JP4595446B2 - Nucleic acid amplification method - Google Patents

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Description

本発明は、核酸増幅方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid amplification method.

(核酸増幅反応器) (Nucleic acid amplification reactor)
核酸増幅反応は従来、ポリプロピレン製やポリカーボネート製のサンプルチューブやガラス製容器で行われることが多かった。 Nucleic acid amplification reaction was often conventionally performed in sample tubes or glass container made of polypropylene or polycarbonate. しかし効率的に核酸増幅反応を進める方法として、例えば酵素を用いた最も代表的な核酸増幅法であるPCR(Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応)法の場合、マイクロ流体デバイスやキャピラリーを反応器に用いた、いわゆる「フロースルーPCR法」が報告されている(例えば、特許文献1および非特許文献1参照)。 Use case; (polymerase chain reaction Polymerase Chain Reaction) method, a microfluidic device or capillary reactor but as a method of efficiently promoting the nucleic acid amplification reaction, PCR for example enzymatic most typical nucleic acid amplification method using There was a so-called "flow-through PCR method" has been reported (e.g., see Patent Document 1 and non-Patent Document 1). この方法は例えば図1に示したように、独立した複数のヒートブロックを各設定温度に調節し、これらを並べた上にマイクロ流体デバイスを密着させ、マイクロ流体デバイス内部の微細流路に反応液を流す方法である。 The method as shown in FIG. 1, for example, to adjust the plurality of independent heat block to the setting temperature, they are brought into close contact with the microfluidic device on the arranged, the reaction liquid into a fine flow path of the internal microfluidic device it is a method to flow.

(マイクロ流体デバイスの材質) (The material of the microfluidic device)
マイクロ流体デバイスの材質として、当初用いられていたのはガラス、あるいはガラスとシリコンゴムとを貼り合わせたものであった。 As the material of the microfluidic device had been used initially it was formed by bonding a glass, or a glass and silicone rubber. しかし、これらのデバイス作製プロセスにはガラスの切削工程、高温高圧下で長時間かけてガラスを貼り合わせる工程、あるいはシリコンゴムの鋳型を作製する工程などが必要であり、手間やコストがかかっていた。 However, the cutting process of the glass in these devices fabrication process, it is necessary, such as a step of manufacturing process, or the template of the silicon rubber bonding the glass over a long time under high temperature and high pressure, it takes a long time and cost . 更に、ガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスは、その流路に高圧を加えるとガラスとシリコンゴムとがしばしば剥離してしまっていた。 Further, the microfluidic device by bonding glass and silicone rubber, glass and silicone rubber has fallen into often peeled Addition of high pressure to the flow path.

このため改善策として、成形が容易で耐衝撃性及び機械的強度に優れた活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスが提案されている(例えば、特許文献2参照)。 As Therefore improvement microfluidic device configured with molded easy impact resistance and excellent active energy ray curable resin in mechanical strength is proposed (e.g., see Patent Document 2). 活性エネルギー線硬化樹脂は薄膜でも高い耐衝撃性を保持しているため、ヒートブロックと接触させるデバイス面の膜厚を薄く(30μm程度)して熱伝導効率を高めることも可能であるし、内外圧により破損することも少ない。 Since the active energy ray curable resin retains high impact resistance in a thin film, it is also possible to the thickness of the device surface contacted with the heat block thin (approximately 30 [mu] m) to increase heat conduction efficiency, and out it is also less likely to be damaged by the pressure. また、該活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスの作製においては、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術を利用することによって容易に微細な溝や流路を成型できるため特別な鋳型を必要とせず、手間やコストを省くことができ、また流路デザインも都度容易に変更可能という利点がある。 In the fabrication of microfluidic devices configured with the active energy ray curable resin, a special template for possible molding easily fine grooves or flow channel by utilizing a photolithography technique used in a semiconductor manufacturing without the need, it is possible to save time and cost, also has the advantage that the flow path design also each time easily can be changed.

(試料由来夾雑物による反応阻害と阻害抑制成分) (Reaction inhibiting inhibition suppressing component according to a sample from contaminants)
ところでPCR法は、増幅しようとする核酸を含む試料として例えば血液、唾液、体細胞のような生体試料を供した場合など、試料由来の夾雑物が反応液中に混在すると反応が強く阻害されることが広く知られている。 Incidentally PCR method, such as when a biological sample has been subjected, contaminants from the sample is strongly inhibited the reaction with mixed in the reaction solution as a sample as for example blood, saliva, somatic cell comprising a nucleic acid to be amplified it has been widely known. そのため一般的には、核酸を含む試料に対してフェノール・クロロホルム抽出法などの夾雑物除去処理を施して核酸を精製した後、これをテンプレートとしてPCRを行うという工程が採用されている。 Therefore in general, after the nucleic acid subjected to contaminant removal process such as phenol-chloroform extraction method with respect to a sample containing the purified nucleic acids, steps of performing PCR are adopted as a template.
該核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、即ち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として、生体試料を含む反応液に界面活性剤またはアルブミン等を添加する核酸増幅法が提案されている(例えば、特許文献3および4参照)。 To omit the nucleic acid purification process, a biological sample directly from the left, i.e. a technique which allows nucleic acid amplification in contaminants laden reaction system, addition of a surfactant or albumin to a reaction solution containing a biological sample nucleic acid amplification method that has been proposed (e.g., see Patent documents 3 and 4). しかしながら、該手法は主として生体試料由来の阻害因子に対してこれを抑制することを想定した手段であった。 However, 該手 method was assumed means that primarily suppress this respect inhibitors derived biological sample.

特開平07−075544 JP-A-07-075544 特開2002−58470 JP 2002-58470 特開2001−008685 Patent 2001-008685 特開平10−080279 JP-A-10-080279

前述したように、これまでに活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスを用いるフロースルーPCR法が提案されていたものの、本発明者らがそのマイクロ流体デバイスを用いてPCRを行ったところ特異的増幅量が少なく、また非特異的増幅が多く発生することが分かり、必ずしも満足のいく精度ではなかった。 As described above, although the flow-through PCR method has been proposed to use a microfluidic device configured with an active energy ray curable resin so far, the present inventors have PCR was performed using the microfluidic device less specific amplification amount, also found that non-specific amplification occurs mostly were not necessarily satisfactory precision. そのため、活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスを初めとする反応器を用いた、高精度な核酸増幅方法が求められていた。 Therefore, using a reactor including the microfluidic device configured with an active energy ray curable resin, highly accurate nucleic acid amplification method has been desired.

そこで本発明が解決しようとする課題は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた核酸増幅法において、非特異的増幅を抑えた高精度の核酸増幅が可能な方法を提供することにある。 Therefore object of the present invention is to provide, in a nucleic acid amplification method in which at least part of the contact surface between reactants with reactor configured with an active energy ray curable resin enzymatic reaction, suppressing non-specific amplification and to provide a high accuracy of nucleic acid amplification capable methods.

本発明者らは、従来から用いられてきたポリプロピレン製あるいはポリカーボネート製のサンプルチューブ、及びガラス製あるいはガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスでの核酸増幅反応では見られなかった現象、即ち反応(増幅)阻害あるいは企図しない反応(非特異的増幅)が、前記活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた場合には発生することを見いだした。 The present inventors have been used conventionally polypropylene or polycarbonate sample tube, and the phenomenon was not observed in the nucleic acid amplification reaction in a microfluidic device by bonding a glass or glass and silicone rubber, i.e. the reaction (amplification) inhibition or not intended reaction (non-specific amplification) has found that occurs when using a reactor which is constituted by the active energy ray curable resin. その原因は未だ不明であるが、活性エネルギー線硬化樹脂中の残存モノマー、重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤、溶剤等のいずれかの成分が反応液中に溶出して阻害を誘発するため、上記現象が起きてしまうのではないかと考えられた。 Its cause is still unknown, the residual monomer in the active energy ray curable resin, polymerization initiator, polymerization retardant, a polymerization inhibitor, any of components such as a solvent to induce inhibition eluted into the reaction liquid Therefore, it was considered that it would be the phenomenon would occur. そこで本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、核酸増幅反応時に核酸増幅阻害抑制成分を作用させることで上記現象を抑えた高精度な核酸増幅が可能となることを見出し、課題解決に至った。 The present inventors have results of extensive research, we found that high precision becomes possible nucleic acid amplification which suppresses the phenomenon by the action of nucleic acid amplification inhibition inhibiting component during nucleic acid amplification reaction, leading to the problem solution .

即ち、本発明は、反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器を用いて酵素の存在下で核酸を増幅する方法であって、核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加える工程を含む核酸増幅方法を提供する。 That is, the present invention, at least a portion of the contact surface with the reaction liquid is a method of amplifying a nucleic acid in the presence of an enzyme using a reactor which is constituted by an active energy ray curable resin, the nucleic acid amplification inhibition inhibition It provides a nucleic acid amplification method comprising the step of adding the components to the reactor.

本発明の方法は、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた核酸増幅反応において反応阻害を回復し、非特異的増幅を抑え高精度の核酸増幅を可能にする。 The method of the present invention is to recover the reaction inhibition in the nucleic acid amplification reaction using a reactor configured with an active energy ray curable resin, to enable highly accurate nucleic acid amplification suppress nonspecific amplification. 前述のように活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスは簡便に作成することができ、また核酸増幅反応を迅速化し得る一方で、反応阻害や企図しない反応が起こり有効に使用することができなかったことから、本発明の方法を該デバイスに適用することは特に有用である。 Microfluidic device configured with an active energy ray curable resin as described above can be created easily, and while that can speed up the nucleic acid amplification reaction, that the reaction does not react inhibit or contemplated to occur effectively used since that could not be, it is particularly useful to apply the method of the present invention to the device.

本発明は、反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器を用いて核酸を増幅する方法であって、核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加える工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法である。 The present invention, at least a portion of the contact surface between the reaction solution is a method of amplifying a nucleic acid using a reactor which is constituted by an active energy ray curable resin, adding a nucleic acid amplification inhibitor inhibiting component in the reactor it is a nucleic acid amplification method which comprises a.

(反応器) (Reactor)
本発明において「反応器」とは、例えばサンプルチューブ等の反応容器や、微細な流路を内部に有するデバイス、所謂、マイクロ流体デバイスなどの反応流路を有する反応機器など、化学反応や生化学反応を行うことのできる反応容器、反応器具、反応機器などを指す。 A "reactor" in the present invention, for example, the reaction vessel such as a sample tube, the device having therein a fine flow path, so-called, and a reaction device having a reaction channel, such as microfluidic devices, chemical and biochemical reaction vessel reaction can be carried out, the reaction device, and reacting device refers. このうち、迅速な核酸増幅が可能なフロースルーPCRに適した反応器として、マイクロ流体デバイスが挙げられる。 Among them, as a reactor suitable for the flow-through PCR that enable rapid nucleic acid amplification include microfluidic devices.

(マイクロ流体デバイス) (Microfluidic device)
本発明におけるマイクロ流体デバイスとしては、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラボ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム(μ−TAS)などと呼ばれるものが挙げられる。 The microfluidic device of the present invention, include micro-fluidic devices, micro Fabry Kay Ted device, a lab-on-a-chip, or micro-Total Analytical Systems (μ-TAS) what is referred to as the It is. すなわちマイクロ流体デバイスは内部に微細な流路を有し、該流路内に流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を有する化学、生化学反応用の反応機器を指す。 That has a microfluidic device minute channels therein, mechanism for receiving the fluid temperature changes in the flow path, mechanisms density adjustment mechanism subject to chemical reaction, the flow rate of the flow, branch flow, mixing or mechanism receiving a control such as separation, or electrical, chemical having a mechanism such as that subjected to optical measurement, refers to a reaction apparatus for a biochemical reaction.

本発明のマイクロ流体デバイスの形状や寸法、及び流路断面の形状や寸法等は従来公知と同じ範囲であれば特に限定されるものではなく任意である。 Shape and size, and the flow path cross-sectional shapes and dimensions of the microfluidic device or the like of the present invention is arbitrary and not limited particularly as long as the same range as conventionally known. 例えば、本発明のマイクロ流体デバイスの形状としては、板状、シート状、フィルム状、ロール状、方形、円形、球形などが挙げられる。 For example, the shape of the microfluidic device of the present invention, plate-like, sheet, film, roll, square, circular, etc. spherical like. 該マイクロ流体デバイスの厚さも特に限定されないが、例えば、フロースルーPCRに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では温度をかける際の調節精度の観点から、ヒートブロック接触面と流路までを含めた部材の厚みを10μm〜5mmとすることが好ましく、10μm〜3mmとすることがより好ましい。 Without limitation the microfluidic thickness of the device in particular, for example, from a regulatory point of view accuracy in applying a temperature at a portion facing the heat block in the case of using the flow-through PCR, to heat block contact surface and the flow path it is preferable that the thickness of the member, including a 10Myuemu~5mm, and more preferably in the 10Myuemu~3mm. また、流路の形状は直線、ジグザグ、波型などが挙げられる。 The shape of the channel straight, zigzag, etc. corrugated and the like. 流路の断面の寸法は、例えば、フロースルーPCRに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では、熱伝導度及び反応液の位相速度の観点から0.25μm 〜9mm 程度であることが好ましく、さらに、1μm 〜1mm 程度であることがより好ましい。 It cross-sectional dimensions of the channel, for example, in the case of using the flow-through PCR in a portion facing the heat block is 0.25μm 2 ~9mm 2 approximately in terms of phase velocity of the thermal conductivity and the reaction solution is preferable, more preferably 1 [mu] m 2 ~ 1 mm 2 approximately. 断面形状は矩形、スリット状、台形、円形、半円形などが挙げられる。 Sectional shape rectangular, slit-shaped, trapezoidal, circular, semi-circular and the like.

(反応器を構成する材料) (Material constituting the reactor)
本発明の方法は反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器(以下、単に「反応器」と言うことがある)に対して有効であり、また酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたものであれば、接触面はもとより反応器の一部が活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料により構成されたものに対しても有効である。 The method of the present invention is effective for a reactor at least a portion of the contact surface between the reaction solution is constituted by an active energy ray curable resin (hereinafter, sometimes simply referred to as "reactor"), also as long as at least a part of the contact surface between the reactants of the enzymatic reaction is constituted by the active energy ray curable resin, the contact surface is part of a well reactor constructed of a material other than the active energy ray curable resin it is also effective against things. 活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料としては、活性エネルギー線硬化樹脂以外の樹脂、金属、ガラス、セラミックなど従来公知のものであれば任意のものが挙げられる。 As a material other than the active energy ray curable resin, the resin other than the active energy ray curable resin, metal, glass, any as long as ceramics such as conventionally known like. ただし、本発明に用いる反応器が微細な流路を有するマイクロ流体デバイスの場合、酵素反応の反応成分との接触面、すなわち流路は活性エネルギー線硬化樹脂を用いて構成されたものに効果的である。 However, if the reactor used in the present invention is a microfluidic device having a fine flow path, effective ones contact surface between the reactants of the enzymatic reaction, i.e. the channel is constructed with an active energy ray curable resin it is. 活性エネルギー線硬化樹脂を用いることによりフォトリソグラフィー技術を用いて流路を形成することができるため微細な溝や流路を容易に成形でき、手間やコストを省くことができ、また流路デザインも都度容易に変更可能な利点を有効に利用することができるようになる。 By using the active energy ray curable resin can be easily shaped fine grooves or flow channel it is possible to form a flow path by using a photolithography technique, it is possible to save time and cost, and also the flow channel design each time easily becomes possible to effectively use a mutable advantages.

(活性エネルギー線硬化樹脂) (Active energy ray curable resin)
本発明の方法が好ましく適用される活性エネルギー線硬化樹脂は、活性エネルギー線硬化性樹脂組成物を、重合開始剤の存在下、あるいは非存在下で活性エネルギー線により硬化して得られる。 Active energy ray curable resin method of the invention is preferably applied, the active energy ray curable resin composition, the presence of a polymerization initiator, or obtained by curing an active energy ray in the absence.
本発明で使用する活性エネルギー線硬化性樹脂組成物には、公知慣用の重合性モノマーを使用することができるが、なかでも、重合性基を2個以上有する多官能モノマーを使用することが好ましい。 The active energy ray curable resin composition used in the present invention may be used polymerizable monomers conventionally known, among others, it is preferable to use a polyfunctional monomer having a polymerizable group at least two . 重合性基としては、(メタ)アクリロイル基、ビニルオキシ基、エポキシ基、アクリルアミド基、マレイミド基等が挙げられるが、中でも、反応性の高い(メタ)アクリロイル基、ビニルオキシ基や、光重合開始剤の不存在下でも硬化するマレイミド基などが好ましい態様として挙げられる。 As the polymerizable group, (meth) acryloyl group, vinyloxy group, an epoxy group, an acrylamide group, a maleimide group, and the like, among others, high reactivity (meth) acryloyl group, or a vinyloxy group, a photopolymerization initiator maleimide groups which cure even in the absence thereof include preferred embodiments. 該重合性化合物は単独で、あるいは二種以上を混合して使用することができる。 Polymerizable compounds may be used alone or as a mixture of two or more. 活性エネルギー線硬化性の組成物には、光重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤などを添加してもよい。 The active energy ray curable composition, a photopolymerization initiator, a polymerization retarder, and the like polymerization inhibitor may be added.

(活性エネルギー線) (Active energy ray)
照射する活性エネルギー線としては、紫外線、可視光線、赤外線、レーザー光線、放射光などの光線や、エックス線、ガンマ線、放射線などの電離放射線や、電子線、イオンビーム、ベータ線、重粒子線などの粒子線が挙げられる。 The active energy ray to be irradiated, ultraviolet rays, visible light, infrared, laser, or light such as synchrotron radiation, X-rays, gamma rays, or ionizing radiation such as radiation, electron beam, ion beam, beta radiation, particles such as heavy ion line, and the like. これらの中でも、取り扱い性や硬化速度の面から紫外線及び可視光が好ましく、紫外線が特に好ましい。 Among these, ultraviolet rays and visible light are preferable from the viewpoint of handling properties and curing rate, ultraviolet rays are particularly preferable. 硬化速度を速め、硬化を完全に行う目的で、活性エネルギー線の照射を低酸素濃度雰囲気で行うことが好ましい。 Accelerate the curing rate, fully performing purposes curing, it is preferable to perform irradiation with active energy ray in a low oxygen concentration atmosphere. 低酸素濃度雰囲気としては、窒素気流中、二酸化炭素気流中、アルゴン気流中、真空又は減圧雰囲気中が好ましい。 The low oxygen concentration atmosphere, in a nitrogen stream, carbon dioxide gas stream, under argon, in a vacuum or reduced pressure atmosphere is preferable.

(核酸増幅阻害抑制成分) (Nucleic acid amplification inhibition inhibiting component)
本発明の発明者らは、核酸増幅反応の成分が反応器の活性エネルギー線硬化樹脂により構成された部分と接することにより、核酸増幅反応に阻害が起こり、核酸が増幅しない、あるいは企図しない非特異的増幅が起こるなどの問題が生じることを見出した。 The inventors of the present invention, by components of the nucleic acid amplification reaction is in contact with the structure portion by the reactor of the active energy ray curable resin, occur inhibit nucleic acid amplification reaction, the nucleic acid does not amplify or not intended nonspecific It found that amplification occurs such problems.
本発明において核酸増幅阻害抑制成分とは、反応器の活性エネルギー線硬化樹脂により構成された部分と核酸増幅反応成分が接することに起因する核酸増幅反応阻害を抑制することができる成分を指す。 The nucleic acid amplification inhibitor inhibiting component in the present invention refers to a component capable of inhibiting a nucleic acid amplification reaction inhibition caused by the reactor of the active energy ray portion and a nucleic acid amplification reaction component is constituted by the cured resin in contact. 具体的には、界面活性剤、ポリペプチド及び多価アルコールが挙げられる。 Specifically, surfactants, polypeptides and polyhydric alcohols.
既述したように、従来から核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、すなわち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として界面活性剤又はアルブミンを添加して核酸増幅を行う方法が知られていた。 As already mentioned, in order to omit the conventionally nucleic acid purification step, the biological sample directly from the left, i.e. the surfactant or albumin was added as a method to permit nucleic acid amplification in laden reaction contaminants method of performing nucleic acid amplification has been known. しかしながら、これは血液等の動物体液中の蛋白質や糖、色素などの生体試料に起因する酵素阻害因子を抑制するものであって、活性エネルギー線硬化樹脂に起因する阻害因子との関連性は全くなかった。 However, this is merely to inhibit the enzyme inhibitors due to biological samples such as proteins and sugars, dyes in an animal body fluid such as blood, associated with the inhibitor caused by the active energy ray curable resin is completely There was no. 従って、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器で酵素反応を行った場合に酵素阻害が起こることを連想させるものではなく、さらに、このような反応器で酵素反応を行った場合に、界面活性剤やアルブミンが活性エネルギー線硬化樹脂に起因する酵素阻害因子に対して抑制効果があることを連想させるものでもなかった。 Therefore, not reminiscent of the enzyme inhibition in the case of performing the enzymatic reaction in a reactor constituted by an active energy ray curable resin takes place, further, when performing enzymatic reactions in such reactors, the interface active agent or albumin did not have those reminiscent that could effectively inhibit the enzyme inhibitors due to the active energy ray curable resin.

該核酸増幅阻害抑制成分の反応器への加え方は、酵素反応の際に該核酸増幅阻害抑制成分が作用するタイミングで反応器に加えることができればその方法は特に制限されないが、通常は、反応液に先立って反応器に加えるか、反応液の後からであっても核酸増幅反応の開始前までに反応場に到達するよう反応器に加えるか、または、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えればよい。 Additionally way to the reactor of nucleic acid amplification inhibition suppressing component is the method is not particularly limited as long as it can be added to the reactor at a timing nucleic acid amplification inhibitor inhibiting component during the enzymatic reaction acts, usually, the reaction either added to the reactor prior to the liquid, either added to the reactor to reach the reaction field and before the start of the even also a nucleic acid amplification reaction from after the reaction solution, or in advance by mixing in advance the reaction liquid reaction it may be added to the reactor together with the liquid. ただし、たとえ核酸増幅反応の開始前までに反応器に加えたとしても、該核酸増幅阻害抑制成分が存在しない状態で、活性エネルギー線硬化樹脂と反応液が接触することは好ましくないため、反応液に先立って反応器に加えるか、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えることが好ましい。 However, even if added to the reactor before the start of the nucleic acid amplification reaction, in the absence of the nucleic acid amplification inhibitor suppressing component, for reaction with the active energy ray curable resin it is not preferable to contact the reaction solution either added to the reactor prior to, it is preferable to add to the reactor with pre-reaction solution in advance by mixing the reaction solution.

例えば、反応器がサンプルチューブ等のバッチ式の反応容器であれば、反応液を反応器に加える前、もしくは反応溶液を反応器に加えた後でも核酸増幅反応の開始前までに該核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加えるか、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えればよい。 For example, if the reactor is a reaction vessel of the batch type, such as a sample tube, prior to adding the reaction solution to the reactor, or the nucleic acid amplification inhibition before the start of the nucleic acid amplification reaction even after the addition of the reaction solution to the reactor or adding the reduction component to the reactor, may be added to the reactor with pre-reaction reaction leave mixed. また、反応器がマイクロ流体デバイスであれば、反応液に先立って流路に流すか、予め反応液と混合しておき、該反応液と共に流路に流せばよい。 Also, if the reactor is a microfluidic device, or flow in the flow path prior to the reaction solution, previously mixed with pre-reaction may be allowed to flow into the flow path together with the reaction solution.

(ポリペプチド) (Polypeptide)
本発明において核酸増幅反応阻害抑制成分として用いることができるポリペプチドとしては、アルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチンなどが挙げられ、このうちアルブミンが好ましく挙げられる。 The polypeptides that can be used as a nucleic acid amplification reaction inhibitory inhibiting component in the present invention, albumin, globulin, casein, gelatin and the like, these albumin may preferably be mentioned. さらにアルブミンとしては特にその種類は限定されないが、例えばウシ血清アルブミン(以下、「BSA」ということがある)やラクトアルブミンやヒト血清アルブミンなどが好ましいものとして挙げられる。 The type is not limited more particularly as albumin, such as bovine serum albumin are mentioned as such (hereinafter sometimes referred to as "BSA") or lactalbumin and human serum albumin are preferred. アルブミン含有率が高く、これを分解する酵素を含んでいないことから和光純薬社製「アルブミン プロテアーゼ不含(ウシ血清由来)」が好ましいものとして例示される。 High albumin content, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. "(derived from bovine serum) albumin protease free" because it does not contain enzymes that degrade this is exemplified as preferred.

ポリペプチドを予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれるポリペプチド濃度が少なくとも0.01質量%、好ましくは0.01質量%〜5質量%となるよう調整することが好ましい。 When added to the reactor together with the reaction mixture leave premixed with reaction polypeptides, polypeptide concentration of at least 0.01% by weight contained in the reaction solution, preferably from 0.01% to 5% by weight it is preferable to adjust so as to be.
また、ポリペプチドを反応液に先だって反応器に加える場合には、濃度が0.1質量%〜10質量%となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。 Further, when adding a polypeptide to a prior reactor to the reaction solution, the concentration is preferably used dissolved in a solvent so as to be 0.1 wt% to 10 wt%. 溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。 As the solvent, such as water or a buffer solution and the like, buffers as for example phosphate buffer, acetate buffer, Tris - hydrochloride and the like buffers. ポリペプチドを加える量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも0.01質量%、好ましくは0.01質量%〜5質量%となるよう調整することが好ましい。 The amount of addition of the polypeptide, the method, the amount of the reaction solution, the temperature, the concentration time also can not be said sweepingly because affected, which mixed with the reaction solution is added after the addition flow rate in the case of the microfluidic device There at least 0.01% by weight, preferably be adjusted to be 0.01 wt% to 5 wt%. また、更に、ポリペプチドは下記多価アルコールや下記界面活性剤と併用することも可能である。 Also, further, the polypeptide can be used in combination with the following polyhydric alcohols and the following surfactants.

(多価アルコール) (Polyhydric alcohol)
本発明において核酸増幅反応抑制成分として用いることができる多価アルコールとしては、グリセロール、エチレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられ、このうちグリセロールが好ましく挙げられる。 The polyhydric alcohols which can be used as a nucleic acid amplification reaction-inhibiting component in the present invention, glycerol, ethylene glycol, propane diol and the like, these glycerol may preferably be mentioned.

多価アルコールを予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれる多価アルコール濃度が少なくとも5質量%、さらに5質量%〜30質量%となるよう調整することが好ましく、10質量%〜20質量%となるよう調整することが最も好ましい。 When added to the reactor together with the leave premixed with reaction liquid polyhydric alcohol reaction, the polyhydric alcohol concentration of at least 5 wt% contained in the reaction solution, such an amount as to result in a 5% by mass to 30% is preferably adjusted, it is most preferable to adjust so as to be 10% to 20% by weight.
また、多価アルコールを反応液に先だって反応器に加える場合には、濃度が5質量%〜50質量%となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。 Further, when adding the polyhydric alcohol to the prior reactor to the reaction solution is preferably used dissolved in a solvent to a concentration of 5 wt% to 50 wt%. 溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。 As the solvent, such as water or a buffer solution and the like, buffers as for example phosphate buffer, acetate buffer, Tris - hydrochloride and the like buffers. 多価アルコールを加える量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも5質量%、好ましくは5質量%〜30質量%となるよう調整することが好ましく、さらに10質量%〜20質量%となるよう調整することがもっとも好ましい。 The amount of addition of polyhydric alcohol is its the method, the amount of the reaction solution, temperature, time also can not be said sweepingly because affected, which mixed with the reaction solution is added after the addition flow rate in the case of the microfluidic device concentration of at least 5 wt%, preferably preferably be adjusted to be 5% to 30% by weight, and most preferably adjusted such an amount as to result in a 10% to 20% by weight. また、更に、多価アルコールは上記ポリペプチドや下記界面活性剤と併用することも可能である。 Also, further, a polyhydric alcohol is also be used in combination with the polypeptide or following surfactant.

(界面活性剤) (Surfactant)
本発明において核酸増幅反応抑制成分として用いることができる界面活性剤としては特に限定されることなく挙げられるが、具体的にはノニオン界面活性剤(例えばポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル(IGEPAL CA−630)、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(Triton X−100)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポリ It is exemplified without particular limitation as a surfactant which can be used as a nucleic acid amplification reaction-inhibiting component in the present invention, specifically, nonionic surfactants (such as polyoxyethylene (9) octyl phenyl ether (IGEPAL CA -630), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton X-100), polyoxyethylene alkyl phenyl ethers such as polyoxyethylene nonyl phenyl ether, such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20), poly polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, and polyoxyethylene sorbitan trioleate poly オキシエチレンアルキルエステル類、例えばポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル(Brij 97)、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、例えばオクタノイル−N−メチルグルカミド、ノナノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド等のメチルグルカミド誘導体、例えばn−オクチル−β−D−グルコシド等のアルキル糖誘導体等)、 Polyoxyethylene alkyl esters such as polyoxyethylene (10) oleyl ether (Brij 97), polyoxyethylene (20) cetyl ether, polyoxyethylene (23) polyoxyethylene alkyl ethers such as lauryl ether, e.g. octanoyl -N - methyl glucamide, nonanoyl -N- methyl glucamide, decanoyl -N- methyl glucamide derivatives such as methyl glucamides, for example, n- alkyl sugar derivatives such as octyl-beta-D-glucoside, etc.),
アニオン界面活性剤(例えばラウリルベンゼンスルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンドデシルサルフェイト(Tris DS)等)、 Anionic surfactants (such as lauryl benzenesulfonic acid, deoxycholic acid, cholic acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane dodecyl Sulfate (Tris DS), etc.),
カチオン界面活性剤(例えばオクタデシルアミン酢酸塩,テトラデシルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩、ラウリルアミン酢酸塩、ラウリルジエタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、メチル硫酸アリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム等の第4級アンモニウム塩、例えば塩化ラウリルピリジニウム、塩化ステアリルアミドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等)、 Cationic surfactants (e.g. octadecylamine acetate, tetradecylamine acetate, stearylamine acetate, laurylamine acetate, alkylamine salts such as lauryl diethanolamine acetate, for example octadecyl trimethyl ammonium chloride, dodecyl trimethyl ammonium chloride, cetyl chloride trimethylammonium, cetyltrimethylammonium bromide, allyltrimethylammonium methylsulfate, benzalkonium chloride, tetradecyl dimethyl benzyl ammonium chloride, octadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride, quaternary ammonium salts such as chloride lauryl dimethyl benzyl ammonium, such as lauryl pyridinium chloride alkyl pyridinium salts such as chloride stearyl amide methylpyridinium, etc.),
両性界面活性剤(例えば3−[(3−コラミドアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネイト、3−[(3−コラミドアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネイト等)、 Amphoteric surfactants (e.g., 3 - [(3-Kola bromide amidopropyl) dimethyl ammonio] -1-propanesulfonate Nate, 3 - [(3-Kola bromide amidopropyl) dimethyl ammonio] -2-hydroxy-1- propanesulfonate Nate etc.),
天然の界面活性剤(例えばサポニン(大豆由来)、ジギトニン等) Natural surfactants (e.g., saponin (derived from soybean), digitonin, etc.)
などの界面活性剤が挙げられるが、反応時の酵素等への影響を考慮すると、中でもノニオン界面活性剤が好ましく挙げられる。 It includes surfactants such as, but considering the influence of the enzyme or the like during the reaction, among others nonionic surfactants are preferred. これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いても何れでもよい。 These may be used alone, it may be either be used in combination.

界面活性剤を予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれる界面活性剤濃度が少なくとも5質量%以上、好ましくは5質量%〜25質量%となるよう調整することが望ましい。 When added with a surfactant in advance reaction solution mixture to leave the reaction mixture to the reactor, the surfactant concentration in the reaction solution is at least 5 wt% or more, preferably a 5 to 25 mass% so as it is desirable to adjust.
また、界面活性剤を反応液に先だって反応器に加える場合は、別途適当な濃度となるように溶媒に溶解して用いる。 Also, when added to the prior reactor surfactant to the reaction solution, used by dissolving in a solvent so as to separate the appropriate concentration. すなわち、加える界面活性剤の濃度及び量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも5質量%、好ましくは5質量%〜25質量%となるよう調整することが望ましい。 That is, the concentration and amount of the surfactant added is its method, the amount of the reaction solution, the temperature, can not be said sweepingly because also affected by the addition flow rate in the case of the microfluidic device is added later the reaction mixture intermingled at that concentration of at least 5 wt%, it is desirable that preferably adjusted to be 5 to 25 mass%. 溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。 As the solvent, such as water or a buffer solution and the like, buffers as for example phosphate buffer, acetate buffer, Tris - hydrochloride and the like buffers. また、更に、界面活性剤は上記ポリペプチドや上記多価アルコールと併用することも可能である。 Also, further, the surfactant can be used in combination with the polypeptide or the polyhydric alcohol.

(核酸(テンプレート)) (Nucleic acid (template))
本発明の核酸増幅反応においてテンプレートとして用いる核酸としては、生体由来試料(動物由来(皮膚、毛髪、唾液、血液、尿、糞)、植物由来試料(根、茎、葉、種、果肉、花))および環境試料(土、水、空気)から抽出・精製されたもの、およびそれらをPCR法等にて一旦増幅したものを使用することが可能である。 Nucleic acids used as a template in a nucleic acid amplification reaction of the present invention, biological samples (animal (skin, hair, saliva, blood, urine, feces), plant-derived samples (roots, stems, leaves, seeds, fruit, flowers) ) and environmental samples (soil which water was extracted and purified from the air), and they are capable to be used after once amplified by PCR or the like.

(核酸(テンプレート)の精製方法) (Purification methods of nucleic acid (template))
増幅しようとする核酸が夾雑物を多く含む生体由来試料等中に存在する場合には、増幅反応に先立って、混在する夾雑物の除去を目的とした核酸精製処理を行う必要がある。 Where the nucleic acid to be amplified is present in a biological sample or the like containing a large amount of contaminants, prior to the amplification reaction, it is necessary to perform a nucleic acid purification treatment for removal of the mixture to contaminants. 具体的な精製方法としては、公知の方法がいずれも使用でき、例えば、フェノール/クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿法が挙げられる。 Specific purification methods can be used any known methods, for example, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation method. 更にイオン交換樹脂、ガラスビーズ等を使用したカラム、ガラスフィルターあるいはタンパク質凝集作用を有する試薬を使用して精製度を上げることができる。 Can be increased further ion exchange resins, column using glass beads, the purity using reagents with a glass filter or protein agglomeration. より夾雑物濃度を低減するため、複数の方法を同時にまたは順次行うことができる。 To reduce the more contaminants concentration, or a plurality of ways at the same time can be carried out sequentially.

また、いわゆるPCR法等の核酸増幅法により既に増幅した核酸や、合成した核酸を使用する場合は、上記のような試料由来の夾雑物がない、若しくは非常に少ないので上記の精製処理を必ずしも行う必要がないこともある。 Moreover, and nucleic acids that have already been amplified by a nucleic acid amplification method of the so-called PCR method, when using a synthesized nucleic acid are not necessarily perform the above purification treatment is not contaminants from the sample as described above, or so very little sometimes there is no need.

(核酸(テンプレート)の精製度) (Degree of purification of nucleic acid (template))
いずれの試料の場合にも代表的な夾雑物としてはタンパク質が挙げられ、本発明の核酸増幅反応に供する反応液中に含まれる夾雑物が、タンパク質濃度を測定した場合に0.5mg/ml以下に抑制されていることが好ましい。 Include proteins Typical contaminants in the case of any sample, impurities contained in the reaction solution to be subjected to nucleic acid amplification reaction of the present invention, when measuring protein concentration 0.5 mg / ml or less which is preferably suppressed to. ただし、本発明に用いる核酸増幅阻害抑制成分がポリペプチドの場合には、該ポリペプチド自身もタンパク質であるので、ポリペプチドのみを除いた反応液中、又はポリペプチドのみを添加する前の反応液中におけるタンパク質濃度が0.5mg/ml以下に抑制されていることが好ましい。 However, if the nucleic acid amplification inhibitor inhibiting component for use in the present invention is a polypeptide, since it is the polypeptide itself proteins, the reaction solution excluding the only polypeptide, or the reaction solution prior to the addition of only polypeptide it is preferred that the protein concentration is reduced to below 0.5 mg / ml in the medium.

尚、本発明中で示されているタンパク質濃度は、Bradford色素結合法に基づく方法(日本バイオラッドラボラトリーズ社製Bio−Rad Protein Assay使用)により算出した。 Incidentally, the protein concentration indicated in the present invention was calculated by the method (Nippon Bio-Rad Laboratories, Inc. Bio-Rad Protein Assay used) based on the Bradford dye binding method.

(核酸増幅反応) (Nucleic acid amplification reaction)
本発明の核酸増幅反応としては、PCR法あるいはその変法、転写や逆転写を利用する増幅法など原理の異なる他の各種核酸増幅法など酵素を使った公知慣用のいずれの核酸増幅反応であっても良い。 The nucleic acid amplification reaction of the present invention, there by PCR or variations thereof, any nucleic acid amplification reaction conventionally known using an enzyme such as different other various nucleic acid amplification methods of principles such as amplification method utilizing transcription and reverse transcription and it may be. 例えば、核酸(テンプレート)、プライマー、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸及び緩衝液を用いた通常のPCR法の他に、Nested PCR法、インバースPCR法、AP−PCR法、RACE法、degenerate PCR法などの各種PCRの応用法や、LAMP法、ICAN法、LCR法、gapLCR法、SDA法、Qβ replicase amplification法、TAS法、3SR法、NASBA法、TMA法等が挙げられる。 For example, a nucleic acid (template), a primer, a polymerase, in addition to the conventional PCR method using deoxynucleotide triphosphates and buffer, Nested PCR method, inverse PCR method, AP-PCR method, RACE method, degenerate PCR method, etc. application method and the various PCR, LAMP method, ICAN method, LCR method, GapLCR method, SDA method, Q [beta] replicase Amplification method, TAS method, 3SR method, NASBA method, TMA method.

本発明の核酸増幅反応は、常法に従って行えばよい。 Nucleic acid amplification reaction of the present invention may be carried out according to a conventional method. 例えば、サンプルチューブ等のバッチ式の反応容器を用いたPCR法であれば、該反応容器に反応液を加え2又は3段階の設定温度に各々所望の時間だけ維持するサイクルを繰り返せばよい。 For example, if the PCR method using a reaction vessel of the batch type, such as a sample tube, may be repeated cycles of maintaining each desired time only to the set temperature of 2 or 3-step reaction mixture was added to the reaction vessel. また例えば、マイクロ流体デバイスを反応容器として用いたPCR法であれば、各設定温度に調節し、適切に配置されたヒートブロック群にデバイスを密着させ、該デバイスの流路に反応液を流し、反応液の温度が所望の温度履歴を受けるようにすればよい。 Further, for example, if the PCR method using the microfluidic device as the reaction vessel was adjusted to the set temperature, suitably brought into close contact with the device arranged heat block set, flowing the reaction solution in the flow path of the device, temperature of the reaction solution may be to receive a desired temperature history.

(作製例1) (Preparation Example 1)
(マイクロ流体デバイス1の作製) (Preparation of the microfluidic device 1)
以下の操作によりマイクロ流体デバイスを作製した。 To prepare a microfluidic device by the following procedures. その断面模式図を図2に示す。 The cross-sectional schematic view shown in FIG. 上面からの外観は図1を参照。 Appearance from upper surface reference to FIG.

[活性エネルギー線硬化性組成物(i)の調製] [Preparation of active energy ray curable composition (i)]
平均分子量2000の3官能ウレタンアクリレートオリゴマー(大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックV−4263」)80質量部、及び1,6−ヘキサンジオールジアクリレート(第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアHDDA」)を20質量部、光重合開始剤として1−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン(チバ・スペシャリティ・ケミカルズ社製の「イルガキュア184」)5質量部を均一に混合して組成物(i)を調製した。 Mean trifunctional urethane acrylate oligomer having a molecular weight of 2000 (manufactured by Dainippon Ink and Chemicals, Inc. of "UNIDIC V-4263") 80 parts by weight, and 1,6-hexanediol diacrylate (manufactured by Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co. Ltd. " New Frontier HDDA ") and 20 parts by weight of 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone as a photopolymerization initiator (manufactured by Ciba Specialty Chemicals of" Irgacure 184 ") 5 parts by mass of uniformly mixed to composition (i) It was prepared.

[活性エネルギー線硬化性組成物(ii)の調製] [Preparation of active energy ray curable composition (ii)]
活性エネルギー線硬化性化合物として、「ユニディックV−4263」を60質量部、「ニューフロンティアHDDA」40質量部、光重合開始剤として「イルガキュア184」5質量部、及び重合遅延剤として2,4−ジフェニル−4−メチル−1−ペンテン(関東化学株式会社製)0.5質量部を均一に混合して組成物(ii)を調製した。 As the active energy ray-curable compound, a "UNIDIC V-4263" 60 parts by weight, "New Frontier HDDA" 40 parts by weight, "Irgacure 184" 5 parts by weight photoinitiator, and a polymerization retarder 2,4 - diphenyl-4-methyl-1-pentene (Kanto Chemical Co., Ltd.) were uniformly mixed and composition 0.5 parts by weight of (ii) was prepared.

[塗膜層の形成] [Formation of coating layer]
下基材(7)としてポリアクリレート製の板(12cm×3cm×1mm;三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」)を用い、これに2000rpm、50秒間条件のスピンコーターにて組成物(i)を塗布した。 Shitamotozai (7) as a polyacrylate plate made of; using (12cm × 3 cm × 1 mm manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd. "ACRYLITE L 000 No."), which in 2000 rpm, the composition with a spin coater for 50 seconds conditions ( i) was applied. 下記紫外線ランプ1により紫外線を3秒照射してこれを半硬化させ、厚さ10μmの塗膜(8)を形成した。 By ultraviolet irradiation for 3 seconds by following ultraviolet lamp 1 is semi-cured it to form a coating film (8) having a thickness of 10 [mu] m.

[凹部(流路)の形成] [Formation of recesses (flow path)
塗膜(8)の上に、500rpm、30秒間のスピンコーターにて組成物(ii)を塗工し、該組成物(ii)の未硬化塗膜を形成した。 On the coating film (8), and applying the composition (ii) with a spin coater 500 rpm, 30 seconds to form an uncured coating film of the composition (ii). 流路形成部を黒色で描画したフォトマスクを通して下記紫外線ランプ2による紫外線照射を120秒間行い、組成物(ii)からなる厚さ80μmの半硬化塗膜(9)を形成した。 The ultraviolet irradiation by following ultraviolet lamp 2 is performed for 120 seconds the flow path forming portion through a photomask drawn in black, to form a semi-cured coating film having a thickness of 80μm of the composition (ii) (9). 非照射部分の未硬化の組成物(ii)をエタノールで除去して、塗膜(8)が底面に露出した幅200μmの凹部状の塗膜(9)を形成した。 Uncured composition of the non-irradiated portions (ii) was removed with ethanol, the coating film (8) has a recess-like coating of width 200μm exposed on the bottom (9).

[蓋の固着] [Fixed lid]
組成物(i)を、一時的な支持体である12cm×5cm×30μmのポリプロピレンフィルム(二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」FOR 30番」)のコロナ放電処理された面上に、127μmのバーコーターにて塗工した。 Composition (i), was corona discharge treated polypropylene film of 12cm × 5cm × 30μm it is a temporary support (Futamura Chemical Industries, Ltd., "biaxially oriented polypropylene film" Taiko "FOR 30 No.") surface above, it was applied by a bar coater of 127μm. 該組成物(i)の未硬化塗膜に、紫外線ランプ1により紫外線を3秒照射し、半硬化塗膜(10)を形成した。 Uncured coating of the composition (i), ultraviolet rays are irradiated for 3 seconds by an ultraviolet lamp 1, to form a semi-cured coating film (10). これを蓋として前記凹部状塗膜(9)に張り合わせ、紫外線ランプ1により、紫外線を40秒間照射して完全に硬化させ、流路(11)を形成した。 This bonded to the recessed coating as a lid (9), the ultraviolet lamp 1, the ultraviolet ray was irradiated for 40 seconds was completely cured, to form a flow path (11). その後、不要となったポリプロピレンフィルムを剥離し、除去した。 Thereafter, peeling off the polypropylene film which has become unnecessary to remove.

[開口部の形成] Formation of the openings'
この後、前記工程において凹部に張り合わせ完全に硬化した塗膜(10)上に組成物(i)を塗布して塗膜(12)を形成し、さらにその上に上基材(13)として、下基材(7)と同じポリアクリレート製の板(三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」)を重ね合わせ、紫外線ランプ1により塗膜全面に紫外線を40秒間照射し、塗膜(12)を硬化させた。 Thereafter, the process by applying the composition (i) on the coating film (10) complete curing bonded into the recess to form a coating film (12), examples Uemotozai (13) thereon addition, superposed Shitamotozai (7) and the same polyacrylate made plate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd. "ACRYLITE L 000 No."), the ultraviolet radiation 40 seconds coating the entire surface by the ultraviolet lamp 1, the paint film (12 ) was cured. これにより塗膜(10)上に塗膜(12)および上基板(13)が接着一体化された。 Thus coating on the coating film (10) (12) and the upper substrate (13) is bonded and integrated.

次いで、上基板(13)、塗膜(12)および塗膜(10)を通過し流路(11)に通じる直径1mmの孔を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら2つの孔にそれぞれ内径3mm、高さ5mmのポリ塩化ビニル管を接着して開口部(5)(6)とした。 Then, the upper substrate (13), a coating (12) and coating (10) and passed through the flow path (11) communicating diameter 1mm holes, formed on both ends of the channel by using a drill, further these two holes each inner diameter 3 mm, and the opening by bonding a polyvinyl chloride tube height 5mm (5) (6).

[紫外線ランプ1照射条件] [Ultraviolet lamp 1 irradiation conditions]
3000Wメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のUE031−353CHC型UV照射装置を用い、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。 Using UE031-353CHC type UV irradiation apparatus by Eye Graphics Co., Ltd. to a 3000W metal halide lamp as a light source, ultraviolet intensity at 365nm was irradiated with ultraviolet rays of 40 mW / cm 2 at room temperature, in a nitrogen atmosphere.

[紫外線ランプ2照射条件] [Ultraviolet lamp 2 irradiation conditions]
250W高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト250Wシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、365nmにおける紫外線強度が50mW/cm の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。 Using a multi-light 250W series exposure apparatus light source unit manufactured by Ushio Inc. as a light source a 250W high pressure mercury lamp, an ultraviolet intensity at 365nm was irradiated with ultraviolet rays of 50 mW / cm 2 at room temperature, in a nitrogen atmosphere.

(作製例2) (Preparation Example 2)
(マイクロ流体デバイス2の作製) (Preparation of the microfluidic device 2)
1,6−ヘキサンジオールジアクリレートの変わりにノニルフェノキシポリエチレングリコールアクリレート(第一工業製薬株式会社製の「N−177E」)を使用した以外は作製例1と同様の方法にてマイクロ流体デバイスを作製した。 Manufactured microfluidic device by the same method except for using nonylphenoxy polyethylene glycol acrylate (manufactured by Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. of "N-177E") instead of 1,6-hexanediol diacrylate as Preparation Example 1 did.

(調製例1) (Preparation Example 1)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) Preparation of solution)
DNAポリメラーゼとしてジーンタック(株式会社ニッポンジーン製)を使用し、PCR用緩衝液、dNTP混合液は該酵素に添付のものを使用した(以下同様)。 Using the Gene Tac (manufactured by Nippon Gene) as a DNA polymerase, PCR buffer, dNTPs mixture was used for attachment to the enzyme, and so forth.
10μlのPCR用緩衝液(10倍濃縮)、8μlのdNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各2.5mM)、5μlのプライマー(1)(primer (1))(10μM;配列番号1)、5μlのプライマー(2)(primer (2))(10μM;配列番号2)、0.5μlのジーンタック(5ユニット/μl)、テンプレートとして1μlのras Mutant Set c−Ki−ras codon12 Gly(1ng;タカラバイオ株式会社製;配列番号3)、さらに滅菌水を加えて100μlとし、核酸増幅反応液(1)を調製した。 PCR buffer of 10 [mu] l (10-fold concentrated), dNTPs mixture 8μl (dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 2.5 mM), 5 [mu] l of primer (1) (primer (1)) (10μM; SEQ ID NO: 1) , 5 [mu] l of primer (2) (primer (2)) (10μM; SEQ ID NO: 2), 0.5 [mu] l of Gene tack (5 units / [mu] l), of 1μl as templates ras Mutant Set c-Ki-ras codon12 Gly (1ng ; manufactured by Takara Bio Inc., SEQ ID NO: 3), and 100μl added further sterilized water, nucleic acid amplification reaction solution (1) was prepared. なお、前記ras Mutant Set c−Ki−ras codon12 Gly(1ng;タカラバイオ株式会社製;配列番号3)のタンパク質濃度を後述の参考例2により測定したところ0.0mg/mlであった。 Incidentally, the ras Mutant Set c-Ki-ras codon12 Gly was 0.0 mg / ml was measured for protein concentration (1 ng; SEQ ID NO: 3; manufactured by Takara Bio Inc.) by Reference Example 2 described later.

(調製例2) (Preparation Example 2)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/グリセロール) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution of Preparation / glycerol)
調製例1と同様の方法で核酸増幅反応液(2)を準備した。 It was prepared nucleic acid amplification reaction solution (2) in the same manner as in Preparation Example 1. ただし、反応液中にグリセロールを20質量%となるように添加した。 However, glycerol was added so that 20 wt% in the reaction mixture.
(調製例3) (Preparation Example 3)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/Triton X−100) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution of Preparation / Triton X-100)
まず初めに、界面活性剤としてポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「Triton X−100」)に水を加え25質量%の界面活性剤含有水溶液を調製した。 First, was prepared a polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (ICN Co., "Triton X-100") in water was added 25 wt% surfactant-containing aqueous solution as a surfactant.
次に、4μlのPCR用緩衝液(10倍濃縮)、3.2μlのdNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各2.5mM)、2μlのプライマー(3)(primer (3))(10μM;配列番号4)、2μlのプライマー(4)(primer (4))(10μM;配列番号5)、0.2μlのジーンタック(5ユニット/μl)、テンプレートとして1μlのras Mutant Set c−Ki−ras codon12 Gly(1ng;タカラバイオ株式会社製;配列番号3)、8μlの前記界面活性剤含有水溶液を混合し、さらに滅菌水を加えて全体を40μlとし、核酸増幅反応液(3)を調製した。 Then, 4 [mu] l of PCR buffer (10 fold concentrated), dNTPs mixture 3.2μl (dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 2.5 mM), 2 [mu] l of primer (3) (primer (3)) (10μM ; SEQ ID NO: 4), 2 [mu] l of primer (4) (primer (4)) (10 [mu] M; SEQ ID NO: 5), Gene Tac (5 units / [mu] l of 0.2 [mu] l), 1 [mu] l of ras Mutant Set c-Ki- as template ras codon 12 Gly (1 ng; manufactured by Takara Bio Inc., SEQ ID NO: 3) was mixed with the surfactant-containing aqueous solution of 8 [mu] l, the entirety is taken as 40μl added further sterilized water, nucleic acid amplification reaction solution (3) was prepared .
(調製例4) (Preparation Example 4)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/Tween 20) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution of Preparation / Tween 20)
界面活性剤ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「Triton X−100」)の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ICN社製の「Tween 20」)を用いた以外は調製例3と同様の方法で核酸増幅反応液(4)を準備した。 Prepared except for using a surface active agent polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (ICN Co., "Triton X-100") instead of polyoxyethylene sorbitan monolaurate (ICN Co., "Tween 20") is It was prepared nucleic acid amplification reaction solution (4) in the same manner as in example 3.
(調製例5) (Preparation Example 5)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/Tween 80) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution of Preparation / Tween 80)
界面活性剤ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「Triton X−100」)の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ICN社製の「Tween 80」)を用いた以外は調製例3と同様の方法で核酸増幅反応液(5)を準備した。 Prepared except for using a surface active agent polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (ICN Co., "Triton X-100") polyoxyethylene sorbitan monooleate instead of (ICN Co., "Tween 80") is It was prepared nucleic acid amplification reaction solution (5) in the same manner as in example 3.
(調製例6) (Preparation Example 6)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/Brij 97) (Preparation of a nucleic acid amplification reaction (PCR) was / Brij 97)
界面活性剤ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「Triton X−100」)の代わりにポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル(SIGMA社製の「Brij 97」)を用いた以外は調製例3と同様の方法で核酸増幅反応液(6)を準備した。 Surfactant polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (ICN Co., "Triton X-100") instead of polyoxyethylene (10) oleyl ether (SIGMA Co. "Brij 97") other than using the It was prepared nucleic acid amplification reaction solution (6) in the same manner as in preparation example 3.
(調製例7) (Preparation Example 7)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製/IGEPAL CA−630) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution of Preparation / IGEPAL CA-630)
界面活性剤ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「Triton X−100」)の代わりにポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル(ICN社製の「IGEPAL CA−630」)を用いた以外は調製例3と同様の方法で核酸増幅反応液(7)を準備した。 Use instead of polyoxyethylene (9) octyl phenyl ether (ICN Co., "IGEPAL CA-630") of the surfactant polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (ICN Co., "Triton X-100") except that had had providing a nucleic acid amplification reaction (7) in the same manner as in preparation example 3.
(調製例8) (Preparation Example 8)
(核酸増幅反応(Cell direct PCR)液の調製/Tween 80) (Nucleic acid amplification reaction (Cell direct PCR) solution of Preparation / Tween 80)
調製例5と同様の方法で核酸増幅反応液(8)を準備した。 It was prepared nucleic acid amplification reaction solution (8) in the same manner as in Preparation Example 5. ただし、ras Mutant Set c−Ki−ras codon12 Glyの代わりに5μlの細胞懸濁液を用いた。 However, with 5μl of cell suspension instead of the ras Mutant Set c-Ki-ras codon12 Gly. 細胞懸濁液は頬の内側から掻き取ったヒト頬粘膜細胞を蒸留水で洗浄し遠心分離で回収した後、再び蒸留水に懸濁して調製した。 After the cell suspension is recovered by washing centrifuged human buccal mucosa cells scraped from the inside of the cheek with distilled water, was prepared and suspended in distilled water again. なお、前記細胞懸濁液のタンパク質濃度を後述の参考例2により測定したところ1.0mg/mlであった。 Incidentally, was 1.0 mg / ml at a protein concentration of the cell suspension was determined by Reference Example 2 described later.
(調製例9) (Preparation Example 9)
(核酸増幅反応(PCR)液の調製) (Nucleic acid amplification reaction (PCR) Preparation of solution)
プライマー(1)(primer (1))(10μM;配列番号1)、及びプライマー(2)(primer (2))(10μM;配列番号2)の代わりにプライマー(3)(primer (3))(10μM;配列番号4)、及びプライマー(4)(primer (4))(10μM;配列番号5)を用いた以外は調製例1と同様の方法で核酸増幅反応液(9)を準備した。 Primer (1) (primer (1)) (10 [mu] M; SEQ ID NO: 1), and primers (2) (primer (2)); primer (3) instead of (10 [mu] M SEQ ID NO: 2) (primer (3)) ( 10 [mu] M; SEQ ID NO: 4), and primer (4) (primer (4)) (10 [mu] M; were prepared SEQ ID NO: 5) nucleic acid amplification reaction in the same manner as in preparation example 1 except for using (9).

(実施例1) (Example 1)
(マイクロ流体デバイス1/BSA前処理/PCR) (Microfluidic device 1 / BSA pretreatment / PCR)
作製例1で作製したマイクロ流体デバイスの流路に5質量%のBSA水溶液を満たし、約1時間室温に放置した。 The flow path of the microfluidic device prepared in Preparation Example 1 satisfies the 5 wt% of the BSA solution and allowed to stand for about 1 hour at room temperature. その後、流路に水を2ml流して洗浄した。 Thereafter, water washing by flowing 2ml the flow path.
このBSA前処理デバイスを3つのヒートブロックから成るヒーター上に、図1に示す位置に固定した。 The BSA pretreatment device on a heater of three heat block was fixed in the position shown in FIG. ヒートブロック(A)を90℃、ヒートブロック(B)を72℃、ヒートブロック(C)を55℃に設定した。 Heat block (A) 90 ℃, heat block and (B) 72 ℃, and set the heat block (C) to 55 ° C..
調製例1で調製した核酸増幅反応液(1)25μlをデバイスの開口部(入口)に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ(kdScientific社製 IC3200)を接続し、5μl/分にて送液した。 Nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 1 (1) 25 [mu] l was injected into the opening of the device (inlet), and further connected to a micro syringe pump (KdScientific Co. IC3200) in opening, feeding at 5 [mu] l / min It was liquid. これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック(A)、(B)、(C)、(B)、(A)、(B)、(C)・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。 Thus, the nucleic acid amplification reaction solution heat block (A), (B), (C), (B), (A), (B), it passes over the order of (C) · · ·, enzymatic reaction nucleic acid amplification occurred in the process.
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。 Result of the reaction was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid has been amplified. 目的とするバンドが検出され(図3)、よって該マイクロ流体デバイスを用いた核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 It detected a band of interest (Figure 3), thus the nucleic acid amplification reaction using the microfluidic device is proceeding normally was confirmed.

(実施例2) (Example 2)
(マイクロ流体デバイス2/グリセロール添加/PCR) (Microfluidic device 2 / glycerol added / PCR)
作製例2で作製したマイクロ流体デバイス2を3つの金属ブロックから成るヒーター上に、図1に示す位置に固定した。 On the heater comprising a microfluidic device 2 produced in Production Example 2 of three metal blocks were fixed in the position shown in FIG. ヒートブロック(A)を90℃、ヒートブロック(B)を72℃、ヒートブロック(C)を55℃に設定した。 Heat block (A) 90 ℃, heat block and (B) 72 ℃, and set the heat block (C) to 55 ° C..
調製例2で調製した核酸増幅反応液(2)25μlをデバイスの開口部(入口)に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ(kdScientific社製 IC3200)を接続し、5μl/分にて送液した。 Nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 2 (2) 25 [mu] l was injected into the opening of the device (inlet), and further connected to a micro syringe pump (KdScientific Co. IC3200) in opening, feeding at 5 [mu] l / min It was liquid. これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック(A)、(B)、(C)、(B)、(A)、(B)、(C)・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。 Thus, the nucleic acid amplification reaction solution heat block (A), (B), (C), (B), (A), (B), it passes over the order of (C) · · ·, enzymatic reaction nucleic acid amplification occurred in the process.
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。 Result of the reaction was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid has been amplified. 目的とするバンドが検出され(図4)、よって該マイクロ流体デバイスを用いた核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 It detected a band of interest (Fig. 4), thus the nucleic acid amplification reaction using the microfluidic device is proceeding normally was confirmed.

(実施例3) (Example 3)
(マイクロ流体デバイス1/Triton X−100/PCR) (Microfluidic device 1 / Triton X-100 / PCR)
作製例1で作製したマイクロ流体デバイス1を3つのヒートブロックから成るヒーター上に、図1に示す位置に固定した。 On the heater comprising a microfluidic device 1 prepared in Preparation Example 1 of three heat block was fixed in the position shown in FIG. ヒートブロック(A)を90℃、ヒートブロック(B)を72℃、ヒートブロック(C)を55℃に設定した。 Heat block (A) 90 ℃, heat block and (B) 72 ℃, and set the heat block (C) to 55 ° C..
調製例3で調製した核酸増幅反応液(3)40μlをデバイスの開口部(入口)に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ(kdScientific社製 IC3200)を接続し、5μl/分にて送液した。 Nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 3 (3) 40 [mu] l was injected into the opening of the device (inlet), and further connected to a micro syringe pump (KdScientific Co. IC3200) in opening, feeding at 5 [mu] l / min It was liquid. これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック(A)、(B)、(C)、(B)、(A)、(B)、(C)・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。 Thus, the nucleic acid amplification reaction solution heat block (A), (B), (C), (B), (A), (B), it passes over the order of (C) · · ·, enzymatic reaction nucleic acid amplification occurred in the process.
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。 Result of the reaction was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid has been amplified. 目的とするバンドが検出され(図5)、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 Band of interest is detected (Fig. 5), that the nucleic acid amplification reaction has proceeded normally was confirmed.
(実施例4) (Example 4)
(マイクロ流体デバイス1/Tween 20/PCR) (Microfluidic device 1 / Tween 20 / PCR)
実施例3と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Example 3. ただし、核酸増幅反応液は調製例4で調製した核酸増幅反応液(4)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 4 (4). その結果、目的とするバンドが検出され(図6)、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 As a result, the detection band of interest (Fig. 6), that the nucleic acid amplification reaction has proceeded normally was confirmed.
(実施例5) (Example 5)
(マイクロ流体デバイス1/Tween 80/PCR) (Microfluidic device 1 / Tween 80 / PCR)
実施例3と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Example 3. ただし、核酸増幅反応液は調製例5で調製した核酸増幅反応液(5)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 5 (5). その結果、目的とするバンドが検出され(図7)、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 As a result, the detection band of interest (Fig. 7), it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction has proceeded normally.
(実施例6) (Example 6)
(マイクロ流体デバイス1/Brij 97/PCR) (Microfluidic device 1 / Brij 97 / PCR)
実施例3と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Example 3. ただし、核酸増幅反応液は調製例6で調製した核酸増幅反応液(6)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 6 (6). その結果、目的とするバンドが検出され(図8)、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 As a result, bands were detected (FIG. 8) of interest, it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction has proceeded normally.
(実施例7) (Example 7)
(マイクロ流体デバイス1/IGEPAL CA−630/PCR) (Microfluidic device 1 / IGEPAL CA-630 / PCR)
実施例3と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Example 3. ただし、核酸増幅反応液は調製例7で調製した核酸増幅反応液(7)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 7 (7). その結果、目的とするバンドが検出され(図9)、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。 As a result, the detection band of interest (Fig. 9), it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction has proceeded normally.

(比較例1) (Comparative Example 1)
(マイクロ流体デバイス1/酵素阻害抑制成分未処理/PCR) (Microfluidic device 1 / enzyme inhibitor suppressing component raw / PCR)
作製例1で作製したマイクロ流体デバイス1を3つのヒートブロックから成るヒーター上に、図1に示す位置に固定した。 On the heater comprising a microfluidic device 1 prepared in Preparation Example 1 of three heat block was fixed in the position shown in FIG. ヒートブロック(A)を90℃、ヒートブロック(B)を72℃、ヒートブロック(C)を55℃に設定した。 Heat block (A) 90 ℃, heat block and (B) 72 ℃, and set the heat block (C) to 55 ° C..
調製例1で調製した核酸増幅反応液(1)25μlをデバイスの開口部(入口)に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ(kdScientific社製 IC3200)を接続し、5μl/分にて送液した。 Nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 1 (1) 25 [mu] l was injected into the opening of the device (inlet), and further connected to a micro syringe pump (KdScientific Co. IC3200) in opening, feeding at 5 [mu] l / min It was liquid. これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック(A)、(B)、(C)、(B)、(A)、(B)、(C)・・・という順序でその上を通過した。 Thus, the nucleic acid amplification reaction solution heat block (A), passes over the at (B), (C), (B), the order of (A), (B), (C) ···.
反応の結果、核酸が増幅されたか否かを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって調べた。 Result of the reaction, whether the nucleic acid was amplified was examined by agarose gel electrophoresis in a conventional manner. バンドは全く検出されず(図10)、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。 Not at all detected bands (FIG. 10), it was found that the nucleic acid amplification reaction did not proceed.

(比較例2) (Comparative Example 2)
(マイクロ流体デバイス2/酵素阻害抑制成分未処理/PCR) (Microfluidic device 2 / enzyme inhibitor suppressing component raw / PCR)
作製例2で作製したマイクロ流体デバイス2と調製例1で調整した核酸増幅反応液(1)25μlとを用い、比較例1と同様の方法にてPCR及びその結果解析を行った。 Using a nucleic acid amplification reaction solution prepared in the microfluidic device 2 as in Preparation Example 1 prepared in Preparation Example 2 (1) 25 [mu] l, and PCR was carried out and the results analyzed in the same manner as in Comparative Example 1. バンドは検出されたものの、その分子量は目的とするものとは異なり(図11)、正常な核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。 Although bands were detected, the molecular weight was found to be different from those of interest (FIG. 11), the normal nucleic acid amplification reaction did not proceed.

(比較例3) (Comparative Example 3)
(マイクロ流体デバイス1/酵素阻害抑制成分未処理/PCR) (Microfluidic device 1 / enzyme inhibitor suppressing component raw / PCR)
比較例1と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Comparative Example 1. ただし、核酸増幅反応液は調製例9で調製した核酸増幅反応液(9)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 9 (9). その結果、バンドは全く検出されず(図12)、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。 As a result, a band was not detected at all (Figure 12), it was found that the nucleic acid amplification reaction did not proceed.
(比較例4) (Comparative Example 4)
(マイクロ流体デバイス1/Tween 80/PCR(Cell direct)) (Microfluidic device 1 / Tween 80 / PCR (Cell direct))
実施例3と同様にして核酸増幅反応を行った。 Was nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Example 3. ただし、核酸増幅反応液は調製例8で調製した核酸増幅反応液(8)を用いた。 However, the nucleic acid amplification reaction solution using the nucleic acid amplification reaction solution prepared in Preparation Example 8 (8). その結果、特異的増幅(107bp)を示すバンドは検出されず(図13)、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。 As a result, a band indicating the specific amplification (107 bp) was not detected (Fig. 13), it was found that the nucleic acid amplification reaction did not proceed.

(参考例1) (Reference Example 1)
(ガラス製マイクロ流体デバイス/酵素阻害抑制成分未処理/PCR) (Glass microfluidic device / enzyme inhibitor suppressing component raw / PCR)
常法に従って作製したガラス製マイクロ流体デバイス、及び調製例9で調製した核酸増幅反応液(9)25μlを用いた以外は比較例1と同様にして核酸増幅反応を行った。 Glass microfluidic devices were produced according to a conventional method, and except for using nucleic acid amplification reaction solution (9) 25 [mu] l prepared in Preparation Example 9 was carried out to a nucleic acid amplification reaction in the same manner as in Comparative Example 1. 増幅の有無をアガロースゲル電気泳動によって解析した結果、目的とするバンドが検出された(図14)。 Result of the presence of the amplification were analyzed by agarose gel electrophoresis, bands of interest were detected (Figure 14). これにより、ガラス製マイクロ流体デバイスを用いた場合には、阻害物質漏出などに起因する反応阻害問題は起きず、正常に反応が進行することが確認された。 Thus, in the case of using the glass microfluidic device, reaction inhibition problems caused such as inhibitors leakage does not occur, it was confirmed that the normal reaction proceeds.
(参考例2) (Reference Example 2)
(タンパク質濃度測定) (Protein concentration measurement)
日本バイオラッドラボラトリーズ社製Bio−Rad Protein Assayを使用して測定した。 It was measured using the Japan Bio-Rad Laboratories, Inc. Bio-Rad Protein Assay. 測定手順は、該キット商品に添付されている説明書4〜6頁(Section2 Instructions 2.1〜2.3)を参考にした。 The measurement procedure, and instructions 4 to 6 pages that are attached to the kit Product (Section2 Instructions 2.1~2.3) as a reference.
調製例1記載のras Mutant Set c−Ki−ras codon12 Gly溶液(試料A)は蒸留水で3倍希釈し(試料B)、Microassay Procedureを参考に測定した。 Preparation Example 1 described ras Mutant Set c-Ki-ras codon12 Gly solution (Sample A) was 3-fold diluted with distilled water (Sample B), was measured Microassay Procedure reference. 即ち、 In other words,
1. 1. サンプルチューブに試料B20μlとBio−Rad Protein Assay液(薬液A)5μlを加え、撹拌した。 Samples B20μl the Bio-Rad Protein Assay solution (solution A) 5 [mu] l was added to the sample tube, and stirred.
2. 2. 室温にて約10分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて595nmの吸収を測定した。 After incubation for about 10 minutes at room temperature, absorbance was measured of 595nm by a spectrophotometer taking part.
3. 3. 同様の操作で予め作成した検量線(標準物質として牛血清アルブミンを使用)を基に試料Bのタンパク質濃度を算出した。 It was calculated protein concentration of the sample B based on similar calibration curve prepared in advance by the operation (using bovine serum albumin as standard). これを3倍し、試料Aの値とした。 This 3 was multiplied by the value of the sample A.
その結果、試料Aのタンパク質濃度は0.0mg/mlと判明した。 As a result, the protein concentration of the sample A was found to 0.0 mg / ml.
調製例7記載の細胞懸濁液(試料C)は蒸留水で3倍希釈し(試料D)、Standard Procedureで測定した。 Preparation Example 7 described cell suspension (Sample C) was 3-fold diluted with distilled water (Sample D), was measured by Standard Procedure. 即ち、 In other words,
1. 1. Bio−Rad Protein Assay液(薬液A)を蒸留水で5倍希釈し、ろ紙(Whatman#1)で濾過した(薬液B)。 Bio-Rad Protein Assay solution (solution A) was 5-fold diluted with distilled water and filtered through filter paper (Whatman # 1) (solution B).
2. 2. 試験管に前記試料D100μlと前記薬液B5mlを加え、撹拌した。 The sample D100μl and the chemical B5ml added to the tube, and stirred.
3. 3. 室温にて約10分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて595nmの吸収を測定した。 After incubation for about 10 minutes at room temperature, absorbance was measured of 595nm by a spectrophotometer taking part.
4. 4. 同様の操作で予め作成した検量線(標準物質として牛血清アルブミンを使用)を基に試料Dのタンパク質濃度を算出した。 It was calculated protein concentration of the sample D based on a similar calibration curve prepared in advance by the operation (using bovine serum albumin as standard). これを3倍し、試料Cの値とした。 This triples, and the value of sample C.
その結果、試料Cのタンパク質濃度は1.0mg/mlと判明した。 As a result, the protein concentration of the sample C was found to 1.0 mg / ml.

マイクロ流体デバイスを用いたフロースルーPCR法の模式図である。 It is a schematic view of a flow-through PCR using microfluidic devices. 作製例1のマイクロ流体デバイスの断面模式図である。 It is a cross-sectional schematic view of a microfluidic device of Preparation Example 1. 実施例1で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 1 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー(タカラバイオ(株)の20bp DNA Ladder)。 Left column side marker (Takara 20bp DNA Ladder of Bio Co., Ltd.). 実施例2で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 2 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 実施例3で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 3 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 実施例4で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 4 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 実施例5で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 5 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 実施例6で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 6 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 実施例7で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Example 7 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 比較例1で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Comparative Example 1 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 比較例2で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Comparative Example 2 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 比較例3で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Comparative Example 3 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 比較例4で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 The results of PCR performed in Comparative Example 4 is a photograph analyzed by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker. 参考例1で行ったPCRの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である(右列側)。 It is a photograph of an analysis of the results of PCR performed in Reference Example 1 by agarose gel electrophoresis (right column side). 左列側はマーカー。 Left column side marker.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1 変性温度に設定したヒートブロック2 伸長反応温度に設定したヒートブロック3 アニーリング温度に設定したヒートブロック4 マイクロ流体デバイス5,6 開口部(入口、出口) Heat block 4 microfluidic device 5,6 opening set in a heat block 3 annealing temperature set to heat block 2 elongation reaction temperature was set to 1 denaturation temperature (inlet, outlet)
7 下基材8,9,10,12 塗膜11 流路13 上基材 7 Shitamotozai 8, 9, 10, 12 coating film 11 flow path 13 Uemotozai

Claims (1)

  1. 反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器を用いて酵素の存在下で核酸を増幅する方法であって、核酸増幅阻害抑制成分としてウシ血清アルブミン、界面活性剤又はグリセロールの少なくとも一つを反応器に加える工程を含む核酸増幅方法であって、 At least a portion of the contact surface between the reaction solution is a method of amplifying a nucleic acid in the presence of an enzyme using a reactor which is constituted by an active energy ray curable resin, bovine serum albumin as a nucleic acid amplification inhibitor suppressing component, at least one surfactant or glycerol a nucleic acid amplification method comprising the step of adding to the reactor,
    前記反応液が、予め核酸精製処理を施しテンプレートとして利用可能な核酸を含む反応液であることを特徴とする核酸増幅方法。 Wherein the reaction solution, nucleic acid amplification method which is a reaction solution containing the available nucleic acid as a template previously subjected to nucleic acid purification process.
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