability, and can be cultured by filling the culture solution into a full container. Therefore, the culture space can be reduced as compared with the case of culturing in a petri dish made of polystyrene, which is suitable for mass culture.
しかしながら、さらに培養スペースを効率化するために、優れた細胞増殖効果を有し、大量培養に適した細胞培養容器が必要とされている。 However, in order to further increase the efficiency of the culture space, a cell culture container having an excellent cell proliferation effect and suitable for mass culture is required.
従来の細胞培養容器よりも培地への異物の混入を抑制し、細胞増殖能に優れ、大量培養に適した細胞培養容器の開発が求められている。 There is a demand for the development of a cell culture container that suppresses the contamination of foreign substances into the culture medium, has superior cell growth ability, and is suitable for large-scale culture than conventional cell culture containers.
本発明は、
（１）ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面において、ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換され、酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ ３ ／ｍ ２ ・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ ３ ／ｍ ２ ・２４ｈｒ・ａｔｍである細胞培養容器、
（２）上記ポリエチレンシートの厚みが、５０〜３００μｍである上記（１）項に記載の細胞培養容器、
（３）ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面と、フッ素ガスとを不活性ガス存在下で反応させることを特徴とするポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換されたポリエチレンシートで成型された細胞培養容器の製造方法、
（４）上記容器の流入ポート及び流出ポートを通じて、容器の内部にフッ素ガスを含有する不活性ガスを流通させることにより、ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部をフッ素原子に置換させる上記（３）項に記載の細胞培養容器の製造方法、及び
（５）フッ素ガスの含有量が不活性ガスに対して０．１〜２０．０容量％である上記（３）又は（４）項に記載の細胞培養容器の製造方法に関する。
The present invention
(1) Molded with a polyethylene sheet , and on the inner surface of a bag-like container having an inflow port and an outflow port for cell suspension, a part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting polyethylene are converted to fluorine atoms. A cell culture vessel that is substituted and has an oxygen permeability coefficient of 100 to 5000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm and a carbon dioxide permeability coefficient of 1000 to 20000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm ,
(2) The cell culture container according to ( 1) above, wherein the polyethylene sheet has a thickness of 50 to 300 μm .
(3) are molded with polyethylene sheets, polyethylene, wherein the inner surface of the bag-like container having an inlet port and outlet port of the cell suspension, a and fluorine gas to react in the presence of an inert gas A method for producing a cell culture vessel molded with a polyethylene sheet in which a part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting the fluorine atom is substituted,
(4) By passing an inert gas containing fluorine gas through the inflow port and outflow port of the container, a part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting polyethylene is replaced with fluorine atoms. A method for producing the cell culture vessel according to (3) above, and
(5) The method for producing a cell culture container according to the above (3) or (4), wherein the fluorine gas content is 0.1 to 20.0% by volume with respect to the inert gas .
本発明の細胞培養容器は、従来の細胞培養容器よりも培地への異物の混入を抑制し、細胞増殖能に優れ、しかも大量培養に適している。本発明の細胞培養容器では、従来の容器に比べて、細胞をより高密度に培養でき、より多数の細胞を得ることができる。さらに一定数の細胞を得るためには、より小容量の培地での培養、増殖が可能となる。 The cell culture container of the present invention suppresses the contamination of foreign substances into the medium as compared with conventional cell culture containers, is excellent in cell proliferation ability, and is suitable for mass culture. In the cell culture container of the present invention, cells can be cultured at a higher density than in conventional containers, and a larger number of cells can be obtained. Furthermore, in order to obtain a certain number of cells, culture and proliferation in a smaller volume of medium are possible.
本発明の細胞培養容器は、細胞を培養するためのプラスチック容器であり、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換（以下、フッ素置換ともいう）されることを特徴としている。フッ素置換とは、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置き換わることを意味し、一部とはフッ素原子の置換前のポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の数の割合を１００％とした場合、フッ素原子に置換した数が約０．１〜９９．９％、好ましくは約０．５〜５０％、さらに好ましくは約１〜１０％である。最も好ましくは約２〜５％である。 The cell culture container of the present invention is a plastic container for culturing cells, wherein a part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting the polymer is substituted with fluorine atoms (hereinafter also referred to as fluorine substitution). It is a feature. Fluorine substitution means that a part of hydrogen atoms bonded to the carbon atoms constituting the polymer is replaced with fluorine atoms, and a part is a hydrogen atom bonded to the carbon atoms constituting the polymer before substitution of fluorine atoms. Assuming that the ratio of the number is 100%, the number of fluorine atoms substituted is about 0.1 to 99.9%, preferably about 0.5 to 50%, more preferably about 1 to 10%. Most preferably about 2-5%.
本発明のポリマー容器の形状は特に限定されるものではなく、例えばバッグ、ボトルなどが挙げられる。とりわけ大量生産が容易であり、軽量である可撓性のシートで形成されたバッグ形状が好ましい。さらに、細胞懸濁液を導入・導出するポートをそれぞれ設けることが、取り扱いの上で好ましい。 The shape of the polymer container of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include bags and bottles. In particular, a bag shape formed of a flexible sheet that is easy to mass-produce and is lightweight is preferable. Furthermore, it is preferable in terms of handling to provide ports for introducing and leading out cell suspensions.
また、ポリマーは、構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素ガスによりフッ素原子に置換されうるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエステル、シリカ系ポリマーまたはポリオレフィンなどの熱可塑性樹脂が挙げられ、中でもポリオレフィンが好ましい。ポリオレフィンの具体例としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンおよびポリ４−メチルペンテンなどが挙げられるが、中でもポリエチレンが好ましい。 The polymer is not particularly limited as long as a part of hydrogen atoms bonded to the constituent carbon atoms can be substituted with fluorine atoms by fluorine gas. Specific examples include thermoplastic resins such as polyvinyl chloride, polystyrene, polyester, silica-based polymer, and polyolefin, and among them, polyolefin is preferable. Specific examples of the polyolefin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, and poly-4-methylpentene. Among them, polyethylene is preferable.
また、本発明の細胞培養容器において、フッ素置換は、ポリマー容器の内表面、外表面または両面のいずれであってもよい。ポリマー容器の内表面がフッ素置換されていることが好ましい。 In the cell culture container of the present invention, the fluorine substitution may be performed on the inner surface, the outer surface, or both surfaces of the polymer container. The inner surface of the polymer container is preferably substituted with fluorine.
本発明の細胞培養容器は、細胞を培養するにあたり十分な通気性を有していることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が約１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約１１００〜３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、さらに好ましくは約１２５０〜２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が約１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約３０００〜１１５００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、さらに好ましくは約５０００〜９０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍである。 The cell culture container of the present invention preferably has sufficient air permeability for culturing cells. Specifically, the oxygen permeability coefficient is about 100 to 5000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm, preferably about 1100 to 3000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm, more preferably about 1250 to 2750 cm 3 / m 2 · 24 hr. Atm, and the carbon dioxide permeability coefficient is about 1000 to 20000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm, preferably about 3000 to 11500 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm, more preferably about 5000 to 9000 cm 3 / m. 2 · 24 hr · atm.
本発明におけるフッ素置換は、ポリマーシートで成型された容器の内表面または／及び外表面と、フッ素含有ガスとを不活性ガス存在下で反応させることで達成されるが、同様の効果が得られる方法であれば、これに限定されるものではない。不活性ガスは、窒素、アルゴンなどフッ素置換反応を阻害しないものであればよい。不活性ガスに対するフッ素ガスの含有量は約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％である。温度条件は約−２０〜１５０℃、好ましくは約０〜４０℃である。反応温度は高いほどフッ素置換の反応速度が増すが、火災などの災害に注意する必要がある。また、圧力条件は、約０．０１〜１０．０ａｔｍ、好ましくは約０．０１〜２．０ａｔｍ、さらに好ましくは常圧付近である。反応時間は、反応温度、圧力条件により異なるが、例えば約２５℃で圧力条件が常圧（大気圧）付近であれば約３０秒〜２００分、好ましくは約１分〜２００分、より好ましくは約１分〜２０分である。 The fluorine substitution in the present invention is achieved by reacting the inner surface or / and outer surface of a container molded with a polymer sheet with a fluorine-containing gas in the presence of an inert gas, but the same effect can be obtained. The method is not limited to this. The inert gas should just be a thing which does not inhibit fluorine substitution reactions, such as nitrogen and argon. The content of fluorine gas with respect to the inert gas is about 0.1 to 20.0% by volume, preferably about 0.1 to 10% by volume. The temperature condition is about -20 to 150 ° C, preferably about 0 to 40 ° C. The higher the reaction temperature, the faster the fluorine substitution reaction rate, but it is necessary to pay attention to disasters such as fire. The pressure condition is about 0.01 to 10.0 atm, preferably about 0.01 to 2.0 atm, and more preferably around normal pressure. The reaction time varies depending on the reaction temperature and pressure conditions. For example, when the pressure condition is about 25 ° C. and the pressure condition is near atmospheric pressure (atmospheric pressure), the reaction time is about 30 seconds to 200 minutes, preferably about 1 minute to 200 minutes, more preferably About 1 to 20 minutes.
本発明の細胞培養容器は、成型したポリマー容器に直接フッ素置換を施す方法、またはあらかじめフッ素置換したポリマーを容器に成型する方法で製造することができる。ここで、ポリマー容器の製造はプラスチックシートを用いて常法により実施できる。プラスチックシートの厚みは、通常約５０〜３００μmが好適に用いられる。例えば、ポリマー容器がバッグ状である場合、インフレーション法、Ｔダイ法などで可撓性シートを作成し、ヒートシール法によって成型することができる。 The cell culture container of the present invention can be produced by a method in which a molded polymer container is directly subjected to fluorine substitution, or a method in which a polymer that has been previously subjected to fluorine substitution is molded into a container. Here, the polymer container can be produced by a conventional method using a plastic sheet. The thickness of the plastic sheet is usually preferably about 50 to 300 μm. For example, when the polymer container has a bag shape, a flexible sheet can be prepared by an inflation method, a T-die method, or the like and molded by a heat seal method.
成型したポリマー容器に直接フッ素置換を施す方法は、例えばポリマーをインフレーション法やＴダイ法により作成したシートを、細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けてバッグ状に成型し、該流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、フッ素を含有した不活性ガスを流すことにより行われる。インフレーション法の条件は、ポリマーの種類によって異なり、例えば、ポリエチレンを使用する場合、溶融温度は約１６０〜１８０℃、引取速度は約１０〜３０ｍ／ｍｉｎでポリエチレンシートを作成することができる。フッ素置換反応は、フッ素ガスを約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％含有した不活性ガスを使用する。 The method of directly fluorinating the molded polymer container is, for example, by forming a sheet made of a polymer by an inflation method or a T-die method into a bag shape by providing an inflow port and an outflow port for cell suspension. And an inert gas containing fluorine from the outflow port into the bag. The conditions of the inflation method vary depending on the type of polymer. For example, when polyethylene is used, a polyethylene sheet can be prepared at a melting temperature of about 160 to 180 ° C. and a take-up speed of about 10 to 30 m / min. The fluorine substitution reaction uses an inert gas containing about 0.1 to 20.0% by volume of fluorine gas, preferably about 0.1 to 10% by volume.
あらかじめフッ素置換したポリマーを容器に成型する方法しては、片面のみがフッ素置換されたポリマーを作成し、該ポリマーのシートにポートを設けた状態でバッグに成型する方法が挙げられる。例えば、特開昭６２−１４０８２１号公報に記載された方法またはこれに準じた方法により片面のみがフッ素置換されたポリマーのシートからバッグを作成することができる。具体的にはポリマーをインフレーション法によりシート状に成型する際に、内部にフッ素ガスを約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％含有した不活性ガスを流すことでフッ素置換反応を行う。インフレーション法における条件は、ポリマーの種類によって異なり、例えば、ポリエチレンを使用する場合、溶融温度は約１６０〜１８０℃、引取速度は約１０〜３０ｍ／ｍｉｎで作成することができる。このようにして得たシートを、温度約１７０〜１９０℃におけるヒートシール法によりバッグ状に成型することにより本発明の細胞培養容器を製造することができる。 Examples of the method of molding a polymer substituted in advance with a fluorine into a container include a method in which a polymer in which only one side is fluorine-substituted is prepared and molded into a bag with a port provided on the polymer sheet. For example, a bag can be made from a polymer sheet in which only one side is fluorine-substituted by the method described in JP-A-62-140821 or a method based thereon. Specifically, when a polymer is molded into a sheet by an inflation method, an inert gas containing about 0.1 to 20.0% by volume, preferably about 0.1 to 10% by volume of fluorine gas is flowed therein. The fluorine substitution reaction is performed. Conditions in the inflation method vary depending on the type of polymer. For example, when polyethylene is used, the melting temperature is about 160 to 180 ° C., and the take-up speed is about 10 to 30 m / min. The cell culture container of the present invention can be produced by molding the sheet thus obtained into a bag shape by a heat sealing method at a temperature of about 170 to 190 ° C.
さらに、上記フッ素置換反応は、プラズマ処理、コロナ放電処理などの処理と併用することにより、一層効果的に行うことができる。例えば、コロナ放電の場合、電圧約１０〜３０ｋＶ、好ましくは約１５〜２５ｋＶであり、周波数は約１０〜３０ｋＨｚ、約１５〜２５ｋＨｚである。加えて、材料の融点より約２０〜１３０℃低い温度で加熱するとさらに好ましい。加熱方法は、赤外線照射、熱風吹きつけなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。 Further, the fluorine substitution reaction can be performed more effectively by using in combination with a treatment such as plasma treatment or corona discharge treatment. For example, in the case of corona discharge, the voltage is about 10-30 kV, preferably about 15-25 kV, and the frequency is about 10-30 kHz, about 15-25 kHz. In addition, it is more preferred to heat at a temperature about 20-130 ° C. below the melting point of the material. Examples of the heating method include infrared irradiation and hot air blowing, but are not particularly limited.
上記製造方法によって得られた細胞培養容器を用いた細胞培養は、常法に従って実施できる。例えば、培養する細胞は、臍帯血細胞、造血幹細胞、リンパ球細胞、ハイブリドーマなどの浮遊細胞、肝細胞などの臓器を形成する実質細胞等が挙げられる。また、用いる培地は市販されている基礎培地でよく、イーグルＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地などが挙げられる。播種する細胞の濃度は、好ましくは約１．０×１０４〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、さらに好ましくは、約１．０×１０５〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、より高密度で培養することができ、細胞の大量培養が可能となる。 Cell culture using the cell culture vessel obtained by the above production method can be performed according to a conventional method. Examples of cells to be cultured include cord blood cells, hematopoietic stem cells, lymphocyte cells, floating cells such as hybridomas, and parenchymal cells that form organs such as hepatocytes. Moreover, the culture medium to be used may be a commercially available basal medium such as Eagle MEM medium, DMEM medium, RPMI 1640, HamF10 medium, HamF12 medium, and the like. The concentration of cells to be seeded is preferably about 1.0 × 10 4 to 5.0 × 10 5 cells / ml, more preferably about 1.0 × 10 5 to 2.0 × 10 5 cells / ml. Therefore, the cells can be cultured at a higher density, and a large amount of cells can be cultured.
以下に本発明を、実施例、実験例により具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and experimental examples.
実施例１
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をＴダイ法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。Ｔダイ法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを６×１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、３０℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
Example 1
A sheet (thickness: 100 μm) of linear low density polyethylene (Mitsui Chemicals) was prepared by the T-die method. The conditions in the T-die method were a melting temperature of 170 ° C. and a pulling speed of 25 m / min. This sheet is cut into 6 × 10 cm squares, stacked with the cell suspension inflow and outflow ports between two polyethylene sheets, and the edges are molded into a bag shape by the heat seal method. A cell culture container of polyethylene bag was prepared. A cell culture container was manufactured by flowing nitrogen gas containing 10% by volume of fluorine gas at 30 ° C. for 1 minute from the inflow port and the outflow port of the cell culture container into the bag at atmospheric pressure.
実施例２
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をＴダイ法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。Ｔダイ法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを６×１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、３０℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１分または１８０分間流すことにより、細胞培養容器（２種類）を製造した。
Example 2
A sheet (thickness: 100 μm) of a linear low density polyethylene (manufactured by Mitsui Chemicals) was prepared by a T-die method. The conditions in the T-die method were a melting temperature of 170 ° C. and a pulling speed of 25 m / min. This sheet is cut into 6 × 10 cm squares, stacked in a state where an inflow port and an outflow port for cell suspension are provided between two polyethylene sheets, and the edge is molded into a bag shape by a heat seal method. The cell culture container of a polyethylene bag was created. By flowing nitrogen gas containing 10% by volume of fluorine gas under atmospheric pressure at 30 ° C. for 1 minute or 180 minutes from the inflow port and outflow port of the cell culture container into the bag, Manufactured.
実施例３
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス１５容量％を含有した窒素ガスを１分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
Example 3
A sheet (thickness: 100 μm) of linear low density polyethylene (Mitsui Chemicals) was prepared by an inflation method. The conditions in the inflation method were a melting temperature of 170 ° C. and a tensile speed of 25 m / min. This sheet is cut into 10 centimeters, overlapped with two polyethylene sheets with an inflow port and outflow port for cell suspension, and the edges are molded into a bag shape by the heat seal method. A cell culture container for the bag was made. A cell culture container was produced by flowing nitrogen gas containing 15% by volume of fluorine gas at 25 ° C. for 1 minute from the inflow port and the outflow port of the cell culture container into the bag at atmospheric pressure.
実施例４
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス５容量％を含有した窒素ガスを５分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
Example 4
A sheet (thickness: 100 μm) of linear low density polyethylene (Mitsui Chemicals) was prepared by an inflation method. The conditions in the inflation method were a melting temperature of 170 ° C. and a tensile speed of 25 m / min. This sheet is cut into 10 centimeters, overlapped with two polyethylene sheets with an inflow port and outflow port for cell suspension, and the edges are molded into a bag shape by the heat seal method. A cell culture container for the bag was made. A cell culture container was produced by flowing nitrogen gas containing 5% by volume of fluorine gas at 25 ° C. for 5 minutes from the inflow port and outflow port of the cell culture container into the bag at atmospheric pressure.
実施例５
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１０分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
Example 5
A sheet (thickness: 100 μm) of linear low density polyethylene (Mitsui Chemicals) was prepared by an inflation method. The conditions in the inflation method were a melting temperature of 170 ° C. and a tensile speed of 25 m / min. This sheet is cut into 10 centimeters, overlapped with two polyethylene sheets with an inflow port and outflow port for cell suspension, and the edges are molded into a bag shape by the heat seal method. A cell culture container for the bag was made. A cell culture container was produced by flowing nitrogen gas containing 10% by volume of fluorine gas at 25 ° C. for 10 minutes from the inflow port and outflow port of the cell culture container into the bag at atmospheric pressure.
実験例１ フッ素ガス処理容器の内表面ポリマーの元素分析値及びガス透過性
実施例１で得られた細胞培養容器、比較対照として、(1)実施例１に記載のフッ素ガスで処理する前のポリエチレン容器（ＰＥ）、(2)フッ素ガスで処理されていないポリテトラフルオロエチレン（厚み：１００μm）容器（ＰＴＦＥ）及び(3)フッ素ガスで処理されていないテトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（厚み：１００μm）容器（ＦＥＰ）の内表面の元素分析値並びに容器の酸素ガス及び二酸化炭素（炭酸ガス）の透過性を測定した。
元素分析値は、蛍光Ｘ線分析（島津蛍光Ｘ線分析装置ＸＲＦ―１７００）を用いて測定した。酸素及び二酸化炭素のガス透過性はJIS K ７１２６法（ISO 2556に記載の方法）に準拠し、ガス透過性測定装置（ＭＴ−Ｃ３、東洋精機製作所）を用いて測定した。
結果を表１に示す。
表１ 内表面ポリマーの元素分析値及びガス透過性
供試サンプル（実施例１）のバッグ状容器の外表面では、フッ素原子が検出限界以下であり、バッグ状容器のフッ素ガス処理によりフッ素原子で置換されている部分は、バッグ状容器の内表面のごく浅い部分であることが示された。
Experimental Example 1 Elemental Analysis Value and Gas Permeability of Inner Surface Polymer of Fluorine Gas Treatment Container As a cell culture container obtained in Example 1, as a comparative control, (1) Before treatment with the fluorine gas described in Example 1 Polyethylene container (PE), (2) Polytetrafluoroethylene not treated with fluorine gas (thickness: 100 μm) container (PTFE), and (3) Tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer not treated with fluorine gas (Thickness: 100 μm) The elemental analysis value of the inner surface of the container (FEP) and the permeability of oxygen gas and carbon dioxide (carbon dioxide gas) of the container were measured.
Elemental analysis values were measured using fluorescent X-ray analysis (Shimadzu X-ray fluorescence analyzer XRF-1700). The gas permeability of oxygen and carbon dioxide was measured using a gas permeability measuring device (MT-C3, Toyo Seiki Seisakusho) in accordance with JIS K 7126 method (method described in ISO 2556).
The results are shown in Table 1.
Table 1 Elemental analysis values and gas permeability of inner surface polymer
On the outer surface of the bag-shaped container of the test sample (Example 1), the fluorine atoms are below the detection limit, and the portion of the bag-shaped container that is substituted with fluorine atoms by the fluorine gas treatment is the inner surface of the bag-shaped container. It was shown to be a very shallow part.
実験例２ 細胞増殖試験
実施例１で得られた細胞培養容器、及び比較対照として実施例１に記載のフッ素ガス処理前の直鎖状低密度ポリエチレン容器に、ヒト白血病細胞株のＭＯＬＴ−４細胞を懸濁した１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＯＬＴ−４細胞株の播種濃度：１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌをそれぞれ加え、３７℃／５％二酸化炭素／９９％ＲＨ（相対湿度）で１０日間培養を行った。培養５日目より、バッグ状容器から培養液の一部をサンプリングし、ヘモサイトメーターによりバッグ状容器内の細胞濃度を算出した。
結果を表２に示す。
表２ ＭＯＬＴ−４細胞濃度（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
The results are shown in Table 2.
Table 2 MOLT-4 cell concentration (× 10 4 cells / ml)
実験例３ 細胞増殖試験
実施例２で得られた２種類の細胞培養容器〔フッ素ガス処理時間が１分間で製造された容器（本発明(1)）及びフッ素ガス処理時間が１８０分間で製造された容器（本発明(2)）〕、及び比較対照として市販のポリスチレン製の培養フラスコ（２５ｃｍ２フラスコ、カタログ番号４３０６３９、コーニング社製、米国）に、ヒト白血病細胞株のＭＯＬＴ−４細胞を懸濁した１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＯＬＴ−４細胞株の播種濃度；１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌを加え、３７℃／５％二酸化炭素／９９％ＲＨ（相対湿度）で、６日間培養を行った。バッグ状容器から培養液の一部をサンプリングし、実験例２に記載の方法と同様な方法によりバッグ状容器内の細胞濃度を算出した。
結果を表３に示す。
表３ ＭＯＬＴ−４細胞濃度
The results are shown in Table 3.
Table 3 MOLT-4 cell concentration
実験例４ フッ素ガス処理容器の内表面ポリマーの元素分析値及び水接触角
実施例２で得られた２種類の細胞培養容器〔フッ素ガス処理時間が１分間で製造された容器（本発明(1)）及びフッ素ガス処理時間が１８０分間で製造された容器（本発明(2)）〕、及び比較対照として市販のポリスチレン製の培養フラスコ（２５ｃｍ２フラスコ、カタログ番号４３０６３９、コーニング社製、米国）の内表面ポリマーの元素分析値（炭素原子及びフッ素原子）及び水接触角を表４に示す。
元素分析は、実験例１に記載の方法と同様に行い、水接触角はJIS K 6768 （ISO 8296）に記載の方法で測定した。
表４ 元素分析値及び水接触角
Elemental analysis was performed in the same manner as described in Experimental Example 1, and the water contact angle was measured by the method described in JIS K 6768 (ISO 8296).
Table 4 Elemental analysis values and water contact angle
本発明の細胞培養容器は、優れた細胞増殖能を有し、培地への異物の混入を抑制し、より効率的な大量細胞培養ができる。 The cell culture container of the present invention has an excellent cell growth ability, suppresses the mixing of foreign substances into the medium, and enables more efficient mass cell culture.
Claims (5)
ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換され、
酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ ３ ／ｍ ２ ・２４ｈｒ・ａｔｍであり、
二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ ３ ／ｍ ２ ・２４ｈｒ・ａｔｍである細胞培養容器。 In the inner surface of a bag-like container that is molded with a polyethylene sheet and has an inflow port and an outflow port for cell suspension ,
A part of hydrogen atoms bonded to carbon atoms constituting polyethylene is substituted with fluorine atoms ,
The oxygen permeability coefficient is 100 to 5000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm,
A cell culture vessel having a carbon dioxide permeability coefficient of 1000 to 20000 cm 3 / m 2 · 24 hr · atm .
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