JP4612629B2 - 細胞株及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２と表記される新規細胞株及び該細胞株の使用に関する。例えば、前記細胞株は、非組換えメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）受容体タンパク質の産生、並びに前記受容体に対するアンタゴニスト、インバースアゴニスト及びアゴニストの同定に使用することができる。

組換えＭＣＨ受容体は、様々な細胞株の中で発現されており、これらの細胞株は、組換えＭＣＨ受容体から起こり得る細胞内シグナル伝達経路を解明するために使用されてきた（Ｇｒｉｆｆｏｎｄ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． ２１３：２３３−２７７（２００２） ａｎｄ Ｈａｗｅｓ ｅｔａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：４５２４−４５３２（２０００））。さらに、多数の細胞株が、ＭＣＨＲ_１ ｍＲＮＡを発現し、及び／又は^１２５Ｉ−ＭＣＨを結合し、又はＭＣＨによって媒介される受容体の活性化を示すことが報告されている（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ２８３：Ｅ５８４−Ｅ５９２（２００２）；Ｂｕｒｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４１：６２２−６２９（１９９７）； Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８９：４４−５０（２００１）； Ｔａｄａｙｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７５：７０９−７１２（２０００） ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ． ８６：３６９−３７４（２００１））。しかしながら、公表された研究で使用されている^１２５Ｉで標識されたペプチドの一部で観察されている、高レベルの非特異的結合のために、様々な細胞株へのＭＣＨ結合の報告の中には正しくないものがあり得る（Ｋｏｋｋｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ３４：２４０−２４７（２０００））。

ＭＣＨ受容体活性化の小分子アンタゴニストを発見するための、組換え受容体の使用も報告されている（Ｔａｋｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ． ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４３８ ：１２９−１３５（２００２） ａｎｄ Ｂｏｒｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：８２５−８３０ （２００２））。

上記に照らせば、前記受容体の産生方法を発見する大きな必要が存在する。一旦受容体が産生されれば、例えば、該受容体に関連するアンタゴニスト、アゴニスト及びインバースアゴニストを見つけるために使用することができる。この受容体は、この受容体が関わっている生理的経路を解明するために使用することもできる。

本明細書に参照されている全ての米国特許及び文献は、参照により、それらの全体を本明細書に組み込まれる。

本発明は、Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２（「Ｉ．３．４．２」）と表記され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する単離された細胞株、及び該細胞株の細胞によって産生される、単離されたタンパク質を含む。特に、前記タンパク質は、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）受容体である。本発明は、細胞株の細胞又は該細胞の膜を含む組成物も包含する。

さらに、本発明は、１０培養継代を超えて、ＭＣＨに対する応答性を保持する細胞株も包含する。ＭＣＨは、天然のヒトＭＣＨペプチド又は他の種のＭＣＨ（例えば、サケＭＣＨ）であり得、例えば、生じたペプチドが１００ｎＭ未満のＫ_ｄでＭＣＨＲ_１に結合できる能力を維持するように、アミノ酸欠失、置換又は修飾によって前記ＭＣＨペプチドの改変された形態であり得る。前記細胞株は、ＭＣＨによって媒介されるカルシウム^＋＋動員に対して約９０ｎＭのＥＣ_５０も示す。また、本発明には、この細胞株の細胞を含む組成物が含まれる。

さらに、本発明は、ＭＣＨ受容体の産生に十分な時間及び条件下で、上記細胞株の細胞又は該細胞から得られる細胞株を培養するステップを含む、ＭＣＨ受容体を産生する方法を包含する。

さらに、本発明は、ａ）細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、前記試験化合物を前記細胞株の前記細胞に接触させるステップと、ｂ）ステップ（ａ）の前記接触された細胞にＭＣＨを添加するステップと、ｃ）前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の細胞と比較して、ステップ（ａ）の前記細胞中の細胞内カルシウム流入を測定し、前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の細胞と比べて、ステップ（ａ）の前記接触された細胞中の細胞内カルシウム流入が減少していることが、前記試験化合物が前記ＭＣＨ受容体に対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストであることを示すステップと、を含む、ＭＣＨ受容体（ＭＣＨＲ）に対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストを同定する方法、を含む。また、本発明には、該方法に従って同定された全てのＭＣＨＲアンタゴニスト又はインバースアゴニストが含まれる。

さらに、本発明は、ａ）細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、前記試験化合物を前記細胞株の前記細胞に接触させるステップと、ｂ）前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の細胞と比較して、ステップ（ａ）の前記細胞中の細胞内カルシウム流入を測定し、前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の前記細胞と比べて、ステップ（ａ）の前記細胞中の前記細胞内カルシウム流入が増加していることが、前記試験化合物が前記ＭＣＨ受容体に対するアゴニストであることを示すステップと、を含む、ＭＣＨ受容体に対するアゴニストを同定する方法、を包含する。本発明は、該方法によって同定された任意のアゴニストも含む。

さらに、本発明には、ＭＣＨＲに対するアンタゴニストが細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞によって産生されたＭＣＨＲに結合するのに十分な時間と条件下で、前記細胞株の前記細胞を前記アンタゴニトに接触させることを含み、前記結合が、前記細胞株の前記接触された細胞にその後添加されたＭＣＨによる細胞内シグナル伝達の活性化を阻害する、ＭＣＨによる細胞内シグナル伝達の活性化を阻害する方法が含まれる。

また、本発明は、ａ）細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞又はその膜を、前記細胞株の前記細胞により産生されたＭＨＣＲがコンジュゲートのＭＣＨに結合するのに十分な時間と条件下で、コンジュゲートと接触させるステップと、ここにおいて、前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含み、
ｂ）非標識ＭＣＨを、前記非標識ＭＣＨが前記コンジュゲートを置換させるのに十分な時間と条件下で、前記結合されたＭＣＨＲに添加するステップと、ｃ）前記非標識ＭＣＨによる前記コンジュゲート中のＭＣＨの置換に比例する、前記ＭＣＨＲに対する前記コンジュゲートのＭＣＨの結合親和性を示す、前記シグナル生成化合物によって生成されたシグナルの強度を検出するステップと、を含む、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合の親和性を決定する方法、を含む。

さらに、本発明は、ａ）細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を阻害すると疑われる前記試験化合物に、前記細胞株の前記細胞又はそれらの膜を接触させるステップと、ｂ）測定可能なシグナルを生成できるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含むコンジュゲートを、ステップ（ａ）の前記細胞株の前記接触された細胞に添加するステップと、ｃ）前記生成された測定可能なシグナルを定量し、前記生成された測定可能なシグナルを前記試験化合物の不存在下で生成された対照シグナルと比較することによって、前記試験化合物による、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合の阻害を測定するステップと（ここにおいて、前記対照シグナルがＭＣＨＲへのＭＣＨの結合のゼロパーセント阻害を表し、前記対照シグナルに比べて前記試験化合物を用いて得られたシグナルが小さいことが、前記試験化合物がＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を部分的に又は完全に阻害することを表す。）を含む、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を阻害する組成物を同定する方法、を含む。

本発明は、ａ）細胞株Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、ＭＣＨＲの活性化を阻害すると疑われる前記試験化合物に、前記細胞株の前記細胞又はそれらの膜に接触させるステップと、ｂ）測定可能なシグナルを生成できるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含むコンジュゲートを、ステップ（ａ）の前記接触された細胞に添加するステップと、ｃ）生成された測定可能なシグナルを定量し、前記生成された測定可能なシグナルを、前記試験化合物の不存在下で生じた対照シグナルと比較することによって、前記試験化合物によるＭＣＨＲの活性の基底レベルの阻害を測定するステップと、を含む、ＭＣＨＲのアンタゴニストとインバースアゴニストを識別する方法も包含する。対照シグナルは、ＭＣＨＲの基底活性を表す。このため、対照シグナルに比べて、試験化合物の使用によって得られるシグナルが小さいことは、該化合物がＭＣＨＲのインバースアゴニストであることを示し、対照シグナルに比べて、試験化合物の使用によって得られたシグナルが等しいことは、該化合物がＭＣＨＲのアンタゴニストであることを示す。

さらに、本発明には、ＭＣＨＲを発現する細胞株を産生する方法が含まれる。本方法は、ａ）ＩＭＲ３２細胞を、Ｇα_１６と抗生物質耐性マーカーとをコードするＤＮＡと接触させるステップと、ｂ）前記抗生物質耐性マーカーに対する抗生物質を前記接触された細胞に添加するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の抗生物質耐性細胞を単離し、単離された該細胞を増殖させるステップと、ｄ）前記増殖された細胞に、ステップ（ｂ）で使用された濃度より高い濃度で、前記抗生物質を添加するステップと、ｅ）ＭＣＨＲを産生する細胞株を産生するために、ステップ（ｄ）の得られた細胞を単離し、単離された該細胞を増殖するステップと、を含む。増加する抗生物質の濃度は、ＭＣＨＲ、Ｇα_１６及び抗生物質耐性マーカーをコードする遺伝子の発現を安定化させる役割を果たす。

（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２（又は「Ｉ３．４．２」）と表記され、その細胞がＭＣＨ受容体又はタンパク質を産生する、遺伝子改変された細胞株に関する。この細胞株は、Ｇα_１６タンパク質をコードするプラスミドの形質移入によって、ＩＭＲ３２細胞株（ＡＴＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１２７を有し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９から入手できる。）から得られた。ＩＭＲ３２は、メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ） ｍＲＮＡを発現するヒト神経芽細胞株である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ（２００１）参照）。しかしながら、ＩＭＲ３２細胞株では、ＭＣＨに対して応答する細胞内シグナル伝達を検出することができなかった。

この新規細胞株は、ＭＣＨに対する応答性を、１０培養継代を超えて維持し、（蛍光定量イメージングプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いて測定した場合）ＭＣＨによって媒介されるＣａ^＋＋動員に対して約９０ｎＭのＥＣ_５０を示す。配列分析（図１ａ）は、Ｉ３．４．２細胞株中にコードされたＭＨＣＲ_１配列が、文献（Ｇｒｉｆｆｏｎｄ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ｓｕｐｒａ（２００２））に記載されているものと同じであることを示している。思いがけないことに、Ｉ３．４．２細胞株の細胞は、ｑＰＣＲ分析によって示されたところによると（図１ｂ）、親ＩＭＲ３２細胞株の細胞よりずっと高いレベルのＭＣＨＲ_１ ｍＲＮＡを発現する。

特に、前記細胞株は、ＭＣＨ受容体アゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニストを発見及び開発するために、並びに神経由来の細胞モデルに対するＭＣＨ、ＭＣＨＲアゴニスト、ＭＣＨＲインバースアゴニスト及びＭＣＨＲアンタゴニストの効果をインビトロで研究するために、ＭＣＨ受容体を産生する上で有用であり得る。より一般的に使用されている、組換え受容体を発現するＨＥＫ又はＣＨＯ繊維芽細胞株より、このような細胞株は、ニューロペプチド受容体アンタゴニスト又はアゴニストの研究のためにより適切な細胞種であり得る。さらに、ＭＣＨアンタゴニストの発見は、例えば、脳の摂食中枢に存在するＭＣＨ受容体に対する作用を通じて食物摂取を減少させることによって及び／又はエネルギー消費の増加を促進することによって、体重を減少させるための薬物をもたらすものと期待され得る。多くの細胞内シグナル伝達経路がＭＣＨの存在によって影響を受けることにも留意すべきである。このように、ＭＣＨ受容体に結合し、その活性化を抑える化合物は、このような経路の本来の進路又は結果を変更するであろう。従って、本発明の細胞株は、これらの経路に影響を与えるアンタゴニスト又はインバースアゴニストの同定において使用し得る。例えば、前記細胞株は、前記受容体に対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストの同定に使用することができ、前記アンタゴニスト又はインバースアゴニストは、次いで、ＭＡＰＫの活性化及びホスホチジルイノシトールの加水分解を抑制し、ｃＡＭＰを蓄積させる（すなわち、この経路の副産物又は最終産物）。あるいは、これらの経路に対して正の影響を与えたいのであれば、ＭＣＨ受容体の機能を増強するアゴニストを同定するために、細胞株を使用し得る。

ホルモン自体に関していえば、ＭＣＨは、げっ歯類において食物摂取とエネルギーの恒常性を制御することが示されている、１９アミノ酸の環状ニューロペプチドである。げっ歯類の視床下部中に脳内注射すると、ＭＣＨは食物摂取を刺激する。ＭＣＨ ｍＲＮＡの発現は、遺伝的な肥満ｏｂ／ｏｂマウス中で上昇しており、ＭＣＨを過剰発現するトランスジェニックマウスは、過食及び肥満である。逆に、ＭＣＨを発現していない（ＭＣＨ^−／−）トランスジェニックマウスは、少食及び痩身である。ＭＣＨ受容体を発現していない（ＭＣＨＲ^−／−）マウスは、少食ではないが、高脂肪食を摂取した場合でも、痩身のままである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒｉｏｌ． １４３：２４６９−２４７７（２００２）； Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：３２４０−３２４５（２００２））。

以下の非限定例を使用することによって、本発明を説明する。

細胞株の作製及び細胞シグナル伝達の測定
基礎培地（ＭＥＭ）／１０％ウシ胎児血清／５０μｇ／ｍＬ／ゲンタマイシン（成長培地）中で、ＩＭＲ３２ 細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１２７）を培養した。トランスフェクションの２４時間前に、２００，０００細胞／ウェルで、２４ウェル組織培養プレート中に細胞を播種した。トランスフェクションのために、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の推奨に従って、無血清ＭＥＭ中で、Ｇα_１６及びＺｅｏｃｉｎ耐性マーカーをコードするプラスミドのＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ ２０００と混合した。この溶液を、培地中のＩＭＲ３２細胞に与えた。６時間後、このトランスフェクション培地を取り除き、新鮮な培地と交換した。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、最初の細胞密度の約１／４で、６ウェル培養プレート中に再度播種した。

翌日、２０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように、Ｚｅｏｃｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を添加した。分離したコロニーが観察されるまで、定期的に交換しながら、この培地中に細胞を維持した。各コロニーを単離し、細胞試料を低温保存できるように、十分に大きな細胞集団が得られるまで増殖させた。低温保存後、ＭＣＨによって媒介されるシグナル伝達について、細胞を調べた。アンタゴニスト化合物がアッセイ中に含まれていないこと、及び、受容体の活性化に対するＥＣ_５０を決定するために、様々な濃度のＭＣＨ（１ｎＭから１０μＭ）（Ｂａｃｈｅｍ， Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）が細胞に与えられたことを除き、Ｃａ^＋＋の動員に関して実施例ＩＩＩに記載されているアッセイと同様のアッセイを使用して、このようなシグナル伝達を求めた。

得られた細胞株（すなわち、Ｉ３．４）は、当初、ＭＣＨに対する安定な応答を示さなかった。３から４代の培養継代を経る間に、ＭＣＨに対する細胞の応答は、Ｃａ^＋＋の動員アッセイで検出不能なレベルまで低下した。

このような表現型の不安定さは、このような細胞集団中で起こる遺伝的修飾が高い割合であるため、形質移入された細胞株においては珍しいわけではない。最初の細胞株の再選択及びサブクローニングによって、元の細胞集団内から、より安定な変種を単離することが可能となる場合がある。より高濃度の選択的薬剤を使用することにより、高レベルの薬剤耐性導入遺伝子の発現に対する選択圧が増加する。非選択の導入遺伝子（このケースでは、Ｇα_１６）は、薬剤耐性導入遺伝子に遺伝的に近接して連鎖しているので、この再選択プロセスは、マーカー遺伝子と非選択導入遺伝子の両方を高レベルで発現するクローン変種を選択する傾向がある。従って、ＭＣＨ応答性細胞株を回収するために、低温保存された細胞を融解し、続いて、所望の表現型をさらに安定に発現する細胞株を取得する試みで、２００μｇ／ｍＬで、Ｚｅｏｃｉｎ耐性について再選択を行った。各細胞コロニーを単離し、増殖させ、上記のとおりアッセイを行った。

得られた細胞株、Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２は、Ｃａ^＋＋の動員アッセイを使用して測定したところ、１０培養継代を超えて、ＭＣＨに対する応答性を維持していた。前記細胞に対する典型的なＥＣ_５０曲線が図２に示されている。ＥＣ_５０は、８０ｎＭであることが明らかとなった（ＳＥＭ＝１２、ｎ＝８）。この値は、組換えＭＣＨＲ_１を発現する細胞株に関する、ＥＣ_５０の文献報告と同等である（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４００：２６１−２６５（１９９９）； Ｓａｉｔｏ ｅｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４００：２６５−２６９ （１９９９）；Ｌｅｍｂｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １：２６７−２７１ （１９９９）；Ｈａｗｅｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｅｎｄｏｃｒｉｏｌ． １４１：４５２４−４５３２（２０００））。

本発明のＩ３．４．２細胞株は、２００３年５月１５日に、ブダペスト条約の規定に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、寄託番号ＰＴＡ−５２０１が与えられた。

ＭＣＨＲ_１の配列及びＩ３．４．２細胞中でのｍＲＮＡの発現
Ｉ３．４．２細胞について、ＭＣＨＲ_１配列を決定した。簡潔に述べると、成長培地を除去するために、Ｄ−ＰＢＳで集密細胞を洗浄し、５ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で溶解し、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮＡを調製した。混入するＤＮＡのレベルを低下させるために、得られたＲＮＡを、ＲＱ１ ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）で処理した。ＰＣＲ用の基質としてｃＤＮＡを作製するために、製造業者が推奨するプロトコールに従って、二つ組みで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてＲＮＡを逆転写した。以下に列記されているＰＣＲプライマーを用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡを増幅した。

ＰＣＲのサイクル条件は、次のとおりであった。９４℃で２分を１サイクル；９４℃で３０秒／５０℃で３０秒／６８℃で２分を３０サイクル；６８℃で１０分を１サイクル。外側プライマーを用いた最初の増幅後、上記のネステッド（内側）プライマーセットを用いて、この最初のＰＣＲ増幅から得た１μＬの試料を再増幅した（３０サイクル）。ネステッドＰＣＲ反応から得た産物を、アガロースゲル上で電気泳動し、得られた最高分子量のバンドをゲル精製し、配列を決定した。増幅反応の産物は、ＭＣＨＲ_１転写物の報告されたサイズに基づくと、予想より大きかったが、独立に生成された８つのＰＣＲ産物から、下記のプライマー及びＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｇ Ｄｙｅサイクル配列決定技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ．， ＣＡ）を、製造業者の推奨されるプロトコールに従って使用し、ＤＮＡの配列を決定した。

ＤＮＡ配列決定の結果、配列決定されたバンドはゲノムＤＮＡから得られたことが示唆され、これは、おそらく、ＲＱ１の不完全な消化の結果であると思われる。このゲノム配列は短いイントロンを一つ含有しているだけなので、微量のゲノムＤＮＡの増幅は、使用した手法の結果である可能性がないとはいえない。得られた配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ配列ＮＭ ００５２９７と同一である。予想されるアミノ酸配列は、図１ａに示されている（配列番号１）。

Ｉ３．４．２及び親ＩＭＲ３２細胞株中でのヒトＭＣＨＲ_１ ｍＲＮＡの相対発現は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＴａｑＭａｎ^（Ｒ） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ法を用いて定量された。ヒトＭＣＨＲ_１遺伝子に対する遺伝子特異的（ＧＳＰ）ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プライマー及びプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｐｒｏｇｒａｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計され、標準的なホスホラミダイト化学を用いて合成された。全てのＧＳＰ ＴａｑＭａｎ^（Ｒ）プローブは、レポーターフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’標識し、消光剤テトラメチルローダミン（ＴＡＭＡＲＡ）で３’標識した。全ての細胞ＲＮＡは、製造業者の記載どおりに、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて調製し、全ての混入ゲノムＤＮＡを除去するためにＤｎａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で処理した。ＭＣＨＲ_１転写物を検出するために、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ− ＰＣＲ ｋｉｔ^（Ｒ）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用した。以下のプライマーを用いて、６９ｂｐのＭＣＨＲ_１アンプリコンを増幅した。

温度サイクリング用光学ＰＣＲプレート中に１００ｎｇの総ＲＮＡを含有する２５μＬの反応用量で、三つ組みにて、増幅を実施した。ＱＲＴＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。５０℃で３０分／９５℃で１５分を１サイクル、続いて、９４℃で１５秒／６０℃で１分を４０サイクル。データは、ＰＣＲ伸長相の間に収集し、ＡＢＩ−７７００ ＳＤＳ １．６．３ソフトウェアパッケージを用いて分析した。内部標準２８Ｓ ｒＲＮＡ増幅に対して、データを標準化した。各試料に対して２８Ｓ ｒＲＮＡ及びＭＣＨＲ_１データを使用し、Ｉ３．４．２細胞の相対発現値をＩＭＲ３２親細胞株と比較するために、ΔΔＣｔ法（ＰＥ−ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｕｓｅｒｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２）を利用した。結果（図１ｂ）は、Ｉ３．４．２細胞株が、親ＩＭＲ３２細胞株中で検出されたレベルより、１０００倍高いレベルで、ＭＣＨＲ_１転写物を発現することを示している。

Ｉ３．４．２細胞を用いたＣａ^＋＋動員アッセイ
メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）によるメラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ）の活性化は、細胞内貯蔵からのＣａ^＋＋の放出を誘導する。この細胞内カルシウム放出は、Ｃａ^＋＋感受性色素試薬（Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）とともに、蛍光定量イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ^ＴＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて測定する。細胞内貯蔵からのＣａ^＋＋の放出は、Ｃａ^＋＋濃度に比例する、色素の蛍光の増加を引き起こす。このように、本方法は、ＭＣＨＲ_１のアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストを同定するために使用することができる。

通常、試験化合物によるＣａ^＋＋動員のパーセント阻害は、ＩＣ_５０値を決定することによるのではなく、０．１μＭ及び２μＭの最終試験化合物濃度で決定されるであろう。この手法は、活性をスクリーニングできる化合物の割合と数を増加させるであろう。優先度が高い特定の試験化合物については、複数濃度の試験化合物を調べることによって、実質的に同じアッセイ手法を用いて、ＩＣ_５０値を取得することができる。上で略述したアッセイに対する、本明細書に記載された細胞株の有用性を確認するために、２つのＭＣＨＲ_１アンタゴニスト、Ｔ−２２６２９６（Ｔａｋｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｔｓｕｋｕｂａ， Ｊａｐａｎによって開発された。）及びＳＮＡＰ−７９４１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪによって開発された。）（Ｔａｋｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３８：１２９−１３５（２００２）；Ｂｏｒｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：７９３−８００（２００２）によって、最近、文献で報告された。）について、ＩＣ_５０を測定した。これらの文献では、これらの化合物は、^１２５Ｉ標識されたＭＣＨのＭＣＨＲ_１への結合及びＭＣＨによる細胞内シグナル伝達の活性化を阻害することが示された。本発明者らの結果（図３参照）は、Ｔ４２４０２Ｉ３．４．２細胞株中の、ＭＣＨによって刺激される細胞内Ｃａ^＋＋流動が、予想通り、ＭＣＨＲ_１アンタゴニストＴ−２２６２９６及びＳＮＡＰ−７９４１によって阻害されることを示している。

具体的には、前記アッセイは、以下のように実施する。ＭＥＭ／１０％ ウシ胎児血清／５０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン／２００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎ中で、前記細胞を培養する。ポリ−Ｄ−リシンでコートされた９６ ＦＬＩＰＲ^ＴＭアッセイプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）中に、１００，０００細胞／ウェルで、この細胞を播種する。２日後に、１時間、３７℃で、細胞をＣａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔに加える。試験化合物は、６％ ジメチルスルホキシド中、６０μＭで調製する。細胞プレートをＦＬＩＰＲ^ＴＭ中に置き、５０μＬ／ウェルの試験化合物を導入する。試験化合物によってもたらされ得るアゴニスト活性をアッセイするために、カルシウムシグナルを３分間追跡する。次いで、５０μＬ／ウェルの６μＭ ヒトＭＣＨ（０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中）を添加し、リガンドによって誘導されたカルシウムシグナルをさらに３分間追跡する。ＭＣＨによって誘導されたＣａ^＋＋流動を試験化合物が阻害する能力によって測定されたアンタゴニスト活性は、以下の式によって記載されるパーセント阻害として計算される。

％阻害＝［１−（（ｆＴＣ−−ｆＢ）／（ｆＭＣＨ−ｆＢ））］ｘ１００
ｆＴＣ＝試験化合物の存在下において、ＭＣＨによって誘導された蛍光；
ｆＭＣＨ＝試験化合物の不存在下において、ＭＣＨによって誘導された蛍光；及び
ｆＢ＝ベースライン蛍光

ＭＣＨ（１μＭ）は、通常、約７００ＲＦＵのベースラインで、５，０００−６，０００の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の応答を引き起こす。Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔの蛍光は、０．４０秒の曝露及びＦ−ｓｔｏｐ＝２．０及び０．２０から０．４０Ｗの一定の光出力に設定されたレーザーを用い、４８８ｎｍで測定する。このアッセイでは、アンタゴニストとインバースアゴニストはともに、同様の結果を与えると予想されることに留意すべきである。両種の作用剤は、様々なＧＰＣＲによるシグナル伝達を阻害するために、治療的に有用であることが見出された。

リガンド結合アッセイ
その受容体へのリガンドの結合とその阻害を測定するための様々なアッセイが広く使用されており、当業者に周知である。ＭＣＨＲ_１へのＭＣＨの結合は、このようなアッセイを用いて測定することができる。このアッセイは、ＭＣＨ結合の阻害剤を同定するために使用することもできる。このような阻害剤は、ペプチド又は小分子組成物であり得る。例えば、^１２５Ｉ−ＭＣＨ（又は蛍光分子ビオチン、その他の放射性標識などで標識されたＭＣＨ）はトレーサーとして使用することができ、ＭＣＨＲ_１は、無処置の細胞の表面上に提示され得る。細胞は、非酵素的細胞分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、培養基材から剥離し、血球計数器を用いて計数する。結合緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５％ ＢＳＡ）を用いて、細胞密度を２．２×１０^６細胞／ｍＬに調節し、９６ウェルのポリプロピレンｖ字底マイクロタイタープレートに８９μＬ／ウェルの細胞懸濁液を添加する。１００％ ＤＭＳＯ中に希釈された試験化合物（１μＬ）又は非標識ＭＣＨを、０から１０μＭの最終濃度になるようにウェルに添加し、続いて、１０μＬの^１２５Ｉ−ＭＣＨ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を添加する。各ウェル中の^１２５Ｉ−ＭＣＨの最終濃度は、５０ｐＭである。次いで、室温で１時間、プレートをタイタープレート揺動装置上に置く。次いでＰａｃｋａｒｄ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｏｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）を用いて、０．１％のＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｓｉｇｍａ）で処理されたグラフ繊維フィルタープレートに、この試料を移す。２００μＬの洗浄緩衝液（ＢＳＡなし、０．５Ｍ ＮａＣｌありの結合緩衝液）を用いて、フィルタープレートを三回洗浄する。全てのウェルに、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）を添加し、接着性フィルム（Ｔｏｐｓｅａｌ Ａ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）でプレートを密封する。マイクロプレート・シンチレーション・カウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、プレートからＣＰＭを測定する。ＭＣＨＲ_１への結合について標識ＭＣＨと競合する、試験化合物の能力は、以下のように計算される。

％阻害＝［１−（（ＣＰＭ_Ｔ−ＣＰＭ_０）／（ＣＰＭ_Ｂ−ＣＰＭ_０））］ｘ１００
ＣＰＭ_Ｔ＝試験化合物の存在下でのＣＰＭ
ＣＰＭ_Ｂ＝競合物質の不存在下でのＣＰＭ
ＣＰＭ_０＝非特異的結合、すなわち、過剰（典型的には、標識されたＭＣＨの１０００倍のを超える濃度）の非標識ＭＣＨ化合物の存在下でのＣＰＭ。

当業者に周知である、本アッセイの修飾は、未変性リガンド又は阻害剤化合物に対する解離定数を決定するために使用することができる。

上記アッセイでは、適切に標識された小分子又はペプチド模倣化合物又は配列が修飾されたＭＣＨ関連ペプチドによって、標識されたＭＣＨが置換され得ることにも留意すべきである。このようなアッセイは周知であり、ＧＰＣＲへのリガンド結合を評価するために広く使用される。例えば、α_１アドレナリン作動性受容体へのリガンド結合の測定は、標識されたプラゾシンを用いて実施することができ（Ｇｒｅｅｎｇｒａｓｓ ａｎｄ Ｂｒｅｍｍｅｒ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５５：１３２３−３２６（１９７９））、エンドセリンＡ受容体へのリガンド結合は、標識されたＢＱ−１２３（Ｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２７４：１−６（１９９５））を用いて実施することができ、ニューロテンシン受容体へのリガンド結合は、標識されたＳＲ−４８６９２を用いて実施することができる（Ｂｅｔａｎｃｕｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４３：６７−７７ （１９９８））。

インバースアゴニストアッセイ
インバースアゴニスト（例えば、リバースアゴニスト及びネガティブアゴニスト）とは、当該受容体の基底活性状態（すなわち、アゴニストの不存在下での活性レベル）より下に、受容体の活性レベルを減少させる化合物である（Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ２３：８９−９５ （２００２））。上記実施例３で記載したように、インバースアゴニスト及びアンタゴニストは、Ｃａ^＋＋動員アッセイにおいて、同様の活性を示すであろう。これらのクラスの化合物を識別することは、特に標的受容体の基底活性が低い場合には困難な場合がある。しかしながら、インバースアゴニストをアンタゴニストと区別することは、ＭＣＨＲ_１シグナル伝達の阻害剤として同定された化合物のインビボ特性を理解するのに有用であり得る。インバースアゴニストは、受容体の不活性状態に優先的に結合し、このため、アゴニスト非依存的な、ＧＰＴの受容体への結合を抑制する。受容体−Ｇタンパク質複合体へのＧＴＰの結合は、［^３５Ｓ］ＧＴＰ−γＳ又はＥｕ標識されたＧＴＰなどの、非加水分解性ＧＴＰ類縁体を使用して測定することができる。簡潔に述べると、このようなアッセイは、以下のように実施し得る。標準的な膜調製法を用いて、膜を含有するＭＣＨＲ_１をＩ３．４．２細胞から単離する（Ｂｏｕａｂｏｕｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７２：２２３３０−２２３３９（１９９７）。緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ ウシ血清アルブミン）中において、１０μＭ ＧＤＰ、標識されたＧＴＰ（０．０１から０．１μＭ）及び試験化合物又はＭＣＨとともに、Ｉ３．４．２細胞膜（１から２０μｇ）を適切な時間、インキュベートする。次いで、ガラスファイバー膜を通して、この反応混合物をろ過し、結合していない標識されたＧＴＰを取り除くために洗浄し、適切な装置（すなわち、［^３５Ｓ］ＧＴＰ−γＳに対してはシンチレーションカウンター、又はＥｕ−ＧＴＰに対しては時間分解蛍光光度計）を用いて、標識されたＧＴＰの結合を検出する。得られた結果は、一般に、基底活性と比較して報告される。

％活性化＝［（（Ｓ_ｔｃ−ＮＳＢ）ｘ１００）］÷（Ｓ_ｂ−ＮＳＢ）］−１００
Ｓ_ｔｃ＝試験化合物の存在下でのシグナル
Ｓ_ｂ＝ＭＣＨの不存在下での基底シグナル
ＮＳＢ＝非特異的結合；標識されていない過剰のＧＴＰ−γＳの存在下でのシグナル

この方法を使用すると、インバースアゴニストは、基底シグナルより低いシグナルを発生し、負の活性化（すなわち、ゼロ未満の％活性化）をもたらす。古典的なアンタゴニストは、本アッセイで測定された基底活性に対して、ほとんど又はまったく影響を与えないと予測されるであろう。インバースアゴニストの候補を特定するために、文献に記載されている様々な方法を用いた他のアッセイ（ｄｅ Ｌｉｇｔ ｅｔ ａｌ， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３０：１−１２（２０００））を、Ｉ３．４．２細胞（又はそれらの画分）を用いて使用することもできる。

図１ａは、ゲノムＭＣＨＲ_１ ＤＮＡ配列から推定された、Ｉ３．４．２細胞から得られるＭＣＨＲ_１のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、図１ｂは、親及びＩ３．４．２細胞中での、ＭＣＨＲ発現のｑＰＣＲ解析を表す。 図２は、ＭＣＨに対する、Ｉ３．４．２細胞株の用量応答曲線を示す。 図３は、２つのＭＣＨＲ_１アンタゴニストによる、ＭＣＨによって誘導されたＣａ^＋＋の流動の阻害を示す。

Claims (10)

1. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する、単離された細胞株。
2. 請求項１に記載の細胞株の細胞を含む組成物。
3. ＭＣＨ受容体の産生に十分な時間及び条件下で、請求項１に記載の細胞株の細胞を培養するステップを含む、ＭＣＨ受容体を産生する方法。
4. ａ）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、前記試験化合物を前記細胞株の前記細胞に接触させるステップと、
   ｂ）ステップ（ａ）の前記接触された細胞にＭＣＨを添加するステップと、
   ｃ）前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の細胞と比較して、ステップ（ａ）の前記細胞中の細胞内カルシウム流入を測定し、前記試験化合物に曝露されていない前記細胞と比べて、ステップ（ａ）の前記細胞中の前記細胞内カルシウム流入が減少していることが、前記試験化合物が前記ＭＣＨ受容体に対するアンタゴニストであることを示すステップと、
   を含む、ＭＣＨ受容体（ＭＣＨＲ）に対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストを同定する方法。
5. ａ）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、前記試験化合物を前記細胞株の前記細胞に接触させるステップと、
   ｂ）前記試験化合物に曝露されていない前記細胞株の細胞と比較して、ステップ（ａ）の前記細胞中の細胞内カルシウム流入を測定し、前記試験化合物に曝露されていない前記細胞と比べて、ステップ（ａ）の前記細胞中の前記細胞内カルシウム流入が増加していることが、前記試験化合物が前記ＭＣＨ受容体に対するアゴニストであることを示すステップと、
   を含む、ＭＣＨ受容体に対するアゴニストを同定する方法。
6. ＭＣＨＲに対するアンタゴニストがＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞によって産生されたＭＣＨＲに結合するのに十分な時間と条件下で、前記細胞株の前記細胞を前記アンタゴニストに接触させることを含み、前記アンタゴニストはＴ−２２６２９６及びＳＮＡＰ−７９４１から成る群より選択され、前記結合は、前記接触された細胞にその後添加されたＭＣＨによる細胞内シグナル伝達の活性化を阻害する、ＭＣＨによる細胞内シグナル伝達の活性化を阻害する方法。
7. ａ）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞又はその膜を、前記細胞株の前記細胞により産生されたＭＨＣＲがコンジュゲートのＭＣＨに結合するのに十分な時間と条件下で、コンジュゲートと接触させるステップと、ここにおいて、前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含み、
   ｂ）非標識ＭＣＨを、前記非標識ＭＣＨが前記コンジュゲートを置換させるのに十分な時間と条件下で、前記結合されたＭＣＨＲに添加するステップと、
   ｃ）前記非標識ＭＣＨによる前記コンジュゲートの置換に比例する、前記ＭＣＨＲに対する前記ＭＣＨの結合親和性を示す、前記シグナル生成化合物によって生成されたシグナルの強度を検出するステップと、
   を含む、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合親和性を決定する方法。
8. ａ）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を阻害すると疑われる前記試験化合物を前記細胞株の前記細胞又はそれらの膜に接触させるステップと、
   ｂ）測定可能なシグナルを生成できるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含むコンジュゲートを、ステップ（ａ）の前記接触された細胞に添加するステップと、
   ｃ）前記生成された測定可能なシグナルを定量し、前記生成された測定可能なシグナルを前記試験化合物の不存在下で生成された対照シグナルと比較することによって、前記試験化合物による、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合の阻害を測定するステップと（ここにおいて、前記対照シグナルはＭＣＨＲへのＭＣＨの結合のゼロパーセント阻害を表し、前記対照シグナルに比べて前記試験化合物を用いて得られたシグナルが小さいことが、前記化合物がＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を部分的に又は完全に阻害することを表す。）
   を含む、ＭＣＨＲへのＭＣＨの結合を阻害する組成物を同定する方法。
9. ａ）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−５２０１を有する細胞株の細胞によって産生されるＭＣＨＲに試験化合物が結合するのに十分な時間及び条件下で、ＭＣＨＲの活性化を阻害すると疑われる前記試験化合物を、前記細胞株の前記細胞又はそれらの膜に接触させるステップと、
   ｂ）測定可能なシグナルを生成できるシグナル生成化合物に付着されたＭＣＨを含むコンジュゲートを、ステップ（ａ）の前記接触された細胞に添加するステップと、
   ｃ）前記生成された測定可能なシグナルを定量し、前記生成された測定可能なシグナルを前記試験化合物の不存在下で生成された対照シグナルと比較することによって、前記試験化合物によるＭＣＨＲの活性の基底レベルの阻害を測定するステップと（ここにおいて、前記対照シグナルがＭＣＨＲの基底活性を表し、前記試験化合物を用いて得られたシグナルが前記対照シグナルに比べて小さいことが、前記化合物がＭＣＨＲのインバースアゴニストであることを表し、前記試験化合物を用いて得られたシグナルが前記対照シグナルに比べて等しいことが、前記化合物がＭＣＨＲのアンタゴニストであることを表す。）
   を含む、ＭＣＨＲのアンタゴニストとインバースアゴニストを識別する方法。
10. ａ）ＩＭＲ３２細胞を、Ｇα_１６と抗生物質耐性マーカーとをコードするＤＮＡと接触させるステップと；
    ｂ）前記抗生物質耐性マーカーに対する抗生物質を前記接触された細胞に添加するステップと；
    ｃ）ステップ（ｂ）の抗生物質耐性細胞を単離し、該細胞を増殖させるステップと；
    ｄ）前記増殖された細胞に、ステップ（ｂ）で使用された濃度より高い濃度で、前記抗生物質を添加するステップと；
    ｅ）ＭＣＨＲを産生する細胞株を産生するために、ステップ（ｄ）の得られた細胞を単離し、該細胞を増殖させるステップと、
    を含む、ＭＣＨＲを産生する細胞株を産生する方法。

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