JP4590117B2

JP4590117B2 - Immunoassay reagent

Info

Publication number: JP4590117B2
Application number: JP2001045316A
Authority: JP
Inventors: 勉本庄; 治樹柴田; 政則杉谷; 慎一豆越
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2021-02-21
Also published as: JP2002243740A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、高い感度を有する免疫測定試薬及びキット並びにその製造方法に関し、特に、インスリンを高感度に測定する免疫測定試薬及びキット並びにその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
インスリンは血糖降下作用をもつホルモンとして広く知られており、その血中濃度を測定することは糖尿病の診断や病態の把握に不可欠である。
【０００３】
このようなヒト血中インスリン濃度の測定は、当初、放射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイで行われてきたが、後に酵素免疫測定法が確立され、これもインスリンの測定に応用されるようになってきており、したがって、当該免疫測定キットとしてはラジオイムノアッセイや酵素免疫測定法を利用したキットが臨床診断薬キット等の目的で市販されている。
【０００４】
しかしながら、上記いずれのキットも、測定試料として数十マイクロリットルから百マイクロリットル程度の試料を必要とし、測定感度は数百ｐｇ／ｍｌ程度に過ぎない。
【０００５】
一方、近年、糖尿病研究が盛んになるにつれて、実験動物でのインスリン測定の必要性も増大してきている。
【０００６】
このような実験動物でのインスリン測定においても、従来はヒトインスリン測定試薬が用いられ、その抗体の交差反応性を利用して実験動物のインスリンが測定されてきた。しかしながら、標準品としてヒトインスリンを用いることで動物インスリン濃度の真の値が得られないという問題があったことから、実験動物専用の測定試薬が期待されるようになった。
【０００７】
このため、ラットインスリン測定用ラジオイムノアッセイ法が最初に開発され、米国ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｃｈ社、英国Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国Ｉｎｋｓｔａｒ社等から市販されるに至った。これらのキットには、標準品としてラットインスリンが添付されており、ヒトインスリンを標準物質として用いることによるトラブルは回避されるようになった。
【０００８】
しかし、そのようなキットでは、依然、用いる試料の容量がヒトインスリン測定キットと同じ約１００マイクロリットル程度であり、また、後の実験に支障をきたさないように一匹の動物から得ることのできる血液の量にも限界があるため、実験には必然的に多数の動物を使う必要が生じた。とりわけ、体重がラットの十分の一程度のマウスを用いる実験においては、一つのデータを取るために複数のマウスを犠牲にする必要があり、後の実験が不可能となる場合さえあった。
【０００９】
上記の問題を解決するために、従来の測定試薬と同程度の感度を有し、且つ微量の試料でも測定可能な方法が開発された。当該測定試薬は、本件出願人の他、株式会社シバヤギやスウェーデンのＭｅｒｃｏｄｉａ社からも販売されている。
【００１０】
しかしながら、たとえ微量試料で測定可能な上記の試薬であっても、それが従来の測定試薬と同程度の感度では測定に不十分な場合がある。例えば、ストレプトゾトシン処理ラットやマウスに代表されるＩ型糖尿病のモデル等が示すような、低濃度の血中インスリンを測定する場合等には、より高い測定感度が要求される。この場合、従来の測定試薬を用いつつ、逆に、比較的大量の血清を試料とすれば、当該血清中に含まれている多量の抗原抗体反応阻害物質により反応系が影響され、その影響を無視できなくなる。したがって、上記のような低濃度の血中インスリン測定等に際しても有効な、極めて高い感度を有する免疫測定試薬の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度を有する免疫測定試薬及びキットを提供することを課題とする。
【００１２】
殊に、糖尿病の治療や研究においては血中インスリンの濃度を測定することが必須であり、Ｉ型糖尿病患者やストレプトゾトシン処理動物等の血中インスリン濃度をも測定できる試薬が求められている。とりわけ、実験用小動物の血中インスリン濃度を測定するにはヒトインスリン測定に用いられるような１００マイクロリットルの試料を用いるのではなく、できるだけ小容量の試料で測定できる極めて高い感度の測定系が必要とされている。
【００１３】
したがって、本願の免疫測定試薬及びキットは、インスリンの濃度を測定する際に有利に使用され得る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記のとおり、本願発明は、従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度を有する免疫測定試薬及びキットを提供することを課題とする。
【００１５】
ここで、インスリンを例にとれば、現在市販されているインスリン測定試薬やインスリン測定診断薬の多くには、その特異性を高めるためにマウスを用いて作製された「モノクローナル抗体」が使用されている。
【００１６】
ところが、これらのモノクローナル抗体は、その特異性にも拘らず、一般的に抗原（インスリン）に対する親和性がポリクローナル抗体に比べて低く、そのため当該モノクローナル抗体を用いたインスリン測定法の感度には自ずと一定の限界があった。
【００１７】
すなわち、モノクローナル抗体は単一分子であるが故に、その特異性も高いことが利点ではあるが、その抗原に対する親和性もまた単一である。一般に、モノクローナル抗体の結合定数は１０^８程度、高くても１０^９が限度であり、１０^１０程度の非常に高い結合定数を持つモノクローナル抗体を分離するのは容易ではない。
【００１８】
これとは対照的に、ポリクローナル抗体は複数の抗体分子の混合物であり、したがって、それが認識する抗原上のエピトープは単一ではないが、その親和性もまた単一ではなく、適当な方法で免疫された抗血清の中には１０^１０程度の非常に高い結合定数を持つ抗体も含まれる場合がある。とすれば、これらの高い結合定数を有する抗体をポリクローナル抗体としてそのまま測定に利用することにより、当該測定系の感度を上げ得ることが期待される。
【００１９】
ところが、上記のとおり、ポリクローナル抗体には親和性が高い抗体分子が含まれるという利点がある反面、それが抗原分子上の異なるエピトープを認識する抗体分子の集合体であるという欠点も有している。しかも、各免疫動物毎に血中に含まれる抗体分子の比率や量、抗原分子に対する親和性が異なるため、同じ性質を持つ抗血清を安定的に得るには同じ条件で免疫した動物の抗血清を少なくとも数十匹分、理想的には数百匹分をプールし、そこからポリクローナル抗体を調製しなければならないという欠点を有するものであった。したがって、その高い親和性にも拘らず、ポリクローナル抗体の免疫測定法への使用は、近年、一般的ではなかった。
【００２０】
しかしながら、本発明者らは、インスリン測定系の開発を進める過程で、驚くべきことに、インスリン免疫したモルモットの抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）が優先的に認識するエピトープは免疫モルモット個体毎に異なり、極端な例ではその特異性がモノクローナル抗体に近い場合があることを見いだした。
【００２１】
更に、本発明者らは、上記のモノクローナル抗体に似た反応性（特異性）を有するという性質と、インスリンに対して非常に高い親和性を持つことの二つの条件を併せ持つポリクローナル抗体を利用することにより、インスリンの測定感度を上昇させる得ることを想到した。
【００２２】
すなわち、インスリン分子上の、互いに異なるエピトープを優先的に認識する２以上の高親和性ポリクローナル抗体を選択して組み合わせることにより、従来用いられてきた測定試薬より高感度な測定系を組み立てることに成功した。したがって、本願発明の第１は、
（１）少なくとも２以上のポリクローナル抗体試薬を含む免疫測定キットの製造方法であって、当該ポリクローナル抗体試薬は、互いに抗原上の異なるエピトープを優先的に認識するように選択されることを特徴とする、前記キットの製造方法である。
【００２３】
より詳細には、モノクローナル抗体に匹敵する特異性を有し、且つモノクローナル抗体に比べて高い親和性を有する幾つかのポリクローナル抗体を個々の免疫動物の抗血清から得た場合でも、それらを単に任意に組み合わせて、キャプチャー側（固定化抗体側）及び検出側（標識抗体側）の各試薬に用いたのでは、当該ポリクローナル抗体試薬間でエピトープの競合が起って、折角の検出感度が損なわれてしまう場合がある。例えば、キャプチャー側と検出側のポリクローナル抗体試薬が同一のエピトープを優先的に認識したのでは、キャプチャー側のポリクローナル抗体試薬が優先的に認識するべきエピトープが、先に検出側のポリクローナル抗体試薬に優先的に認識されてしまい、当該エピトープが検出側の抗体試薬によって前もって塞がれてもはやキャプチャー側と結合し得なくなり、そのことでサンドイッチアッセイの検出感度が低下する惧れがあるのである。
【００２４】
これに対し、本願のように、キャプチャー側と検出側が優先的に認識するエピトープが異なったものとなるように夫々を選択して組み合わせれば、上記のようなエピトープの競合が起こらず、したがって、互いのポリクローナル抗体が有するモノクローナル抗体に比べた高い親和性が損われることがなく、結果として高い感度を達成することが可能なのである。
【００２５】
更に、このような選択及び組み合わせは、均質で安定的な免疫測定キットの供給をも可能にするのである。
【００２６】
従来のように、均質なポリクローナル抗体を得る目的で複数の免疫動物からの抗血清を一旦プールし、そこからポリクローナル抗体を得て免疫測定キットの試薬として使用すると、個々のポリクローナル抗体が有する有利な特徴であるモノクローナル抗体に似た高い特異性と、抗原に対する高い親和性が希釈及び／または相殺されて、ポリクローナル抗体を使用する本願の利点が失われてしまう結果となる。
【００２７】
これに対し、本願のようにポリクローナル抗体を選択すれば、均質で安定的なキットを与えるように各ポリクローナル抗体を簡便に組み合わせることができ、抗血清をプールする必要がなくなるのである。
【００２８】
さて、以上の観点からすれば、本願の免疫測定キットの製造方法においては各免疫動物から得られる抗血清に含まれるポリクローナル抗体のエピトープに対する特異性を迅速に判別することが更に望ましい。したがって、本願発明の第２は、
（２）上記（１）に記載の免疫測定キットの製造方法であって、該方法は；
（イ）少なくとも２以上の免疫動物から各々の抗血清を得；
（ロ）該免疫動物を免疫した抗原に対する特定のモノクローナル抗体と該抗血清との間でのエピトープの競合を検査し；
（ハ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示す抗血清からキャプチャー側または検出側のポリクローナル抗体試薬を調製し；そして
（ニ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示さない抗血清から他方のポリクローナル抗体試薬を調製することを特徴とする、
前記キットの製造方法である。
【００２９】
上記の構成によれば、特定のモノクローナル抗体は単一のエピトープを認識するので、当該モノクローナル抗体とのエピトープの競合を指標にすることで、ポリクローナル抗体同士のエピトープの競合も迅速に特徴付けることが可能である。すなわち、特定のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す抗血清は、そこに含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）が当該エピトープ若しくはその近傍を優先的に認識していると考えられる。一方、モノクローナル抗体との間でエピトープの競合が起こらなければ、その抗血清は当該エピトープとは別の、離れたエピトープを優先的に認識する抗体群（ポリクローナル抗体）を含むと判別できるのである。
【００３０】
なお、上記の判別は、特定のポリクローナルを固相化して、サンドイッチアッセイ法の原理を利用して行うのが更に簡便である。したがって、本願発明の第３は、
（３）上記特定のモノクローナル抗体と抗血清の間でのエピトープの競合の検査が；
（イ）一定濃度の抗原と抗血清の混合溶液を調製し；
（ロ）該溶液内で抗原抗体結合体を形成させ；
（ハ）次いで、該混合溶液を、上記特定のモノクローナル抗体の固相化体に添加し；そして、
（ニ）該固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した（ロ）の抗原抗体結合体の量を測定することを特徴とする、
上記（２）に記載の方法である。
【００３１】
上記において、固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した抗原抗体結合体の量の測定は、抗血清に含まれる抗体分子に特異的に反応する酵素標識抗体を用いて、「固相化モノクローナル抗体」−「抗原」−「抗血清由来の抗体分子」−「酵素標識抗体」の４分子結合体を形成させることで容易に測定できる。例えば、抗原がマウスインスリンであり、免疫動物がモルモットである場合は、「固相化マウスインスリンモノクローナル抗体」−「マウスインスリン」−「モルモット由来の抗インスリン抗体（ＩｇＧ）」−「抗モルモットＩｇＧ抗体（酵素標識付き）」である。酵素標識抗体の固相支持体への結合量が少ないことは、固相化モノクローナル抗体と抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）との間にエピトープ競合があったことを示し、逆に当該結合量が多いことは、エピトープの競合が少なかったことを示す。
【００３２】
なお、抗原と抗血清との混合による上記抗原抗体結合体の形成は、固相化モノクローナル抗体との接触（添加）と同時に行われてもよい。
【００３３】
更に、上記サンドイッチアッセイにおいては、検査する抗血清を段階的に希釈してその用量依存性を調べることが、エピトープの競合の判別において有利である。したがって、本願発明の第４は、
（４）上記一定濃度の抗原と混合される抗血清の濃度を段階的に希釈して上記抗原抗体結合体量を測定することを特徴とする、上記（３）に記載の方法である。
【００３４】
なお、本願発明に用いることのできるポリクローナル抗体試薬は、ポリクローナル抗体自身のほか、そのいかなる反応性のフラグメント、例えばポリクローナル抗体の酵素消化体をも含み得る。好適な酵素消化体は、抗体分子をペプシンで消化したＦ（ａｂ’）_２フラグメントであり、そのようなフラグメントの使用は高感度測定では必須とされるバックグラウンドの低減に有効である。したがって、本願発明の第５及び第６は、
（５）ポリクローナル抗体試薬の少なくとも１つが抗体分子の酵素消化体から調製される、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法であり、
（６）上記酵素消化体が抗体分子のＦ（ａｂ’）_２フラグメントである、上記（５）に記載の方法である。
【００３５】
本願発明の方法は、抗原の分子量が約５０００以下のような場合に特に有効である。そのような抗原では、固体に認識されるエピトープの数がそれほど多くないため、任意のポリクローナル抗体の組み合わせの結果生じるポリクローナル抗体試薬間でエピトープの競合が起こりやすいからであり、そのような場合に本願のような特定のポリクローナル抗体どうしの組み合わせが有効になるのである。
【００３６】
抗原がインスリンである場合が特に有利である。したがって、本願発明の第７は、
（７）測定対象がインスリンである、上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法である。
【００３７】
また、ポリクローナル抗体の生産性の観点等から、抗原がインスリンであるときは免疫動物としてモルモットを用いることが有利である。したがって、本願発明の第８は、
（８）ポリクローナル抗体がモルモットを免疫動物として得られる、上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法である。
【００３８】
更に本願は、上記のような、エピトープの競合を起こさないポリクローナル抗体の組み合わせ、特に、抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示すようなポリクローナル抗体と、競合を示さないようなポリクローナル抗体を組み合わせた免疫測定キットにも関する。したがって、本願発明の第９乃至１５は、
（９）測定対象である抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す第１のポリクローナル抗体試薬と、該モノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示さない第２のポリクローナル抗体試薬を含む免疫測定キット、
（１０）サンドイッチアッセイのための上記（９）の免疫測定キットであって、上記第１のポリクローナル抗体試薬がキャプチャー側または検出側であり、上記第２のポリクローナル抗体試薬がその他方の側である前記キット、
（１１）上記ポリクローナル抗体試薬の少なくとも一方が抗体分子のＦ（ａｂ’）_２フラグメントから調製される、上記（９）または（１０）に記載のキット、
（１２）測定対象がインスリンである、上記（９）乃至（１１）のいずれかに記載のキット、
（１３）上記インスリンが実験動物由来である、上記（１２）に記載のキット、
（１４）上記実験動物がマウス、ラット及びハムスターからなる群から選択される、上記（１３）に記載のキットであり、また、
（１５）ポリクローナル抗体がモルモットを免疫動物として得られる、上記（９）乃至（１４）のいずれかに記載のキットである。
【００３９】
上記のようなキットを用いれば、インスリンを５ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能である。したがって、本願発明の第１６は、
（１６）試料中のインスリンを１ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能な上記（１２）乃至（１５）のいずれかに記載のキットである。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本願発明に用いるポリクローナル抗体は、測定対象である抗原で免疫した実験動物からの抗血清を使用して調製する。抗原の調製、免疫動物への投与及び当該動物からの抗血清の採取は当業者にとって周知のいずれのプロトコールをも使用することができ、そのようなプロトコールの最適化も当業者にとって容易であろう。
【００４１】
免疫動物としては、ヒツジ、ウサギ、サル等も用いられ得るが、モルモットを用いるのが特に有利である。
【００４２】
当該免疫動物からの抗血清は、例えば、アジュバントと共に抗原を免疫動物に皮下注射し、当該皮下投与を適当な間隔（例えば２週間）で所定の回数（例えば４回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、これを分離することで得ることができる。そのような方法は、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.４章（発行元：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,ＮｅｗＹｏｒｋ）」等に記載されている。
【００４３】
次いで、本願発明によれば、複数の免疫動物から得られた個々の抗血清は、その抗原に対する親和性と、モノクローナル抗体に似た反応性、すなわち、優先的に特定のエピトープを認識するという性質の２つの観点から分別され選択される。
【００４４】
ここで、インスリンに対する親和性については、例えば、免疫測定用のマイクロプレートやビーズに固相化したインスリンとの反応の強さを測定することで容易に判定できる。
【００４５】
次いで、エピトープの認識に関する特異性は以下の方法に準じて判定することが可能である。
【００４６】
すなわち、インスリンを例にとれば、まず、インスリン分子上の１のエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体を免疫測定用のマイクロプレートやビーズに固相化（コート）する。次いで、そこに、一定濃度のインスリンと、濃度を変えたモルモット抗インスリン（ポリクローナル）抗体溶液またはモルモット抗インスリン血清を同時に加えて固相と反応させる。固相を洗浄後、モルモットＩｇＧに特異的に反応する酵素標識抗体を加えて更に反応させ、次いで固相を再度洗浄後、酵素基質を加えて酵素反応を行わせる。
【００４７】
コートされたマウスモノクローナル抗体と同一、或いはその近傍のエピトープを認識する抗体群が多く含まれるようなモルモットポリクローナル抗体溶液や抗血清は、該エピトープ或いはその近傍部位と結合し、それにより、コートされたモノクローナル抗体と当該エピトープとが更に結合するのを阻害する（エピトープの競合が起こる）。その結果、酵素標識抗体（抗モルモットＩｇＧ抗体）が固相化モノクローナル抗体と結合する量が減少し、酵素反応が弱くなる。
【００４８】
一方、コートされたモノクローナル抗体の認識するエピトープとは別の、離れたところにあるエピトープを認識する抗体群が多く含まれるポリクローナル抗体溶液や抗血清は、コートされたモノクローナル抗体とインスリンが結合することを阻害しないために（エピトープが競合しないために）酵素反応が強くなる。従って、このような方法により、異なるエピトープを認識する抗体溶液や抗血清を分別することができるのである。
【００４９】
上記ようにしてインスリンに対する親和性と、モノクローナル抗体とのエピトープの競合とを判別することにより、モノクローナル抗体より高い親和性を持ち、且つ、モノクローナル抗体と類似の反応性（特異性）を持つポリクローナル抗体を選び出すことができる。
【００５０】
そして、このようにして選び出された複数の抗血清からＩｇＧ画分または特異（ポリクローナル）抗体を精製し、そのままでキャプチャー側のポリクローナル抗体試薬として使用することができ、また、酵素標識すれば検出側のポリクローナル抗体試薬として用いることができる。
【００５１】
そのような、ＩｇＧ画分等の精製や酵素標識の方法は当業者にとって周知のいかなる方法も用いることができ、例えば、夫々、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,ＮｅｗＹｏｒｋ）」記載の方法や、「ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＲｅｌａｔｅｄＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ/ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２１５〜２２４頁（１９７８年））」、「化学と生物、第１２巻、６２６〜６３１頁（１９７４年）」、「Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．８（Ｓｕｐｐｌ.７）、４３〜５５頁（１９７８年）」記載の方法を利用することができる。
【００５２】
酵素標識に用いる酵素にも特に制限はなく、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する場合は、当該酵素の基質として３,３',５,５'−テトラメチルベンチジンがキットに含まれてよく、アルカリ性フォスファターゼを使用する場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸がキットに含まれ得る。
【００５３】
更に、本願発明のポリクローナル抗体試薬には、上記のようなＩｇＧ画分または特異抗体の他、特異抗体を酵素消化して得られるような、該抗体の反応性フラグメントを用いることもできる。特に、該フラグメントが、特異抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）_２フラグメントである場合が有利である。当該Ｆ（ａｂ’）_２等の酵素消化フラグメントは、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,ＮｅｗＹｏｒｋ）」記載の方法に準じて容易に調製可能である。
【００５４】
上記のように調製されたポリクローナル抗体試薬は、キャプチャー側と検出側でエピトープの競合が起こらないように組み合わされて最終的に免疫測定キットとなるのである。
【００５５】
本願発明のキットの測定対象としては蛋白質、ペプチド等があげられる。したがって、本願発明のキットは、例えば、インスリン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、ベータ２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、アルファ１−ミクログロブリン、アルファ−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子等の測定に用いられ得るがこれに限定されない。特に、分子量が５０００以下の蛋白質の測定に関し本願のキットは好適に用いられる。測定対象としての抗原がインスリン、とくにマウス、ラットやハムスター由来のインスリンである場合が一層好ましい。その場合、インスリンの超高感度測定系を作製することができる。
【００５６】
以下に、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本願発明は当該実施例により何等限定されるものではないことは言うまでもない。
【００５７】
【実施例】
実施例１
インスリンを１０ｍＭ塩酸に対して２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、０．４Ｍの炭酸水素ナトリウムで２倍に希釈し、フロイントの完全アジュバントで水中油型エマルジョンを作製して、２０匹のモルモットに一匹あたり皮下２０箇所において０．０５ｍｌづつ注射し、免疫した。
【００５８】
二週間の間隔をあけて４回の免疫を繰り返し、最終免疫後２週間目に全採血した。
【００５９】
分離した抗血清を、インスリンを固相化した免疫測定用のマイクロプレートを用いてインスリンとの反応性を調べたところ、２０匹から得られた個々の抗血清の全てが１００万倍の希釈でも吸光度が１．０以上あり、インスリンに対する結合活性（親和性）は免疫測定に用いるには十分なものであった。
【００６０】
実施例２
実施例１で作製した抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）と抗インスリンモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を調べた。
【００６１】
測定結果は表１に示す。
【００６２】
【表１】

このデータより１６番と１７番の抗血清がコート抗体として用いたモノクローナル抗体とほぼ同じエピトープを、１番と２０番の抗血清がコートに用いたモノクローナル抗体と異なるエピトープを認識する抗体を多く含むことが明らかとなった。すなわち、１６番及び１７番では、希釈倍率が低い（すなわち、濃度が高い）抗血清において吸光度の顕著な低下が観察され、これはコートしたモノクローナル抗体とのエピトープの競合によるものと考えられる。一方、１番及び２０番ではそのような吸光度の低下は観察されず、これはエピトープの競合がないことを示す。
【００６３】
実施例３
実施例２において、インスリン分子上での認識するエピトープが異なることが明らかとなった抗血清１番と１６番より、特異抗体（ポリクローナル抗体）をインスリン固相化カラムを通じて精製した。
【００６４】
９６穴の免疫測定用のマイクロプレートを用い、１番より精製した特異抗体（ポリクローナル抗体）を２μｌ／ｍｌの濃度で１００μｌづつウェルに分注し、室温で２時間静置してコートし、その後２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１５０ｍＭＮａＣｌで溶解した０．１％ＢＳＡを２００μｌづつウェルに分注してブロッキングを行った。
【００６５】
１６番より精製した特異抗体を０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムに対して透析し、同重量の活性化ペルオキシダーゼと混合して酵素標識抗体を得た。
【００６６】
抗体固相化マイクロプレートに９５μｌのインスリン除去ラット血清を分注し、次いで０ｐｇ／ｍｌから５,０００ｐｇ／ｍｌの標準インスリン希釈系列５μｌを分注し、室温で一時間反応させた。次いで、ウェルを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で１時間反応させた。
【００６７】
ウェルを洗浄後、１００μｌの酵素基質液（ＴＭＢ溶液）を加えて３０分間酵素反応を行い、１規定の硫酸を加えて酵素反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
その結果を図１Ａ及びＢに示す。
【００６９】
この結果より、本発明の測定試薬で１００μｌの試料を用いると１ｐｇ／ｍｌの濃度までインスリンが測定できることが示された。
【００７０】
実施例４
実施例３で得られた特異抗体をペプシンで酵素消化してＦ（ａｂ’）_２を作製し、この１ｍｇと活性化ペルオキシダーゼ０．７ｍｇと混合し、酵素標識Ｆ（ａｂ’）_２得た。
【００７１】
この酵素標識Ｆ（ａｂ’）_２を実施例３で用いたペルオキシダーゼ標識抗体の代わりに用いてインスリンを測定した結果を図２に示す。
【００７２】
この結果より１００μｌの試料を用いると上記実施例３よりも０ｐｇ／ｍｌの時の吸光度が下がり、より安定したデータが得られるようになった。
【００７３】
実施例５
実施例３に示した方法でラット血清を試料としてインスリン濃度を測定した。
【００７４】
同じラット血清の量を変えて測定した結果を図３に示す。
この結果より本発明の測定試薬を用いるとラットの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線性が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリンが測定できることが示された（図１Ｂの標準曲線参照）。
【００７５】
実施例６
実施例４と同様にマウス血清を試料としてインスリン濃度を測定した結果を図４に示す。
【００７６】
この結果より本発明の測定試薬を用いるとマウスの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線性が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリンが測定できることが示された。
【００７７】
実施例７
実施例５と同様にマウス血清及びマウス全血を試料としてインスリン濃度を測定した結果を図５に示す。
【００７８】
この結果より本発明の測定試薬を用いるとマウスの全血を用いてもインスリン濃度を測定することができることが示された。
【００７９】
実施例８
実施例３の方法に準じて、ヒトインスリン標準用液１００μｌを用い、ヒトインスリンの測定も行った。その結果を図６に示す。
【００８０】
この結果から、１００μｌのサンプル量においてもヒトインスリンを１ｐｇ／ｍｌの感度で測定可能なことが示された。
【００８１】
【効果】
抗原分子上の異なるエピトープを優先的に認識するような２以上の高親和性抗体群（ポリクローナル抗体）を選択し、これらを組み合わせて使用するという本願発明の構成により、従来用いられてきた測定試薬より高感度な免疫測定キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、本願のキットによるラットインスリン（０〜５ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本願のキットによるラットインスリン（０〜２０ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。
【図２】図２は、ポリクローナル抗体試薬としてＦ（ａｂ’）_２フラグメントを使用した場合の本願のキットによるラットインスリンの測定結果を示す。
【図３】図３は、本願のキットによるラット血清中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図４】図４は、本願のキットによるマウス血清中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図５】図５は、本願のキットによるマウス血清及びマウス全血中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図６】図６は、本願のキットによるヒトインスリンの測定結果（サンプル量１００μｌ）を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunoassay reagent and kit having high sensitivity and a method for producing the same, and more particularly to an immunoassay reagent and kit for measuring insulin with high sensitivity and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Insulin is widely known as a hormone having a hypoglycemic action, and measuring its blood concentration is indispensable for diagnosing diabetes and understanding the disease state.
[0003]
Such measurement of human blood insulin concentration was initially performed by radioimmunoassay using a radioisotope. Later, an enzyme immunoassay was established, and this was also applied to the measurement of insulin. Therefore, as the immunoassay kit, a kit using a radioimmunoassay or an enzyme immunoassay is commercially available for the purpose of a clinical diagnostic kit or the like.
[0004]
However, any of the above kits requires a sample of about several tens of microliters to one hundred microliters as a measurement sample, and the measurement sensitivity is only about several hundred pg / ml.
[0005]
On the other hand, in recent years, the need for insulin measurement in laboratory animals has increased as diabetes research has become active.
[0006]
In the measurement of insulin in such experimental animals, human insulin measurement reagents have been conventionally used, and insulin in experimental animals has been measured using the cross-reactivity of the antibodies. However, since there is a problem that a true value of animal insulin concentration cannot be obtained by using human insulin as a standard product, a measurement reagent dedicated to experimental animals has come to be expected.
[0007]
For this reason, a radioimmunoassay method for measuring rat insulin was first developed and commercially available from Linco Research, USA, Amersham, UK and Inkstar, USA. Rat insulin is attached to these kits as a standard product, and troubles caused by using human insulin as a standard substance have been avoided.
[0008]
However, in such a kit, the volume of the sample to be used is still about 100 microliters, which is the same as that of the human insulin measurement kit, and can be obtained from one animal so as not to hinder the subsequent experiment. Due to the limited amount of blood, it was necessary to use a large number of animals for experiments. In particular, in an experiment using a mouse whose body weight is one-tenth of a rat, it was necessary to sacrifice a plurality of mice to obtain one data, and later experiments could be impossible.
[0009]
In order to solve the above problems, a method has been developed that has the same sensitivity as a conventional measurement reagent and can measure even a very small amount of sample. In addition to the applicant of the present application, the measurement reagent is also sold by Shiba Goat Co., Ltd. and Mercodia, Sweden.
[0010]
However, even the above-described reagent that can be measured with a small amount of sample may be insufficient for measurement if it has the same sensitivity as a conventional measurement reagent. For example, higher measurement sensitivity is required when measuring low concentrations of blood insulin as shown by type I diabetes models typified by streptozotocin-treated rats and mice. In this case, conversely, if a relatively large amount of serum is used as a sample while using a conventional measurement reagent, the reaction system is affected by a large amount of the antigen-antibody reaction inhibitor contained in the serum, and the influence is affected. It cannot be ignored. Therefore, there has been a demand for the development of an immunoassay reagent having extremely high sensitivity that is effective in measuring blood insulin at low concentrations as described above.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide an immunoassay reagent and kit having extremely high measurement sensitivity as compared with conventional immunoassay reagents.
[0012]
In particular, in the treatment and research of diabetes, it is essential to measure the blood insulin concentration, and a reagent capable of measuring the blood insulin concentration of type I diabetic patients, streptozotocin-treated animals, etc. is required. In particular, in order to measure the blood insulin concentration of small laboratory animals, a highly sensitive measurement system that can measure with the smallest possible sample volume is required instead of using a 100 microliter sample as used for human insulin measurement. It is said that.
[0013]
Therefore, the immunoassay reagent and kit of the present application can be advantageously used in measuring the concentration of insulin.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
As described above, an object of the present invention is to provide an immunoassay reagent and a kit having extremely high measurement sensitivity as compared with conventional immunoassay reagents.
[0015]
Here, taking insulin as an example, many of the currently marketed insulin measuring reagents and insulin measuring diagnostic agents use “monoclonal antibodies” produced using mice to increase their specificity. Yes.
[0016]
However, in spite of their specificity, these monoclonal antibodies generally have a lower affinity for antigen (insulin) than polyclonal antibodies, and therefore the sensitivity of insulin measurement methods using such monoclonal antibodies is naturally constant. There was a limit.
[0017]
That is, since a monoclonal antibody is a single molecule, its specificity is high, but its affinity for an antigen is also single. In general, the binding constant of a monoclonal antibody is 10⁸Degree, at most 10⁹Is the limit, 10¹⁰It is not easy to isolate monoclonal antibodies with very high binding constants.
[0018]
In contrast, a polyclonal antibody is a mixture of multiple antibody molecules, so that the epitope on the antigen it recognizes is not single, but its affinity is also not single and in a suitable way. 10 of the immunized antisera¹⁰Antibodies with very high binding constants may also be included. Then, it is expected that the sensitivity of the measurement system can be increased by using an antibody having such a high binding constant as a polyclonal antibody for measurement.
[0019]
However, as described above, a polyclonal antibody has an advantage that an antibody molecule having a high affinity is included, but has a disadvantage that it is an assembly of antibody molecules that recognize different epitopes on an antigen molecule. . Moreover, since the ratio and amount of antibody molecules contained in the blood and the affinity for antigen molecules are different for each immunized animal, the antiserum of animals immunized under the same conditions is necessary to stably obtain antisera having the same properties. At least several tens of animals, ideally hundreds of animals were pooled and polyclonal antibodies had to be prepared therefrom. Therefore, despite the high affinity, the use of polyclonal antibodies for immunoassays has not been common in recent years.
[0020]
However, in the course of advancing the development of an insulin measurement system, the present inventors surprisingly found that the epitopes that are preferentially recognized by the antibody group (polyclonal antibody) contained in the antiserum of insulin-immunized guinea pigs are immunized guinea pig individuals. We found that in some extreme cases, the specificity may be close to that of a monoclonal antibody.
[0021]
Furthermore, the present inventors use a polyclonal antibody having both the property of having reactivity (specificity) similar to the above monoclonal antibody and the two conditions of having a very high affinity for insulin. Thus, it has been conceived that the measurement sensitivity of insulin can be increased.
[0022]
In other words, by selecting and combining two or more high-affinity polyclonal antibodies that preferentially recognize different epitopes on the insulin molecule, we succeeded in assembling a measurement system with higher sensitivity than conventional measurement reagents. did. Therefore, the first of the present invention is
(1) A method for producing an immunoassay kit comprising at least two or more polyclonal antibody reagents, wherein the polyclonal antibody reagents are selected so as to preferentially recognize different epitopes on the antigen. The method for producing the kit.
[0023]
More specifically, even if several polyclonal antibodies with specificities comparable to monoclonal antibodies and with higher affinity compared to monoclonal antibodies are obtained from the antiserum of individual immunized animals, they are simply optional. In combination with the above, it is used for each reagent on the capture side (immobilized antibody side) and on the detection side (labeled antibody side), epitope competition occurs between the polyclonal antibody reagents, and the detection sensitivity of the corner is impaired. May end up. For example, if the capture-side and detection-side polyclonal antibody reagents recognize the same epitope preferentially, the capture-side polyclonal antibody reagent should preferentially recognize the detection-side polyclonal antibody reagent first. The epitope is previously blocked by the antibody reagent on the detection side and can no longer bind to the capture side, which may reduce the detection sensitivity of the sandwich assay.
[0024]
On the other hand, as in the present application, if each is selected and combined so that the epitopes recognized preferentially on the capture side and the detection side are different, epitope competition as described above does not occur. The high affinity compared with the monoclonal antibody which each polyclonal antibody has is not spoiled, As a result, it is possible to achieve high sensitivity.
[0025]
Furthermore, such selection and combination also makes it possible to provide a homogeneous and stable immunoassay kit.
[0026]
As in the past, when antiserum from a plurality of immunized animals is once pooled for the purpose of obtaining a homogeneous polyclonal antibody, and polyclonal antibody is obtained therefrom and used as a reagent for an immunoassay kit, each polyclonal antibody has advantages. The high specificity similar to the characteristic monoclonal antibody and the high affinity for the antigen are diluted and / or offset, resulting in the loss of the advantages of the present application using polyclonal antibodies.
[0027]
On the other hand, if a polyclonal antibody is selected as in the present application, the polyclonal antibodies can be easily combined so as to give a homogeneous and stable kit, eliminating the need to pool antisera.
[0028]
From the above viewpoint, in the method for producing an immunoassay kit of the present application, it is more desirable to quickly determine the specificity of the polyclonal antibody for the epitope contained in the antiserum obtained from each immunized animal. Therefore, the second aspect of the present invention is
(2) A method for producing the immunoassay kit according to (1), wherein the method comprises:
(B) obtaining each antiserum from at least two immunized animals;
(B) examining epitope competition between a specific monoclonal antibody against the antigen immunized with the immunized animal and the antiserum;
(C) preparing a capture or detection polyclonal antibody reagent from an antiserum that exhibits epitope competition with the monoclonal antibody; and
(D) preparing the other polyclonal antibody reagent from an antiserum that does not show epitope competition with the monoclonal antibody,
It is a manufacturing method of the said kit.
[0029]
According to the above configuration, since a specific monoclonal antibody recognizes a single epitope, it is possible to quickly characterize epitope competition between polyclonal antibodies by using epitope competition with the monoclonal antibody as an index. It is. That is, it is considered that antiserum showing epitope competition with a specific monoclonal antibody recognizes the epitope or its vicinity preferentially in the antibody group (polyclonal antibody) contained therein. On the other hand, if there is no epitope competition with the monoclonal antibody, it can be determined that the antiserum contains an antibody group (polyclonal antibody) that recognizes a distant epitope differently from the epitope.
[0030]
In addition, it is easier to perform the above-described discrimination by solidifying a specific polyclonal and using the principle of the sandwich assay method. Therefore, the third aspect of the present invention is
(3) testing for epitope competition between the specific monoclonal antibody and the antiserum;
(A) preparing a mixed solution of a constant concentration of antigen and antiserum;
(B) forming an antigen-antibody conjugate in the solution;
(C) Next, the mixed solution is added to the solid phase of the specific monoclonal antibody; and
(D) measuring the amount of the antigen-antibody conjugate of (b) specifically bound to the immobilized monoclonal antibody,
This is the method described in (2) above.
[0031]
In the above, the amount of the antigen-antibody conjugate specifically bound to the immobilized monoclonal antibody is measured using an enzyme-labeled antibody that reacts specifically with the antibody molecule contained in the antiserum. It can be easily measured by forming a four-molecule conjugate of "-" antigen "-" anti-serum-derived antibody molecule "-" enzyme-labeled antibody ". For example, when the antigen is mouse insulin and the immunized animal is guinea pig, “solid-phase mouse insulin monoclonal antibody” — “mouse insulin” — “anti-insulin antibody (IgG) derived from guinea pig” — “anti-guinea pig IgG antibody” (With enzyme label) ”. A small amount of the enzyme-labeled antibody bound to the solid support indicates that there was epitope competition between the immobilized monoclonal antibody and the antibody group (polyclonal antibody) contained in the antiserum. Larger amounts of binding indicate less epitope competition.
[0032]
The formation of the antigen-antibody conjugate by mixing the antigen and antiserum may be performed simultaneously with the contact (addition) with the immobilized monoclonal antibody.
[0033]
Furthermore, in the sandwich assay, it is advantageous in determining epitope competition to serially dilute the antiserum to be examined and examine its dose dependency. Therefore, the fourth aspect of the present invention is
(4) The method according to (3) above, wherein the concentration of the antigen-antibody conjugate is measured by stepwise diluting the concentration of the antiserum mixed with the antigen having the constant concentration.
[0034]
The polyclonal antibody reagent that can be used in the present invention may include any reactive fragment thereof, for example, an enzyme digest of the polyclonal antibody, in addition to the polyclonal antibody itself. A suitable enzyme digest is F (ab ') obtained by digesting antibody molecules with pepsin.₂Fragments, and the use of such fragments is effective in reducing the background that is essential for sensitive measurements. Therefore, the fifth and sixth aspects of the present invention
(5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein at least one of the polyclonal antibody reagents is prepared from an enzyme digest of an antibody molecule,
(6) The enzyme digest is F (ab ′) of an antibody molecule.₂The method according to (5) above, which is a fragment.
[0035]
The method of the present invention is particularly effective when the molecular weight of the antigen is about 5000 or less. In such an antigen, since the number of epitopes recognized in a solid state is not so large, epitope competition is likely to occur between polyclonal antibody reagents resulting from any combination of polyclonal antibodies. A combination of specific polyclonal antibodies such as is effective.
[0036]
It is particularly advantageous when the antigen is insulin. Therefore, the seventh aspect of the present invention is
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the measurement target is insulin.
[0037]
From the viewpoint of polyclonal antibody productivity, etc., it is advantageous to use a guinea pig as an immunized animal when the antigen is insulin. Accordingly, the eighth aspect of the present invention is
(8) The method according to any one of (1) to (7) above, wherein the polyclonal antibody is obtained using a guinea pig as an immunized animal.
[0038]
Further, the present application relates to a combination of polyclonal antibodies that do not cause epitope competition as described above, in particular, a polyclonal antibody that shows epitope competition with one monoclonal antibody against an antigen and a polyclonal antibody that does not show competition. The present invention also relates to an immunoassay kit combined with an antibody. Therefore, the ninth to fifteenth aspects of the present invention are:
(9) a first polyclonal antibody reagent that exhibits epitope competition with one monoclonal antibody against an antigen to be measured; and a second polyclonal antibody reagent that does not exhibit epitope competition with the monoclonal antibody Including an immunoassay kit,
(10) The immunoassay kit according to (9) for sandwich assay, wherein the first polyclonal antibody reagent is on the capture side or the detection side, and the second polyclonal antibody reagent is on the other side The kit,
(11) At least one of the polyclonal antibody reagents is an antibody molecule F (ab ')₂A kit according to (9) or (10), prepared from a fragment,
(12) The kit according to any one of (9) to (11), wherein the measurement target is insulin,
(13) The kit according to (12), wherein the insulin is derived from an experimental animal,
(14) The kit according to (13), wherein the experimental animal is selected from the group consisting of a mouse, a rat, and a hamster,
(15) The kit according to any one of (9) to (14) above, wherein the polyclonal antibody is obtained using a guinea pig as an immunized animal.
[0039]
If the above kit is used, insulin can be detected with a sensitivity of 5 pg / ml. Therefore, the sixteenth aspect of the present invention is
(16) The kit according to any one of (12) to (15), wherein insulin in the sample can be detected with a sensitivity of 1 pg / ml.
[0040]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The polyclonal antibody used in the present invention is prepared using antiserum from an experimental animal immunized with the antigen to be measured. Antigen preparation, administration to immunized animals and collection of antisera from such animals can use any protocol known to those skilled in the art, and optimization of such protocols would be easy for those skilled in the art. .
[0041]
As immunized animals, sheep, rabbits, monkeys and the like can be used, but it is particularly advantageous to use guinea pigs.
[0042]
Antiserum from the immunized animal can be obtained by, for example, subcutaneously injecting an antigen together with an adjuvant into the immunized animal, and repeating the subcutaneous administration a predetermined number of times (for example, 4 times) at an appropriate interval (for example, 2 weeks). Can be obtained by collecting and separating. Such a method is described, for example, in “CURRENT PROTOCOLINS IMMUNOLOGY, Chapter 2.4 (Publisher: John Wiley & Sons, Inc., New York)”.
[0043]
Next, according to the present invention, each antiserum obtained from a plurality of immunized animals has an affinity for the antigen and a reactivity similar to that of a monoclonal antibody, that is, a property of preferentially recognizing a specific epitope. Are selected and selected from the following two viewpoints.
[0044]
Here, the affinity for insulin can be easily determined, for example, by measuring the strength of the reaction with insulin immobilized on microplates or beads for immunoassay.
[0045]
Then, the specificity for epitope recognition can be determined according to the following method.
[0046]
That is, taking insulin as an example, first, a mouse monoclonal antibody that recognizes one epitope on an insulin molecule is immobilized (coated) on a microplate or bead for immunoassay. Next, a constant concentration of insulin and a guinea pig anti-insulin (polyclonal) antibody solution or a guinea pig anti-insulin serum with different concentrations are simultaneously added to react with the solid phase. After washing the solid phase, an enzyme-labeled antibody that specifically reacts with guinea pig IgG is added to cause further reaction, and after washing the solid phase again, an enzyme substrate is added to cause an enzyme reaction.
[0047]
Guinea pig polyclonal antibody solutions and antisera that contain many antibody groups that recognize the same or nearby epitope as the coated mouse monoclonal antibody bind to the epitope or its nearby site, and are thus coated. Inhibits further binding of the monoclonal antibody to the epitope (epitope competition occurs). As a result, the amount of the enzyme-labeled antibody (anti-guinea pig IgG antibody) bound to the immobilized monoclonal antibody is reduced, and the enzyme reaction is weakened.
[0048]
On the other hand, a polyclonal antibody solution or antiserum containing a large number of antibodies that recognize epitopes that are separated from the epitope recognized by the coated monoclonal antibody binds the coated monoclonal antibody to insulin. Enzyme reaction becomes stronger because it does not inhibit (because epitopes do not compete). Therefore, antibody solutions and antisera that recognize different epitopes can be separated by such a method.
[0049]
A polyclonal antibody having a higher affinity than a monoclonal antibody and a reactivity (specificity) similar to that of a monoclonal antibody by discriminating between affinity for insulin and epitope competition with the monoclonal antibody as described above. Can be selected.
[0050]
The IgG fraction or specific (polyclonal) antibody can be purified from the multiple antisera selected in this way and used as it is as a polyclonal antibody reagent on the capture side. It can be used as a side polyclonal antibody reagent.
[0051]
Any method known to those skilled in the art can be used as such a method for purifying the IgG fraction and the enzyme labeling. For example, “CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Chapter 2.7 (Publisher: John Wiley)” & Sons, Inc., New York) "and" Immunofluorescence and Related Staining Techniques (Elsevier / North Holland Biomedical Press, Amsterdam, 215, 224) (1978, Biology, 1978). 626-631 (1974) "," Scan. J. Immunol., Vol. 8 (Suppl. 7), 43-55 (1978) ". It can be used.
[0052]
There is no restriction | limiting in particular also in the enzyme used for an enzyme label, For example, enzymes, such as a horseradish peroxidase and alkaline phosphatase, are used advantageously. When horseradish peroxidase is used, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine may be included in the kit as a substrate for the enzyme, and when alkaline phosphatase is used, p-nitrophenyl as the substrate. Phosphoric acid can be included in the kit.
[0053]
Furthermore, in the polyclonal antibody reagent of the present invention, in addition to the above-described IgG fraction or specific antibody, a reactive fragment of the antibody that can be obtained by enzymatic digestion of the specific antibody can also be used. In particular, the fragment is F (ab ') obtained by digesting a specific antibody with pepsin.₂It is advantageous if it is a fragment. F (ab ')₂Enzyme digested fragments such as CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Chapter 2.7 (Publisher: John Wiley & Sons, Inc., New York) can be easily prepared.
[0054]
The polyclonal antibody reagent prepared as described above is combined so that no epitope competition occurs between the capture side and the detection side, and finally becomes an immunoassay kit.
[0055]
Examples of the measurement target of the kit of the present invention include proteins and peptides. Accordingly, the kit of the present invention includes, for example, insulin, calcitonin, C-peptide, leptin, beta2-microglobulin, retinol-binding protein, alpha1-microglobulin, alpha-fetoprotein, carcinoembryonic antigen, troponin-I, curcagon Although it can be used for the measurement of an insulin-like peptide, insulin-like peptide, tumor growth factor, fibroblast growth factor, platelet growth factor, epidermal growth factor, etc., it is not limited thereto. In particular, the kit of the present application is suitably used for measuring a protein having a molecular weight of 5000 or less. More preferably, the antigen to be measured is insulin, particularly mouse, rat or hamster-derived insulin. In that case, an ultrasensitive measurement system for insulin can be prepared.
[0056]
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to the examples.
[0057]
【Example】
Example 1
Insulin was dissolved in 10 mM hydrochloric acid at a concentration of 2 mg / ml, then diluted 2-fold with 0.4 M sodium bicarbonate, and an oil-in-water emulsion was prepared with Freund's complete adjuvant, to 20 guinea pigs. Immunization was carried out by injecting 0.05 ml at 20 subcutaneous sites per animal.
[0058]
The immunization was repeated 4 times at intervals of 2 weeks, and whole blood was collected 2 weeks after the final immunization.
[0059]
When the separated antiserum was examined for its reactivity with insulin using an immunoassay microplate in which insulin was solid-phased, all the individual antisera obtained from 20 animals were diluted 1 million times. The absorbance was 1.0 or more, and the binding activity (affinity) to insulin was sufficient for use in immunoassay.
[0060]
Example 2
Epitope competition between the antibody group (polyclonal antibody) contained in the antiserum prepared in Example 1 and the anti-insulin monoclonal antibody was examined.
[0061]
The measurement results are shown in Table 1.
[0062]
[Table 1]

From this data, the antisera of No. 16 and No. 17 contain almost the same epitope as the monoclonal antibody used as the coat antibody, and many antibodies that the No. 1 and No. 20 antiserum recognize different epitopes from the monoclonal antibody used for the coat are included. It became clear. That is, in No. 16 and No. 17, a significant decrease in absorbance was observed in antiserum with low dilution ratio (ie, high concentration), which is considered to be due to epitope competition with the coated monoclonal antibody. On the other hand, in No. 1 and No. 20, such a decrease in absorbance is not observed, indicating that there is no epitope competition.
[0063]
Example 3
In Example 2, a specific antibody (polyclonal antibody) was purified through an insulin-immobilized column from antisera No. 1 and No. 16 whose epitopes recognized on the insulin molecule were different.
[0064]
Using a 96-well microplate for immunoassay, 100 μl of the specific antibody (polyclonal antibody) purified from No. 1 was dispensed into wells at a concentration of 2 μl / ml, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then coated. Blocking was performed by dispensing 200 μl of 0.1% BSA dissolved in 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 150 mM NaCl into wells.
[0065]
The specific antibody purified from No. 16 was dialyzed against 0.2 M sodium bicarbonate and mixed with the same weight of activated peroxidase to obtain an enzyme-labeled antibody.
[0066]
95 μl of insulin-removed rat serum was dispensed onto an antibody-immobilized microplate, and then 5 μl of a standard insulin dilution series from 0 pg / ml to 5,000 pg / ml was dispensed and allowed to react at room temperature for 1 hour. Next, after washing the well, a peroxidase-labeled antibody was added and allowed to react at room temperature for 1 hour.
[0067]
After washing the wells, 100 μl of an enzyme substrate solution (TMB solution) was added to carry out an enzyme reaction for 30 minutes, 1N sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 450 nm was measured.
[0068]
The results are shown in FIGS. 1A and B.
[0069]
From this result, it was shown that insulin can be measured to a concentration of 1 pg / ml when a sample of 100 μl is used with the measurement reagent of the present invention.
[0070]
Example 4
The specific antibody obtained in Example 3 was enzymatically digested with pepsin to obtain F (ab ')₂Is mixed with 1 mg of this and 0.7 mg of activated peroxidase, and enzyme-labeled F (ab ′)₂Obtained.
[0071]
This enzyme label F (ab ')₂Is used instead of the peroxidase-labeled antibody used in Example 3, and the results of measuring insulin are shown in FIG.
[0072]
From this result, when a sample of 100 μl was used, the absorbance at 0 pg / ml was lower than that in Example 3, and more stable data was obtained.
[0073]
Example 5
Insulin concentration was measured using rat serum as a sample by the method shown in Example 3.
[0074]
FIG. 3 shows the results of measurement with different amounts of the same rat serum.
From these results, it was shown that when the measurement reagent of the present invention was used, good linearity was obtained from 5 μl to 100 μl of rat serum, and insulin could be measured using 100 μl of serum sample (see the standard curve in FIG. 1B). ).
[0075]
Example 6
The result of measuring the insulin concentration using mouse serum as a sample in the same manner as in Example 4 is shown in FIG.
[0076]
From this result, it was shown that when the measurement reagent of the present invention was used, good linearity was obtained from 5 μl to 100 μl of mouse serum volume, and insulin could be measured even using a 100 μl serum sample.
[0077]
Example 7
The results of measuring insulin concentration using mouse serum and mouse whole blood as samples as in Example 5 are shown in FIG.
[0078]
From these results, it was shown that the insulin concentration can be measured using whole mouse blood when the measurement reagent of the present invention is used.
[0079]
Example 8
According to the method of Example 3, human insulin was also measured using 100 μl of human insulin standard solution. The result is shown in FIG.
[0080]
From this result, it was shown that human insulin can be measured with a sensitivity of 1 pg / ml even in a sample amount of 100 μl.
[0081]
【effect】
Conventionally used measurement reagents by the configuration of the present invention in which two or more high-affinity antibody groups (polyclonal antibodies) that preferentially recognize different epitopes on an antigen molecule are selected and used in combination. A more sensitive immunoassay kit is provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A shows the measurement results of rat insulin (0 to 5 ng / ml) by the kit of the present application.
FIG. 1B shows the measurement results of rat insulin (0 to 20 ng / ml) using the kit of the present application.
FIG. 2 shows F (ab ′) as a polyclonal antibody reagent.₂The measurement result of the rat insulin by the kit of this application at the time of using a fragment is shown.
FIG. 3 shows measurement results of insulin concentration in rat serum using the kit of the present application.
FIG. 4 shows the measurement results of insulin concentration in mouse serum using the kit of the present application.
FIG. 5 shows measurement results of insulin concentration in mouse serum and mouse whole blood by the kit of the present application.
FIG. 6 shows measurement results of human insulin (sample amount: 100 μl) using the kit of the present application.

Claims

A method of manufacturing a immunoassay kit comprising at least two or more polyclonal antibody reagents, the polyclonal antibody reagent, characterized in that it is selected to recognize different epitopes on an antigen preferentially with each other, also the polyclonal The antibody is obtained using guinea pigs as immunized animals, the method comprising:
(B) give each of the antisera from at least two of the immunized guinea pigs;
(B) examining epitope competition between a specific monoclonal antibody against the antigen immunized with the guinea pig and the antiserum;
(C) preparing a capture or detection side polyclonal antibody reagent from the antiserum showing epitope competition with the monoclonal antibody; and (d) the other polyclonal antibody reagent from the antiserum showing no epitope competition with the monoclonal antibody. Characterized in that
A method for producing the kit.

Testing for epitope competition between the specific monoclonal antibody and the antiserum;
(A) preparing a mixed solution of a constant concentration of antigen and antiserum;
(B) forming an antigen-antibody conjugate in the solution;
(C) Next, the mixed solution is added to the solid phase of the specific monoclonal antibody; and
(D) measuring the amount of the antigen-antibody conjugate of (b) specifically bound to the immobilized monoclonal antibody,
The method of claim 1.

The method according to claim 2, wherein the amount of the antigen-antibody conjugate is measured by stepwise diluting the concentration of the antiserum mixed with the antigen having a constant concentration.

4. A method according to any one of claims 1 to 3, wherein at least one of the polyclonal antibody reagents is prepared from an enzymatic digest of the antibody molecule.

The method according to claim 4, wherein the enzyme digest is an F (ab ′) ₂ fragment of an antibody molecule.

The method according to claim 1, wherein the measurement target is insulin.

An immunoassay kit comprising:
(A) a first polyclonal antibody reagent showing epitope competition with one monoclonal antibody against the antigen to be measured;
(B) binds to the antigen, seen including a second polyclonal antibody reagent which does not exhibit competing epitopes between the monoclonal antibody,
Here, the polyclonal antibody is obtained using guinea pigs as an immunized animal,
Said kit.

The immunoassay kit according to claim 7 for sandwich assay, wherein the first polyclonal antibody reagent is on the capture side or the detection side, and the second polyclonal antibody reagent is on the other side. kit.

9. Kit according to claim 7 or 8 , wherein at least one of the polyclonal antibody reagents is prepared from an F (ab ') ₂ fragment of an antibody molecule.

The kit according to any one of claims 7 to 9 , wherein the measurement target is insulin.

The kit according to claim 10 , wherein the insulin is derived from an experimental animal.

The kit according to claim 11 , wherein the experimental animal is selected from the group consisting of a mouse, a rat and a hamster.

The kit according to any one of claims 10 to 12 , wherein insulin in the sample can be detected with a sensitivity of 1 pg / ml.