JP4630018B2 - Microbial accumulation culture method - Google Patents
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Description
本発明は、微生物の集積培養方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、特定の物質に対し還元活性と耐性を有する培養対象微生物を、前記物質を溶解させた培養液中で選択的に集積培養する微生物の集積培養方法であって、培養対象微生物以外の微生物に対して前記物質が毒性等の生育環境を悪化させる性質を有している場合の微生物の集積培養方法に関するものである。 The present invention relates to a method for accumulating and culturing microorganisms. More specifically, the present invention relates to a method for collecting and culturing microorganisms that selectively accumulate and cultivate a microorganism to be cultured having a reduction activity and resistance to a specific substance in a culture solution in which the substance is dissolved, The present invention relates to a method for accumulating microorganisms when the substance has a property of deteriorating the growth environment such as toxicity to microorganisms other than the microorganism to be cultured.
クロム還元菌は、嫌気的環境で培養すると、培地中に含まれる有害な六価クロムを三価に還元する作用がある。三価クロムは、溶解度が低いため、沈殿させて溶液から分離することができる。このようにクロム還元菌の作用は、六価クロムで汚染された排水や土壌を浄化するのに有効である。 When chromium-reducing bacteria are cultured in an anaerobic environment, they have the effect of reducing harmful hexavalent chromium contained in the medium to trivalent. Since trivalent chromium has low solubility, it can be precipitated and separated from the solution. Thus, the action of the chromium-reducing bacteria is effective in purifying drainage and soil contaminated with hexavalent chromium.
ところで、クロム還元菌の培養には、六価クロムを培養液中に溶解させて行うが、培養初期段階においては六価クロムの毒性のために、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌が優先的に増殖することができる。しかし、クロム還元菌の作用によって次第に培養液中の六価クロム濃度が減少してくると、それまで増殖ができないでいた雑多な菌群が増殖を開始してくるといった問題があった。これは、クロム還元菌を用いた浄化を考える際に、クロム還元菌の集積培養を困難なものとする要因となりうる。このような、雑多な菌群の増殖を防ぐには、（１）クロム還元菌を純粋分離し、雑菌の混入のないクリーンな環境で培養操作を実施する、（２）六価クロムを連続的に培地に添加しながら培養を実施する、などの手法が考えられる。 By the way, culturing chromium-reducing bacteria is performed by dissolving hexavalent chromium in the culture solution. However, in the early stage of culture, chromium-reducing bacteria resistant to hexavalent chromium are given priority because of the toxicity of hexavalent chromium. Can multiply. However, when the hexavalent chromium concentration in the culture solution gradually decreases due to the action of the chromium-reducing bacteria, there is a problem that a variety of bacterial groups that could not grow until then start to grow. This can be a factor that makes it difficult to enrich and culture chromium-reducing bacteria when considering purification using chromium-reducing bacteria. In order to prevent the growth of such a diverse group of bacteria, (1) purely isolate chromium-reducing bacteria and carry out the culture operation in a clean environment free from contamination with bacteria (2) continuous hexavalent chromium. For example, the culture may be performed while adding to the medium.
なお、クロム還元菌を用いた六価クロムの除去方法として、特開平２−２６８８９９号公報、特開２００２−２８１９６０号公報に開示されている技術がある。 As a method for removing hexavalent chromium using chromium-reducing bacteria, there are techniques disclosed in JP-A-2-268899 and JP-A-2002-281960.
しかしながら、上記（１）の手法においては、特殊な培養環境を整える必要があり、簡便な培養方法とはなりえない。また、上記（２）の手法においては、結果的に有害である六価クロムを大量に使用することとなり、好ましくない。 However, the technique (1) requires a special culture environment and cannot be a simple culture method. In the method (2), hexavalent chromium which is harmful as a result is used in a large amount, which is not preferable.
そして、これらの不都合は、六価クロムを使用したクロム還元菌の培養に限るものではなく、毒性のある物質を使用した培養であって、その物質に耐性のある微生物の培養についても同様である。 These inconveniences are not limited to the culture of chromium-reducing bacteria using hexavalent chromium, but the same applies to the culture of microorganisms that are resistant to such substances. .
本発明は、培養の対象となる微生物の選択的な培養を簡便に行うことができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。また、本発明は、微生物の培養に有害物質を使用する場合、その有害物質を大量に使用しなくても培養の対象となる微生物を選択的に集積培養することができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for accumulating and culturing microorganisms, which can easily perform selective culturing of microorganisms to be cultured. Further, the present invention provides a method for accumulating and cultivating microorganisms that can selectively cultivate microorganisms to be cultured without using a large amount of the harmful substances when toxic substances are used for culturing microorganisms. The purpose is to provide.
かかる目的を達成するために、請求項１記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物が還元活性を有し且つ耐性があり培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有している物質である六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つを溶解させた培養液中に有機物を含ませて培養対象微生物を選択的に集積培養する際、培養対象微生物の有機物を利用した発酵の過程で還元された前記物質を培養液中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。 In order to achieve such an object, the method for collecting and culturing a microorganism according to claim 1 is a substance in which the microorganism to be cultured has a reducing activity and is resistant and toxic to microorganisms other than the microorganism to be cultured. Selective accumulation of microorganisms to be cultured by including organic substances in a culture solution in which any one of hexavalent chromium, silver, copper, mercury, iodine, arsenous acid, manganese, nickel, selenious acid is dissolved When culturing, culture is performed while regenerating by generating an oxidation reaction by applying an electric potential to an electrode immersed in the culture solution of the substance reduced in the fermentation process using the organic matter of the microorganism to be cultured. .
したがって、前記物質の溶解した培養液は培養対象微生物以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、前記物質に耐性のある培養対象微生物を選択的に培養することができる。培養対象微生物の培養により培養液中の前記物質がつぎつぎに還元されることになるが、培養液中の電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで還元された前記物質を再生させることができる。このため、前記物質を新たに補充しなくても、培養液中の前記物質の濃度を維持することができる。 Therefore, the culture solution in which the substance is dissolved is difficult to live for various microorganisms other than the microorganism to be cultured. For this reason, the microorganisms to be cultured that are resistant to the substance can be selectively cultured. Although the substance in the culture solution is successively reduced by culturing the microorganism to be cultured, it is possible to regenerate the reduced substance by applying an electric potential to the electrode in the culture solution to cause an oxidation reaction. it can. For this reason, the concentration of the substance in the culture solution can be maintained without replenishing the substance.
また、請求項１記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。 In the method for accumulating and culturing microorganisms according to claim 1 , the culture solution contains an organic substance, and the microorganism to be cultured reduces the substance in the course of fermentation using the organic substance. That is, the microorganism to be cultured does not need the substance for respiration, but eventually reduces the substance in the process of fermentation.
また、請求項１記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物が、耐性の無い他の雑多な微生物に対し優先的に増殖する。 In addition, as in the culture of microorganisms according to claim 1 , the substance is any one of hexavalent chromium, silver, copper, mercury, iodine, arsenous acid, manganese, nickel, selenious acid. Is preferred. Silver, copper, mercury and iodine have a bactericidal effect against many types of microorganisms. Arsenite, manganese, nickel, and selenite have ecotoxicity against many types of microorganisms. Therefore, microorganisms resistant to these substances proliferate preferentially over other miscellaneous microorganisms that are not resistant.
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。 According to the method for collecting and culturing microorganisms according to claim 2, the microorganism to be cultured is a chromium reducing bacterium, the substance is hexavalent chromium, and the trivalent chromium reduced by the chromium reducing bacterium is regenerated into hexavalent chromium. While culturing.
したがって、培養液はクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌を選択的に培養することができる。クロム還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。 Therefore, the culture solution is difficult to live for miscellaneous microorganisms other than chromium-reducing bacteria. For this reason, chromium-reducing bacteria resistant to hexavalent chromium can be selectively cultured. Hexavalent chromium in the culture solution is subsequently reduced to trivalent chromium by culturing chromium-reducing bacteria, but the trivalent chromium is reduced by applying an electric potential to the electrode immersed in the culture solution to cause an oxidation reaction. Reduced chromium can be regenerated to hexavalent. For this reason, the density | concentration of the hexavalent chromium in a culture solution can be maintained.
また、請求項３記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。 According to a third aspect of the present invention, the microorganism to be cultured is a uranium-reducing bacterium, the substance is hexavalent chromium, and the trivalent chromium reduced by the uranium-reducing bacterium is regenerated into hexavalent chromium. While culturing.
したがって、培養液はウラン還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるウラン還元菌を選択的に培養することができる。ウラン還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。 Therefore, the culture solution is difficult to live for miscellaneous microorganisms other than uranium-reducing bacteria. For this reason, uranium reducing bacteria resistant to hexavalent chromium can be selectively cultured. Hexavalent chromium in the culture solution is subsequently reduced to trivalent chromium by culturing uranium-reducing bacteria, but it is trivalent by applying an electric potential to the electrode immersed in the culture solution to cause an oxidation reaction. Reduced chromium can be regenerated to hexavalent. For this reason, the density | concentration of the hexavalent chromium in a culture solution can be maintained.
しかして、請求項１記載の微生物の集積培養方法によれば、上述のようにして微生物を集積培養するので、培養液中に前記物質を補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、培養対象微生物の培養に適した環境を維持することができる。しかも、前記物質が培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有しているので、培養液が培養対象微生物以外の微生物にとって生息に適さないものとなる。このため、培養対象微生物以外の微生物の繁殖を抑え、培養対象微生物をより優先的に培養することができる。また、前記物質の再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストで微生物を集積培養することができる。さらに、前記物質を再生して使用するので、その使用量が少量で足り、この点からもコストを安くすることができる。 Thus, according to the method for accumulating and culturing microorganisms described in claim 1, since the microorganisms are accumulated and cultured as described above, the concentration can be maintained without supplementing the substance in the culture solution. For this reason, the environment suitable for culture | cultivation of microorganisms for culture | cultivation can be maintained. In addition, since the substance is toxic to microorganisms other than the culture target microorganism, the culture solution is not suitable for inhabiting microorganisms other than the culture target microorganism. For this reason, reproduction of microorganisms other than culture target microorganisms can be suppressed, and culture target microorganisms can be cultured more preferentially. In addition, since the electrolysis is used for the regeneration of the substance, it is simple and only a simple apparatus is necessary. For this reason, microorganisms can be accumulated and cultured at low cost. Furthermore , since the said substance is regenerated | regenerated and used, the usage-amount is sufficient, and a cost can be reduced also from this point.
また、請求項１記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。 In the method for accumulating and culturing microorganisms according to claim 1 , the culture solution contains an organic substance, and the microorganism to be cultured reduces the substance in the course of fermentation using the organic substance. That is, the microorganism to be cultured does not need the substance for respiration, but eventually reduces the substance in the process of fermentation.
また、請求項１記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物を優先的に培養することができる。 In addition, as in the culture of microorganisms according to claim 1 , the substance is any one of hexavalent chromium, silver, copper, mercury, iodine, arsenous acid, manganese, nickel, selenious acid. Is preferred. Silver, copper, mercury and iodine have a bactericidal effect against many types of microorganisms. Arsenite, manganese, nickel, and selenite have ecotoxicity against many types of microorganisms. Therefore, microorganisms resistant to these substances can be preferentially cultured.
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法では、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、クロム還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。 Further, in the microorganism culture method according to claim 2, the microorganism to be cultured is a chromium-reducing bacterium, the substance is hexavalent chromium, and the trivalent chromium reduced by the chromium-reducing bacterium is regenerated into hexavalent chromium. Since the culture is performed, the concentration can be maintained without supplementing the culture medium with hexavalent chromium. For this reason, the environment suitable for culture | cultivation of chromium reduction bacteria can be maintained. Since the electrolysis is used for the regeneration of hexavalent chromium, it is simple, and the necessary equipment is sufficient. For this reason, chromium-reducing bacteria can be accumulated and cultured at low cost. In addition, since hexavalent chromium is regenerated and used, a small amount is sufficient, safety is high, and the cost required for enrichment culture can be further reduced.
さらに、請求項３記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、ウラン還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでウラン還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。即ち、クロム還元菌と同様の方法で、ウラン還元菌を選択的に集積培養することができる。 Furthermore, in the method for collecting and culturing microorganisms according to claim 3, the microorganism to be cultured is a uranium reducing bacterium, the substance is hexavalent chromium, and the trivalent chromium reduced by the uranium reducing bacterium is regenerated into hexavalent chromium. Since the culture is performed, the concentration can be maintained without supplementing the culture medium with hexavalent chromium. For this reason, the environment suitable for culture | cultivation of uranium reducing bacteria can be maintained. Since the electrolysis is used for the regeneration of hexavalent chromium, it is simple, and the necessary equipment is sufficient. For this reason, uranium-reducing bacteria can be accumulated and cultured at low cost. In addition, since hexavalent chromium is regenerated and used, a small amount is sufficient, safety is high, and the cost required for enrichment culture can be further reduced. That is, uranium-reducing bacteria can be selectively accumulated and cultured by the same method as chromium-reducing bacteria.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
図１に、本発明の微生物の集積培養方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物１が還元活性を有し且つ耐性のある物質２を溶解させた培養液３中で培養対象微生物１を選択的に集積培養する際、培養対象微生物１によって還元された物質２を培養液３中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。即ち、物質２に対し耐性のある培養対象微生物１を、耐性のない微生物に優先して培養を行うものである。本実施形態では、培養対象微生物１は六価クロムに耐性のあるクロム還元菌（以下、クロム還元菌１という）であり、物質２は六価クロム（以下、六価クロム２という）であり、クロム還元菌１によって還元された三価クロムを六価クロム２に再生しながら培養を行うものである。 FIG. 1 conceptually shows an example of an embodiment of the microorganism culture method of the present invention. The method for accumulating and culturing microorganisms according to the present invention is performed when the microorganism 1 to be cultured is selectively accumulated and cultured in a culture solution 3 in which a substance 2 having a reducing activity and a resistant substance is dissolved. Cultivation is performed while regenerating by generating an oxidation reaction by applying an electric potential to an electrode in which the substance 2 reduced by the microorganism 1 is immersed in the culture solution 3. That is, the culture target microorganism 1 resistant to the substance 2 is cultured in preference to the non-resistant microorganism. In this embodiment, the microorganism 1 to be cultured is a chromium-reducing bacterium resistant to hexavalent chromium (hereinafter referred to as chromium-reducing bacterium 1), and the substance 2 is hexavalent chromium (hereinafter referred to as hexavalent chromium 2). Culturing is performed while regenerating trivalent chromium reduced by chromium-reducing bacteria 1 into hexavalent chromium 2.
電解槽４はイオン交換膜５によって培養槽６と対極槽７に仕切られており、培養槽６には六価クロム２を含む培地に懸濁させたクロム還元菌１を、対極槽７には六価クロム２を含まない培地成分を含んだ溶液を充填している。また、培養槽６には陽極８を、対極槽７には陰極９を浸している。 The electrolytic cell 4 is divided into a culture tank 6 and a counter electrode tank 7 by an ion exchange membrane 5. The culture tank 6 contains chromium-reducing bacteria 1 suspended in a medium containing hexavalent chromium 2, and the counter electrode tank 7 contains A solution containing medium components not containing hexavalent chromium 2 is filled. Further, an anode 8 is immersed in the culture tank 6 and a cathode 9 is immersed in the counter electrode tank 7.
培養槽６中の培地には、例えば乳酸、酵母エキス等の有機物が投入されている。クロム還元菌１はこれらの有機物を使用して発酵を行い、その過程で六価クロム２を還元する。六価クロム２は、クロム還元菌１以外の微生物に対して毒性を有しており、その他の雑多な微生物の繁殖を抑えることができる。 The medium in the culture tank 6 is filled with organic substances such as lactic acid and yeast extract. Chromium reducing bacteria 1 ferment using these organic substances and reduce hexavalent chromium 2 in the process. Hexavalent chromium 2 is toxic to microorganisms other than chromium-reducing bacteria 1 and can suppress the propagation of other miscellaneous microorganisms.
つまり、六価クロム２が溶解した培養液３はクロム還元菌１にとっては増殖し易いものであるが、その他の雑多な微生物にとっては増殖し難いものであり、クロム還元菌１を選択的に培養することができる。クロム還元菌１の培養により培養液３中の六価クロム２がつぎつぎに還元されて三価クロムとなるが、陽極８に電位を与えることで三価クロムを六価クロム２に再生することができる。このため、培養液３中の六価クロム２の濃度を維持することができ、クロム還元菌１の優先的な培養に適した環境を維持することができる。 That is, the culture solution 3 in which the hexavalent chromium 2 is dissolved is easy to grow for the chromium-reducing bacteria 1, but is difficult for other miscellaneous microorganisms to grow, and the chromium-reducing bacteria 1 is selectively cultured. can do. By culturing chromium-reducing bacteria 1, hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 is subsequently reduced to trivalent chromium. However, by applying a potential to the anode 8, trivalent chromium can be regenerated to hexavalent chromium 2. it can. For this reason, the density | concentration of the hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 can be maintained, and the environment suitable for the preferential culture of the chromium reducing bacteria 1 can be maintained.
このように、本発明では電気分解によりクロムを三価から六価に再生するので、簡便であり、必要な装置類も簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌１を集積培養することができる。また、培養槽６中の六価クロム２を再生して使用するので、六価クロム２の使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。 As described above, in the present invention, chromium is regenerated from trivalent to hexavalent by electrolysis, which is simple and requires a simple apparatus. For this reason, the chromium-reducing bacteria 1 can be accumulated and cultured at a low cost. Moreover, since the hexavalent chromium 2 in the culture tank 6 is regenerated and used, a small amount of the hexavalent chromium 2 is sufficient, the safety is high, and the cost required for enrichment culture can be further reduced.
クロム還元菌１としては、例えば表１に掲げるものがある。即ち、例えばShwanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacterである。ただし、これらのクロム還元菌１に限るものではない。 Examples of the chromium-reducing bacteria 1 include those listed in Table 1. That is, for example, Shwanella, Pseudomonas, Sulfate reducing bacteria, Arthrobacter, Bacillus, Aerococcus, Micrococcus, Aeromonas, Thermoanaerobacter, Cellulomonas, Geobacter, Streptomyces, Escherichia, Enterobacter. However, it is not limited to these chromium-reducing bacteria 1.
電気分解を行うために培養液３には、三価クロムを六価クロム２に酸化させることができる値の電位を与える。実験では、図６に示すように、１Ｖ付近の電位で三価クロムが六価クロム２に酸化された。したがって、三価クロムを六価クロム２に酸化させる電位は約１Ｖであると判断できるので、培養液３に１Ｖの電位をかけながら培養を行うことが好ましい。 In order to perform electrolysis, the culture solution 3 is given a potential that can oxidize trivalent chromium to hexavalent chromium 2. In the experiment, as shown in FIG. 6, trivalent chromium was oxidized to hexavalent chromium 2 at a potential near 1 V. Therefore, since it can be determined that the potential for oxidizing trivalent chromium to hexavalent chromium 2 is about 1 V, it is preferable to perform culture while applying a potential of 1 V to the culture solution 3.
また、培養液３中の六価クロム２の濃度が高すぎると、六価クロムの毒性によりクロム還元菌１自身も増殖し難くなるので、六価クロム２の濃度の上限値は、例えば０．５ｍ mol／Ｌが好ましい。 In addition, if the concentration of hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 is too high, the chromium-reducing bacterium 1 itself is difficult to grow due to toxicity of hexavalent chromium, so the upper limit of the concentration of hexavalent chromium 2 is, for example, 0. 5 mmol / L is preferred.
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の説明では、培養対象微生物がクロム還元菌１であったが、クロム還元菌１以外の微生物でも良い。 The above-described embodiment is an example of a preferred embodiment of the present invention, but is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the scope of the present invention. For example, in the above description, the microorganism to be cultured is the chromium-reducing bacterium 1, but a microorganism other than the chromium-reducing bacterium 1 may be used.
また、上述の説明では、物質２として六価クロムを使用していたが、六価クロムに限るものではない。例えば、銀（Ａｇ＋）、銅（Ｃｕ２＋）、水銀（Ｈｇ２＋）、ヨウ素（Ｉ２）、亜ヒ酸（ＡｓＯ２ −）、マンガン（Ｍｎ２＋）、ニッケル（Ｎｉ＋）、亜セレン酸（ＳｅＯ３ ２−）のいずれかでも良い。即ち、これらの物質２に還元活性のある微生物１を、これらの物質２を再生しながら培養しても良い。六価クロム２と同様に銀、銅、水銀、ヨウ素も多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有しており、銀、銅、水銀、ヨウ素に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は多くの種類の微生物に対し生態毒性を有しており、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。これらの場合にも、上述のクロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。 In the above description, hexavalent chromium is used as the substance 2, but it is not limited to hexavalent chromium. For example, silver (Ag + ), copper (Cu 2+ ), mercury (Hg 2+ ), iodine (I 2 ), arsenous acid (AsO 2 − ), manganese (Mn 2+ ), nickel (Ni + ), selenite Any of (SeO 3 2− ) may be used. That is, the microorganism 1 having a reducing activity on these substances 2 may be cultured while regenerating these substances 2. Like hexavalent chromium 2, silver, copper, mercury, and iodine have a bactericidal effect on many types of microorganisms, and microorganisms 1 resistant to silver, copper, mercury, and iodine are selectively accumulated and cultured. be able to. Arsenite, manganese, nickel and selenite have ecotoxicity against many types of microorganisms, and the microorganism 1 resistant to arsenite, manganese, nickel and selenite is selectively used. Accumulation culture can be performed. In these cases, the same effects as those obtained when the chromium-reducing bacteria 1 are cultured can be obtained.
なお、物質２が銀の場合、培養液３中のＡｇ＋を銀還元菌１がＡｇに還元し、これを電気分解によってＡｇ＋に再生することが考えられる。また、物質２が銅の場合、培養液３中のＣｕ２＋を銅還元菌１がＣｕに還元し、これを電気分解によってＣｕ２＋に再生することが考えられる。また、物質２が水銀の場合、培養液３中のＨｇ２＋を水銀還元菌１がＨｇに還元し、これを電気分解によってＨｇ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がヨウ素の場合、培養液３中のＩ２をヨウ素還元菌１がＩ−に還元し、これを電気分解によってＩ２に再生することが考えられる。また、物質２が亜ヒ酸の場合、培養液３中の亜ヒ酸を亜ヒ酸還元菌１がヒ素に還元し、これを電気分解によって亜ヒ酸に再生することが考えられる。また、物質２がマンガンの場合、培養液３中のＭｎ２＋をマンガン還元菌１がＭｎに還元し、これを電気分解によってＭｎ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がニッケルの場合、培養液３中のＮｉ＋をニッケル還元菌１がＮｉに還元し、これを電気分解によってＮｉ＋に再生することが考えられる。また、物質２が亜セレン酸の場合、培養液３中の亜セレン酸を亜セレン酸還元菌１がセレンに還元し、これを電気分解によって亜セレン酸に再生することが考えられる。 In the case material 2 is silver, the Ag + in the culture solution 3 silver-reducing bacteria 1 is reduced to Ag, which is considered to play Ag + by electrolysis. Further, if the material 2 is copper, the Cu 2+ in the culture solution 3 copper reducing bacteria 1 is reduced to Cu, it is conceivable to play Cu 2+ by electrolysis. Moreover, when the substance 2 is mercury, it can be considered that mercury-reducing bacteria 1 reduce Hg 2+ in the culture solution 3 to Hg and regenerate it to Hg 2+ by electrolysis. Further, when the substance 2 is iodine, it is conceivable that the iodine-reducing bacteria 1 reduce I 2 in the culture solution 3 to I − and regenerate it to I 2 by electrolysis. Moreover, when the substance 2 is arsenous acid, the arsenite in the culture solution 3 may be reduced to arsenic by the arsenite-reducing bacteria 1 and regenerated to arsenite by electrolysis. Moreover, when the substance 2 is manganese, it is possible that the manganese reducing bacteria 1 reduce Mn <2+> in the culture solution 3 to Mn, and this is regenerated to Mn <2+> by electrolysis. Further, if the material 2 is nickel, a Ni + in the culture solution 3 nickel reducing bacteria 1 is reduced to Ni, this is considered to play a Ni + by electrolysis. Moreover, when the substance 2 is selenious acid, it is possible that the selenite in the culture solution 3 is reduced to selenium by the selenite-reducing bacteria 1 and is regenerated to selenite by electrolysis.
また、物質２として六価クロム２を使用して、ウラン還元菌１を選択的に集積培養しても良い。即ち、ウラン還元菌１によって還元された三価クロムを培養液３中に流した電気により酸化反応を生じさせて六価クロム２に再生しながら培養を行うようにしても良い。この場合にも、クロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。ウラン還元菌１として、六価クロムに対し還元活性を有し且つ耐性のあるものがある。ウランを溶解させた培養液３でウラン還元菌１を培養することが安全面、コスト面等で不利な場合がある。このような場合には、ウラン還元菌１を六価クロムを溶解させた培養液３中で培養することが安全面、コスト面等で有利となることも考えられる。 In addition, uranium reducing bacteria 1 may be selectively accumulated and cultured using hexavalent chromium 2 as substance 2. That is, the culture may be carried out while regenerating the hexavalent chromium 2 by causing an oxidation reaction by electricity in which trivalent chromium reduced by the uranium-reducing bacteria 1 is flowed into the culture solution 3. In this case, the same effect as that obtained when the chromium-reducing bacteria 1 is cultured can be obtained. As uranium-reducing bacteria 1, there is one having a reducing activity and resistance to hexavalent chromium. In some cases, culturing the uranium-reducing bacteria 1 in the culture solution 3 in which uranium is dissolved is disadvantageous in terms of safety, cost, and the like. In such a case, culturing the uranium-reducing bacteria 1 in the culture solution 3 in which hexavalent chromium is dissolved may be advantageous in terms of safety and cost.
本発明により、クロム還元菌１を良好に培養できることを確認するための実験を行った。使用した培養装置を図２に示す。電解槽４は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）５で仕切った二槽式とし、片方を培養槽６、もう一方を対極槽７とした。培養槽６には白金網（４０ｍｍ×７０ｍｍ、８０ｍｅｓｈ）製の陽極８、および銀・塩化銀参照電極１０（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。さらに、対極槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）を陰極９として設置した。これら３本の電極８，９，１０を電位制御装置１１に結線する事で、培養槽６内の陽極８の電位を厳密に設定可能とした 。 According to the present invention, an experiment was conducted to confirm that chromium-reducing bacteria 1 can be cultured well. The culture apparatus used is shown in FIG. The electrolytic cell 4 is a two-tank type in which the inside of a glass petri dish with an outer diameter of 75 mm and a height of 90 mm is partitioned by a monovalent cation-permeable exchange membrane (Asahi Kasei, K-192) 5 and one side is cultured. The tank 6 was used as the counter electrode tank 7 on the other side. The culture tank 6 was provided with an anode 8 made of platinum mesh (40 mm × 70 mm, 80 mesh) and a silver / silver chloride reference electrode 10 (HS-205C, Toa DKK). Further, a carbon plate (40 mm × 70 mm, 4 mm thickness) was installed as a cathode 9 in the counter electrode tank 7. By connecting these three electrodes 8, 9, 10 to the potential control device 11, the potential of the anode 8 in the culture tank 6 can be set strictly.
培養に際しては、電解槽４をアクリル製の嫌気ボックス１２内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０度に設定した恒温槽（図示せず）内に設置した。嫌気ボックス１２には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。 When culturing, the electrolytic cell 4 was enclosed in an acrylic anaerobic box 12, and the entire anaerobic box was installed in a thermostat (not shown) set at 30 degrees. Nitrogen gas was always injected into the anaerobic box 12 (0.2 L / min) to maintain an anaerobic atmosphere.
培養液３の組成を表２に、その中の金属溶液の組成を表３に示す。なお、以下の実験では、全てこの組成の培養液３を用いた。 The composition of the culture solution 3 is shown in Table 2, and the composition of the metal solution therein is shown in Table 3. In the following experiments, the culture solution 3 having this composition was used.
培養液３はまず、無機基本成分を調整後にオートクレーブ滅菌を施した。実験直前に、クロム塩および有機成分（Yeast Extract：０．２ｇ／Ｌ、乳酸ナトリウム：１ｇ／Ｌ）を混合し、フィルター（０．２２μｍ，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）によりろ過除菌した。 The culture solution 3 was first subjected to autoclave sterilization after adjusting the inorganic basic components. Immediately before the experiment, chromium salts and organic components (Yeast Extract: 0.2 g / L, sodium lactate: 1 g / L) were mixed and sterilized by filtration with a filter (0.22 μm, Millex-GS, MILLIPORE, Ireland).
陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながら２週間にわたり培養を行った。その結果を図３に示す。２週間の培養でクロム還元菌１の濃度が初期状態の約３倍に増加したことを確認できた。本発明によってクロム還元菌１を培養できることを確認できた。なお、クロム還元菌１の数は、光学顕微鏡観察による菌数カウントによって計測した。 Culturing was performed for 2 weeks while applying a potential of +1.0 V to the anode 8. The result is shown in FIG. It was confirmed that the concentration of chromium-reducing bacteria 1 increased to about 3 times the initial state after 2 weeks of culture. It was confirmed that chromium-reducing bacteria 1 can be cultured according to the present invention. The number of chromium-reducing bacteria 1 was measured by counting the number of bacteria by observation with an optical microscope.
また、微生物の形状に関する、より詳細な視覚的情報の取得を目的として、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Digital Instruments社、Nanoscope IIIa）による観察を行った。上記実験後の試料（本発明試料）と、比較のためにバイアル瓶を用いて培養を行った試料（比較試料）について観察を行った。ＡＦＭ観察試料は、アセトン中で超音波洗浄したカバーガラス（MATSUNAMI，Micro cover glass，１８×１８ｍｍ）を用いて作成した。カバーガラス上に微生物の懸濁液５０μＬを滴下し、約１時間常温で静置後、カバーガラスを蒸留水中に１０秒間浸漬させ、培養液３成分を洗い流した。その後、約１時間常温大気中で乾燥させ、測定に供した。ＡＦＭ測定は大気中にておこない、探針の制御法はコンタクトモードを採用した。個々のサンプルに対し、２０μｍ×２０μｍの領域をスキャンし、画像を取得した。なお、比較試料を得るためのバイアル瓶を用いた培養は、以下の通り行った。即ち、微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。 In addition, for the purpose of obtaining more detailed visual information on the shape of microorganisms, observation was performed with an atomic force microscope (AFM: Digital Instruments, Nanoscope IIIa). The sample after the experiment (the sample of the present invention) and a sample (comparative sample) cultured using a vial for comparison were observed. The AFM observation sample was prepared using a cover glass (MATSUNAMI, Micro cover glass, 18 × 18 mm) ultrasonically cleaned in acetone. 50 μL of the microorganism suspension was dropped onto the cover glass and allowed to stand at room temperature for about 1 hour, and then the cover glass was immersed in distilled water for 10 seconds to wash away the three components of the culture solution. Then, it was dried in room temperature air for about 1 hour and used for measurement. AFM measurement was performed in the atmosphere, and the contact mode was adopted as the probe control method. For each sample, an area of 20 μm × 20 μm was scanned to obtain an image. In addition, culture | cultivation using the vial bottle for obtaining a comparative sample was performed as follows. That is, a chromium salt and an organic component were added to a microorganism suspension, and 30 mL was injected into a 100 mL vial and sealed with a butyl rubber stopper and an aluminum cap. Subsequently, the gas in the vial was replaced with nitrogen, and the final gas pressure was adjusted to 1.5 atmospheres. The vial was subjected to shaking culture in a constant temperature room at 30 degrees.
その結果を図４に示す。図４（Ａ）は比較試料についての画像写真、図４（Ｂ）は本発明試料についての画像写真である。なお、各図中右下の線の長さは５μｍに相当する。比較試料では複数種の微生物の増殖が確認されたのに対し、本発明試料では菌形のそろった単一の微生物の増殖が確認できた。本発明試料で確認された微生物はクロム還元菌１であり、本発明によってクロム還元菌１を選択的に集積培養を行うことができることを確認できた。 The result is shown in FIG. 4A is an image photograph of the comparative sample, and FIG. 4B is an image photograph of the sample of the present invention. The length of the lower right line in each figure corresponds to 5 μm. In the comparative sample, the growth of a plurality of types of microorganisms was confirmed, whereas in the sample of the present invention, the growth of a single microorganism having a uniform fungus shape was confirmed. The microorganism confirmed in the sample of the present invention is chromium-reducing bacteria 1, and it was confirmed that the chromium-reducing bacteria 1 can be selectively enriched and cultured according to the present invention.
さらに念のため、上記実験（陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながらの実験）によって集積培養した微生物を、今度は陽極８に電位を与えずに２週間培養した。その結果を図５に示す。図５からも明らかなように、培養液３中の六価クロム２の濃度の減少が確認された。これにより、上記実験によって集積培養された微生物がクロム還元菌１であることを再確認できた。 As a precaution, the microorganisms accumulated and cultured by the above experiment (experiment while applying a potential of +1.0 V to the anode 8) were cultured for 2 weeks without applying a potential to the anode 8. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 5, a decrease in the concentration of hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 was confirmed. Thereby, it was reconfirmed that the microorganism accumulated and cultured in the above experiment was the chromium-reducing bacterium 1.
陽極８に与える電位を決定するための実験を行った。クロムをはじめとする種々の電極活性物質２の酸化還元電位の測定は、電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ｂ、BAS社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により実施した。この際、電解系は３極式で行い、電極反応を見るための作用極には白金円盤電極（面積：０．７８５ｍｍ２、BAS社）を、参照電極には銀・塩化銀電極（ＲＥ−１Ｂ、BAS社）、さらに電流を流すための対極には白金棒電極（１ｍｍ径×５ｃｍ、自作）を使用した。それぞれの電極活性物質２、具体的には六価クロムについては１ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、銀，銅，水銀，ヨウ素，亜ヒ酸，マンガン，ニッケル，亜セレン酸については５ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、電解質溶液中に溶解させた。ＣＶ結果は、それぞれの物質２ごとに、物質２の入っていない電解質溶液をベースラインとして表示した。 Experiments were performed to determine the potential applied to the anode 8. The measurement of the oxidation-reduction potential of various electrode active materials 2 including chromium was performed by a cyclic voltammetry (CV) method using an electrochemical analyzer (ALS model 660B, BAS). At this time, the electrolysis system is a three-pole system, a platinum disk electrode (area: 0.785 mm 2 , BAS) is used as a working electrode for observing the electrode reaction, and a silver / silver chloride electrode (RE--) is used as a reference electrode. 1B, BAS), and a platinum rod electrode (1 mm diameter × 5 cm, self-made) was used as a counter electrode for further flowing current. Each electrode active substance 2, specifically hexavalent chromium, is adjusted to a concentration of 1 mmol / L, and silver, copper, mercury, iodine, arsenous acid, manganese, nickel, selenious acid is adjusted to 5 mmol / L. The concentration was adjusted and dissolved in the electrolyte solution. The CV result was displayed for each substance 2 as the baseline of the electrolyte solution not containing substance 2.
六価クロム２についての酸化電位の測定結果を図６に示す。図６において、薄い色の実線はクロムを含まない培養液３（バックグラウンド）についての測定結果、濃い色の実線は１ｍ mol／Ｌのクロムイオンを含む培養液３についての測定結果である。なお、横軸（電位）は、銀塩化銀参照電極に対する値である（図７〜図１４において同じ）。培養液３にクロムが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近（矢印Ａ）に還元電流、＋１Ｖ付近（矢印Ｂ）に酸化電流の増加が確認できた。これらはそれぞれ、Ｃｒ(VI)→Ｃｒ(III)、Ｃｒ(III)→Ｃｒ(VI)の反応に起因する電流値であると判断できる。これは、培養液３に常時＋１Ｖの電位を加えることで、培養液３中のクロムをＣｒ(VI)に保持できることを示している。したがって、培養中に与える電位は＋１．０Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for hexavalent chromium 2 is shown in FIG. In FIG. 6, the light solid line is the measurement result for the culture solution 3 (background) not containing chromium, and the dark solid line is the measurement result for the culture solution 3 containing 1 mmol / L chromium ions. The horizontal axis (potential) is a value with respect to the silver-silver chloride reference electrode (same in FIGS. 7 to 14). When electrochemical reduction / reduction was carried out in the presence of chromium in the culture solution 3, an increase in reduction current was observed near 0 V (arrow A) and an increase in oxidation current was observed near +1 V (arrow B). These can be judged to be current values resulting from the reaction of Cr (VI) → Cr (III) and Cr (III) → Cr (VI), respectively. This indicates that chromium in the culture medium 3 can be held in Cr (VI) by always applying a potential of +1 V to the culture medium 3. Therefore, +1.0 V is suitable for the potential applied during the culture.
銀（Ａｇ＋）についての酸化電位の測定結果を図７に示す。図７において、実線は銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for silver (Ag + ) is shown in FIG. In FIG. 7, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing silver, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L silver ions. When electrochemical reduction / reduction was carried out in the presence of silver in the culture solution, an increase in oxidation current was confirmed at around +0.5 V (arrow). Therefore, + 0.5V is suitable for the potential applied during the culture.
銅（Ｃｕ２＋）についての酸化電位の測定結果を図８に示す。図８において、実線は銅を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銅イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銅が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近と＋０．２Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、０Ｖ又は＋０．２Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for copper (Cu 2+ ) is shown in FIG. In FIG. 8, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing copper, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L copper ions. When electrochemical oxidation / reduction was carried out in a state where copper was present in the culture solution, an increase in oxidation current could be confirmed around 0 V and around +0.2 V (two arrows). Therefore, 0V or + 0.2V is suitable for the potential applied during the culture.
水銀（Ｈｇ２＋）についての酸化電位の測定結果を図９に示す。図９において、実線は水銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの水銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に水銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．３Ｖ付近と＋０．６Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．３Ｖ又は＋０．６Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for mercury (Hg 2+ ) is shown in FIG. In FIG. 9, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing mercury, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L mercury ions. When electrochemical oxidation / reduction was performed in the presence of mercury in the culture solution, an increase in oxidation current could be confirmed around +0.3 V and around +0.6 V (two arrows). Therefore, + 0.3V or + 0.6V is suitable for the potential applied during the culture.
ヨウ素（Ｉ２）についての酸化電位の測定結果を図１０に示す。図１０において、実線はヨウ素を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのヨウ素を含む培養液についての測定結果である。培養液にヨウ素が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近と＋０．８Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖ又は＋０．８Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for iodine (I 2 ) is shown in FIG. In FIG. 10, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing iodine, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L iodine. When electrochemical oxidation / reduction was carried out in the presence of iodine in the culture solution, an increase in oxidation current was confirmed at around +0.5 V and around +0.8 V (two arrows). Therefore, + 0.5V or + 0.8V is suitable for the potential applied during the culture.
亜ヒ酸（ＡｓＯ２ −）についての酸化電位の測定結果を図１１に示す。図１１において、実線は亜ヒ酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜ヒ酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜ヒ酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖが適している。 FIG. 11 shows the measurement results of the oxidation potential for arsenous acid (AsO 2 − ). In FIG. 11, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) containing no arsenite, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L arsenous acid. When electrochemical oxidation / reduction was performed in the presence of arsenous acid in the culture solution, an increase in oxidation current was confirmed at around +0.7 V (arrow). Therefore, + 0.7V is suitable for the potential applied during the culture.
マンガン（Ｍｎ２＋）についての酸化電位の測定結果を図１２に示す。図１２において、実線はマンガンを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのマンガンイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にマンガンが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近と＋１．０Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖ又は＋１．０Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for manganese (Mn 2+ ) is shown in FIG. In FIG. 12, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing manganese, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L manganese ions. When electrochemical reduction was carried out in the presence of manganese in the culture solution, an increase in oxidation current could be confirmed around +0.7 V and +1.0 V (two arrows). Therefore, + 0.7V or + 1.0V is suitable for the potential applied during the culture.
ニッケル（Ｎｉ＋）についての酸化電位の測定結果を図１３に示す。図１３において、実線はニッケルを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのニッケルイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にニッケルが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、−０．４Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、−０．４Ｖが適している。 The measurement results of the oxidation potential for nickel (Ni + ) are shown in FIG. In FIG. 13, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing nickel, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L nickel ions. When electrochemical oxidation / reduction was performed in a state where nickel was present in the culture solution, an increase in oxidation current was confirmed at around -0.4 V (arrow). Therefore, -0.4V is suitable for the potential applied during the culture.
亜セレン酸（ＳｅＯ３ ２−）についての酸化電位の測定結果を図１４に示す。図１４において、実線は亜セレン酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜セレン酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜セレン酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。 The measurement result of the oxidation potential for selenious acid (SeO 3 2− ) is shown in FIG. In FIG. 14, the solid line shows the measurement results for the culture solution (background) not containing selenite, and the broken line shows the measurement results for the culture solution containing 5 mmol / L selenious acid. When electrochemical reduction was carried out in the presence of selenious acid in the culture solution, an increase in oxidation current was confirmed at around +0.5 V (arrow). Therefore, + 0.5V is suitable for the potential applied during the culture.
培養液３中の六価クロム２の濃度の適正値を求めるための実験を行った。実験ではバイアル瓶を使用し、電位を与えない状態（六価クロム２の再生を行わない状態）で実験を行った。微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。微生物として２箇所の土壌（土壌Ａ、土壌Ｂ）から採取したクロム還元菌１を使用し、培養液３中の六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌ、０．２ｍ mol／Ｌ、０．５ｍ mol／Ｌ、１．０ｍ mol／Ｌの４つの値について実験を行った。また、比較のために、クロム還元菌１を投入しない場合（control）についても実験を行った。 An experiment was performed to determine the appropriate value of the concentration of hexavalent chromium 2 in the culture solution 3. In the experiment, a vial was used, and the experiment was performed in a state where no potential was applied (a state where hexavalent chromium 2 was not regenerated). Chromium salt and organic components were added to the microorganism suspension, and 30 mL was injected into a 100 mL vial, and sealed with a butyl rubber stopper and an aluminum cap. Subsequently, the gas in the vial was replaced with nitrogen, and the final gas pressure was adjusted to 1.5 atmospheres. The vial was subjected to shaking culture in a constant temperature room at 30 degrees. Using chromium-reducing bacteria 1 collected from two soils (soil A and soil B) as microorganisms, the initial concentration of hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 is 0.1 mmol / L, 0.2 mmol / L , 0.5 mmol / L and 1.0 mmol / L were tested. For comparison, an experiment was also conducted for the case where the chromium-reducing bacteria 1 was not added (control).
まず最初に、クロム還元菌１による培養液３中の六価クロム濃度の時間変化についての測定結果を図１５に示す。図１５（Ａ）は六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌの場合、（Ｂ）は六価クロム２の初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌの場合、（Ｃ）は六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合、（Ｄ）は六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合である。なお、各図では縦軸のスケールが異なっている。六価クロム２の初発濃度が０．１と０．２ｍ mol／Ｌの場合には、実験開始から１〜２週間で六価クロム２の濃度が０近くまで減少した。また、六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合には、六価クロム濃度の減少は僅かであった。一方、六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合、六価クロム濃度の有意な減少はみられなかった。 First, the measurement result about the time change of the hexavalent chromium concentration in the culture solution 3 by the chromium reducing bacteria 1 is shown in FIG. 15A shows the case where the initial concentration of hexavalent chromium 2 is 0.1 mmol / L, FIG. 15B shows the case where the initial concentration of hexavalent chromium 2 is 0.2 mmol / L, and FIG. When the initial concentration of chromium 2 is 0.5 mmol / L, (D) is the case where the initial concentration of hexavalent chromium 2 is 1.0 mmol / L. In each figure, the scale of the vertical axis is different. When the initial concentration of hexavalent chromium 2 was 0.1 and 0.2 mmol / L, the concentration of hexavalent chromium 2 decreased to nearly 0 in 1 to 2 weeks from the start of the experiment. When the initial concentration of hexavalent chromium 2 was 0.5 mmol / L, the decrease in hexavalent chromium concentration was slight. On the other hand, when the initial concentration of hexavalent chromium 2 was 1.0 mmol / L, no significant decrease in hexavalent chromium concentration was observed.
なお、培養液３中のクロムは、六価クロム２の状態では溶液中に溶解しているが、三価クロムの状態では沈殿するので、培養液３をフィルター（０．２２μm，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）で三価クロムをろ過することにより、六価クロム２のみを抽出し、クロム濃度を分析した。クロムの定量にはＩＣＰ発光分析装置（Ｐ８０００、HITACHI社）を使用した。 Chromium in the culture solution 3 is dissolved in the solution in the hexavalent chromium 2 state, but precipitates in the trivalent chromium state, so the culture solution 3 is filtered (0.22 μm, Millex-GS, By filtering trivalent chromium with MILLIPORE, Ireland, only hexavalent chromium 2 was extracted and analyzed for chromium concentration. An ICP emission analyzer (P8000, HITACHI) was used for chromium determination.
次に、各初発濃度における菌濃度の時間変化についての測定結果を図１６に示す。なお、図中縦軸は、クロム還元菌１を含む菌全体（クロム還元菌１以外の雑多な菌も含む）の濃度（cells／ｍＬ）である。また、図中右上四角枠内の数値（０．１／０．２／０．５／１．０）は、六価クロム２の初発濃度（ｍ mol／Ｌ）を示している。図１６（Ａ）は土壌Ａについての測定結果、図１６（Ｂ）は土壌Ｂについての測定結果である。 Next, the measurement result about the time change of the microbe density | concentration in each initial concentration is shown in FIG. In addition, the vertical axis | shaft in a figure is the density | concentration (cells / mL) of the whole microbe (including miscellaneous microbes other than the chromium reducing microbe 1) containing the chromium reducing microbe 1. FIG. Moreover, the numerical value (0.1 / 0.2 / 0.5 / 1.0) in the upper right square frame in the figure shows the initial concentration (m mol / L) of hexavalent chromium 2. 16A shows the measurement results for soil A, and FIG. 16B shows the measurement results for soil B.
六価クロム初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌ以下の場合、培養後半では六価クロム２の濃度がほぼゼロになっている（図１５（Ａ）（Ｂ））ことから、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．１、０．２ｍ mol／Ｌで増えている菌は、雑多な菌も含まれていると考えられる。一方、六価クロム初発濃度０．５ｍ mol／Ｌの場合、培養後半でも六価クロム２が維持されている（図１５（Ｃ））ので、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．５ｍ mol／Ｌで増えている菌は、クロム還元菌１であると考えられる。すなわち、土壌Ａ、土壌Ｂに含まれるクロム還元菌１は、与えられた培養液３環境において、少なくともそれぞれ、１．４×１０９cells／ｍＬ、６×１０８cells／ｍＬまで増殖できることが確認できた。 When the initial concentration of hexavalent chromium is 0.2 mmol / L or less, the concentration of hexavalent chromium 2 is almost zero in the latter half of the culture (FIGS. 15A and 15B). It is considered that the bacteria increasing at 0.1 and 0.2 mmol / L in (B) include miscellaneous bacteria. On the other hand, when the initial concentration of hexavalent chromium is 0.5 mmol / L, hexavalent chromium 2 is maintained even in the latter half of the culture (FIG. 15C), so 0.5 mmol of FIGS. 16A and 16B. Bacteria increasing at / L is considered to be chromium-reducing bacteria 1. That is, it was confirmed that chromium-reducing bacteria 1 contained in soil A and soil B can grow to at least 1.4 × 10 9 cells / mL and 6 × 10 8 cells / mL, respectively, in the given culture medium 3 environment. did it.
なお、六価クロム２が培養液３中に残っているにもかかわらず、微生物１の増殖が止まっているのは、六価クロム２が微生物１の増殖に直接関与しない物質である（即ち、微生物が呼吸するのに六価クロム２を必要とするのではなく、微生物１の発酵の過程で六価クロム２を還元する）証であり、おそらくは増殖に必要な有機物が使い尽くされたためと考えられる。 It should be noted that although the hexavalent chromium 2 remains in the culture solution 3, the microorganism 1 has stopped growing because the hexavalent chromium 2 is not directly involved in the growth of the microorganism 1 (ie, This is evidence that hexavalent chromium 2 is reduced in the process of fermentation of microorganism 1, rather than requiring hexavalent chromium 2 for respiration, and probably because organic substances necessary for growth have been used up. It is done.
一方、六価クロム２の初発濃度１．０ｍ mol／Ｌの場合、ここで増えているのはクロム還元菌１と考えられる（図１５（Ｄ）より培養液３中に六価クロム２が存在しているため）が、０．５ｍ mol／Ｌの場合に比べて明らかに菌体濃度が低いことから（図１６）、１．０ｍ mol／Ｌの場合の六価クロム２は、クロム還元菌１自体の増殖を阻害していると考えられる。 On the other hand, when the initial concentration of hexavalent chromium 2 is 1.0 mmol / L, it is considered that the increased amount is chromium-reducing bacteria 1 (from FIG. 15D, hexavalent chromium 2 is present in the culture solution 3). However, since the bacterial cell concentration is clearly lower than that in the case of 0.5 mmol / L (FIG. 16), hexavalent chromium 2 in the case of 1.0 mmol / L is a chromium-reducing bacterium. 1 is thought to inhibit the growth of itself.
以上より、培養液３中の六価クロム濃度が高過ぎても培養に適さないことがわかった。そして、具体的には、クロム還元菌１の集積培養の際には、０．５ｍ mol／Ｌ以下の六価クロム濃度にて、培養液３中の六価クロム２がなくならないような条件の下で培養することが好ましいことがわかった。 From the above, it was found that the hexavalent chromium concentration in the culture medium 3 is not suitable for culture even if it is too high. Specifically, in the enrichment culture of the chromium-reducing bacteria 1, the hexavalent chromium 2 in the culture solution 3 is not lost at a hexavalent chromium concentration of 0.5 mmol / L or less. It has been found that it is preferable to culture under.
また、培養液３中の六価クロム濃度が低すぎるとクロム還元菌１以外の雑多な菌の繁殖を許してしまうことになるので、六価クロム濃度としては、最低でも雑多な菌の繁殖を抑えることができる濃度を確保する必要がある。例えば、０．１ｍ mol程度の濃度を確保することが好ましい。 In addition, if the hexavalent chromium concentration in the culture solution 3 is too low, it will allow the breeding of miscellaneous bacteria other than the chromium-reducing bacteria 1, and therefore the hexavalent chromium concentration is at least the breeding of miscellaneous bacteria. It is necessary to secure a concentration that can be suppressed. For example, it is preferable to secure a concentration of about 0.1 mmol.
１ 培養対象微生物
２ 六価クロム（物質）
３ 培養液
1 Target microorganism 2 Hexavalent chromium (substance)
3 Culture solution
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