JP4585242B2 - Cell transfection array for nucleic acid introduction - Google Patents
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Description
本発明は、新規な核酸導入用セルトランスフェクションアレイに関する。より詳細には、コラーゲンを用いた核酸導入用セルトランスフェクションアレイに関する。 The present invention relates to a novel cell transfection array for introducing a nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a cell transfection array for introducing nucleic acid using collagen.
遺伝子研究の手法のひとつである宿主となりうる細胞への核酸の導入（トランスフェクション）は、遺伝子の機能を解析するための有用な方法である。具体的にはプラスミドＤＮＡ，ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを細胞に導入し、遺伝子発現後の細胞機能の変化、あるいは遺伝子の発現抑制による細胞機能の変化を観察することが行われる。すでに様々な種のゲノムが解読され、遺伝子研究においてはその遺伝子の機能を細胞レベルで解析する技術がおおいに注目されている。近年のマルチイメージングアナライザーやプレートリーダー等の細胞機能解析装置の発達によって、マルチウェルプレートで培養した多検体の細胞の機能を短時間に解析することができるようになり、核酸のトランスフェクションと細胞機能解析装置を組み合わせた細胞レベルでの遺伝子機能解析は、その重要性を増している。 Introduction of a nucleic acid into a cell that can be a host, which is one of genetic research methods (transfection), is a useful method for analyzing the function of a gene. Specifically, plasmid DNA, viral vectors, antisense oligonucleotides, siRNA, and the like are introduced into cells, and changes in cell functions after gene expression or changes in cell functions due to gene expression suppression are observed. The genomes of various species have already been deciphered, and in gene research, techniques for analyzing the functions of the genes at the cellular level have attracted a great deal of attention. Recent developments in cell function analyzers such as multi-imaging analyzers and plate readers have made it possible to quickly analyze the functions of multiple samples cultured in multi-well plates. Analysis of gene function at the cell level combined with an analysis device has become increasingly important.
しかし、従来の核酸の導入は、培養容器に細胞を播種、培養後に導入を目的とする核酸を組み込んだウイルスベクターを感染させる、あるいは核酸を導入剤と混合して培地に加えることにより行われており、そのつどウイルスベクターや核酸と導入剤の混合物を調製する必要があり煩雑で、特に多種多検体の核酸を導入する場合は大変な労力を要する。またそれらの方法は、ウイルスや導入剤の細胞毒性のために、細胞増殖、アポトーシス等のアッセイの際の障害となり、正確に細胞機能を判定できないという問題があった。 However, conventional nucleic acid introduction is performed by seeding cells in a culture vessel, infecting a viral vector incorporating a nucleic acid to be introduced after culturing, or mixing the nucleic acid with an introduction agent and adding it to the medium. Each time, it is necessary to prepare a mixture of a viral vector or nucleic acid and an introduction agent, which is cumbersome. In particular, a large amount of labor is required when introducing various kinds of nucleic acids. In addition, these methods have a problem in that cell function cannot be accurately determined because of the cytotoxicity of the virus and the introduction agent, which becomes an obstacle in assays such as cell proliferation and apoptosis.
そこでスライドグラスにあらかじめ遺伝子を備え、使用時に導入剤の添加、細胞の播種を行うトランスフェクション方法が開発されている（非特許文献１）。 Therefore, a transfection method has been developed in which a gene is preliminarily provided in a slide glass, and an introduction agent is added and cells are seeded at the time of use (Non-patent Document 1).
また、アテロコラーゲンと核酸を混合したものをプレコーティングしたプレートによるセルトランスフェクションアレイを使用して遺伝子発現の促進あるいは抑制による細胞機能の変化から、遺伝子をスクリーニングする方法についての報告がある（非特許文献２、特許文献１）。
本発明は、細胞に遺伝子を導入するに際し、所望の核酸を備えた固相に細胞を播種し培養するだけで、該細胞に核酸を導入し、効果的に発現させることができる核酸導入用セルトランスフェクションアレイを提供することを課題とする。 The present invention provides a nucleic acid introduction cell that can introduce a nucleic acid into a cell and effectively express the cell by simply seeding and culturing the cell on a solid phase equipped with a desired nucleic acid when introducing the gene into the cell. It is an object to provide a transfection array.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、細胞の培養前に、固相にコラーゲン、核酸導入剤および所望の核酸を備えたセルトランスフェクションアレイを利用することにより、細胞の培養後にウイルスベクターや核酸、核酸導入剤等を該培養細胞に加える必要なく細胞に核酸を導入しうることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has utilized a cell transfection array comprising collagen, a nucleic acid introduction agent and a desired nucleic acid in a solid phase before culturing cells. The inventors have found that a nucleic acid can be introduced into a cell without adding a viral vector, a nucleic acid, a nucleic acid introduction agent or the like to the cultured cell after the cell has been cultured, and the present invention has been completed.
本発明は、以下よりなる。
１．アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイであって、核酸導入剤がリポソームである、核酸導入用セルトランスフェクションアレイ。
２．アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備える前項１に記載のセルトランスフェクションアレイ。
３．核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである前項１または２に記載のセルトランスフェクションアレイ。
４．前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイの調製方法。
５．前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ調製用キット。
６．前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを使用する細胞への核酸導入方法。
７．前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイに、細胞を播種することを特徴とする細胞への核酸導入方法。
８．アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含み、核酸導入剤がリポソームである、核酸導入方法。
９．前項８の核酸導入方法において、アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備えることを含む核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含む細胞への核酸導入方法。
１０．核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである前項８または９に記載の核酸導入方法。
１１．前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを含む核酸導入用キット。
The present invention consists of the following.
1. A cell transfection array for nucleic acid introduction comprising atelocollagen, a nucleic acid introduction agent and a nucleic acid , wherein the nucleic acid introduction agent is a liposome .
2. Cell Le transfection array according atelocollagen in item 1 comprising an amount capable of reducing the cytotoxicity.
3. 3. The cell transfection array according to item 1 or 2 , wherein the nucleic acid is plasmid DNA, polynucleotide, oligonucleotide, ribozyme or siRNA.
4). 4. The method for preparing a cell transfection array according to any one of items 1 to 3 .
5. 4. The kit for preparing a cell transfection array according to any one of 1 to 3 above.
6). 4. A method for introducing a nucleic acid into a cell using the cell transfection array according to any one of items 1 to 3 .
7). 4. A method for introducing a nucleic acid into a cell, comprising seeding the cell into the cell transfection array according to any one of 1 to 3 above.
8). Atelocollagen, seen including a step of preparing a nucleic acid-introducing cells transfected array with a nucleic acid-introducing agent and nucleic acid, the step of seeding cells on the cell transfection array, nucleic acid transfer agent is a liposome, a nucleic acid introduction method.
9. The method for introducing a nucleic acid according to item 8 above , comprising the step of preparing a cell transfection array for introducing nucleic acid comprising atelocollagen in an amount capable of reducing cytotoxicity, and the step of seeding the cell into the cell transfection array. Nucleic acid introduction method.
10. 10. The nucleic acid introduction method according to 8 or 9 above, wherein the nucleic acid is plasmid DNA, polynucleotide, oligonucleotide, ribozyme or siRNA.
11. 4. A kit for introducing a nucleic acid comprising the cell transfection array according to any one of 1 to 3 above.
本発明により、核酸導入効率、適当な核酸導入、細胞毒性の軽減された状態で遺伝子の長期発現が実現され、さらには核酸を導入可能な状態で、核酸導入用セルトランスフェクションアレイを長期保存することができる。また、本発明の核酸導入用セルトランスフェクションアレイ（以下単に「セルトランスフェクションアレイ」ともいう。）は、異なる核酸ごとに培養環境が区別されているため、例えば異なる核酸の導入による細胞の分泌物の変化を、各培養液を回収して調べるというような細胞外環境を評価することも可能となる。さらに、汎用されている培養用マルチウェルプレートをセルトランスフェクションアレイの基材とすることができるため、既存の細胞機能解析用試薬や細胞機能解析装置に適用できるという利点がある。 According to the present invention, long-term expression of a gene is realized in a state where nucleic acid introduction efficiency, appropriate nucleic acid introduction, and cytotoxicity are reduced, and further, a cell transfection array for nucleic acid introduction is stored for a long time in a state where nucleic acid can be introduced. be able to. The cell transfection array for nucleic acid introduction of the present invention (hereinafter also simply referred to as “cell transfection array”) has a culture environment that is different for each different nucleic acid. It is also possible to evaluate the extracellular environment, such as collecting and examining each culture solution. Furthermore, since a multiwell plate for culture that is widely used can be used as a base material for a cell transfection array, there is an advantage that it can be applied to an existing reagent for cell function analysis or a cell function analyzer.
本発明のセルトランスフェクションアレイに備えられ、細胞に導入されうる核酸は、その種類に制限はなく、具体的にはプラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイム、短い干渉ＲＮＡ（small interferring ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）等のいかなる核酸であっても使用することができ、一本鎖、二本鎖およびこれら類縁体のいずれでも良い。 The nucleic acid provided in the cell transfection array of the present invention and capable of being introduced into the cell is not limited in its kind, and specifically, plasmid DNA, polynucleotide, oligonucleotide, ribozyme, short interfering RNA (siRNA) Any nucleic acid such as single-stranded, double-stranded, and analogs thereof may be used.
本発明に使用する核酸が、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである場合には、直鎖状または環状のいずれの形態であっても良い。また所望の配列を有する核酸は、ベクターに組み込まれた状態でも良く、プラスミドの形態であっても良い。当該プラスミドは、発現プラスミドまたは非発現プラスミドであっても良い。 When the nucleic acid used in the present invention is double-stranded DNA or double-stranded RNA, it may be either linear or circular. The nucleic acid having a desired sequence may be incorporated in a vector or may be in the form of a plasmid. The plasmid may be an expression plasmid or a non-expression plasmid.
本発明に使用する核酸がオリゴヌクレオチドである場合、導入するオリゴヌクレオチドの種類に制限はなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはこれらの類縁体のいずれも用いることができる。具体的には、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド、2-O（2-メトキシ）エチル−修飾核酸（2'-MOE-修飾核酸）、ｓｉＲＮＡ、架橋型核酸（Locked Nucleic Acid:LNA; Singh, et al., Chem. Commun., 455(1998)）、ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA; Nielsen, et al., Science, 254, 1497,1991）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸（Morpholino antisense; Sumerton and Weller, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7, 187, 1997）などを挙げることができる。 When the nucleic acid used in the present invention is an oligonucleotide, the type of oligonucleotide to be introduced is not limited, and single-stranded oligonucleotides, double-stranded oligonucleotides, or analogs thereof can be used. Specifically, deoxyribonucleotide (DNA), ribonucleotide, 2-O (2-methoxy) ethyl-modified nucleic acid (2′-MOE-modified nucleic acid), siRNA, cross-linked nucleic acid (Locked Nucleic Acid: LNA; Singh, et al., Chem. Commun., 455 (1998)), peptide nucleic acids (Peptide Nucleic Acid: PNA; Nielsen, et al., Science, 254, 1497,1991) or Morpholino antisense; Sumerton and Weller, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7, 187, 1997).
本発明に使用される核酸導入剤は、自体公知のものを使用することができ、具体的にはリポソーム、非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等を挙げることができ、好ましくはリポソームであり、より好ましくはカチオン性リポソームを使用することができる。 As the nucleic acid introduction agent used in the present invention, those known per se can be used, and specific examples include liposomes, non-liposomal lipids, viral vectors, DEAE dextran, calcium phosphate, dendrimers, and the like. Is a liposome, more preferably a cationic liposome.
核酸導入剤の使用量は、コラーゲン使用量との関係で適宜選択することができる。具体的には、核酸導入剤溶液の濃度は0.01ng/mL〜100ng/mL、好ましくは0.1ng/mL〜50ng/mLの範囲の何れかで使用することができる。例えば市販のものであれば核酸導入剤の使用取り扱い説明書等に記載の量の1/1〜1/100の量の範囲で使用することができ、好ましくは1/2〜1/50の範囲で使用することができる。 The amount of the nucleic acid introduction agent used can be appropriately selected in relation to the amount of collagen used. Specifically, the concentration of the nucleic acid introduction agent solution can be used within a range of 0.01 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 0.1 ng / mL to 50 ng / mL. For example, if it is a commercially available product, it can be used in the range of 1/1 to 1/100 of the amount described in the instruction manual for use of the nucleic acid introduction agent, preferably in the range of 1/2 to 1/50 Can be used in
本発明に使用されるコラーゲンは、アテロコラーゲンが好適であり、その種類、由来、型等特に制限はない。種類としては酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）及びその修飾物を挙げることができる。修飾物としては、側鎖アミノ基、カルボキシル基の化学修飾、あるいは化学的・物理的架橋物を用いることができる。また、由来として、ウシ、ブタ、ウマ、ヒト等の哺乳動物、鳥、魚類を由来とするいずれのコラーゲンも用いることが可能であるが、細胞が培養される温度で変化しない熱安定性を持つことが望ましい。具体的には、哺乳動物、鳥由来のコラーゲンが望ましく、若しくはそれらの遺伝子組み換えにより得られたコラーゲンが望ましい。コラーゲンの型については、特に制限はないが、入手の容易さよりＩ、ＩＩ，ＩＩＩ型などを使用することができる。 The collagen used in the present invention is preferably atelocollagen, and there is no particular limitation on the type, origin, type and the like. Examples of the type include enzyme-solubilized collagen (Atelocollagen) and modified products thereof. As a modified product, a side chain amino group, a chemical modification of a carboxyl group, or a chemical / physical cross-linked product can be used. In addition, any collagen derived from mammals such as cattle, pigs, horses, humans, birds, and fish can be used as a source, but it has thermal stability that does not change at the temperature at which the cells are cultured. It is desirable. Specifically, collagen derived from mammals and birds is desirable, or collagen obtained by genetic recombination thereof is desirable. Although there is no restriction | limiting in particular about the type | mold of collagen, I, II, III type | mold etc. can be used from availability.
コラーゲンは、細胞に及ぼす毒性を軽減しうる量使用することができる。例えば核酸導入剤によって、細胞に毒性が及ぶことが危惧される。具体的には、コラーゲン溶液の濃度は0.00001〜3％（0.0001〜30mg/mL）の範囲で使用することができ、好ましくは0.0001〜0.1％、より好ましくは0.0005〜0.05％の範囲で使用することができる。 Collagen can be used in an amount that can reduce toxicity to cells. For example, there is a concern that the nucleic acid introduction agent may cause toxicity to cells. Specifically, the concentration of the collagen solution can be used in the range of 0.00001 to 3% (0.0001 to 30 mg / mL), preferably 0.0001 to 0.1%, more preferably 0.0005 to 0.05%. Can do.
コラーゲン、核酸導入剤、核酸混合溶液中の核酸の濃度は、0.001〜1000μg/mLの範囲で可能であり、好ましくは0.01〜200μg/mL、より好ましくは0.05〜100μg/mLの範囲で使用することができる。 The concentration of the nucleic acid in the collagen, nucleic acid introduction agent, and nucleic acid mixed solution can be in the range of 0.001 to 1000 μg / mL, preferably 0.01 to 200 μg / mL, more preferably 0.05 to 100 μg / mL. Can do.
前記核酸および核酸導入剤をコラーゲンの中に混合し、固相上に備えることで本発明のセルトランスフェクションアレイを調製することができる。コラーゲン溶液、核酸導入剤、核酸はどのような順番で混合しても良く、またどのような割合でも混合することができるが、核酸と核酸導入剤を混合した後にコラーゲン溶液を混合するのが好ましい。核酸および核酸導入剤を含む溶液とコラーゲン溶液の割合は、１：９９〜９９：１の範囲で混合することができ、好ましくは１０：９０〜９０：１０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０の範囲で混合することができる。 The cell transfection array of the present invention can be prepared by mixing the nucleic acid and the nucleic acid introduction agent in collagen and providing the mixture on a solid phase. The collagen solution, the nucleic acid introduction agent, and the nucleic acid may be mixed in any order, and can be mixed in any proportion, but it is preferable to mix the collagen solution after mixing the nucleic acid and the nucleic acid introduction agent. . The ratio of the solution containing the nucleic acid and the nucleic acid introduction agent and the collagen solution can be mixed in the range of 1:99 to 99: 1, preferably 10:90 to 90:10, more preferably 30:70 to 70: It is possible to mix in the range of 30.
本発明のセルトランスフェクションアレイは、細胞培養が可能な固相を使用することができる。すなわち、細胞が死滅せず、かつ本発明の核酸導入による細胞内への核酸の取り込みに支障をもたらさないものであれば、いかなる固相も使用することができる。また、異なる核酸ごとに培養環境が区分されている固相であることが好ましく、具体的には細胞培養用プレートを使用することができる。より好ましくは6ウェル、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェル、1536ウェル等の培養環境が区分されているウェルを有する市販の細胞培養用プレートを使用することができる。 The cell transfection array of the present invention can use a solid phase capable of cell culture. That is, any solid phase can be used as long as the cell does not die and does not hinder the uptake of nucleic acid into the cell by the introduction of the nucleic acid of the present invention. Further, it is preferably a solid phase in which the culture environment is divided for each different nucleic acid, and specifically, a cell culture plate can be used. More preferably, a commercially available cell culture plate having wells in which the culture environment is divided, such as 6 wells, 24 wells, 48 wells, 96 wells, 384 wells, 1536 wells, can be used.
本発明のセルトランスフェクションアレイの調製に際し、上記細胞培養用プレートを使用する場合には、コラーゲン、核酸導入剤および核酸の混合液を各ウェルに0.1〜3000μL/cm2、好ましくは1〜1500μL/cm2の範囲で添加して備えることができる。 When preparing the cell transfection array of the present invention, when using the above cell culture plate, a mixed solution of collagen, nucleic acid introduction agent and nucleic acid is added to each well at 0.1 to 3000 μL / cm 2 , preferably 1 to 1500 μL / It can be added in the range of cm 2 .
コラーゲン、核酸導入剤および核酸を本発明のセルトランスフェクションアレイに備えるために、核酸と核酸導入剤を混合したものをさらにコラーゲン溶液に混合したものをプレートに添加することができ、または、核酸導入剤とコラーゲンの混合溶液に核酸を加えたものをプレートに添加することもできる。さらに、核酸と核酸導入剤を混合プレートに添加した後に、コラーゲン溶液を添加することもできる。核酸と核酸導入剤を混合し、しばらく室温にて放置した後に、コラーゲン溶液を混合し、それをプレートに添加するのが好ましい。 In order to prepare collagen, a nucleic acid introduction agent and a nucleic acid in the cell transfection array of the present invention, a mixture of a nucleic acid and a nucleic acid introduction agent can be further added to a collagen solution, or a nucleic acid introduction A solution obtained by adding a nucleic acid to a mixed solution of an agent and collagen can also be added to the plate. Furthermore, after adding a nucleic acid and a nucleic acid introduction agent to a mixing plate, a collagen solution can also be added. It is preferable that the nucleic acid and the nucleic acid introduction agent are mixed and allowed to stand at room temperature for a while, and then the collagen solution is mixed and added to the plate.
導入される核酸と、核酸導入剤およびコラーゲンの混合溶液をプレート等の固相に添加した後に乾燥させるか、あるいは乾燥させずに核酸、核酸導入剤およびコラーゲンをプレートに吸着させる等のいずれの方法によっても本発明のセルトランスフェクションアレイを調製することができる。 Either a method of adding a mixed solution of a nucleic acid to be introduced and a nucleic acid introduction agent and collagen to a solid phase such as a plate and then drying, or adsorbing a nucleic acid, a nucleic acid introduction agent and collagen to a plate without drying Can also prepare the cell transfection array of the present invention.
上記のように調製して得られたセルトランスフェクションアレイに、細胞を播種し、培養し、形質転換細胞を得ることができる。細胞の種類としては、所望の遺伝子の宿主となりうる細胞であれば良く、例えば酵母菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を使用することができる。添加する細胞は、例えば96穴のマイクロプレートの１ウェルあたりに10〜106cells／well、好ましくは102〜105cells／wellとなるように公知の細胞培養用培地を用いて調製したものを使用することができる。 Cells can be seeded and cultured in the cell transfection array prepared as described above to obtain transformed cells. The cell type may be any cell that can serve as a host for a desired gene. For example, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used. Cells to be added, for example in a single well of a 96-well microplate 10 to 10 6 cells / well, which preferably was prepared using the medium for known cell culture such that the 10 2 ~10 5 cells / well Can be used.
本発明は、上記セルトランスフェクションアレイ、その調製方法、上記セルトランスフェクションアレイを用いた核酸導入方法並びに本発明のセルトランスフェクションアレイを含む核酸導入法に関する。さらに、本発明は核酸導入剤およびコラーゲンを含むセルトランスフェクションアレイの調製用キットにもおよび、さらに上記セルトランスフェクションアレイを含む核酸導入用キットにもおよぶ。 The present invention relates to the above-described cell transfection array, a method for preparing the same, a nucleic acid introduction method using the cell transfection array, and a nucleic acid introduction method including the cell transfection array of the invention. Furthermore, the present invention extends to a kit for preparing a cell transfection array containing a nucleic acid introduction agent and collagen, and further to a kit for introducing a nucleic acid containing the cell transfection array.
本発明の理解を深めるために、以下に実施例および実験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるまでもないことが明らかである。 In order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be specifically described below with reference to examples and experimental examples. However, it is obvious that the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）セルトランスフェクションアレイの調製
１）材料
核酸（遺伝子）としてプラスミドＤＮＡを用い、緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するpEGFP-N1（クローンテック社製）を用いた。核酸導入剤としてカチオン性リポソームを含む市販のリポフェクトアミン2000（Lipofectamine2000 (Invitrogen社製)、以下単に「LF」または「LF2000」という。）を用いた。
２）方法
セルトランスフェクションアレイは図１のフローチャートに従って調製した。原則として、図１に示すプラスミドＤＮＡ（核酸）、LF2000（核酸導入剤）およびアテロコラーゲン（コラーゲン）を混合したものを96穴のマイクロプレートに添加したものをセルトランスフェクションアレイとした。以下の実験例では、マイクロプレートに添加する条件を各種変動させたものについて、細胞増殖、遺伝子導入および遺伝子の発現効果等を調べた。
Example 1 Preparation of Cell Transfection Array 1) Material pEGFP-N1 (Clontech) expressing green fluorescent protein (EGFP) was used using plasmid DNA as a nucleic acid (gene). Commercially available Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen), hereinafter simply referred to as “LF” or “LF2000”) containing cationic liposomes as a nucleic acid introduction agent was used.
2) Method The cell transfection array was prepared according to the flowchart of FIG. In principle, a cell transfection array was prepared by adding a mixture of plasmid DNA (nucleic acid), LF2000 (nucleic acid introduction agent) and atelocollagen (collagen) shown in FIG. 1 to a 96-well microplate. In the following experimental examples, cell proliferation, gene transfer, gene expression effects, and the like were examined for various changes in the conditions added to the microplate.
（実験例１） 核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイにＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫由来細胞）に遺伝子を導入したときの細胞に対する影響および遺伝子導入効率を確認した。
ＰＣ１２細胞をDMEM培地にウマ血清10％およびウシ胎児血清（FBS）を5％添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。
(Experimental example 1) Confirmation of gene transfer efficiency when the amount of nucleic acid transfer agent used was changed Cell transfection arrays were prepared in a system using various amounts of LF2000 according to the technique of Example 1. When the gene was introduced into PC12 cells (rat adrenal pheochromocytoma-derived cells) into the cell transfection array, the effect on the cells and the gene introduction efficiency were confirmed.
PC12 cells were proliferated using a medium in which 10% horse serum and 5% fetal bovine serum (FBS) were added to DMEM medium and seeded with 100 μL of each well prepared to 2 × 10 5 cells / ml. Cultured for 3 days.
細胞への遺伝子の導入は、細胞に緑色蛍光タンパク質（EGFP）が発現したことによる蛍光を観察することにより確認した。遺伝子導入効率は、ある視野における全細胞あたりのEGFPを発現している細胞の割合で示した。 The introduction of the gene into the cells was confirmed by observing fluorescence due to the expression of green fluorescent protein (EGFP) in the cells. Gene transfer efficiency was expressed as the percentage of cells expressing EGFP per total cell in a field of view.
LF2000試薬の使用量は添付文書によれば、0.8 μg/wellであるが、使用量を1/2から1/10量まで変化させて遺伝子導入効率を確認した結果、図２および図３に示すようにLF2000の使用量依存的に遺伝子導入効率を示したが、LF2000の使用量を1/4以上としたときに、従来の核酸導入法と同等に約25％以上の遺伝子導入効率が認められた。 According to the package insert, the amount of LF2000 reagent used is 0.8 μg / well. As a result of confirming gene transfer efficiency by changing the amount used from 1/2 to 1/10, the results are shown in FIG. 2 and FIG. As shown in the figure, gene transfer efficiency was shown to depend on the amount of LF2000 used, but when the amount of LF2000 used was 1/4 or higher, gene transfer efficiency of about 25% or more was observed, equivalent to the conventional nucleic acid transfer method. It was.
（実験例２） 核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに２９３細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子導入効率を確認した。
２９３細胞（ヒト胎児腎由来細胞；アデノウイルスにより形質変換された細胞）は、DMEM培地にウシ胎児血清(FBS)10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。遺伝子導入効率の測定は、実験例１と同様に行った。
(Experimental example 2) Confirmation of gene transfer efficiency when the amount of nucleic acid transfer agent used was changed Cell transfection arrays were prepared in a system using various amounts of LF2000 according to the technique of Example 1. The gene transfer efficiency when the gene was introduced into 293 cells into the cell transfection array was confirmed.
293 cells (human embryonic kidney-derived cells; cells transformed with adenovirus) were grown using a medium obtained by adding 10% fetal bovine serum (FBS) to DMEM medium, and the number of cells was 2 × 10 5 cells / ml. Each well was seeded with 100 μL of each well and cultured for 3 days. The gene introduction efficiency was measured in the same manner as in Experimental Example 1.
LF2000試薬の使用量を1/5から1/10量まで変化させて遺伝子導入効率を確認した結果、図４に示すように、LF2000試薬使用量1/6量以上のときに安定的に35％以上の遺伝子導入が認められた。 As a result of confirming gene transfer efficiency by changing the amount of LF2000 reagent used from 1/5 to 1/10 volume, as shown in Fig. 4, 35% is stable when the amount of LF2000 reagent used is 1/6 or more. The above gene transfer was observed.
（実験例３） 核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌由来細胞）を播種し、遺伝子を導入したときの細胞に及ぼす影響および遺伝子導入効率を確認した。
ＭＣＦ−７細胞は、RPMI1640培地にウシ胎児血清10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×104cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、５日間培養した。
(Experimental example 3) Confirmation of gene transfer efficiency when the amount of the nucleic acid transfer agent used was changed Cell transfection arrays were prepared in a system using various amounts of LF2000 according to the method of Example 1. The cell transfection array was seeded with MCF-7 cells (human breast cancer-derived cells), and the effect on the cells when the gene was introduced and the gene introduction efficiency were confirmed.
MCF-7 cells were grown using RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, seeded with 100 μL of each well prepared at 2 × 10 4 cells / ml, and cultured for 5 days.
細胞増殖度は、各ウェルに、Tetra color one proliferation assay試薬を10μL添加し、37℃のCO2インキュベーターで１時間インキュベート後、波長450nmでの吸光度（O.D450）を波長630nmでの吸光度（O.D630）を対照として測定した。遺伝子導入効率は、実験例１と同様に行った。 The cell proliferation degree was determined by adding 10 μL of Tetra color one proliferation assay reagent to each well, incubating for 1 hour in a CO 2 incubator at 37 ° C., and then measuring the absorbance at 450 nm wavelength (O.D450) at the absorbance at 630 nm wavelength (O .D630) as a control. Gene transfer efficiency was performed in the same manner as in Experimental Example 1.
上記の結果、添付文書における使用量の1/40量より少ないLF2000を用いた場合に細胞毒性が軽減された（図５）。また、1/40量を使用した場合に遺伝子の導入効果が認められた（表１）。
これにより、LF2000を添付文書に記載の使用量の1/40量の核酸導入剤を添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると細胞毒性が軽減化され、遺伝子導入効果も得られることが確認された。
Thus, it was confirmed that when LF2000 was used with a cell transfection array to which a nucleic acid introduction agent of 1/40 of the use amount described in the package insert was used, cytotoxicity was reduced and a gene introduction effect was also obtained.
（実験例４） アテロコラーゲンの有無による細胞および発現効率に対する影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量の1/40量のLF2000を用い、さらにアテロコラーゲンの添加の系および無添加の系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例３と同様にＭＣＦ−７細胞を播種し、遺伝子を導入したときおよび遺伝子を導入しないときのコラーゲンの有無による細胞に対する影響を検討した。細胞増殖度の測定は実験例３と同様に行い、遺伝子導入効率の測定方法は実験例１と同様に行った。
(Experimental example 4) Effect of presence or absence of atelocollagen on cell and expression efficiency Using LF2000 of 1/40 of the amount used in the package insert according to the method of Example 1, and further in the system with and without the addition of atelocollagen A cell transfection array was prepared. MCF-7 cells were seeded on the cell transfection array in the same manner as in Experimental Example 3, and the effect on the presence or absence of collagen when the gene was introduced and when the gene was not introduced was examined. The degree of cell proliferation was measured in the same manner as in Experimental Example 3, and the method for measuring gene transfer efficiency was performed in the same manner as in Experimental Example 1.
上記の結果、アテロコラーゲンを用いたセルトランスフェクションアレイに細胞を播種した場合、良好な細胞の増殖が認められ、細胞毒性が軽減された（図６）。また1/20量、1/40量のLF2000を用いて調製したセルトランスフェクションアレイでの細胞に遺伝子の導入が観察された。また、その効果は培養後１日目および５日目のいずれの場合においてもアテロコラーゲンを添加した系のほうが優れていた（図７、８）。
これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。
As a result, when cells were seeded on a cell transfection array using atelocollagen, good cell growth was observed and cytotoxicity was reduced (FIG. 6). In addition, gene introduction into cells was observed with cell transfection arrays prepared using 1/20 and 1/40 LF2000. In addition, the effect of the system to which atelocollagen was added was superior in both cases of the first day and the fifth day after the culture (FIGS. 7 and 8).
Thus, it was confirmed that when a cell transfection array to which atelocollagen was added was used, a high gene transfer effect was obtained.
（実験例５） アテロコラーゲンの有無による細胞および導入効率に対する影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量の1/4量のLF2000を用い、さらにアテロコラーゲンの添加の系および無添加の系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例１と同様にＰＣ１２細胞を播種し、３日間培養した。遺伝子を導入したときおよび遺伝子を導入しないときのコラーゲンの有無による細胞に及ぼす影響を検討した。遺伝子導入については、実験例１と同様の手法で測定した。
(Experimental example 5) Effect of presence or absence of atelocollagen on cells and introduction efficiency In accordance with the method of Example 1, LF2000 was used in an amount of 1/4 of the amount used in the package insert, and in addition and in the system without addition of atelocollagen A cell transfection array was prepared. PC12 cells were seeded on the cell transfection array in the same manner as in Experimental Example 1, and cultured for 3 days. The effect of the presence or absence of collagen on the cells when the gene was introduced and when the gene was not introduced was examined. The gene introduction was measured by the same method as in Experimental Example 1.
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、アテロコラーゲンを添加した系について培養後３日目において高い遺伝子導入が認められた（図９）。これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。 As a result of the above, when cells were seeded on the cell transfection array, high gene transfer was observed on the third day after culture in the system to which atelocollagen was added (FIG. 9). Thus, it was confirmed that when a cell transfection array to which atelocollagen was added was used, a high gene transfer effect was obtained.
（実験例６） アテロコラーゲンの有無による細胞に及ぼす影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量から２倍に希釈したLF2000を用い、セルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例１と同様にＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞）を、DMEM培地にウシ胎児血清10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数1×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。また、従来法として、本法と同量のLF2000試薬を使用し、添付文書に従って遺伝子導入を行った。顕微鏡観察によりそれぞれの方法で遺伝子導入した細胞の状態を確認した。遺伝子導入は、蛍光顕微鏡を用いてEGFPの発現を観察することにより確認した。
(Experimental example 6) Influence on the cell by the presence or absence of atelocollagen According to the method of Example 1, a cell transfection array was prepared using LF2000 diluted two-fold from the amount used in the package insert. As in Experimental Example 1, HepG2 cells (human hepatoma-derived cells) were grown on the cell transfection array using a medium obtained by adding 10% fetal bovine serum to DMEM medium, and the number of cells was 1 × 10 5 cells / ml. Each well was seeded with 100 μL of each well and cultured for 3 days. As a conventional method, the same amount of LF2000 reagent as in this method was used, and gene transfer was performed according to the package insert. The state of the cell into which the gene was introduced by each method was confirmed by microscopic observation. Gene transfer was confirmed by observing the expression of EGFP using a fluorescence microscope.
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、培養後３日目において細胞毒性の軽減が認められた（図１０）。これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると、細胞毒性が軽減され、かつ高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。 As a result of the above, when cells were seeded on the cell transfection array, reduction of cytotoxicity was observed on the third day after culturing (FIG. 10). Thus, it was confirmed that when a cell transfection array to which atelocollagen was added was used, cytotoxicity was reduced and a high gene transfer effect was obtained.
（実験例７） アテロコラーゲンの有無による遺伝子発現期間の違い
実施例１の手法に従い、実験例１と同様にＰＣ１２細胞に遺伝子を導入した。その結果を蛍光顕微鏡を用い、倍率100倍でEGFPの発現を経時的に観察した。
(Experimental example 7) The difference in the gene expression period by the presence or absence of atelocollagen According to the method of Example 1, a gene was introduced into PC12 cells in the same manner as in Experimental Example 1. The results were observed over time using a fluorescence microscope at a magnification of 100 times.
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、顕微鏡観察下では培養後３日後であればアテロコラーゲンの有無に関係なく遺伝子発現が認められたが、培養後７日目では、アテロコラーゲンを添加しない系ではEGFPの発現が激減しているのに対して、アテロコラーゲンを添加した系ではEGFPの発現が維持されており、アテロコラーゲンの添加により、長期間の遺伝子発現が可能になることが示された（図１１）。 As a result of the above, when the cells were seeded on the cell transfection array, gene expression was observed regardless of the presence or absence of atelocollagen after 3 days of culture under microscopic observation. The expression of EGFP is drastically reduced in the system without addition, whereas the expression of EGFP is maintained in the system with addition of atelocollagen, and it is shown that long-term gene expression is possible with the addition of atelocollagen. (FIG. 11).
（実験例８） セルトランスフェクションアレイの保存安定性
実施例１の手法に従ってセルトランスフェクションアレイを調製した直後および各時間保存した後に細胞を播種して３日間培養したときの遺伝子導入効率を調べ、保存安定性を確かめた。遺伝子導入効率の測定は、実験例１と同様に行った。
(Experimental Example 8) Storage Stability of Cell Transfection Array Immediately after the cell transfection array was prepared according to the method of Example 1 and after storage for each time, the gene introduction efficiency was examined when cells were seeded and cultured for 3 days, Storage stability was confirmed. The gene introduction efficiency was measured in the same manner as in Experimental Example 1.
上記の結果、セルトランスフェクションアレイ調製後４週間経過後であっても、調製直後と同等の遺伝子導入効率が確認された（図１２）。それにより、保存安定性があることが示された。 As a result, even after 4 weeks from the preparation of the cell transfection array, the gene transfer efficiency equivalent to that immediately after the preparation was confirmed (FIG. 12). Thereby, it was shown that there is storage stability.
上記説明した結果、本発明のセルトランスフェクションアレイを用いると、細胞播種時に核酸導入剤等の添加の必要なく効果的に宿主細胞中に遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、調製したセルトランスフェクションアレイは４週間程度の保存に耐えうるものである。これにより、セルトランスフェクションアレイを調製後、運搬、流通させることができる。そこで、多種類の核酸をプレーティングしたセルトランスフェクションアレイを調製し、流通させれば、ユーザーはそのセルトランスフェクションアレイに細胞を播種するだけで、多検体の遺伝子を細胞レベルで解析できることが可能となるため、各研究機関における遺伝子機能解析、創薬におけるスクリーニング、各臨床検査機関での検査等への応用が期待できる。 As a result of the above description, when the cell transfection array of the present invention is used, it is possible to effectively express a gene in a host cell without the necessity of adding a nucleic acid introduction agent or the like at the time of cell seeding. Furthermore, the prepared cell transfection array can withstand storage for about 4 weeks. Thereby, a cell transfection array can be transported and distributed after preparation. Therefore, if a cell transfection array plated with many kinds of nucleic acids is prepared and distributed, users can analyze the genes of many samples at the cell level by simply seeding the cells into the cell transfection array. Therefore, it can be expected to be applied to gene function analysis in each research institution, screening in drug discovery, examination in each clinical laboratory.
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