JP4599550B2 - Preparation of hybrid gel by nanogel engineering and biomaterial application - Google Patents
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Description
本発明は、ナノ微粒子とゲルの特性を合わせ持つナノメーターサイズ（特に100nm以下）の高分子ゲル微粒子（ナノゲル）の改良に関し、さらに詳しくは多層構造化によってより高度な制御が可能となったハイブリッドゲルに関するものである。加えて本発明は、ハイブリッドゲルの調製法、及びその用途に関する。 The present invention relates to the improvement of nanometer-size (particularly 100 nm or less) polymer gel fine particles (nanogel) that combine the properties of nanoparticle and gel, and more specifically, a hybrid that can be controlled at a higher level by forming a multilayer structure. It relates to gel. In addition, the present invention relates to a method for preparing a hybrid gel and its use.
ポリマーゲルは、薬学・医療分野から分子テクノロジーや化粧品、食品の分野まで幅広く利用されている。近年、デンドリマー、微粒子(microsphere)を架橋点とする化学ゲル、抗体、人工タンパク質モチーフを架橋点とする物理架橋ゲル、さらに架橋点が移動するトポロジカルゲルなど様々な架橋点を有する新しいゲルが報告されている。しかし、架橋点の構造やゲルの網目の構造制御は依然として大きな課題である。一方で、ナノ微粒子とゲルの特性を合わせ持つナノメーターサイズ（特に100nm以下）の高分子ゲル微粒子（ナノゲル）は、特にドラッグデリバリーシステムやナノテクノロジー分野で注目されるようになってきた。一般に化学架橋ナノゲルは、マイクロエマルション重合法や高分子分子内での架橋反応により合成されてきた。我々は、疎水化高分子の自己組織化により物理架橋ナノゲルの新規な調製法を報告した（非特許文献１）。すなわち、比較的疎水性の高い疎水基（コレステロール基）を部分的に導入した水溶性多糖類が、希薄水溶液中で自己組織的に会合し、疎水基の会合領域を架橋点とする単分散なナノゲルを形成することを見出した。我々の知る限り、物理架橋点を有する50nm以下のサイズの揃ったナノゲルとしては、初めての報告であった。通常のナノ微粒子は、その表面の特性を利用した研究がほとんどであるが、ナノゲルはさらにその内部にも物質を取り込めるスペースを有することが最大の特色である。コレステロール置換プルラン(CHP)のナノゲルは、タンパク質と選択的に相互作用するホストとして機能し、ドラッグデリバリーシステムのキャリアーとして有効であることを報告している。また、第2の利点は、物理架橋点であるために、架橋構造の動的構造制御が可能であることである。疎水基の構造を変えることでゲルネットワークの動的特性を制御しえることやシクロデキストリンとのホストーゲスト相互作用を利用することで、ナノゲルの生成と崩壊を動的に制御しえる。この性質を利用して、変性タンパク質の取り込みと放出を制御した人工分子シャペロンの開発に成功している。
本発明は、自己組織化ナノゲルをビルディングブロックとした構造制御された新規ハイブリッドゲルの合成と利用（ナノゲルエンジニアリング）達成することである。 The present invention is to achieve the synthesis and utilization (nanogel engineering) of a novel hybrid gel whose structure is controlled using a self-assembled nanogel as a building block.
本発明は、重合性自己組織化ナノゲル（ナノゲルマクロマー）の合成と新規ハイブリッドナノゲルの合成およびナノゲルを架橋点とする階層的ゲルの合成と生理活性物質リザーバーシステムとしての機能、さらにナノゲルーリポソーム複合体を架橋点とするリポソームネットワークゲルの合成を主要な特徴とする。
つまり本発明は以下よりなる；
１．プルランに100単糖あたり1〜5個のコレステロール基を導入して得られた分子量20,000〜200,000のコレステロール置換プルラン（ＣＨＰ）に、さらに100単糖あたり2〜20個のメタクリロイル基またはアクリロイル基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、これと2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）またはN-イソプロピルアクリルアミドとで共重合反応をおこさせることを特徴とする、プルランと2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）またはN-イソプロピルアクリルアミドとのハイブリッドゲルの調製方法。
２．多糖類によるナノゲル間の架橋反応を抑えるために、メタクリロイル化ＣＨＰ（ＣＨＰＭＡ）のメタクリロイル基に対して、10〜100倍モル比の2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）で共重合反応をおこさせることを特徴とする前項１に記載のハイブリッドゲルの調製方法。
３．マクロゲルを調製するために、ＣＨＰＭＡナノゲルのメタクリロイル基に対して6倍モル濃度以上のＭＰＣで共重合反応をおこさせることを特徴とする前項１に記載のハイブリッドゲルの調製方法。
４．プルランに100単糖あたり1〜5個のコレステロール基を導入して得られた分子量20,000〜200,000のコレステロール置換プルラン（ＣＨＰ）に、さらに100単糖あたり2〜20個のメタクリロイル基またはアクリロイル基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、この物質でリポソームの表面を被覆した後に、さらに2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）またはN-イソプロピルアクリルアミドで共重合反応をおこさせることを特徴とする前項３に記載のハイブリッドゲルの調製方法。
The present invention relates to the synthesis of a polymerizable self-assembled nanogel (nanogel macromer), the synthesis of a novel hybrid nanogel, the synthesis of a hierarchical gel with the nanogel as a crosslinking point, the function as a bioactive substance reservoir system, and the nanogel-liposome complex The main feature is the synthesis of liposome network gels having a cross-linking point.
That is, the present invention comprises:
1. Introduce 2-20 methacryloyl or acryloyl groups per 100 monosaccharides into cholesterol-substituted pullulan (CHP) with a molecular weight of 20,000-200,000 obtained by introducing 1-5 cholesterol groups per 100 monosaccharides into pullulan the compound obtained was then the foundation material, with 2-methacryloyloxy characterized by the oxyethyl phosphorylcholine (MPC) or N- isopropylacrylamide to cause a copolymerization reaction, pullulan and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC ) Or a method for preparing a hybrid gel with N-isopropylacrylamide .
2. In order to suppress the crosslinking reaction between Nanogel by polysaccharides, the relative methacryloyl group methacryloylated CHP (CHPMA), cause a copolymerization reaction at 10 to 100 times the molar ratio of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) 2. A method for preparing a hybrid gel according to item 1 above.
3. 2. The method for preparing a hybrid gel according to item 1, wherein a copolymerization reaction is performed with MPC having a molar concentration of 6 times or more with respect to the methacryloyl group of the CHPMA nanogel in order to prepare a macrogel.
4). Introduce 2-20 methacryloyl or acryloyl groups per 100 monosaccharides into cholesterol-substituted pullulan (CHP) with a molecular weight of 20,000-200,000 obtained by introducing 1-5 cholesterol groups per 100 monosaccharides into pullulan the compound obtained was the foundation material, after coating the surface of the liposome in this material, further 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) or the preceding paragraph 3, characterized in that to cause the copolymerization reaction with N- isopropylacrylamide A method for preparing a hybrid gel described in 1.
本発明のハイブリッドゲルは、生理活性物質のリザーバーシステム、制御システム、DDSシステムへの応用において大きな利点がある。 The hybrid gel of the present invention has a great advantage in applications to bioactive substance reservoir systems, control systems, and DDS systems.
本発明のハイブリッドゲルは、複合構造をもつ。
その基盤物質は、親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物として調製される。親水性多糖類は、分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類である。具体的な多糖類は、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群より選択される１種以上である。導入される疎水性基は、炭素数12〜50の炭化水素基、ステリル基等が好適に例示される。この疎水性基は、親水性多糖類における100単糖あたり整数値に限定されない1〜5個より好ましくは1〜3個の疎水性基が導入されている。この疎水性基含有多糖類の調製法は、例えばWO00/12564に開示がある。それによると、第1段階反応は、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、ＯＣＮ-Ｒ1-ＮＣＯ（式中、Ｒ1は炭素数1〜50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。第2段階反応は、前記第1段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。この第2段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。
疎水性基含有多糖類は、ついでその100単糖あたり整数値に限定されない2〜20個より好ましくは5〜8個の重合性基を導入される。重合性基とは、メタクリロイル基やアクリロイル基が好適に例示される。この重合性基の導入方法は、実施例１にその詳細な例示を説明した。このようにして調製された重合性多糖類は、水に分散させ、膨潤させた後に、超音波処理を行うと、疎水性基含有多糖類によって調製されるものと同様のナノゲル（実施例によると会合数3.9、慣性半径17.2nmが例示）が形成される。そして、実施例では、このナノゲル一つは、重合性基を約160個有することが確認された。
このように調製された基盤物質は、これを利用して機能性モノマーとの共重合反応をおこさせる。機能性モノマーとは、水溶性モノマーであって、たんぱく質等の吸着が極めて少ない等の生体適合性に優れた特性を有する化合物が選択される。この機能性モノマーの導入は、その導入条件によって最終製剤の性質に様々の効果をもたらし、特に重合化物の硬さ、柔らかさ等の物理的な効果をもたらす。この機能性モノマーとしては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）、N-イソプロピルアクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アクリル酸、N-ビニルピロリドン、アクリアミド、2-アミノエチルメタクリレート等が好適に例示される。この機能性モノマーとの共重合反応をおこすことで、前記重合性多糖類は、多糖類と合成高分子とのハイブリッドゲルとして調製される。このハイブリッドゲルは、以下に説明する調製条件による多様な性質をもち、目的に合わせた性質の生体対応物質の調製を可能とする。
The hybrid gel of the present invention has a composite structure.
The base material is a water-soluble polysaccharide having a molecular weight of 20,000 to 200,000 obtained by introducing 1 to 5 hydrophobic groups per 100 monosaccharides into a hydrophilic polysaccharide, and 2 to 20 more per 100 monosaccharides. It is prepared as a compound obtained by introducing a polymerizable group. The hydrophilic polysaccharide is a water-soluble polysaccharide having a molecular weight of 20,000 to 200,000. The specific polysaccharide is at least one selected from the group consisting of pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethylcellulose, hydroxyethyldextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, xyloglucan and water-soluble cellulose. . The hydrophobic group to be introduced is preferably a hydrocarbon group having 12 to 50 carbon atoms, a steryl group or the like. This hydrophobic group is not limited to an integer value per 100 monosaccharides in the hydrophilic polysaccharide, and preferably 1 to 3 hydrophobic groups are introduced. A method for preparing this hydrophobic group-containing polysaccharide is disclosed, for example, in WO00 / 12564. According to this, the first-stage reaction comprises a hydroxyl group-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms and OCN—R 1 —NCO (wherein R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 50 carbon atoms). To produce an isocyanate group-containing hydrophobic compound in which one molecule of a hydroxyl group-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms is reacted. In the second stage reaction, the isocyanate group-containing hydrophobic compound obtained in the first stage reaction is further reacted with a polysaccharide to contain a hydrocarbon group having 12 to 50 carbon atoms or a steryl group as the hydrophobic group. To produce a hydrophobic group-containing polysaccharide. The reaction product of the second stage reaction can be purified with a ketone solvent to produce a high purity hydrophobic group-containing polysaccharide.
The hydrophobic group-containing polysaccharide is then introduced with 2 to 20, more preferably 5 to 8 polymerizable groups that are not limited to integer values per 100 monosaccharides. Suitable examples of the polymerizable group include a methacryloyl group and an acryloyl group. This method for introducing a polymerizable group has been described in detail in Example 1. The polymerizable polysaccharide prepared in this manner is dispersed in water, swollen, and then subjected to ultrasonic treatment, and then a nanogel similar to that prepared with a hydrophobic group-containing polysaccharide (according to the examples) The number of meetings is 3.9 and the radius of inertia is 17.2 nm, for example). In the examples, it was confirmed that one nanogel had about 160 polymerizable groups.
The base material thus prepared is used to cause a copolymerization reaction with a functional monomer. The functional monomer is a water-soluble monomer and is selected from compounds having excellent biocompatibility such as very little adsorption of proteins and the like. The introduction of the functional monomer has various effects on the properties of the final preparation depending on the introduction conditions, and in particular, physical effects such as hardness and softness of the polymerized product. As this functional monomer, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC), N-isopropylacrylamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, methacrylic acid, acrylic acid, N-vinylpyrrolidone, acrylamide, 2-aminoethyl methacrylate, etc. are suitable. Illustrated. By performing a copolymerization reaction with this functional monomer, the polymerizable polysaccharide is prepared as a hybrid gel of polysaccharide and synthetic polymer. This hybrid gel has various properties depending on the preparation conditions described below, and makes it possible to prepare a biocompatible substance having properties suited to the purpose.
具体的な調製方法の1は、共重合反応を、多糖類によるナノゲル間の架橋反応を抑えることが可能な重合反応物の条件特に重合反応物の希薄条件下で行うことである。例えば、重合性多糖類によって調製されたナノゲルを0.5〜3mg/mLより好ましくは0.5〜1.5mg/mLというような希薄条件に調整し、これに前記機能性モノマーと重合開始剤を添加して共重合反応をおこし、多糖類と合成高分子とのハイブリッドゲルとして調製する。これは、重合性基の存在に対して、機能性モノマーを10〜100倍モル過剰な条件で共重合反応をおこし、未反応の重合性基を全て消失させるような条件である。この結果、ナノゲル中の重合性基あたり機能性モノマーは平均6.1（例えば機能性モノマーを10倍モル過剰添加の場合、実施例ではCM6と表示）及び平均14.3（例えば機能性モノマーを100倍モル過剰添加の場合、実施例ではCM14と表示）というようなハイブリッドゲルが調製された。得られたゲルを凍結乾燥し、水に分散、超音波処理後、その物性を評価すると、単分散性で非常に狭い分布幅をもつ会合体を形成しており、ナノゲル間で架橋することなく重合し、サイズの揃ったナノゲルの形成が確認された。このナノゲルは、その調製条件におうじて、架橋構造が調整可能であり、例えばナノゲル中の重合性基あたり機能性モノマーが平均6.1のナノゲルはs−シクロデキストリン（以下sCD）の存在下で崩壊する。一方、機能性モノマーが平均14.3のナノゲルはsCDの添加で、その分子量及び慣性半径に大きな変化はあらわれなかったが、具体例では熱変性たんぱく質をナノゲル内部に取り込むことが可能であり、sCDの添加でこのたんぱく質を放出し、正常たんぱく質としての機能を回復させた。分子量とサイズから見積もったナノゲルの密度は、CM6よりもCM14の方が2倍ほど大きくなっており、CM14ナノゲルは内部でMPCポリマー鎖により架橋がなされていることが考えられる。CM14ナノゲルにおいても熱変性タンパク質を内部に取り込み、sCD添加により正常タンパク質を放出した。つまり、このようにして調製されたナノゲルは、疎水性基の会合による物理的架橋と化学架橋の2種類の架橋を有したdual-crosslinking構造を有するナノゲルであると考えられる。 One specific preparation method is to perform the copolymerization reaction under conditions of a polymerization reaction product capable of suppressing a cross-linking reaction between nanogels caused by polysaccharides, particularly under a dilute condition of the polymerization reaction product. For example, the nanogel prepared by the polymerizable polysaccharide is adjusted to a dilute condition of 0.5 to 3 mg / mL, more preferably 0.5 to 1.5 mg / mL, and the functional monomer and the polymerization initiator are added to the diluted condition. A polymerization reaction is performed to prepare a hybrid gel of polysaccharide and synthetic polymer. This is a condition in which a functional monomer is copolymerized under the condition of 10 to 100-fold molar excess with respect to the presence of the polymerizable group, and all unreacted polymerizable groups disappear. As a result, the average number of functional monomers per polymerizable group in the nanogel was 6.1 (for example, when functional monomers were added in a 10-fold molar excess, in the examples, indicated as CM6) and the average was 14.3 (for example, functional monomers were 100-fold molar excess In the case of addition, a hybrid gel such as CM14 in the examples was prepared. The obtained gel was freeze-dried, dispersed in water, and subjected to ultrasonic treatment, and its physical properties were evaluated. As a result, it was found that monodispersed aggregates with a very narrow distribution width were formed, and there was no cross-linking between nanogels. Polymerization and formation of nanogels of uniform size were confirmed. In this nanogel, the cross-linked structure can be adjusted according to the preparation conditions. For example, a nanogel having an average of 6.1 functional monomers per polymerizable group in the nanogel disintegrates in the presence of s-cyclodextrin (hereinafter referred to as sCD). . On the other hand, for nanogels with an average functional monomer of 14.3, the addition of sCD did not show any significant changes in the molecular weight and the radius of inertia, but in a specific example, the heat-denatured protein can be incorporated into the nanogel. This protein was released and the function as a normal protein was restored. The density of the nanogel estimated from the molecular weight and size is about twice as large in CM14 as in CM6, and it is considered that CM14 nanogel is internally cross-linked by MPC polymer chains. In the CM14 nanogel, the heat-denatured protein was incorporated inside and normal protein was released by adding sCD. In other words, the nanogel prepared in this way is considered to be a nanogel having a dual-crosslinking structure having two types of cross-linking, physical cross-linking by association of hydrophobic groups and chemical cross-linking.
具体的な調製方法の2は、全体がゲル化可能な重合反応物濃度、特に重合反応物の比較的濃い条件でマクロゲルを調製する方法である。ナノゲルを準希薄水溶液中（例えば5〜50mg/ml）で重合を行うことで、ナノゲルが機能性モノマーのポリマーでつながったネットワーク構造が形成することが予想される。
例えば、重合性多糖類によって調製されたナノゲルを6mg/ml以上の濃度で、重合性基に対して機能性モノマーを6倍モル濃度以上〔例えば、MPC 32mg/ml（メタクロイル基に対してMPC6倍のモル濃度以上）〕の存在下で重合を行うとマクロなゲルが形成した。ナノゲルが架橋剤（nanogel macro cross-linker）として機能している事を示している。機能性モノマー例えばMPCを一定（例えば32mg/ml）として、重合性多糖類によって調製されたナノゲル濃度を増加させるとゲルの膨潤度が低下して堅いゲルが形成した（実施例参照）。ゲル密度の高いナノゲルの架橋ドメインの増加を反映している。このゲルは電子顕微鏡観察からナノゲル構造が機能性モノマー鎖例えばMPC鎖で架橋されたような構造を有していることが分かった。ナノゲル間の平均の距離は、例えばナノゲル：機能性モノマーの配合量が30mg/ml：32mg/mlであるCM30-32（実施例参照）では83nm、同10mg/ml：32mg/mlであるCM10-32（実施例参照）では289nm、同6mg/ml：32mg/mlであるCM6-32（実施例参照）では552nmと計算された。架橋点構造の明確な、ナノゲルドメインを有する新規なゲルが調製できた。このゲルは、ナノゲル内の10nm以下のネットワークとナノゲル間の数100mのネットワークという二つの階層を有するゲルである。また、それぞれの階層の特性を疎水化多糖の構造および重合性モノマーの選択により、独立に自在に制御可能である。
The specific preparation method 2 is a method of preparing a macrogel under a polymerization reaction product concentration that can be gelled as a whole, in particular, under conditions where the polymerization reaction product is relatively concentrated. By polymerizing the nanogel in a quasi-dilute aqueous solution (for example, 5 to 50 mg / ml), it is expected that a network structure in which the nanogel is connected with a polymer of a functional monomer is formed.
For example, a nanogel prepared with a polymerizable polysaccharide at a concentration of 6 mg / ml or more, and a functional monomer with a polymerizable group at a molar concentration of 6 times or more [for example, MPC 32 mg / ml (MPC 6 times with respect to a methacryloyl group) When the polymerization was carried out in the presence of a molar concentration of at least, a macro gel was formed. This indicates that the nanogel functions as a nanogel macro cross-linker. Increasing the concentration of nanogels prepared with polymerizable polysaccharides with a constant functional monomer such as MPC (eg 32 mg / ml) reduced the degree of gel swelling and formed a firm gel (see Examples). This reflects an increase in the cross-linking domain of high gel density nanogels. The gel was found to have a structure in which the nanogel structure was cross-linked with a functional monomer chain such as an MPC chain, as observed by an electron microscope. The average distance between the nanogels is, for example, 83 nm for CM30-32 (see Example) in which the compounding amount of nanogel: functional monomer is 30 mg / ml: 32 mg / ml, and CM10- is 10 mg / ml: 32 mg / ml. It was calculated as 289 nm for 32 (see Example) and 552 nm for CM6-32 (see Example), which was 6 mg / ml: 32 mg / ml. A novel gel having a nanogel domain with a clear cross-linking point structure was prepared. This gel has two layers, a network of 10 nm or less in the nanogel and a network of several hundreds of meters between the nanogels. In addition, the characteristics of each layer can be independently and freely controlled by selecting the structure of the hydrophobized polysaccharide and the polymerizable monomer.
具体的な調製方法の3は、基盤物質を使いリポソームを修飾し、その後共重合を行い、マクロゲルを調製する方法である。つまり、親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり4〜10個の重合性基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、この物質でリポソームの表面を被覆した後に、さらに機能性モノマーと共重合をおこす工程を含むハイブリッドマクロゲルの調製方法である。リポソームは脂質人工膜で構成される粒子でリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から脂質二重層としてつくられる。その調製には、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法等広く公知方法が適用される。リポソームの調製の詳細は特開平９−２０８５９９号公報及びBiochim. Biophys. Res. Commun., 224, 242-245, 1996に詳しく記載されている。リポソームは、本発明の実施例及び実験例で使用されたが、適宜生体適合性を有するものが選択して使用される。リポソームを基盤物質であるナノゲルで被覆した後に重合を行うことで、リポソーム−ナノゲル複合体を架橋領域とする新しいハイブリイドゲルが調製しえる。例えば120nmのリポソーム(DPPC-cholesterol=7:3mol/mol)(mg/ml)にナノゲル(6〜30mg/ml)を添加して多糖被覆リポソームを調製後、機能性モノマー例えばMPCを10〜30mg/mL添加して同様に共重合を行うことでリポソームを含むゲルが調製できた。電子顕微鏡観察から、リポソームの表面はナノゲルで覆われて安定化されており、リポソーム構造を保ったままゲル化が進行し、リポソーム−ナノゲル複合体が架橋点となったゲルが形成していることが確認された。本条件下では、リポソーム間の平均距離は600nmであり、先の二つの階層的なネットワークに加えて、リポソーム領域を有する三つの階層を有するゲルの調製に成功した。ナノゲルのリザーバーに加えて、リポソームに種々の薬物やタンパク質を保持させることが可能であり、多次元のリザーバーとして機能しえると考えられ、様々な応用が期待出来る。 A specific preparation method 3 is a method of preparing a macrogel by modifying a liposome using a base substance and then performing copolymerization. In other words, a water-soluble polysaccharide having a molecular weight of 20,000 to 200,000 obtained by introducing 1 to 5 hydrophobic groups per 100 monosaccharides into a hydrophilic polysaccharide, and further 4 to 10 polymerizable groups per 100 monosaccharides. This is a method for preparing a hybrid macrogel, which comprises a step of using a compound obtained by introducing sucrose as a base substance, coating the surface of the liposome with this substance, and further copolymerizing with a functional monomer. Liposomes are particles composed of artificial lipid membranes, and are formed as a lipid bilayer from phospholipids, glyceroglycolipids, cholesterol and the like. For the preparation, widely known methods such as a surfactant removal method, a hydration method, an ultrasonic method, a reverse phase distillation method, a freeze-thaw method, an ethanol injection method, an extrusion method, and a high-pressure emulsification method are applied. Details of the preparation of liposomes are described in detail in JP-A-9-208599 and Biochim. Biophys. Res. Commun., 224, 242-245, 1996. Liposomes were used in the examples and experimental examples of the present invention, but those having biocompatibility are appropriately selected and used. A new hybrid gel having a liposome-nanogel complex as a cross-linked region can be prepared by performing polymerization after coating the liposome with a nanogel that is a base material. For example, after preparing a polysaccharide-coated liposome by adding nanogel (6-30 mg / ml) to 120 nm liposome (DPPC-cholesterol = 7: 3 mol / mol) (mg / ml), functional monomer such as MPC is added at 10-30 mg / ml. A gel containing liposomes could be prepared by adding mL and copolymerizing in the same manner. From observation with an electron microscope, the surface of the liposome is stabilized by being covered with a nanogel, and gelation proceeds while the liposome structure is maintained, and a gel is formed in which the liposome-nanogel complex becomes a crosslinking point. Was confirmed. Under this condition, the average distance between liposomes was 600 nm, and in addition to the above two hierarchical networks, a gel having three layers with liposome regions was successfully prepared. In addition to nanogel reservoirs, it is possible to retain various drugs and proteins in liposomes, which can function as multidimensional reservoirs, and various applications can be expected.
以上のような基盤物質をもとに調製された３種類のハイブリッドゲルは、これを利用して生理活性物質の以下の少なくとも１の機能的制御方法が可能である。
１〕生理活性物質の生体内運搬、
２〕生理活性物質の保存・安定化、
３〕生理活性物質の精製、
４〕生理活性物質の反応性の抑制。
ハイブリッドゲルへの生理活性物質の取り込みは、リポソームを使う系の場合は、予めリポソーム中に目的生理活性物質を包埋しておくが、それ以外の場合は、天然蛋白質あるいは変性状態の蛋白質とハイブリッドゲルを接触させ行う。例えば、無細胞蛋白質合成系を利用した系においては、ｍＲＮＡの存在する相にハイブリッドゲルを共存させる。例えば、ｍＲＮＡの約1〜1000μgに対して0.01〜1mgのハイブリッドゲルを添加する。但し、この添加量は、蛋白産生量との比率、取込み効率を考慮し、随時変更可能である。細胞蛋白質合成系においては、分泌型であればそのまま或は化学的変性剤との共存下でナハイブリッドゲルと接触させる。また、非分泌型或は細胞内での凝集体化がおこるものであれば、細胞を破壊し、凝集体等を化学的変性剤で可溶化した後、ハイブリッドゲルと接触させる。その使用適量は、対象蛋白質等の量・分子量によって適宜実験的繰り返しにより決定されるが、一般的には、対象蛋白質等の重量：ハイブリッドゲル重量＝1：0.1〜10の比率で、好適には1：1〜5である。
The three types of hybrid gels prepared based on the base materials as described above can be used for at least one of the following functional control methods of the physiologically active substance.
1] In vivo transport of physiologically active substances,
2] Storage and stabilization of physiologically active substances,
3] Purification of physiologically active substances,
4] Suppression of reactivity of physiologically active substance.
In the case of a system using liposome, the target physiologically active substance is embedded in the liposome in advance in the case of a system using liposome. In other cases, the hybrid gel is mixed with a natural protein or a protein in a denatured state. Perform by contacting the gel. For example, in a system using a cell-free protein synthesis system, a hybrid gel is allowed to coexist in a phase where mRNA exists. For example, 0.01-1 mg of hybrid gel is added to about 1-1000 μg of mRNA. However, this addition amount can be changed at any time in consideration of the ratio to the protein production amount and the uptake efficiency. In the cellular protein synthesis system, if it is a secreted form, it is brought into contact with the nahybrid gel as it is or in the presence of a chemical denaturant. Further, if non-secretory type or aggregation within cells occurs, the cells are destroyed, and the aggregates are solubilized with a chemical denaturant and then contacted with the hybrid gel. The appropriate amount to be used is determined by appropriate experimental repetition depending on the amount and molecular weight of the target protein, etc., but in general, the ratio of the weight of the target protein, etc.:hybrid gel weight = 1: 0.1 to 10, preferably 1: 1 to 5
本発明の蛋白質合成系とは、広く遺伝子工学技術を応用した蛋白質合成手段及び天然の蛋白質合成手段をも対象とし、合成される蛋白質等が凝集等により変性してしまう、或は細胞内に封入された状態にあるものなど、蛋白質等の変性-リフォールデイングが可能な全てを意味する。 The protein synthesis system of the present invention is also intended for protein synthesis means and natural protein synthesis means that widely apply genetic engineering techniques, and the synthesized protein etc. is denatured by aggregation or enclosed in cells It means everything that can be denatured and refolded, such as proteins.
本発明の典型的な系は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等の自体公知の宿主を利用し遺伝子組換え技術によって形質転換した系による蛋白質等の合成である。 A typical system of the present invention is the synthesis of proteins and the like by a system transformed by a gene recombination technique using a host known per se such as Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, insect cells, animal cells and plant cells.
形質転換は、自体公知の手段が広く応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。 For transformation, means known per se are widely applied. For example, a host is transformed using a plasmid, chromosome, virus or the like as a replicon. A more preferable system is an integration method into a chromosome in consideration of gene stability, but it is simply an autonomous replication system using an extranuclear gene. The vector is selected according to the type of the selected host, and comprises a gene sequence intended for expression and a gene sequence carrying information on replication and control.
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス属菌（Streptomyces）および枯草菌（Bacillussubtilis）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（DrosophilaS2）およびスポドプテラＳｆ９（SpodopteraSf9）細胞；動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびボウズ（Bows）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞等がある。 Representative of suitable hosts are bacterial cells such as streptococci, staphylococci, E. coli, Streptomyces and Bacillus subtilis cells Fungal cells such as yeast cells and Aspergillus cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 and Bowes (Bows) melanoma cells; as well as plant cells.
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等がある。 Vectors include chromosomal, episomal and viral vectors such as bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast episomes, insertion elements, yeast chromosomal elements such as baculovirus, papovavirus such as SV40, vaccinia virus, Examples include vectors derived from viruses such as adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and retrovirus, and vectors combining them, such as vectors derived from plasmid and bacteriophage genetic elements, such as cosmids and phagemids.
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。かくして、培養により目的とする蛋白質等が形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地中に本発明のナノ粒子を存在させナノ粒子中に蛋白質等を取込む。蛋白質等が形質転換体の細胞内に生成される場合（分泌されない状態）、細胞内に封入された状態（凝集体化した状態）、或は既にフォールディングされた状態では、まず細胞を溶解し及び／若しくは蛋白質等を化学変性剤で可溶化し、次いで、ハイブリッドゲルと接触させてハイブリッドゲル中に蛋白質等を取込ませた後、これを回収する。 The transformant is cultivated by selecting the optimum conditions for the culture conditions of each host known per se. Thus, when the target protein or the like is secreted into the culture medium of the transformant by culturing, the nanoparticle of the present invention is present in the medium and the protein or the like is taken into the nanoparticle. When proteins or the like are produced in the cells of the transformant (in a state where they are not secreted), the cells are first lysed when encapsulated in the cells (in an aggregated state) or already folded. / Or Proteins are solubilized with a chemical denaturing agent, and then brought into contact with the hybrid gel to incorporate the protein or the like into the hybrid gel, which is then recovered.
以上のようにして、ハイブリッドゲルに取り込まれた蛋白質等は、ハイブリッドゲルを分離し、蛋白質個々の性状におうじた安定化及び生理的条件下で、その使用目的に応じて調製される。つまり包埋された蛋白質等が、ハイブリッドゲルの性状・構造が変化することで、遊離され、リフォールディングにより生理活性を取り戻す。この制御手段は、例えば以下のような蛋白質等の制御に利用される。好適な蛋白質としては、公知のTPA、IFN、CSF（M-、GM-等）、血液凝固因子（例えば、第VIII、IX、XIII因子等）が例示されるが、これに限定されない。 As described above, the protein or the like incorporated into the hybrid gel is prepared according to the intended use under the stabilization and physiological conditions according to the properties of individual proteins after separating the hybrid gel. In other words, the embedded protein or the like is released when the properties and structure of the hybrid gel change, and regains physiological activity by refolding. This control means is used, for example, for controlling proteins and the like as described below. Examples of suitable proteins include, but are not limited to, known TPA, IFN, CSF (M-, GM-, etc.) and blood coagulation factors (eg, Factor VIII, IX, XIII, etc.).
１）生理活性物質、蛋白質（ペプチドを含む）の生体内運搬
これは、所謂、ターゲティング治療に関する。目的生理活性物質を、ハイブリッドゲル内に包埋し、経口或は注射によって生体内に生理活性物質等包埋ハイブリッドゲルを投与し、粒子を目標組織、目標細胞、癌細胞等に移動させ、目標部位に到着後、粒子構造を変化させ、包埋生理活性物質等を遊離させ、蛋白質であればリフォールディング後に生物活性を発揮させるというものである。この方法で、生理活性物質或いは活性蛋白質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。簡便には、腸内の特別の部位での生理活性物質或いは蛋白質等の活性化のために経口投与し、そしてそれに続く腸内のターゲット部位での活性化を達成する。注射薬としては、ハイブリッドゲルの表面を目標組織・細胞との親和性を考慮した修飾を施し、例えばモノクローナル抗体等、その親和性により目標部位に生理活性物質或いは蛋白質等包埋ハイブリッドゲルを集積させ、その後ハイブリッドゲル構造を変化させ、包埋生理活性物質或いは蛋白質等を遊離させ、蛋白質であればリフォールディング後に、生物活性を発揮させるというものである。この方法で、生理活性物質或いは活性蛋白質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。
1) In vivo transport of physiologically active substances and proteins (including peptides) This relates to so-called targeting therapy. The target physiologically active substance is embedded in the hybrid gel, and the hybrid gel embedded with the biologically active substance or the like is administered into the living body orally or by injection, and the particles are transferred to the target tissue, target cell, cancer cell, etc. After arriving at the site, the particle structure is changed to release the embedded physiologically active substance and the like, and if it is a protein, the biological activity is exhibited after refolding. In this way, it is possible to control the inactivation or side effects of the physiologically active substance or active protein during the in vivo movement. Conveniently, it is orally administered for activation of a physiologically active substance or protein at a specific site in the intestine, and the subsequent activation at the target site in the intestine is achieved. As an injection, the surface of the hybrid gel is modified in consideration of the affinity with the target tissue / cell, and for example, a monoclonal antibody or the like is used to accumulate an embedded hybrid gel such as a biologically active substance or protein at the target site based on the affinity. Then, the hybrid gel structure is changed to release the embedded physiologically active substance or protein, and if it is a protein, the biological activity is exhibited after refolding. In this way, it is possible to control the inactivation or side effects of the physiologically active substance or active protein during the in vivo movement.
２）生理活性物質、蛋白質（ペプチドを含む）の保存・安定化
安定性に乏しい生理活性物質の安定化、たんぱく質の場合フォールディングされた状態で、安定性に乏しい蛋白質等の安定化のための手段としても好ましい結果を導く。生理活性物質或いは蛋白質等を主成分とする製剤には、医薬品、化粧品、食品等様々のものがある。目的とする生理活性物質或いは蛋白質等が、放置すれば不可逆的に変性・凝集を起こす場合、本ハイブリッドゲルの中に目的蛋白質等を閉じ込め、用事、目的生理活性物質或いは蛋白質等を遊離させ、目的の生理学的機能を発揮させる。
2) Preservation and stabilization of physiologically active substances and proteins (including peptides) Stabilization of physiologically active substances with poor stability, and means for stabilizing proteins with poor stability in the folded state in the case of proteins As a result, preferable results are obtained. Various preparations mainly composed of physiologically active substances or proteins include pharmaceuticals, cosmetics and foods. If the target physiologically active substance or protein is irreversibly denatured or aggregated if left untreated, the target protein or the like is trapped in this hybrid gel, and the target physiologically active substance or protein is released. Exerts its physiological function.
３）生理活性物質、蛋白質（ペプチドを含む）の精製
目的の蛋白質等が遺伝子工学的に生産される場合、蛋白質等の合成後、細胞外分泌されずインクリュージョンボディーの状態になる場合に有効である。細胞を溶解し変性剤で目的蛋白質等を変性させ、ハイブリッドゲル中に取込み、回収し、その後、適当な生理的条件下でハイブリッドゲルの構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。無細胞タンパク質合成手段或は分泌系の細胞内蛋白質合成手段にあっては、合成系にハイブリッドゲルを共存させ、合成されてくる蛋白質等をハイブリッドゲル内に連続的に取込み、その後、ハイブリッドゲルを分離回収して、適当な生理的条件下でハイブリッドゲルの構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。
3) Purification of physiologically active substances and proteins (including peptides) When the target protein is produced by genetic engineering, it is effective when the protein is synthesized and is in an inclusion body state without being secreted extracellularly. is there. Cells are lysed and the target protein is denatured with a denaturing agent, taken into the hybrid gel and collected, then the structure of the hybrid gel is changed under appropriate physiological conditions, and the target protein is refolded and collected. be able to. In cell-free protein synthesis means or secretory intracellular protein synthesis means, a hybrid gel is allowed to coexist in the synthesis system, and the synthesized protein is continuously taken into the hybrid gel. By separating and collecting, the structure of the hybrid gel can be changed under appropriate physiological conditions, and the target protein and the like can be refolded and recovered.
４）生理活性物質の反応性の制御（酵素・基質反応性の制御）
酵素又は基質を、ハイブリッドゲル内に包埋させておけば、酵素反応の制御が要時まで可能である。ハイブリッドゲル内に包埋された酵素又は基質は、不活性状態として、相手側との交差が制御される。例えば、試薬として一体化製剤として製品化した場合に、ハイブリッドゲルが構造を変化させ、包埋目的酵素又は基質を遊離させ、その結果、酵素反応が初めて開始できる系にしておけば、製剤の効率化・簡略化が達成できる。また、酵素の保存安定性の確保のためにハイブリッドゲル内に酵素を包埋しておき、要時目的酵素をハイブリッドゲルから遊離させて反応系におくことも可能である。
4) Control of reactivity of bioactive substances (control of enzyme / substrate reactivity)
If the enzyme or substrate is embedded in the hybrid gel, the enzyme reaction can be controlled until needed. The enzyme or substrate embedded in the hybrid gel is in an inactive state and the crossing with the counterpart is controlled. For example, when a product is manufactured as an integrated preparation as a reagent, the hybrid gel changes the structure, liberates the target enzyme or substrate for embedding, and as a result, the system can start the enzyme reaction for the first time. Can be achieved. Further, in order to ensure the storage stability of the enzyme, it is possible to embed the enzyme in a hybrid gel and to release the target enzyme from the hybrid gel when necessary and place it in the reaction system.
５）生理活性物質の反応性の制御（抗原・抗体反応の制御）
抗原又は抗体を、ハイブリッドゲル内に包埋しておけば、抗原・抗体反応の制御が可能である。抗原抗体反応を利用した試薬、医薬において、要時目的抗体又は抗原をハイブリッドゲルから遊離させて反応系におくことも可能である。
5) Control of reactivity of bioactive substances (control of antigen / antibody reaction)
If an antigen or antibody is embedded in a hybrid gel, the antigen-antibody reaction can be controlled. In reagents and medicines using antigen-antibody reaction, the target antibody or antigen can be released from the hybrid gel and placed in the reaction system when necessary.
以下本発明を実施例で説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであって、その技術的範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples. However, the examples show examples of the present invention and do not limit the technical scope thereof.
実施例１
重合性ナノゲルの合成
Example 1
Synthesis of polymerizable nanogels
実験1.1 メタクリロイル化CHP（CHPMA）の合成
CHP（分子量108,000、コレステロール基置換度；1.2個/100単糖）（WO00/12564）（Akiyoshi, K.; Deguchi, S.; Moriguchi, N.; Yamaguchi, S.; Sunamoto, J. Macromolecules 1993, 26, 3062. 2） Kuroda, K.; Fujimoto, K.; Sunamoto, J.; and Akiyoshi, K. Langmuir 2002, 10, 3780）に重合性基としてメタクリロイル基の導入を行った。CHPを30mLのDMSOに溶解後、グリシジルメタクリレート(GMA)、ジメチルアミノピリジン（DMAP）を加え、24時間室温にて撹拌し、反応させた。反応は無水系にて行った。 HCl添加により反応停止後、大過剰の水に対して7日間透析を行い、凍結乾燥することでCHPメタクリレート（CHPMA）を得た。1H-NMRによる構造解析から導入されたメタクリロイル基量を決定した。以下CHPMAの100単糖あたりに導入されたメタクリロイル基をXとしてCHPMAXと呼ぶ。
CHP (molecular weight 108,000, cholesterol group substitution degree: 1.2 / 100 monosaccharide) (WO00 / 12564) (Akiyoshi, K .; Deguchi, S .; Moriguchi, N .; Yamaguchi, S .; Sunamoto, J. Macromolecules 1993, 26, 3062. 2) Kuroda, K .; Fujimoto, K .; Sunamoto, J .; and Akiyoshi, K. Langmuir 2002, 10, 3780), a methacryloyl group was introduced as a polymerizable group. CHP was dissolved in 30 mL DMSO, glycidyl methacrylate (GMA) and dimethylaminopyridine (DMAP) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to be reacted. The reaction was carried out in an anhydrous system. After stopping the reaction by adding HCl, dialysis was performed for 7 days against a large excess of water, and freeze-dried to obtain CHP methacrylate (CHPMA). The amount of methacryloyl group introduced was determined from structural analysis by 1 H-NMR. Hereinafter, the methacryloyl group introduced per 100 monosaccharides of CHPMA is referred to as CHPMAX.
実験1.2 MPC グラフト化CHPMA (CM)の合成
実験1の手法で得られたCHPMAと2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)とラジカル共重合を行うことで多糖-合成高分子ハイブリッドポリマーを合成した。CHPMA6.2を 200mgを蒸留水に対し1.0mg/mLとなるように溶解し、超音波処理（40W、15分：以後の超音波処理はこの条件下で行った）することでナノゲルを形成させ、0.45μmフィルターにて濾過した後、CHPMA6.2のメタクリロイル基に対してモル比で100倍ないし10倍のMPCを加え、水系の重合開始剤である2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]（VA-044）をモノマーに対して0.5mol％の割合で加え50℃にて5hr重合した。反応停止後、水に対してMWCO3,500の透析膜を用いて1週間透析して未反応モノマーを除去した後、凍結乾燥した。これを水に対して再溶解させ、MPCホモポリマー除去の目的でエタノールに対して再沈殿、減圧乾燥することで回収した。1H-NMRの結果から100倍量仕込みの場合、１メタクリロイルあたり14.3個のMPC導入量（CM14、収率23.9％）、10倍量仕込みの場合、１メタクリロイル基あたり6.1個のMPCが導入（CM6、収率58.0％）されていると算出された。これらの結果から分子量はCM14；297,000、CM6；188,000と算出した。
実験1.3 CMナノゲルのTEM観察
0.2 mg/mLに調整した各水溶液をフィルター濾過し、うち10μLをとりコロジオン支持膜を張り、親水化処理を行ったグリッド上に滴下、風乾後、2%酢酸ウラニル溶液にて30分ネガティブ染色を行った後、洗浄、カーボン蒸着してTEM観察を行った。その結果、CM6及びCM14共にナノサイズの微粒子が形成されていることが確認された。
Experiment 1.3 TEM observation of CM nanogel
Each aqueous solution adjusted to 0.2 mg / mL is filtered through a filter, 10 μL of which is applied onto a collodion support membrane, dropped onto a hydrophilized grid, air-dried, and then negatively stained with 2% uranyl acetate solution for 30 minutes. After the cleaning, cleaning and carbon deposition were performed, and TEM observation was performed. As a result, it was confirmed that nano-sized fine particles were formed in both CM6 and CM14.
実験1.4 サイズ排除クロマトグラフィー-多角度光散乱（SEC- MALS）測定
それぞれの試料を2mg/mLに調整、超音波処理を行い、0.45μmに続いて0.22μmのフィルターを２度通した後測定を行った。測定はCHP、CHPMA、CM6はTOSOH TSKgel G4000SWXLのカラムにより、CM14はSHODEXSB-806 HQ を用い、NaClの50mM水溶液を溶離液として流速0.5mL/minの条件下で行った。また、この溶離液にCDの10mM加えることでナノゲルの崩壊性について検討を行った。なおサンプルはCD添加後３時間放置してから測定を行った。表２にSEC-MALS 測定結果を示した。
実験1.6 人工分子シャペロンの検討
酵素（Carbonic anhydrase II;CAB）溶液（0.015mg/mL）をナノゲル溶液（4.8mg/mL）と混合した後、熱変性させ、この混合溶液に10 mMのsCDを３時間作用させた場合と作用させなかった場合において、p-Nitrophenyl acetateを基質として用い、これから遊離するパラニトロフェノールの濃度増加を400nmの吸光度の時間変化を追跡することで酵素の活性回復率を見積もった。表３に熱変性させたCABの活性回復率を示した。
実施例２
重合性ナノゲルを架橋点としたマクロゲルの調製とキャラクタリゼーション
CHPMAとMPCによるマクロゲルの調製について示す。
Example 2
Preparation and characterization of macrogels with polymerizable nanogels as crosslinking points
Preparation of macrogel by CHPMA and MPC is shown.
実験2.1 CHPMA-MPCマクロゲル（CMマクロゲル）の調製
CHPMAおよび2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）を所定量（表４参照）加え、水系の重合開始剤である2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]（VA-044）をモノマー（系中の全メタクリロイル基）に対して0.5mol%の割合で加え、アルゴン脱気後、50℃、5hrの条件下で重合を行った。反応停止後、水中に1週間膨潤させることでモノマーを除去、凍結乾燥することで試料を得た。なおゲル化の確認はTilt法により行い、各組成におけるゲル化の可否から相関図を作製した。これよりCHPMA濃度が高くなることで粘度が上昇しマクロなゲル化が進行したと考えられる。この粘度上昇はCHPナノゲルが疎水性基を会合点とした物理架橋ゲルを形成しているためであり、CHPMAのコレステロール基が無い構造（つまりプルランメタクリレート：PULMA、メタクリロイル基置換度100単糖当たり5.1個）にてMPCとPULMA-MPC30-32の条件では粘度上昇が見られず、マクロなゲルは調製できない。その一方でCHPMAのみでは50mg/mLの条件においてもマクロなゲル化は確認されない。このためMPCが存在することでスペーサーとして機能し、マクロゲルを調製可能にしていると考えられた。
Experiment 2.1 Preparation of CHPMA-MPC macrogel (CM macrogel)
CHPMA and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) were added in predetermined amounts (see Table 4), and 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane], an aqueous polymerization initiator, was added (VA -044) was added at a rate of 0.5 mol% with respect to the monomer (all methacryloyl groups in the system), and after degassing with argon, polymerization was carried out at 50 ° C. for 5 hours. After stopping the reaction, the monomer was removed by swelling in water for 1 week, and a sample was obtained by lyophilization. The gelation was confirmed by the Tilt method, and a correlation diagram was prepared based on the possibility of gelation in each composition. From this, it is considered that the CHPMA concentration increased, the viscosity increased, and macro gelation progressed. This increase in viscosity is due to the fact that the CHP nanogel forms a physical cross-linked gel with the hydrophobic group as the point of association, and a structure without the cholesterol group of CHPMA (that is, pullulan methacrylate: PULMA, methacryloyl group substitution degree: 5.1 per 100 monosaccharides) No increase in viscosity is observed under the conditions of MPC and PULMA-MPC30-32, and a macro gel cannot be prepared. On the other hand, macro gelation is not confirmed only with CHPMA even under the condition of 50 mg / mL. For this reason, it was considered that the presence of MPC functions as a spacer, making it possible to prepare a macrogel.
実験2.2 膨潤率測定
得られたCMマクロゲルを凍結乾燥後、また純水に対する平衡膨潤時（24h、室温）においてそれぞれ重量測定を行い下記の式から算出した。
（膨潤率）= （膨潤時重量）/（乾燥時重量）
この結果からマクロゲル中のCHPMA含量が多いほど膨潤率が低く、逆にスペーサーとしての役割を果たすMPC含量が多いほど膨潤率が高いことが明らかとなった。このことはCHPMAナノゲルが架橋点となっていることを示している（表４）。
(Swelling rate) = (Weight when swollen) / (Weight when dried)
From this result, it was clarified that the higher the CHPMA content in the macrogel, the lower the swelling rate, and conversely, the higher the MPC content that plays the role of spacer, the higher the swelling rate. This indicates that the CHPMA nanogel is a crosslinking point (Table 4).
実験2.3 CMマクロゲルのTEM観察
純水にて膨潤させたCMマクロゲルに30%グリセリン溶液となるようにグリセリンを加え、液体窒素下で凍結割断法によりゲル断面を露出させた後、カーボン、白金を蒸着することでシャドーイングしてレプリカを作成し、TEM観察を行った。この結果CMマクロゲル中にCHPMAナノゲルが崩壊せずに形態を保持したまま、分散された構造を有していることが明らかとなり、CM30-32の場合そのナノゲル間距離は86.1nmであった。
Experiment 2.3 TEM observation of CM macrogel Add glycerin to CM macrogel swollen with pure water to form a 30% glycerin solution, expose the gel cross section by freezing cleaving method under liquid nitrogen, and then deposit carbon and platinum By doing so, a replica was made by shadowing and TEM observation was performed. As a result, it was found that the CHPMA nanogel did not collapse in the CM macrogel and had a dispersed structure while maintaining the form. In the case of CM30-32, the distance between the nanogels was 86.1 nm.
実験2.4 CMマクロゲル中へのインスリン（Ins）の取り込み
各マクロゲルを10mgとり、PD-10カラム内で0.1M PBSにより室温で24h膨潤させた後、50μg/mLのFITC-Ins/0.1M PBS溶液をカラムに加えることでFITC-InsのCMマクロゲル中への取り込みを行った。各時間における取り込み量をカラム内の溶液を分取し、UV492nmにおける吸光度の減少とFITC-Insから作製した検量線を用いて算出した。この結果、CMマクロゲルの膨潤率が高いほどInsの取り込みが早く、またナノゲル1個あたりに取り込むInsの量も多いことが明らかとなった。また乾燥状態から膨潤させながらのFITC-Insの取り込みを試みたところ、平衡膨潤時からの場合と同様の取り込み挙動および量を示した。
Experiment 2.4 Intake of insulin (Ins) into CM macrogel Take 10 mg of each macrogel and swell for 24 h at room temperature with 0.1 M PBS in a PD-10 column, then add 50 μg / mL FITC-Ins / 0.1 M PBS solution Incorporation of FITC-Ins into CM macrogel was performed by adding to the column. The amount of uptake at each time was calculated by separating the solution in the column and using a calibration curve prepared from the decrease in absorbance at UV 492 nm and FITC-Ins. As a result, it was clarified that the higher the swelling ratio of the CM macrogel, the faster the Ins incorporation, and the greater the amount of Ins incorporated per nanogel. In addition, we tried to take up FITC-Ins while swelling from the dry state, and showed the same uptake behavior and amount as in the case of equilibrium swelling.
実験2.5 CMマクロゲルからのInsの放出
取り込み実験で吸光度が平衡に達したマクロゲルをFITC-Ins/PBS溶液除去後、マクロゲルを含むカラムに0.1M PBS 5mLを加え、カラムを通すことで洗浄した。なおこの操作は2度行った。このマクロゲルから1) 0.1M PBS、2) 10mM sCDを含む0.1M PBS、3) 10 mg/mLのBSAを含む0.1M PBS、4) 10mM sCD 、10 mg/mLのBSAを含む0.1M PBS、5) 10%FBSを含む0.1M PBS、6) 10mM sCD 、10%FBSを含む0.1M PBSに対してのFITC-Insの放出挙動を各時間におけるUV492nmにおける吸光度から算出した。
この結果よりいずれのマクロゲルにおいてもsCDを作用させることでFITC-Insの放出量を大きく増大させた。また添加後30min以内で（480min時点での）全体量の50%以上を放出していることからナノゲルの応答性の早さが現れている。その放出量はマクロゲル内部に取り込んだFITC-Ins量が多いほど増加した。24hr後での放出量（%）はそれぞれCM6-32; 61%、 CM10-32; 53%、 CM30-32;69%、 CM-20-20; 70%であった。またCM20-20においてはさらに5日後に80%以上の放出を確認している。一方でsCD未添加の場合、3時間までの初期放出段階ではゲル型のリリース曲線を、その後リザーバー型の放出を示すことが明らかとなった。これはCMマクロゲル中のMPCマトリックス内、もしくはCHPMAナノゲル表面に存在するInsの放出（〜3時間）と、CHPMAナノゲル内に取り込まれたInsの放出であると考えられた。sCD添加により急激な放出が見られたことからもCHPMAナノゲル内部にInsが取り込まれていたことが確認された。またBSA、FBS存在下においても同様の曲線が得られたことから、MPCが存在することでタンパク質の吸着を抑制し、放出を持続させられると考えられた。まとめるとこのCMマクロゲルはsCD応答性でかつタンパク質存在下においても持続放出可能なゲルであるといえる。
また分子量約6,000のInsに対し、約60,000の牛血清アルブミンについてもマクロゲル内に取り込み、sCD添加による放出制御が可能であった。
Experiment 2.5 Release of Ins from CM Macrogel After removing the FITC-Ins / PBS solution from the macrogel whose absorbance reached equilibrium in the uptake experiment, 5 mL of 0.1 M PBS was added to the column containing the macrogel and washed by passing through the column. This operation was performed twice. From this macrogel, 1) 0.1 M PBS, 2) 0.1 M PBS containing 10 mM sCD, 3) 0.1 M PBS containing 10 mg / mL BSA, 4) 0.1 M PBS containing 10 mM sCD, 10 mg / mL BSA, 5) The release behavior of FITC-Ins for 0.1 M PBS containing 10% FBS and 6) 0.1 M PBS containing 10 mM sCD and 10% FBS was calculated from the absorbance at UV 492 nm for each time.
From these results, the release amount of FITC-Ins was greatly increased by applying sCD to any macrogel. Moreover, since the release of 50% or more of the total amount within 30 min after addition (at 480 min), the quick response of the nanogel appears. The released amount increased as the amount of FITC-Ins incorporated into the macrogel increased. The release amount (%) after 24 hours was CM6-32; 61%, CM10-32; 53%, CM30-32; 69%, CM-20-20; 70%, respectively. In CM20-20, more than 80% of the release was confirmed after another 5 days. On the other hand, when no sCD was added, it was revealed that a gel-type release curve was exhibited at the initial release stage up to 3 hours, followed by a reservoir-type release. This was considered to be the release of Ins present in the MPC matrix in the CM macrogel or on the surface of the CHPMA nanogel (˜3 hours) and the release of Ins incorporated into the CHPMA nanogel. It was confirmed that Ins was incorporated into the CHPMA nanogel from the fact that rapid release was observed by addition of sCD. In addition, similar curves were obtained even in the presence of BSA and FBS. Therefore, the presence of MPC was considered to suppress protein adsorption and maintain the release. In summary, this CM macrogel is sCD-responsive and can be said to be a sustained release gel even in the presence of protein.
In addition, about 60,000 bovine serum albumin was incorporated into the macrogel for Ins with a molecular weight of about 6,000, and the release could be controlled by adding sCD.
実施例３
リン脂質リポソーム-重合性ナノゲル複合体を架橋点としたマクロゲルの調製とキャラクタリゼーション
実施例２において重合性ナノゲルがその形状、性質を保持したまま架橋点となったマクロゲルが調製できた。リン脂質リポソームを重合性ナノゲルにて被覆することで重合性ナノゲル被覆リポソームを架橋点に有した、つまりリポソームーナノゲルーマトリックスの3層を有したゲルを調製した。これはリポソームのサイズのみならず種類も選択できることから、3層おのおのの部分が独立に選択でき、それぞれの特徴を生かすことが期待できる新規なマテリアルの創製である。以下にCHPMA-MPC-ジパルミトイルホスファチジルコリン/コレステロール（DPPC:cholesterol）リポソームからなるマクロゲルの調製法を示す。
Example 3
Preparation and Characterization of Macrogel Using Phospholipid Liposome-Polymerizable Nanogel Complex as Crosslinking Point In Example 2, a macrogel having a crosslinking point was prepared while maintaining the shape and properties of the polymerizable nanogel. A gel having a polymerizable nanogel-coated liposome at a cross-linking point, that is, a liposome-nanogel-matrix three-layer was prepared by coating phospholipid liposomes with a polymerizable nanogel. This means that not only the size of the liposome but also the type can be selected, so each part of the three layers can be selected independently, and the creation of a new material that can be expected to make use of each feature. A method for preparing a macrogel composed of CHPMA-MPC-dipalmitoylphosphatidylcholine / cholesterol (DPPC: cholesterol) liposomes is shown below.
実験3.1 マクロゲルの調製
直径120nmに調製したリン脂質リポソーム（DPPC:Cholesterol = 3:1(mol:mol)）水溶液2mg/mLにCHPMAナノゲルを3-30 mg/mLの濃度において添加し、リポソームを被覆後、MPC32mg/mLとなるように添加し、VA-044を開始剤として全メタクリロイル基に対して0.5mol%加え、アルゴン脱気後、50℃、5hrの条件下で重合を行った。ゲル化の確認はTilt法により行った。この結果CHPMAナノゲルが10mg/mL以上の条件でゲル化が進行することが確認された。
Experiment 3.1 Preparation of macrogel CHPMA nanogel was added to 2 mg / mL aqueous solution of phospholipid liposome (DPPC: Cholesterol = 3: 1 (mol: mol)) prepared at a diameter of 120 nm at a concentration of 3-30 mg / mL, and the liposome was coated. Thereafter, MPC was added at 32 mg / mL, VA-044 was added as an initiator, and 0.5 mol% was added to all methacryloyl groups. After degassing with argon, polymerization was carried out at 50 ° C. for 5 hours. The gelation was confirmed by the Tilt method. As a result, it was confirmed that the gelation of CHPMA nanogel progressed under the condition of 10 mg / mL or more.
実験3.2 TEM観察
実験2.3と同様の手法にてサンプルを調製し、TEM観察を行った。この結果マクロゲル中にリポソームを単層に被覆したCHPMAナノゲル分散されており、リポソームは構造を保持したまま重合が進行したことが明らかとなった。
Experiment 3.2 TEM observation A sample was prepared in the same manner as in Experiment 2.3, and TEM observation was performed. As a result, it was revealed that CHPMA nanogel in which the liposome was coated in a monolayer was dispersed in the macrogel, and that the polymerization proceeded while maintaining the structure of the liposome.
本発明のハイブリッドゲルは、生理活性物質の保存、精製、運搬、DDS等の医療、生命工学領域において極めて大きな利用可能性を達成した。 The hybrid gel of the present invention has achieved extremely great applicability in the fields of medical and biotechnology such as preservation, purification, transportation, and DDS of physiologically active substances.
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Families Citing this family (11)
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5272784A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-17 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Dextrane derivative gel for electrophoresis separation |
| JPS59218422A (en) * | 1975-10-03 | 1984-12-08 | Meito Sangyo Kk | Contact lens and its manufacture |
| JPS60147423A (en) * | 1984-01-09 | 1985-08-03 | Yasuhiko Onishi | Pullulan copolymer and its use |
| JPH07505417A (en) * | 1992-03-30 | 1995-06-15 | ドイチェ ゲラティネ−ファブリケン シュテス アクチェンゲゼルシャフト | Biodegradable water resistant polymer material |
| JP2002146100A (en) * | 2000-11-13 | 2002-05-22 | Nof Corp | Composition for hydrogel, hydrogen and use thereof |
| JP2002541308A (en) * | 1999-04-12 | 2002-12-03 | コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド | Aqueous gel-forming system with hydrophobic and hydrophilic components |
| JP2003310295A (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-05 | Invitrotech Co Ltd | Method for producing protein |
-
2004
- 2004-04-09 JP JP2004115613A patent/JP4599550B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59218422A (en) * | 1975-10-03 | 1984-12-08 | Meito Sangyo Kk | Contact lens and its manufacture |
| JPS5272784A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-17 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Dextrane derivative gel for electrophoresis separation |
| JPS60147423A (en) * | 1984-01-09 | 1985-08-03 | Yasuhiko Onishi | Pullulan copolymer and its use |
| JPH07505417A (en) * | 1992-03-30 | 1995-06-15 | ドイチェ ゲラティネ−ファブリケン シュテス アクチェンゲゼルシャフト | Biodegradable water resistant polymer material |
| JP2002541308A (en) * | 1999-04-12 | 2002-12-03 | コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド | Aqueous gel-forming system with hydrophobic and hydrophilic components |
| JP2002146100A (en) * | 2000-11-13 | 2002-05-22 | Nof Corp | Composition for hydrogel, hydrogen and use thereof |
| JP2003310295A (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-05 | Invitrotech Co Ltd | Method for producing protein |
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