JP4595446B2 - Nucleic acid amplification method - Google Patents
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Description
本発明は、核酸増幅方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid amplification method.
（核酸増幅反応器）
核酸増幅反応は従来、ポリプロピレン製やポリカーボネート製のサンプルチューブやガラス製容器で行われることが多かった。しかし効率的に核酸増幅反応を進める方法として、例えば酵素を用いた最も代表的な核酸増幅法であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）法の場合、マイクロ流体デバイスやキャピラリーを反応器に用いた、いわゆる「フロースルーＰＣＲ法」が報告されている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。この方法は例えば図１に示したように、独立した複数のヒートブロックを各設定温度に調節し、これらを並べた上にマイクロ流体デバイスを密着させ、マイクロ流体デバイス内部の微細流路に反応液を流す方法である。
(Nucleic acid amplification reactor)
Nucleic acid amplification reactions have heretofore been often performed in polypropylene or polycarbonate sample tubes or glass containers. However, as a method for efficiently advancing the nucleic acid amplification reaction, for example, in the case of PCR (Polymerase Chain Reaction), which is the most typical nucleic acid amplification method using an enzyme, a microfluidic device or a capillary is used for the reactor. The so-called “flow-through PCR method” has been reported (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). In this method, for example, as shown in FIG. 1, a plurality of independent heat blocks are adjusted to each set temperature, the microfluidic device is brought into close contact with each other, and the reaction solution is placed in a microchannel inside the microfluidic device. It is a method of flowing.
（マイクロ流体デバイスの材質）
マイクロ流体デバイスの材質として、当初用いられていたのはガラス、あるいはガラスとシリコンゴムとを貼り合わせたものであった。しかし、これらのデバイス作製プロセスにはガラスの切削工程、高温高圧下で長時間かけてガラスを貼り合わせる工程、あるいはシリコンゴムの鋳型を作製する工程などが必要であり、手間やコストがかかっていた。更に、ガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスは、その流路に高圧を加えるとガラスとシリコンゴムとがしばしば剥離してしまっていた。
(Material of microfluidic device)
As a material of the microfluidic device, glass or a material obtained by bonding glass and silicon rubber was originally used. However, these device fabrication processes required steps and costs, such as a glass cutting process, a process of laminating glass under high temperature and pressure for a long time, or a process of fabricating a silicon rubber mold. . Furthermore, in a microfluidic device in which glass and silicon rubber are bonded together, glass and silicon rubber often peel off when a high pressure is applied to the flow path.
このため改善策として、成形が容易で耐衝撃性及び機械的強度に優れた活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスが提案されている（例えば、特許文献２参照）。活性エネルギー線硬化樹脂は薄膜でも高い耐衝撃性を保持しているため、ヒートブロックと接触させるデバイス面の膜厚を薄く（３０μｍ程度）して熱伝導効率を高めることも可能であるし、内外圧により破損することも少ない。また、該活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスの作製においては、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術を利用することによって容易に微細な溝や流路を成型できるため特別な鋳型を必要とせず、手間やコストを省くことができ、また流路デザインも都度容易に変更可能という利点がある。 For this reason, a microfluidic device composed of an active energy ray-curable resin that is easy to mold and excellent in impact resistance and mechanical strength has been proposed (see, for example, Patent Document 2). Since active energy ray curable resin retains high impact resistance even in a thin film, it is possible to increase the heat conduction efficiency by reducing the film thickness of the device surface in contact with the heat block (about 30 μm). There is little damage by pressure. In the production of a microfluidic device composed of the active energy ray-curable resin, a special mold is used because fine grooves and flow paths can be easily formed by using a photolithography technique used in semiconductor manufacturing. There is an advantage that it is not necessary, labor and cost can be saved, and the flow path design can be easily changed each time.
（試料由来夾雑物による反応阻害と阻害抑制成分）
ところでＰＣＲ法は、増幅しようとする核酸を含む試料として例えば血液、唾液、体細胞のような生体試料を供した場合など、試料由来の夾雑物が反応液中に混在すると反応が強く阻害されることが広く知られている。そのため一般的には、核酸を含む試料に対してフェノール・クロロホルム抽出法などの夾雑物除去処理を施して核酸を精製した後、これをテンプレートとしてＰＣＲを行うという工程が採用されている。
該核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、即ち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として、生体試料を含む反応液に界面活性剤またはアルブミン等を添加する核酸増幅法が提案されている（例えば、特許文献３および４参照）。しかしながら、該手法は主として生体試料由来の阻害因子に対してこれを抑制することを想定した手段であった。
(Reaction inhibition and inhibition inhibitory components by sample-derived impurities)
By the way, in the PCR method, for example, when a biological sample such as blood, saliva, or somatic cell is used as a sample containing the nucleic acid to be amplified, the reaction is strongly inhibited when contaminants derived from the sample are mixed in the reaction solution. It is widely known. Therefore, in general, a process of purifying a nucleic acid by subjecting a sample containing the nucleic acid to a contaminant removal process such as a phenol / chloroform extraction method and then performing PCR using this as a template is employed.
In order to omit the nucleic acid purification step, a surfactant or albumin is added to the reaction solution containing the biological sample as a technique that enables nucleic acid amplification directly from the biological sample, that is, in a reaction system containing a large amount of contaminants. Nucleic acid amplification methods have been proposed (see, for example, Patent Documents 3 and 4). However, this technique is a means that is supposed to suppress mainly an inhibitor derived from a biological sample.
前述したように、これまでに活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスを用いるフロースルーＰＣＲ法が提案されていたものの、本発明者らがそのマイクロ流体デバイスを用いてＰＣＲを行ったところ特異的増幅量が少なく、また非特異的増幅が多く発生することが分かり、必ずしも満足のいく精度ではなかった。そのため、活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスを初めとする反応器を用いた、高精度な核酸増幅方法が求められていた。 As described above, although a flow-through PCR method using a microfluidic device composed of an active energy ray-curable resin has been proposed so far, the present inventors have performed PCR using the microfluidic device. It was found that the amount of specific amplification was small and a large amount of non-specific amplification occurred, which was not always satisfactory. Therefore, a highly accurate nucleic acid amplification method using a reactor including a microfluidic device composed of an active energy ray curable resin has been demanded.
そこで本発明が解決しようとする課題は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた核酸増幅法において、非特異的増幅を抑えた高精度の核酸増幅が可能な方法を提供することにある。 Therefore, the problem to be solved by the present invention is to suppress nonspecific amplification in a nucleic acid amplification method using a reactor in which at least a part of the contact surface with the reaction component of the enzyme reaction is composed of an active energy ray-curable resin. Another object of the present invention is to provide a method capable of highly accurate nucleic acid amplification.
本発明者らは、従来から用いられてきたポリプロピレン製あるいはポリカーボネート製のサンプルチューブ、及びガラス製あるいはガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスでの核酸増幅反応では見られなかった現象、即ち反応（増幅）阻害あるいは企図しない反応（非特異的増幅）が、前記活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた場合には発生することを見いだした。その原因は未だ不明であるが、活性エネルギー線硬化樹脂中の残存モノマー、重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤、溶剤等のいずれかの成分が反応液中に溶出して阻害を誘発するため、上記現象が起きてしまうのではないかと考えられた。そこで本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、核酸増幅反応時に核酸増幅阻害抑制成分を作用させることで上記現象を抑えた高精度な核酸増幅が可能となることを見出し、課題解決に至った。 The present inventors have found a phenomenon that has not been observed in nucleic acid amplification reaction in a sample tube made of polypropylene or polycarbonate and a microfluidic device in which glass or glass and silicon rubber are bonded together. It has been found that (amplification) inhibition or unintended reaction (non-specific amplification) occurs when a reactor composed of the active energy ray-curable resin is used. The cause is still unknown, but any component such as residual monomer, polymerization initiator, polymerization retarder, polymerization inhibitor, solvent, etc. in the active energy ray curable resin is eluted in the reaction solution to induce inhibition. Therefore, it was thought that the above phenomenon would occur. Therefore, as a result of intensive studies, the present inventors have found that high-precision nucleic acid amplification with the above phenomenon suppressed can be achieved by applying a nucleic acid amplification inhibition-suppressing component during the nucleic acid amplification reaction, and the problem has been solved. .
即ち、本発明は、反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器を用いて酵素の存在下で核酸を増幅する方法であって、核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加える工程を含む核酸増幅方法を提供する。 That is, the present invention is a method for amplifying a nucleic acid in the presence of an enzyme using a reactor in which at least a part of the contact surface with the reaction solution is composed of an active energy ray-curable resin, which inhibits inhibition of nucleic acid amplification. Nucleic acid amplification methods comprising the steps of adding components to a reactor are provided.
本発明の方法は、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた核酸増幅反応において反応阻害を回復し、非特異的増幅を抑え高精度の核酸増幅を可能にする。前述のように活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたマイクロ流体デバイスは簡便に作成することができ、また核酸増幅反応を迅速化し得る一方で、反応阻害や企図しない反応が起こり有効に使用することができなかったことから、本発明の方法を該デバイスに適用することは特に有用である。 The method of the present invention recovers reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction using a reactor composed of an active energy ray-curable resin, and suppresses non-specific amplification and enables highly accurate nucleic acid amplification. As described above, a microfluidic device composed of an active energy ray-curable resin can be easily produced and can speed up the nucleic acid amplification reaction, but can be used effectively due to reaction inhibition or unintended reaction. It was particularly useful to apply the method of the present invention to the device because it was not possible.
本発明は、反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器を用いて核酸を増幅する方法であって、核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加える工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法である。 The present invention relates to a method for amplifying nucleic acid using a reactor in which at least a part of a contact surface with a reaction solution is composed of an active energy ray-curable resin, and the step of adding a nucleic acid amplification inhibition inhibiting component to the reactor A nucleic acid amplification method characterized by comprising:
（反応器）
本発明において「反応器」とは、例えばサンプルチューブ等の反応容器や、微細な流路を内部に有するデバイス、所謂、マイクロ流体デバイスなどの反応流路を有する反応機器など、化学反応や生化学反応を行うことのできる反応容器、反応器具、反応機器などを指す。このうち、迅速な核酸増幅が可能なフロースルーＰＣＲに適した反応器として、マイクロ流体デバイスが挙げられる。
(Reactor)
In the present invention, the “reactor” means a chemical reaction or biochemistry such as a reaction vessel such as a sample tube, a device having a fine flow path therein, a reaction device having a reaction flow path such as a so-called microfluidic device, or the like. It refers to a reaction vessel, reaction apparatus, reaction apparatus or the like capable of performing a reaction. Among these, a microfluidic device is mentioned as a reactor suitable for flow-through PCR capable of rapid nucleic acid amplification.
（マイクロ流体デバイス）
本発明におけるマイクロ流体デバイスとしては、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラボ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）などと呼ばれるものが挙げられる。すなわちマイクロ流体デバイスは内部に微細な流路を有し、該流路内に流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を有する化学、生化学反応用の反応機器を指す。
(Microfluidic device)
Examples of the microfluidic device in the present invention include what is called a microfluidic device, a microfabricated device, a lab-on-chip, or a micro total analytical system (μ-TAS). It is done. That is, the microfluidic device has a fine flow path inside, a mechanism in which the fluid undergoes a temperature change, a mechanism in which the concentration is adjusted, a mechanism in which a chemical reaction is performed, a flow velocity of the flow, a branch of flow, mixing or It refers to a reaction device for chemical and biochemical reactions having a mechanism for controlling separation or the like, or a mechanism for receiving electrical and optical measurements.
本発明のマイクロ流体デバイスの形状や寸法、及び流路断面の形状や寸法等は従来公知と同じ範囲であれば特に限定されるものではなく任意である。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスの形状としては、板状、シート状、フィルム状、ロール状、方形、円形、球形などが挙げられる。該マイクロ流体デバイスの厚さも特に限定されないが、例えば、フロースルーＰＣＲに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では温度をかける際の調節精度の観点から、ヒートブロック接触面と流路までを含めた部材の厚みを１０μｍ〜５ｍｍとすることが好ましく、１０μｍ〜３ｍｍとすることがより好ましい。また、流路の形状は直線、ジグザグ、波型などが挙げられる。流路の断面の寸法は、例えば、フロースルーＰＣＲに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では、熱伝導度及び反応液の位相速度の観点から０．２５μｍ２〜９ｍｍ２程度であることが好ましく、さらに、１μｍ２〜１ｍｍ２程度であることがより好ましい。断面形状は矩形、スリット状、台形、円形、半円形などが挙げられる。 The shape and size of the microfluidic device of the present invention and the shape and size of the cross section of the flow path are not particularly limited as long as they are in the same range as conventionally known. For example, the shape of the microfluidic device of the present invention includes a plate shape, a sheet shape, a film shape, a roll shape, a square shape, a circular shape, a spherical shape, and the like. The thickness of the microfluidic device is not particularly limited. For example, in the case of use in flow-through PCR, from the viewpoint of adjustment accuracy when applying a temperature in the portion opposite to each heat block, the heat block contact surface and the flow path are The thickness of the included member is preferably 10 μm to 5 mm, more preferably 10 μm to 3 mm. Moreover, the shape of the flow path includes a straight line, a zigzag, a wave shape, and the like. For example, when used for flow-through PCR, the cross-sectional dimension of the flow path should be about 0.25 μm 2 to 9 mm 2 from the viewpoint of thermal conductivity and phase velocity of the reaction solution at the portion facing each heat block. It is more preferable that it is about 1 μm 2 to 1 mm 2 . Examples of the cross-sectional shape include a rectangle, a slit, a trapezoid, a circle, and a semicircle.
（反応器を構成する材料）
本発明の方法は反応液との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されている反応器（以下、単に「反応器」と言うことがある）に対して有効であり、また酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたものであれば、接触面はもとより反応器の一部が活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料により構成されたものに対しても有効である。活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料としては、活性エネルギー線硬化樹脂以外の樹脂、金属、ガラス、セラミックなど従来公知のものであれば任意のものが挙げられる。ただし、本発明に用いる反応器が微細な流路を有するマイクロ流体デバイスの場合、酵素反応の反応成分との接触面、すなわち流路は活性エネルギー線硬化樹脂を用いて構成されたものに効果的である。活性エネルギー線硬化樹脂を用いることによりフォトリソグラフィー技術を用いて流路を形成することができるため微細な溝や流路を容易に成形でき、手間やコストを省くことができ、また流路デザインも都度容易に変更可能な利点を有効に利用することができるようになる。
(Materials constituting the reactor)
The method of the present invention is effective for a reactor in which at least a part of the contact surface with the reaction liquid is composed of an active energy ray curable resin (hereinafter, simply referred to as “reactor”), and If at least a part of the contact surface with the reaction component of the enzyme reaction is composed of an active energy ray curable resin, a part of the reactor as well as the contact surface is composed of a material other than the active energy ray curable resin. It is also effective for things. As a material other than the active energy ray curable resin, any material may be used as long as it is a conventionally known material such as a resin other than the active energy ray curable resin, a metal, glass, or ceramic. However, in the case where the reactor used in the present invention is a microfluidic device having a fine flow path, the contact surface with the reaction component of the enzyme reaction, that is, the flow path is effective when the active energy ray curable resin is used. It is. By using an active energy ray curable resin, the flow path can be formed using photolithography technology, so that it is possible to easily form fine grooves and flow paths, saving labor and cost, and the flow path design Advantages that can be easily changed each time can be used effectively.
（活性エネルギー線硬化樹脂）
本発明の方法が好ましく適用される活性エネルギー線硬化樹脂は、活性エネルギー線硬化性樹脂組成物を、重合開始剤の存在下、あるいは非存在下で活性エネルギー線により硬化して得られる。
本発明で使用する活性エネルギー線硬化性樹脂組成物には、公知慣用の重合性モノマーを使用することができるが、なかでも、重合性基を２個以上有する多官能モノマーを使用することが好ましい。重合性基としては、（メタ）アクリロイル基、ビニルオキシ基、エポキシ基、アクリルアミド基、マレイミド基等が挙げられるが、中でも、反応性の高い（メタ）アクリロイル基、ビニルオキシ基や、光重合開始剤の不存在下でも硬化するマレイミド基などが好ましい態様として挙げられる。該重合性化合物は単独で、あるいは二種以上を混合して使用することができる。活性エネルギー線硬化性の組成物には、光重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤などを添加してもよい。
(Active energy ray curable resin)
The active energy ray-curable resin to which the method of the present invention is preferably applied is obtained by curing an active energy ray-curable resin composition with active energy rays in the presence or absence of a polymerization initiator.
In the active energy ray-curable resin composition used in the present invention, a known and commonly used polymerizable monomer can be used, and among them, a polyfunctional monomer having two or more polymerizable groups is preferably used. . Examples of the polymerizable group include a (meth) acryloyl group, a vinyloxy group, an epoxy group, an acrylamide group, and a maleimide group. Among them, a highly reactive (meth) acryloyl group, a vinyloxy group, and a photopolymerization initiator. A preferred example is a maleimide group that cures even in the absence. These polymerizable compounds can be used alone or in admixture of two or more. You may add a photoinitiator, a polymerization retarder, a polymerization inhibitor, etc. to an active energy ray hardening composition.
（活性エネルギー線）
照射する活性エネルギー線としては、紫外線、可視光線、赤外線、レーザー光線、放射光などの光線や、エックス線、ガンマ線、放射線などの電離放射線や、電子線、イオンビーム、ベータ線、重粒子線などの粒子線が挙げられる。これらの中でも、取り扱い性や硬化速度の面から紫外線及び可視光が好ましく、紫外線が特に好ましい。硬化速度を速め、硬化を完全に行う目的で、活性エネルギー線の照射を低酸素濃度雰囲気で行うことが好ましい。低酸素濃度雰囲気としては、窒素気流中、二酸化炭素気流中、アルゴン気流中、真空又は減圧雰囲気中が好ましい。
(Active energy rays)
The active energy rays to be irradiated include rays such as ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, laser rays and radiated rays, ionizing radiations such as X-rays, gamma rays and radiation, and particles such as electron rays, ion beams, beta rays and heavy particle rays. A line is mentioned. Among these, ultraviolet rays and visible light are preferable from the viewpoint of handleability and curing speed, and ultraviolet rays are particularly preferable. For the purpose of accelerating the curing and complete the curing, it is preferable to irradiate active energy rays in a low oxygen concentration atmosphere. As the low oxygen concentration atmosphere, a nitrogen stream, a carbon dioxide stream, an argon stream, a vacuum or a reduced pressure atmosphere is preferable.
（核酸増幅阻害抑制成分）
本発明の発明者らは、核酸増幅反応の成分が反応器の活性エネルギー線硬化樹脂により構成された部分と接することにより、核酸増幅反応に阻害が起こり、核酸が増幅しない、あるいは企図しない非特異的増幅が起こるなどの問題が生じることを見出した。
本発明において核酸増幅阻害抑制成分とは、反応器の活性エネルギー線硬化樹脂により構成された部分と核酸増幅反応成分が接することに起因する核酸増幅反応阻害を抑制することができる成分を指す。具体的には、界面活性剤、ポリペプチド及び多価アルコールが挙げられる。
既述したように、従来から核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、すなわち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として界面活性剤又はアルブミンを添加して核酸増幅を行う方法が知られていた。しかしながら、これは血液等の動物体液中の蛋白質や糖、色素などの生体試料に起因する酵素阻害因子を抑制するものであって、活性エネルギー線硬化樹脂に起因する阻害因子との関連性は全くなかった。従って、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器で酵素反応を行った場合に酵素阻害が起こることを連想させるものではなく、さらに、このような反応器で酵素反応を行った場合に、界面活性剤やアルブミンが活性エネルギー線硬化樹脂に起因する酵素阻害因子に対して抑制効果があることを連想させるものでもなかった。
(Nucleic acid amplification inhibitory component)
The inventors of the present invention have non-specificity in which the components of the nucleic acid amplification reaction are in contact with the portion of the reactor made of the active energy ray-curable resin, which inhibits the nucleic acid amplification reaction and does not amplify or intend the nucleic acid. It has been found that problems such as the occurrence of dynamic amplification occur.
In the present invention, the nucleic acid amplification inhibition-suppressing component refers to a component capable of suppressing nucleic acid amplification reaction inhibition caused by the contact between the portion constituted by the active energy ray-curable resin of the reactor and the nucleic acid amplification reaction component. Specific examples include surfactants, polypeptides, and polyhydric alcohols.
As described above, since a nucleic acid purification step is conventionally omitted, a surfactant or albumin is added as a technique that enables nucleic acid amplification directly from a biological sample as it is, that is, in a reaction system containing a large amount of contaminants. Methods for performing nucleic acid amplification have been known. However, this suppresses enzyme inhibitory factors derived from biological samples such as proteins, sugars, and pigments in animal body fluids such as blood, and is completely unrelated to the inhibitory factors derived from active energy ray curable resins. There wasn't. Therefore, it is not reminiscent of enzyme inhibition occurring when an enzyme reaction is carried out in a reactor composed of an active energy ray curable resin. Furthermore, when an enzyme reaction is carried out in such a reactor, the interface Neither was it reminiscent of the inhibitory effect of the activator or albumin on the enzyme inhibitor caused by the active energy ray-curable resin.
該核酸増幅阻害抑制成分の反応器への加え方は、酵素反応の際に該核酸増幅阻害抑制成分が作用するタイミングで反応器に加えることができればその方法は特に制限されないが、通常は、反応液に先立って反応器に加えるか、反応液の後からであっても核酸増幅反応の開始前までに反応場に到達するよう反応器に加えるか、または、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えればよい。ただし、たとえ核酸増幅反応の開始前までに反応器に加えたとしても、該核酸増幅阻害抑制成分が存在しない状態で、活性エネルギー線硬化樹脂と反応液が接触することは好ましくないため、反応液に先立って反応器に加えるか、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えることが好ましい。 The method for adding the nucleic acid amplification inhibition suppressing component to the reactor is not particularly limited as long as the nucleic acid amplification inhibition suppressing component can be added to the reactor at the timing when the nucleic acid amplification inhibition suppressing component acts during the enzyme reaction. Add to the reactor prior to the solution, add to the reactor to reach the reaction field even after the reaction solution and before the start of the nucleic acid amplification reaction, or mix with the reaction solution in advance What is necessary is just to add to a reactor with a liquid. However, even if it is added to the reactor before the start of the nucleic acid amplification reaction, it is not preferable that the active energy ray-curable resin and the reaction liquid come into contact with each other in the absence of the nucleic acid amplification inhibition suppressing component. It is preferable to add to the reactor prior to the reaction, or to mix with the reaction solution in advance and add to the reactor together with the reaction solution.
例えば、反応器がサンプルチューブ等のバッチ式の反応容器であれば、反応液を反応器に加える前、もしくは反応溶液を反応器に加えた後でも核酸増幅反応の開始前までに該核酸増幅阻害抑制成分を反応器に加えるか、予め反応液に混合しておき反応液と共に反応器に加えればよい。また、反応器がマイクロ流体デバイスであれば、反応液に先立って流路に流すか、予め反応液と混合しておき、該反応液と共に流路に流せばよい。 For example, if the reaction vessel is a batch type reaction vessel such as a sample tube, the nucleic acid amplification inhibition is performed before the start of the nucleic acid amplification reaction even before the reaction solution is added to the reaction vessel or even after the reaction solution is added to the reaction vessel. The inhibitory component may be added to the reactor, or mixed in advance with the reaction solution and added to the reactor together with the reaction solution. Further, if the reactor is a microfluidic device, it may be flowed through the flow path prior to the reaction liquid, or mixed with the reaction liquid in advance and flowed through the flow path together with the reaction liquid.
（ポリペプチド）
本発明において核酸増幅反応阻害抑制成分として用いることができるポリペプチドとしては、アルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチンなどが挙げられ、このうちアルブミンが好ましく挙げられる。さらにアルブミンとしては特にその種類は限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ということがある）やラクトアルブミンやヒト血清アルブミンなどが好ましいものとして挙げられる。アルブミン含有率が高く、これを分解する酵素を含んでいないことから和光純薬社製「アルブミン プロテアーゼ不含（ウシ血清由来）」が好ましいものとして例示される。
(Polypeptide)
Examples of the polypeptide that can be used as a nucleic acid amplification reaction inhibition-suppressing component in the present invention include albumin, globulin, casein, gelatin and the like, among which albumin is preferable. Further, the type of albumin is not particularly limited, but preferred examples include bovine serum albumin (hereinafter sometimes referred to as “BSA”), lactalbumin, and human serum albumin. “Albumin protease-free (derived from bovine serum)” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. is preferred because it has a high albumin content and does not contain an enzyme that degrades it.
ポリペプチドを予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれるポリペプチド濃度が少なくとも０．０１質量％、好ましくは０．０１質量％〜５質量％となるよう調整することが好ましい。
また、ポリペプチドを反応液に先だって反応器に加える場合には、濃度が０．１質量％〜１０質量％となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。ポリペプチドを加える量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも０．０１質量％、好ましくは０．０１質量％〜５質量％となるよう調整することが好ましい。また、更に、ポリペプチドは下記多価アルコールや下記界面活性剤と併用することも可能である。
When the polypeptide is mixed with the reaction solution in advance and added to the reactor together with the reaction solution, the concentration of the polypeptide contained in the reaction solution is at least 0.01% by mass, preferably 0.01% by mass to 5% by mass. It is preferable to adjust so that.
In addition, when the polypeptide is added to the reactor prior to the reaction solution, it is preferably used after being dissolved in a solvent so that the concentration becomes 0.1% by mass to 10% by mass. Examples of the solvent include water and a buffer solution, and examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a Tris-HCl buffer solution. The amount of polypeptide to be added is unclear because it is affected by the method, amount of reaction solution, temperature, and in the case of microfluidic devices, and also by the flow rate. Is at least 0.01% by mass, preferably 0.01% by mass to 5% by mass. Furthermore, the polypeptide can be used in combination with the following polyhydric alcohol or the following surfactant.
（多価アルコール）
本発明において核酸増幅反応抑制成分として用いることができる多価アルコールとしては、グリセロール、エチレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられ、このうちグリセロールが好ましく挙げられる。
(Polyhydric alcohol)
Examples of the polyhydric alcohol that can be used as a nucleic acid amplification reaction suppressing component in the present invention include glycerol, ethylene glycol, propanediol, and the like, among which glycerol is preferable.
多価アルコールを予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれる多価アルコール濃度が少なくとも５質量％、さらに５質量％〜３０質量％となるよう調整することが好ましく、１０質量％〜２０質量％となるよう調整することが最も好ましい。
また、多価アルコールを反応液に先だって反応器に加える場合には、濃度が５質量％〜５０質量％となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。多価アルコールを加える量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも５質量％、好ましくは５質量％〜３０質量％となるよう調整することが好ましく、さらに１０質量％〜２０質量％となるよう調整することがもっとも好ましい。また、更に、多価アルコールは上記ポリペプチドや下記界面活性剤と併用することも可能である。
When the polyhydric alcohol is mixed with the reaction liquid in advance and added to the reactor together with the reaction liquid, the concentration of the polyhydric alcohol contained in the reaction liquid is at least 5% by mass, and further 5% by mass to 30% by mass. It is preferable to adjust, and it is most preferable to adjust so that it may become 10 mass%-20 mass%.
Moreover, when adding a polyhydric alcohol to a reactor prior to a reaction liquid, it is preferable to use it by dissolving in a solvent so that the concentration becomes 5 mass% to 50 mass%. Examples of the solvent include water and a buffer solution, and examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a Tris-HCl buffer solution. The amount of polyhydric alcohol added is not affected by the method, amount of reaction solution, temperature, and the flow rate in the case of microfluidic devices. It is preferable to adjust the concentration to be at least 5% by mass, preferably 5% by mass to 30% by mass, and more preferably 10% by mass to 20% by mass. Furthermore, the polyhydric alcohol can be used in combination with the above polypeptide or the following surfactant.
（界面活性剤）
本発明において核酸増幅反応抑制成分として用いることができる界面活性剤としては特に限定されることなく挙げられるが、具体的には
ノニオン界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオキシエチレンアルキルエステル類、例えばポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ ９７）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、例えばオクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等のメチルグルカミド誘導体、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド等のアルキル糖誘導体等）、
アニオン界面活性剤（例えばラウリルベンゼンスルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンドデシルサルフェイト（Ｔｒｉｓ ＤＳ）等）、
カチオン界面活性剤（例えばオクタデシルアミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩、ラウリルアミン酢酸塩、ラウリルジエタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、メチル硫酸アリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、例えば塩化ラウリルピリジニウム、塩化ステアリルアミドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等）、
両性界面活性剤（例えば３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネイト、３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネイト等）、
天然の界面活性剤（例えばサポニン（大豆由来）、ジギトニン等）
などの界面活性剤が挙げられるが、反応時の酵素等への影響を考慮すると、中でもノニオン界面活性剤が好ましく挙げられる。これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いても何れでもよい。
(Surfactant)
Examples of the surfactant that can be used as a nucleic acid amplification reaction suppressing component in the present invention include, but are not limited to, a nonionic surfactant (for example, polyoxyethylene (9) octylphenyl ether (IGEPAL CA)). -630), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton X-100), polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as polyoxyethylene nonylphenyl ether, such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20), poly Poly, such as oxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan trioleate Oxyethylene alkyl esters such as polyoxyethylene (10) oleyl ether (Brij 97), polyoxyethylene (20) cetyl ether, polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene (23) lauryl ether, such as octanoyl-N -Methyl glucamide, nonanoyl-N-methyl glucamide, methyl glucamide derivatives such as decanoyl-N-methyl glucamide, for example, alkyl sugar derivatives such as n-octyl-β-D-glucoside, etc.),
Anionic surfactants (for example, laurylbenzene sulfonic acid, deoxycholic acid, cholic acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane dodecyl sulfate (Tris DS), etc.),
Cationic surfactants (eg octadecylamine acetate, tetradecylamine acetate, stearylamine acetate, laurylamine acetate, lauryldiethanolamine acetate, etc. alkylamine salts such as octadecyltrimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium chloride, cetyl chloride Quaternary ammonium salts such as trimethylammonium, cetyltrimethylammonium bromide, allyltrimethylammonium methylsulfate, benzalkonium chloride, tetradecyldimethylbenzylammonium chloride, octadecyldimethylbenzylammonium chloride, lauryldimethylbenzylammonium chloride, such as laurylpyridinium chloride , Alkylpyridinium salts such as stearylamidomethylpyridinium chloride),
Amphoteric surfactants such as 3-[(3-colamiamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 3-[(3-colamiamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1- Propane sulfonate)
Natural surfactant (eg saponin (derived from soybean), digitonin, etc.)
In view of the influence on the enzyme during the reaction, nonionic surfactants are preferred. These may be used alone or in appropriate combination.
界面活性剤を予め反応液と混合しておき反応液と共に反応器に加える場合には、反応液中に含まれる界面活性剤濃度が少なくとも５質量％以上、好ましくは５質量％〜２５質量％となるよう調整することが望ましい。
また、界面活性剤を反応液に先だって反応器に加える場合は、別途適当な濃度となるように溶媒に溶解して用いる。すなわち、加える界面活性剤の濃度及び量は、その方法、反応液の量、温度、マイクロ流体デバイスの場合にはさらに流速によっても影響を受けるため一概には言えないが、後から加える反応液と混ざったときその濃度が少なくとも５質量％、好ましくは５質量％〜２５質量％となるよう調整することが望ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。また、更に、界面活性剤は上記ポリペプチドや上記多価アルコールと併用することも可能である。
When the surfactant is preliminarily mixed with the reaction liquid and added to the reactor together with the reaction liquid, the concentration of the surfactant contained in the reaction liquid is at least 5% by mass, preferably 5% by mass to 25% by mass. It is desirable to adjust so that.
In addition, when the surfactant is added to the reactor prior to the reaction solution, it is separately dissolved in a solvent so as to have an appropriate concentration. In other words, the concentration and amount of the surfactant to be added are not affected by the method, the amount of the reaction solution, the temperature, and the flow rate in the case of a microfluidic device. When mixed, the concentration is preferably adjusted to be at least 5% by mass, preferably 5% by mass to 25% by mass. Examples of the solvent include water and a buffer solution, and examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a Tris-HCl buffer solution. Furthermore, the surfactant can be used in combination with the polypeptide or the polyhydric alcohol.
（核酸（テンプレート））
本発明の核酸増幅反応においてテンプレートとして用いる核酸としては、生体由来試料（動物由来（皮膚、毛髪、唾液、血液、尿、糞）、植物由来試料（根、茎、葉、種、果肉、花））および環境試料（土、水、空気）から抽出・精製されたもの、およびそれらをＰＣＲ法等にて一旦増幅したものを使用することが可能である。
(Nucleic acid (template))
Examples of nucleic acids used as templates in the nucleic acid amplification reaction of the present invention include biological samples (animal origin (skin, hair, saliva, blood, urine, feces), plant-derived samples (roots, stems, leaves, seeds, pulp, flowers). ) And environmental samples (soil, water, air) extracted and purified, and those once amplified by the PCR method or the like can be used.
（核酸（テンプレート）の精製方法）
増幅しようとする核酸が夾雑物を多く含む生体由来試料等中に存在する場合には、増幅反応に先立って、混在する夾雑物の除去を目的とした核酸精製処理を行う必要がある。具体的な精製方法としては、公知の方法がいずれも使用でき、例えば、フェノール／クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿法が挙げられる。更にイオン交換樹脂、ガラスビーズ等を使用したカラム、ガラスフィルターあるいはタンパク質凝集作用を有する試薬を使用して精製度を上げることができる。より夾雑物濃度を低減するため、複数の方法を同時にまたは順次行うことができる。
(Nucleic acid (template) purification method)
When the nucleic acid to be amplified is present in a biological sample or the like containing a large amount of contaminants, it is necessary to perform a nucleic acid purification treatment for the purpose of removing the contaminated contaminants prior to the amplification reaction. As a specific purification method, any known method can be used, and examples thereof include phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Further, the degree of purification can be increased by using a column using an ion exchange resin, glass beads or the like, a glass filter, or a reagent having a protein aggregating action. In order to further reduce the contaminant concentration, a plurality of methods can be performed simultaneously or sequentially.
また、いわゆるＰＣＲ法等の核酸増幅法により既に増幅した核酸や、合成した核酸を使用する場合は、上記のような試料由来の夾雑物がない、若しくは非常に少ないので上記の精製処理を必ずしも行う必要がないこともある。 In addition, when using nucleic acid already amplified by a nucleic acid amplification method such as a so-called PCR method or synthesized nucleic acid, the above purification treatment is not necessarily performed because there is no or very little sample-derived impurities as described above. It may not be necessary.
（核酸（テンプレート）の精製度）
いずれの試料の場合にも代表的な夾雑物としてはタンパク質が挙げられ、本発明の核酸増幅反応に供する反応液中に含まれる夾雑物が、タンパク質濃度を測定した場合に０．５ｍｇ／ｍｌ以下に抑制されていることが好ましい。ただし、本発明に用いる核酸増幅阻害抑制成分がポリペプチドの場合には、該ポリペプチド自身もタンパク質であるので、ポリペプチドのみを除いた反応液中、又はポリペプチドのみを添加する前の反応液中におけるタンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以下に抑制されていることが好ましい。
(Nucleic acid (template) purity)
In any sample, a typical contaminant is protein, and the contaminant contained in the reaction solution subjected to the nucleic acid amplification reaction of the present invention is 0.5 mg / ml or less when the protein concentration is measured. It is preferable to be suppressed. However, when the nucleic acid amplification inhibition suppressing component used in the present invention is a polypeptide, the polypeptide itself is also a protein. Therefore, in the reaction solution excluding only the polypeptide or the reaction solution before adding only the polypeptide. It is preferable that the protein concentration inside is suppressed to 0.5 mg / ml or less.
尚、本発明中で示されているタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素結合法に基づく方法（日本バイオラッドラボラトリーズ社製Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ使用）により算出した。 The protein concentration shown in the present invention was calculated by a method based on the Bradford dye binding method (using Bio-Rad Protein Assay manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories).
（核酸増幅反応）
本発明の核酸増幅反応としては、ＰＣＲ法あるいはその変法、転写や逆転写を利用する増幅法など原理の異なる他の各種核酸増幅法など酵素を使った公知慣用のいずれの核酸増幅反応であっても良い。例えば、核酸（テンプレート）、プライマー、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸及び緩衝液を用いた通常のＰＣＲ法の他に、Nested ＰＣＲ法、インバースＰＣＲ法、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法、degenerate ＰＣＲ法などの各種ＰＣＲの応用法や、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ｇａｐＬＣＲ法、ＳＤＡ法、Ｑβ replicase amplification法、ＴＡＳ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。
(Nucleic acid amplification reaction)
The nucleic acid amplification reaction of the present invention is any known and commonly used nucleic acid amplification reaction using an enzyme such as a PCR method or a modified method thereof, an amplification method using transcription or reverse transcription, or other various nucleic acid amplification methods having different principles. May be. For example, in addition to the normal PCR method using nucleic acid (template), primer, polymerase, deoxynucleotide triphosphate and buffer, Nested PCR method, inverse PCR method, AP-PCR method, RACE method, degenerate PCR method, etc. Examples of various PCR application methods, LAMP method, ICAN method, LCR method, gapLCR method, SDA method, Qβ replicase amplification method, TAS method, 3SR method, NASBA method, TMA method, and the like.
本発明の核酸増幅反応は、常法に従って行えばよい。例えば、サンプルチューブ等のバッチ式の反応容器を用いたＰＣＲ法であれば、該反応容器に反応液を加え２又は３段階の設定温度に各々所望の時間だけ維持するサイクルを繰り返せばよい。また例えば、マイクロ流体デバイスを反応容器として用いたＰＣＲ法であれば、各設定温度に調節し、適切に配置されたヒートブロック群にデバイスを密着させ、該デバイスの流路に反応液を流し、反応液の温度が所望の温度履歴を受けるようにすればよい。 The nucleic acid amplification reaction of the present invention may be performed according to a conventional method. For example, in the case of a PCR method using a batch-type reaction vessel such as a sample tube, a cycle in which a reaction solution is added to the reaction vessel and maintained at two or three set temperatures for each desired time may be repeated. Also, for example, if the PCR method using a microfluidic device as a reaction vessel, adjust to each set temperature, closely contact the device with a heat block group appropriately arranged, and flow the reaction solution through the flow path of the device, What is necessary is just to make it the temperature of a reaction liquid receive desired temperature history.
（作製例１）
（マイクロ流体デバイス１の作製）
以下の操作によりマイクロ流体デバイスを作製した。その断面模式図を図２に示す。上面からの外観は図１を参照。
(Production Example 1)
(Production of microfluidic device 1)
A microfluidic device was fabricated by the following operation. A schematic sectional view thereof is shown in FIG. See Figure 1 for the appearance from the top.
［活性エネルギー線硬化性組成物（i）の調製］
平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー（大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックＶ−４２６３」）８０質量部、及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアＨＤＤＡ」）を２０質量部、光重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（チバ・スペシャリティ・ケミカルズ社製の「イルガキュア１８４」）５質量部を均一に混合して組成物（i）を調製した。
[Preparation of active energy ray-curable composition (i)]
80 parts by mass of a trifunctional urethane acrylate oligomer having an average molecular weight of 2000 (“Unidic V-4263” manufactured by Dainippon Ink & Chemicals, Inc.) and 1,6-hexanediol diacrylate (“Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.” 20 parts by weight of New Frontier HDDA ") and 5 parts by weight of 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone (" Irgacure 184 "manufactured by Ciba Specialty Chemicals) as a photopolymerization initiator were uniformly mixed to obtain composition (i). Prepared.
［活性エネルギー線硬化性組成物（ii）の調製］
活性エネルギー線硬化性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を６０質量部、「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５質量部を均一に混合して組成物（ii）を調製した。
[Preparation of active energy ray-curable composition (ii)]
As an active energy ray-curable compound, “Unidic V-4263” is 60 parts by mass, “New Frontier HDDA” is 40 parts by mass, “Irgacure 184” is 5 parts by mass as a photopolymerization initiator, and 2,4 as a polymerization retarder. A composition (ii) was prepared by uniformly mixing 0.5 parts by mass of -diphenyl-4-methyl-1-pentene (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.).
［塗膜層の形成］
下基材（７）としてポリアクリレート製の板（１２ｃｍ×３ｃｍ×１ｍｍ；三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」）を用い、これに２０００ｒｐｍ、５０秒間条件のスピンコーターにて組成物（i）を塗布した。下記紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射してこれを半硬化させ、厚さ１０μｍの塗膜（８）を形成した。
[Formation of coating layer]
A polyacrylate plate (12 cm × 3 cm × 1 mm; “Acrylite L 000” manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) was used as the lower substrate (7), and the composition (with a spin coater at 2000 rpm for 50 seconds) i) was applied. The following ultraviolet lamp 1 was irradiated with ultraviolet rays for 3 seconds to be semi-cured to form a coating film (8) having a thickness of 10 μm.
［凹部（流路）の形成］
塗膜（８）の上に、５００ｒｐｍ、３０秒間のスピンコーターにて組成物（ii）を塗工し、該組成物（ii）の未硬化塗膜を形成した。流路形成部を黒色で描画したフォトマスクを通して下記紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行い、組成物（ii）からなる厚さ８０μｍの半硬化塗膜（９）を形成した。非照射部分の未硬化の組成物（ii）をエタノールで除去して、塗膜（８）が底面に露出した幅２００μｍの凹部状の塗膜（９）を形成した。
[Formation of recess (flow path)]
On the coating film (8), the composition (ii) was applied with a spin coater at 500 rpm for 30 seconds to form an uncured coating film of the composition (ii). Ultraviolet irradiation with the following ultraviolet lamp 2 was performed for 120 seconds through a photomask in which the flow path forming portion was drawn in black, thereby forming a semi-cured coating film (9) having a thickness of 80 μm composed of the composition (ii). The uncured composition (ii) in the non-irradiated portion was removed with ethanol to form a concave-shaped coating film (9) having a width of 200 μm with the coating film (8) exposed on the bottom surface.
[蓋の固着]
組成物（i）を、一時的な支持体である１２ｃｍ×５ｃｍ×３０μｍのポリプロピレンフィルム（二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」FOR 30番」）のコロナ放電処理された面上に、１２７μｍのバーコーターにて塗工した。該組成物（i）の未硬化塗膜に、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射し、半硬化塗膜（１０）を形成した。これを蓋として前記凹部状塗膜（９）に張り合わせ、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒間照射して完全に硬化させ、流路（１１）を形成した。その後、不要となったポリプロピレンフィルムを剥離し、除去した。
[Fixing the lid]
The surface of the composition (i) subjected to corona discharge treatment on a 12 cm × 5 cm × 30 μm polypropylene film (“biaxially stretched polypropylene film“ Dazai ”FOR No. 30” manufactured by Nimura Chemical Co., Ltd.) as a temporary support. The coating was performed on a 127 μm bar coater. The uncured coating film of the composition (i) was irradiated with ultraviolet rays from the ultraviolet lamp 1 for 3 seconds to form a semi-cured coating film (10). This was used as a lid and pasted on the concave coating film (9), and the ultraviolet lamp 1 was irradiated with ultraviolet rays for 40 seconds to completely cure, thereby forming a flow path (11). Thereafter, the unnecessary polypropylene film was peeled off and removed.
［開口部の形成］
この後、前記工程において凹部に張り合わせ完全に硬化した塗膜（１０）上に組成物（i）を塗布して塗膜（１２）を形成し、さらにその上に上基材（１３）として、下基材（７）と同じポリアクリレート製の板（三菱レイヨン社製の「アクリライトＬ 000番」）を重ね合わせ、紫外線ランプ１により塗膜全面に紫外線を４０秒間照射し、塗膜（１２）を硬化させた。これにより塗膜（１０）上に塗膜（１２）および上基板（１３）が接着一体化された。
[Formation of opening]
Thereafter, the composition (i) is applied on the coating film (10) which is bonded to the concave portion and completely cured in the above-mentioned step to form a coating film (12), and further, the upper substrate (13) is formed thereon. The same polyacrylate plate (“Acrylite L 000” manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) as the lower substrate (7) is superposed, and the entire surface of the coating film is irradiated with UV light for 40 seconds by the UV lamp 1, and the coating film (12 ) Was cured. Thereby, the coating film (12) and the upper substrate (13) were bonded and integrated on the coating film (10).
次いで、上基板（１３）、塗膜（１２）および塗膜（１０）を通過し流路（１１）に通じる直径１ｍｍの孔を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら２つの孔にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して開口部（５）（６）とした。 Next, holes having a diameter of 1 mm passing through the upper substrate (13), the coating film (12) and the coating film (10) and leading to the flow path (11) are formed at both ends of the flow path using a drill, Polyvinyl chloride pipes having an inner diameter of 3 mm and a height of 5 mm were bonded to these two holes to form openings (5) and (6).
［紫外線ランプ１照射条件］
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。
[Ultraviolet lamp 1 irradiation conditions]
Using a UE031-353CHC type UV irradiation device manufactured by Eye Graphics Co., Ltd. using a 3000 W metal halide lamp as a light source, ultraviolet rays having an ultraviolet intensity at 365 nm of 40 mW / cm 2 were irradiated in a nitrogen atmosphere at room temperature.
［紫外線ランプ２照射条件］
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。
[Ultraviolet lamp 2 irradiation conditions]
Using a light source unit for multi-light 250 W series exposure apparatus manufactured by USHIO INC. Using a 250 W high-pressure mercury lamp as a light source, ultraviolet rays having an ultraviolet intensity at 365 nm of 50 mW / cm 2 were irradiated in a nitrogen atmosphere at room temperature.
（作製例２）
（マイクロ流体デバイス２の作製）
１，６−ヘキサンジオールジアクリレートの変わりにノニルフェノキシポリエチレングリコールアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「Ｎ−１７７Ｅ」）を使用した以外は作製例１と同様の方法にてマイクロ流体デバイスを作製した。
(Production Example 2)
(Production of microfluidic device 2)
A microfluidic device was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that nonylphenoxypolyethylene glycol acrylate (“N-177E” manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) was used instead of 1,6-hexanediol diacrylate. did.
（調製例１）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製）
ＤＮＡポリメラーゼとしてジーンタック（株式会社ニッポンジーン製）を使用し、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰ混合液は該酵素に添付のものを使用した（以下同様）。
１０μｌのＰＣＲ用緩衝液（１０倍濃縮）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ 各２．５ｍＭ）、５μｌのプライマー(１)(primer (1))（１０μＭ；配列番号１）、５μｌのプライマー(２)(primer (2))（１０μＭ；配列番号２）、０．５μｌのジーンタック（５ユニット/μｌ）、テンプレートとして１μlのｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ ｃｏｄｏｎ１２ Ｇｌｙ（１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号３）、さらに滅菌水を加えて１００μｌとし、核酸増幅反応液（１）を調製した。なお、前記ｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ ｃｏｄｏｎ１２ Ｇｌｙ（１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号３）のタンパク質濃度を後述の参考例２により測定したところ０．０ｍｇ／ｍｌであった。
(Preparation Example 1)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution)
GeneTac (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was used as the DNA polymerase, and the PCR buffer solution and dNTP mixed solution attached to the enzyme were used (the same applies hereinafter).
10 μl of PCR buffer (concentrated 10 times), 8 μl of dNTP mixture (dATP, dGTP, dCTP, dTTP 2.5 mM each), 5 μl of primer (1) (primer (1)) (10 μM; SEQ ID NO: 1) 5 μl of primer (2) (primer (2)) (10 μM; SEQ ID NO: 2), 0.5 μl of gene tack (5 units / μl), 1 μl of ras Mutant Set c-Ki-ras codon12 Gly (1 ng) Manufactured by Takara Bio Inc .; SEQ ID NO: 3), and further sterilized water was added to make 100 μl to prepare a nucleic acid amplification reaction solution (1). The protein concentration of the ras Mutant Set c-Ki-ras codon 12 Gly (1 ng; manufactured by Takara Bio Inc .; SEQ ID NO: 3) was measured according to Reference Example 2 to be 0.0 mg / ml.
（調製例２）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／グリセロール）
調製例１と同様の方法で核酸増幅反応液（２）を準備した。ただし、反応液中にグリセロールを２０質量％となるように添加した。
（調製例３）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
まず初めに、界面活性剤としてポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」）に水を加え２５質量％の界面活性剤含有水溶液を調製した。
次に、４μｌのＰＣＲ用緩衝液（１０倍濃縮）、３．２μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ 各２．５ｍＭ）、２μｌのプライマー(３)(primer (3))（１０μＭ；配列番号４）、２μｌのプライマー(４)(primer (4))（１０μＭ；配列番号５）、０．２μｌのジーンタック（５ユニット/μｌ）、テンプレートとして１μlのｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ ｃｏｄｏｎ１２ Ｇｌｙ（１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号３）、８μlの前記界面活性剤含有水溶液を混合し、さらに滅菌水を加えて全体を４０μｌとし、核酸増幅反応液（３）を調製した。
（調製例４）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／Ｔｗｅｅｎ ２０）
界面活性剤ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＩＣＮ社製の「Ｔｗｅｅｎ ２０」）を用いた以外は調製例３と同様の方法で核酸増幅反応液（４）を準備した。
（調製例５）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／Ｔｗｅｅｎ ８０）
界面活性剤ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＩＣＮ社製の「Ｔｗｅｅｎ ８０」）を用いた以外は調製例３と同様の方法で核酸増幅反応液（５）を準備した。
（調製例６）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／Ｂｒｉｊ ９７）
界面活性剤ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（ＳＩＧＭＡ社製の「Ｂｒｉｊ ９７」）を用いた以外は調製例３と同様の方法で核酸増幅反応液（６）を準備した。
（調製例７）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製／ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）
界面活性剤ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０」）を用いた以外は調製例３と同様の方法で核酸増幅反応液（７）を準備した。
（調製例８）
（核酸増幅反応（Ｃｅｌｌ ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ）液の調製／Ｔｗｅｅｎ ８０）
調製例５と同様の方法で核酸増幅反応液（８）を準備した。ただし、ｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ ｃｏｄｏｎ１２ Ｇｌｙの代わりに５μlの細胞懸濁液を用いた。細胞懸濁液は頬の内側から掻き取ったヒト頬粘膜細胞を蒸留水で洗浄し遠心分離で回収した後、再び蒸留水に懸濁して調製した。なお、前記細胞懸濁液のタンパク質濃度を後述の参考例２により測定したところ１．０ｍｇ／ｍｌであった。
（調製例９）
（核酸増幅反応（ＰＣＲ）液の調製）
プライマー(１)(primer (1))（１０μＭ；配列番号１）、及びプライマー(２)(primer (2))（１０μＭ；配列番号２）の代わりにプライマー(３)(primer (3))（１０μＭ；配列番号４）、及びプライマー(４)(primer (4))（１０μＭ；配列番号５）を用いた以外は調製例１と同様の方法で核酸増幅反応液（９）を準備した。
(Preparation Example 2)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution / glycerol)
A nucleic acid amplification reaction solution (2) was prepared in the same manner as in Preparation Example 1. However, glycerol was added to the reaction solution so as to be 20% by mass.
(Preparation Example 3)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution / Triton X-100)
First, water was added as a surfactant to polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (“Triton X-100” manufactured by ICN) to prepare a 25% by mass surfactant-containing aqueous solution.
Next, 4 μl of PCR buffer (10-fold concentration), 3.2 μl of dNTP mixture (dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 2.5 mM), 2 μl of primer (3) (primer (3)) (10 μM SEQ ID NO: 4) 2 μl of primer (4) (primer (4) (10 μM; SEQ ID NO: 5), 0.2 μl of gene tack (5 units / μl), 1 μl of ras Mutant Set c-Ki- as template ras codon 12 Gly (1 ng; manufactured by Takara Bio Inc .; SEQ ID NO: 3) and 8 μl of the surfactant-containing aqueous solution were mixed, and sterilized water was added to make a total of 40 μl to prepare a nucleic acid amplification reaction solution (3). .
(Preparation Example 4)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution / Tween 20)
Prepared except that polyoxyethylene sorbitan monolaurate ("Tween 20" from ICN) was used instead of surfactant polyoxyethylene (10) octylphenyl ether ("Triton X-100" from ICN). A nucleic acid amplification reaction solution (4) was prepared in the same manner as in Example 3.
(Preparation Example 5)
(Nucleic acid amplification reaction (PCR) solution preparation / Tween 80)
Prepared except that polyoxyethylene sorbitan monooleate (“Tween 80” from ICN) was used instead of surfactant polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (“Triton X-100” from ICN) A nucleic acid amplification reaction solution (5) was prepared in the same manner as in Example 3.
(Preparation Example 6)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution / Brij 97)
The surfactant polyoxyethylene (10) octyl phenyl ether (“Triton X-100” manufactured by ICN) was used in place of polyoxyethylene (10) oleyl ether (“Brij 97” manufactured by SIGMA). A nucleic acid amplification reaction solution (6) was prepared in the same manner as in Preparation Example 3.
(Preparation Example 7)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution / IGEPAL CA-630)
Instead of surfactant polyoxyethylene (10) octylphenyl ether ("Triton X-100" manufactured by ICN), polyoxyethylene (9) octylphenyl ether ("IGEPAL CA-630" manufactured by ICN) was used. A nucleic acid amplification reaction solution (7) was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that
(Preparation Example 8)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (Cell direct PCR) solution / Tween 80)
A nucleic acid amplification reaction solution (8) was prepared in the same manner as in Preparation Example 5. However, 5 μl of cell suspension was used in place of ras Mutant Set c-Ki-ras codon 12 Gly. The cell suspension was prepared by washing human buccal mucosal cells scraped from the inside of the cheek with distilled water and collecting it by centrifugation, and then suspending it again in distilled water. In addition, it was 1.0 mg / ml when the protein concentration of the said cell suspension was measured by the below-mentioned reference example 2.
(Preparation Example 9)
(Preparation of nucleic acid amplification reaction (PCR) solution)
Instead of primer (1) (primer (1)) (10 μM; SEQ ID NO: 1) and primer (2) (primer (2) (10 μM; SEQ ID NO: 2), primer (3) (primer (3)) ( A nucleic acid amplification reaction solution (9) was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that 10 μM; SEQ ID NO: 4) and primer (4) (primer (4)) (10 μM; SEQ ID NO: 5) were used.
（実施例１）
（マイクロ流体デバイス１／ＢＳＡ前処理／ＰＣＲ）
作製例１で作製したマイクロ流体デバイスの流路に５質量％のＢＳＡ水溶液を満たし、約１時間室温に放置した。その後、流路に水を２ｍｌ流して洗浄した。
このＢＳＡ前処理デバイスを３つのヒートブロックから成るヒーター上に、図１に示す位置に固定した。ヒートブロック（Ａ）を９０℃、ヒートブロック（Ｂ）を７２℃、ヒートブロック（Ｃ）を５５℃に設定した。
調製例１で調製した核酸増幅反応液（１）２５μlをデバイスの開口部（入口）に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＩＣ３２００）を接続し、５μｌ/分にて送液した。これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。目的とするバンドが検出され（図３）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
Example 1
(Microfluidic device 1 / BSA pretreatment / PCR)
The flow path of the microfluidic device manufactured in Preparation Example 1 was filled with a 5% by mass BSA aqueous solution and left at room temperature for about 1 hour. Thereafter, 2 ml of water was passed through the flow path for washing.
The BSA pretreatment device was fixed on the heater composed of three heat blocks at the position shown in FIG. The heat block (A) was set at 90 ° C, the heat block (B) at 72 ° C, and the heat block (C) at 55 ° C.
25 μl of the nucleic acid amplification reaction solution (1) prepared in Preparation Example 1 is injected into the opening (inlet) of the device, and a microsyringe pump (IC3200 manufactured by kd Scientific) is further connected to the opening and sent at 5 μl / min. Liquid. Thereby, the nucleic acid amplification reaction solution passes over the heat blocks (A), (B), (C), (B), (A), (B), (C). In the process, an enzyme reaction for nucleic acid amplification occurred.
As a result of the reaction, it was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid was amplified. The target band was detected (FIG. 3), thus confirming that the nucleic acid amplification reaction using the microfluidic device proceeded normally.
（実施例２）
（マイクロ流体デバイス２／グリセロール添加／ＰＣＲ）
作製例２で作製したマイクロ流体デバイス２を３つの金属ブロックから成るヒーター上に、図１に示す位置に固定した。ヒートブロック（Ａ）を９０℃、ヒートブロック（Ｂ）を７２℃、ヒートブロック（Ｃ）を５５℃に設定した。
調製例２で調製した核酸増幅反応液（２）２５μlをデバイスの開口部（入口）に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＩＣ３２００）を接続し、５μｌ/分にて送液した。これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。目的とするバンドが検出され（図４）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
(Example 2)
(Microfluidic device 2 / Glycerol addition / PCR)
The microfluidic device 2 produced in Production Example 2 was fixed at the position shown in FIG. 1 on a heater composed of three metal blocks. The heat block (A) was set at 90 ° C, the heat block (B) at 72 ° C, and the heat block (C) at 55 ° C.
25 μl of the nucleic acid amplification reaction solution (2) prepared in Preparation Example 2 is injected into the opening (inlet) of the device, and a microsyringe pump (IC3200 manufactured by kd Scientific) is further connected to the opening and sent at 5 μl / min. Liquid. Thereby, the nucleic acid amplification reaction solution passes over the heat blocks (A), (B), (C), (B), (A), (B), (C). In the process, an enzyme reaction for nucleic acid amplification occurred.
As a result of the reaction, it was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid was amplified. The target band was detected (FIG. 4), thus confirming that the nucleic acid amplification reaction using the microfluidic device proceeded normally.
（実施例３）
（マイクロ流体デバイス１／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＣＲ）
作製例１で作製したマイクロ流体デバイス１を３つのヒートブロックから成るヒーター上に、図１に示す位置に固定した。ヒートブロック（Ａ）を９０℃、ヒートブロック（Ｂ）を７２℃、ヒートブロック（Ｃ）を５５℃に設定した。
調製例３で調製した核酸増幅反応液（３）４０μlをデバイスの開口部（入口）に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＩＣ３２００）を接続し、５μｌ/分にて送液した。これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序でその上を通過し、その過程で核酸増幅の酵素反応が起こった。
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。目的とするバンドが検出され（図５）、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
（実施例４）
（マイクロ流体デバイス１／Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＣＲ）
実施例３と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例４で調製した核酸増幅反応液（４）を用いた。その結果、目的とするバンドが検出され（図６）、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
（実施例５）
（マイクロ流体デバイス１／Ｔｗｅｅｎ ８０／ＰＣＲ）
実施例３と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例５で調製した核酸増幅反応液（５）を用いた。その結果、目的とするバンドが検出され（図７）、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
（実施例６）
（マイクロ流体デバイス１／Ｂｒｉｊ ９７／ＰＣＲ）
実施例３と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例６で調製した核酸増幅反応液（６）を用いた。その結果、目的とするバンドが検出され（図８）、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
（実施例７）
（マイクロ流体デバイス１／ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＰＣＲ）
実施例３と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例７で調製した核酸増幅反応液（７）を用いた。その結果、目的とするバンドが検出され（図９）、核酸増幅反応が正常に進行したことが確認された。
(Example 3)
(Microfluidic device 1 / Triton X-100 / PCR)
The microfluidic device 1 produced in Production Example 1 was fixed at the position shown in FIG. 1 on a heater composed of three heat blocks. The heat block (A) was set at 90 ° C, the heat block (B) at 72 ° C, and the heat block (C) at 55 ° C.
40 μl of the nucleic acid amplification reaction solution (3) prepared in Preparation Example 3 is injected into the opening (inlet) of the device, and a micro syringe pump (IC3200 manufactured by kd Scientific) is further connected to the opening and sent at 5 μl / min. Liquid. Thereby, the nucleic acid amplification reaction solution passes over the heat blocks (A), (B), (C), (B), (A), (B), (C). In the process, an enzyme reaction for nucleic acid amplification occurred.
As a result of the reaction, it was verified by agarose gel electrophoresis according to a conventional method that the nucleic acid was amplified. The target band was detected (FIG. 5), and it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction proceeded normally.
Example 4
(Microfluidic device 1 / Tween 20 / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Example 3. However, the nucleic acid amplification reaction solution (4) prepared in Preparation Example 4 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, the target band was detected (FIG. 6), and it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction proceeded normally.
(Example 5)
(Microfluidic device 1 / Tween 80 / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Example 3. However, the nucleic acid amplification reaction solution (5) prepared in Preparation Example 5 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, the target band was detected (FIG. 7), and it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction proceeded normally.
(Example 6)
(Microfluidic device 1 / Brij 97 / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Example 3. However, the nucleic acid amplification reaction solution (6) prepared in Preparation Example 6 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, the target band was detected (FIG. 8), and it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction proceeded normally.
(Example 7)
(Microfluidic device 1 / IGEPAL CA-630 / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Example 3. However, the nucleic acid amplification reaction solution (7) prepared in Preparation Example 7 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, the target band was detected (FIG. 9), and it was confirmed that the nucleic acid amplification reaction proceeded normally.
（比較例１）
（マイクロ流体デバイス１／酵素阻害抑制成分未処理／ＰＣＲ）
作製例１で作製したマイクロ流体デバイス１を３つのヒートブロックから成るヒーター上に、図１に示す位置に固定した。ヒートブロック（Ａ）を９０℃、ヒートブロック（Ｂ）を７２℃、ヒートブロック（Ｃ）を５５℃に設定した。
調製例１で調製した核酸増幅反応液（１）２５μlをデバイスの開口部（入口）に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＩＣ３２００）を接続し、５μｌ/分にて送液した。これにより、該核酸増幅反応液はヒートブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序でその上を通過した。
反応の結果、核酸が増幅されたか否かを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって調べた。バンドは全く検出されず（図１０）、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。
(Comparative Example 1)
(Microfluidic device 1 / Enzyme inhibition inhibitor component untreated / PCR)
The microfluidic device 1 produced in Production Example 1 was fixed at the position shown in FIG. 1 on a heater composed of three heat blocks. The heat block (A) was set at 90 ° C, the heat block (B) at 72 ° C, and the heat block (C) at 55 ° C.
25 μl of the nucleic acid amplification reaction solution (1) prepared in Preparation Example 1 is injected into the opening (inlet) of the device, and a microsyringe pump (IC3200 manufactured by kd Scientific) is further connected to the opening and sent at 5 μl / min. Liquid. Thus, the nucleic acid amplification reaction solution passed over the heat blocks (A), (B), (C), (B), (A), (B), (C).
As a result of the reaction, whether or not the nucleic acid was amplified was examined by agarose gel electrophoresis according to a conventional method. No band was detected (FIG. 10), indicating that the nucleic acid amplification reaction did not proceed.
（比較例２）
（マイクロ流体デバイス２／酵素阻害抑制成分未処理／ＰＣＲ）
作製例２で作製したマイクロ流体デバイス２と調製例１で調整した核酸増幅反応液（１）２５μlとを用い、比較例１と同様の方法にてＰＣＲ及びその結果解析を行った。バンドは検出されたものの、その分子量は目的とするものとは異なり（図１１）、正常な核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。
(Comparative Example 2)
(Microfluidic device 2 / Enzyme inhibition inhibitor component untreated / PCR)
Using the microfluidic device 2 produced in Production Example 2 and 25 μl of the nucleic acid amplification reaction solution (1) prepared in Preparation Example 1, PCR and the results were analyzed in the same manner as in Comparative Example 1. Although a band was detected, its molecular weight was different from the intended one (FIG. 11), and it was found that normal nucleic acid amplification reaction did not proceed.
（比較例３）
（マイクロ流体デバイス１／酵素阻害抑制成分未処理／ＰＣＲ）
比較例１と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例９で調製した核酸増幅反応液（９）を用いた。その結果、バンドは全く検出されず（図１２）、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。
（比較例４）
（マイクロ流体デバイス１／Ｔｗｅｅｎ ８０／ＰＣＲ（Ｃｅｌｌ ｄｉｒｅｃｔ））
実施例３と同様にして核酸増幅反応を行った。ただし、核酸増幅反応液は調製例８で調製した核酸増幅反応液（８）を用いた。その結果、特異的増幅（１０７ｂｐ）を示すバンドは検出されず（図１３）、核酸増幅反応が進行しなかったことが判明した。
(Comparative Example 3)
(Microfluidic device 1 / Enzyme inhibition inhibitor component untreated / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Comparative Example 1. However, the nucleic acid amplification reaction solution (9) prepared in Preparation Example 9 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, no band was detected (FIG. 12), and it was found that the nucleic acid amplification reaction did not proceed.
(Comparative Example 4)
(Microfluidic device 1 / Tween 80 / PCR (Cell direct))
A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in Example 3. However, the nucleic acid amplification reaction solution (8) prepared in Preparation Example 8 was used as the nucleic acid amplification reaction solution. As a result, it was found that a band indicating specific amplification (107 bp) was not detected (FIG. 13), and the nucleic acid amplification reaction did not proceed.
（参考例１）
（ガラス製マイクロ流体デバイス／酵素阻害抑制成分未処理／ＰＣＲ）
常法に従って作製したガラス製マイクロ流体デバイス、及び調製例９で調製した核酸増幅反応液（９）２５μlを用いた以外は比較例１と同様にして核酸増幅反応を行った。増幅の有無をアガロースゲル電気泳動によって解析した結果、目的とするバンドが検出された（図１４）。これにより、ガラス製マイクロ流体デバイスを用いた場合には、阻害物質漏出などに起因する反応阻害問題は起きず、正常に反応が進行することが確認された。
（参考例２）
（タンパク質濃度測定）
日本バイオラッドラボラトリーズ社製Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを使用して測定した。測定手順は、該キット商品に添付されている説明書４〜６頁（Ｓｅｃｔｉｏｎ２ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ２．１〜２．３）を参考にした。
調製例１記載のｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ ｃｏｄｏｎ１２ Ｇｌｙ溶液（試料Ａ）は蒸留水で３倍希釈し（試料Ｂ）、Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを参考に測定した。即ち、
１．サンプルチューブに試料Ｂ２０μlとＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ液（薬液Ａ）５μlを加え、撹拌した。
２．室温にて約１０分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて５９５ｎｍの吸収を測定した。
３．同様の操作で予め作成した検量線（標準物質として牛血清アルブミンを使用）を基に試料Ｂのタンパク質濃度を算出した。これを３倍し、試料Ａの値とした。
その結果、試料Ａのタンパク質濃度は０．０ｍｇ／ｍｌと判明した。
調製例７記載の細胞懸濁液（試料Ｃ）は蒸留水で３倍希釈し（試料Ｄ）、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅで測定した。即ち、
１．Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ液（薬液Ａ）を蒸留水で５倍希釈し、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で濾過した（薬液Ｂ）。
２．試験管に前記試料Ｄ１００μlと前記薬液Ｂ５ｍｌを加え、撹拌した。
３．室温にて約１０分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて５９５ｎｍの吸収を測定した。
４．同様の操作で予め作成した検量線（標準物質として牛血清アルブミンを使用）を基に試料Ｄのタンパク質濃度を算出した。これを３倍し、試料Ｃの値とした。
その結果、試料Ｃのタンパク質濃度は１．０ｍｇ／ｍｌと判明した。
(Reference Example 1)
(Glass microfluidic device / untreated enzyme inhibition component / PCR)
A nucleic acid amplification reaction was carried out in the same manner as in Comparative Example 1 except that 25 μl of a glass microfluidic device produced according to a conventional method and the nucleic acid amplification reaction solution (9) prepared in Preparation Example 9 were used. As a result of analyzing the presence or absence of amplification by agarose gel electrophoresis, the target band was detected (FIG. 14). As a result, it was confirmed that when the glass microfluidic device was used, the reaction proceeded normally without causing the reaction inhibition problem due to the leakage of the inhibitory substance.
(Reference Example 2)
(Protein concentration measurement)
Measurement was performed using Bio-Rad Protein Assay manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories. The measurement procedure was based on the instructions 4 to 6 pages (Section 2 Instructions 2.1 to 2.3) attached to the kit product.
The ras Mutant Set c-Ki-ras codon 12 Gly solution (Sample A) described in Preparation Example 1 was diluted 3 times with distilled water (Sample B) and measured with reference to the Microassay Procedure. That is,
1. 20 μl of sample B and 5 μl of Bio-Rad Protein Assay solution (chemical solution A) were added to the sample tube and stirred.
2. After incubating at room temperature for about 10 minutes, a portion thereof was taken and the absorption at 595 nm was measured with a spectrophotometer.
3. The protein concentration of sample B was calculated based on a calibration curve (using bovine serum albumin as a standard substance) prepared in advance by the same operation. This was tripled to obtain the value of Sample A.
As a result, the protein concentration of Sample A was found to be 0.0 mg / ml.
The cell suspension described in Preparation Example 7 (Sample C) was diluted 3 times with distilled water (Sample D) and measured by the Standard Procedure. That is,
1. Bio-Rad Protein Assay solution (chemical solution A) was diluted 5-fold with distilled water and filtered through filter paper (Whatman # 1) (chemical solution B).
2. 100 μl of the sample D and 5 ml of the drug solution B were added to a test tube and stirred.
3. After incubating at room temperature for about 10 minutes, a portion thereof was taken and the absorption at 595 nm was measured with a spectrophotometer.
4). The protein concentration of sample D was calculated based on a calibration curve (using bovine serum albumin as a standard substance) prepared in advance by the same operation. This was multiplied by 3 to obtain the value of Sample C.
As a result, the protein concentration of Sample C was found to be 1.0 mg / ml.
１ 変性温度に設定したヒートブロック
２ 伸長反応温度に設定したヒートブロック
３ アニーリング温度に設定したヒートブロック
４ マイクロ流体デバイス
５，６ 開口部（入口、出口）
７ 下基材
８，９，１０，１２ 塗膜
１１ 流路
１３ 上基材
1 Heat block set to denaturation temperature 2 Heat block set to elongation reaction temperature 3 Heat block set to annealing temperature 4 Microfluidic devices 5, 6 Openings (inlet, outlet)
7 Lower substrate 8, 9, 10, 12 Coating 11 Channel 13 Upper substrate
Claims (1)
前記反応液が、予め核酸精製処理を施しテンプレートとして利用可能な核酸を含む反応液であることを特徴とする核酸増幅方法。 A method of amplifying nucleic acid in the presence of an enzyme using a reactor in which at least a part of the contact surface with the reaction solution is composed of an active energy ray curable resin, bovine serum albumin as a nucleic acid amplification inhibition inhibitor component, A method for amplifying nucleic acid comprising the step of adding at least one of a surfactant or glycerol to a reactor ,
A nucleic acid amplification method , wherein the reaction solution is a reaction solution containing a nucleic acid that has been subjected to a nucleic acid purification treatment in advance and can be used as a template .
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