JP4585139B2 - Method for detecting or quantifying bisphosphonate compounds - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩を検出または定量する新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスフォスフォネート化合物は、２つのＣ−Ｐ結合を有することを特徴とする化合物であって、骨吸収を強力に抑制する化合物群として知られている。例えば、ビスフォスフォネート化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞培養や器官培養において、さまざまな手段によって引き起こされた骨吸収を抑制することが知られている。前者においては破骨細胞による石灰化組織上での小窩（ｐｉｔ）の形成を抑制する。また後者においては、胎仔長管骨や、新生仔頭蓋冠における骨吸収を減少させる。また、ビスフォスフォネート化合物によって副甲状腺ホルモン、カルシトリオール、プロスタグランジン、腫瘍細胞などの骨吸収刺激物質の作用が抑制されることが知られている。
【０００３】
またビスフォスフォネート化合物は、成長期の動物において、一次骨梁と二次骨梁の吸収を抑制し、骨幹端のモデリングとリモデリングを停止させることが知られており、ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩は、医薬品として骨吸収が亢進したパジェット病、腫瘍随伴性骨疾患、骨粗鬆症の患者に応用されている。
【０００４】
ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩は、医薬品として通常錠剤の形態で使用されるが、品質検査のため、医薬製剤（特に錠剤）中のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩を、非常に多くのサンプルについて検出または定量する必要がある。
【０００５】
従来、ビスフォスフォネート化合物の検出または定量方法としては、示差屈折法や液体クロマトグラフとマススペクトルを組み合わせた方法が用いられている。しかしながら、これらの方法は、高価な装置が必要であるとともに、分析に長時間要する。また、ビスフォスフォネート化合物自体は、紫外線吸収スペクトル分析に通常使用される紫外線の範囲（波長２２０ｎｍ〜３００ｎｍ）に吸収はほとんどない。
【０００６】
一方、ビスフォスフォネート化合物は、金属イオンに対し強い親和性を有し、可溶性または不溶性の複合体を形成することが知られている。また、ビスフォスフォネート化合物の２価の銅塩は殺藻剤として有用であることが知られている（特開昭４８−９８０１７号公報）。さらに、銅メッキの工程において、銅の回収法としてビスフォスフォネート化合物の２価の銅塩を用いることが知られている（特開平６−２７２０９６号公報）。しかしながら、いずれの報告にもビスフォスフォネート化合物の紫外線吸収スペクトルに関する記載は一切無い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ビスフォスフォネート化合物は、分析に通常使用される紫外線の範囲に吸収はほとんどなく、また、ビスフォスフォネート化合物を検出または定量するには高価な装置が必要であり、さらに分析には長時間を要する等の問題があった。また、上記ビスフォスフォネート化合物は医薬品として使用される化合物であり、品質検査等において非常に多くのサンプルを分析（検出または定量）する必要がある。従って、ビスフォスフォネート化合物を簡便かつ短時間で検出または定量できる方法の開発が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩と、遷移金属とから複合体を形成させ、該複合体による紫外線の吸収を測定することにより、ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩を検出または定量することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
〔１〕下記式（１）
【００１０】
【化６】
（式中、Ｒ1は、水素原子、水酸基またはハロゲン原子を表し、およびＲ2は、ハロゲン原子、アミノ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素数３〜７のシクロアルキルアミノ基、またはアミノ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基および炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換された炭素数１〜６のアルキル基を表す。）で表されるビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩と、遷移金属とから複合体を形成させ、該複合体による紫外線の吸収を測定することを特徴とするビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
〔２〕遷移金属が銅、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルまたは亜鉛である〔１〕記載のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
〔３〕紫外線の波長が２２０ｎｍ〜２５０ｎｍである〔１〕記載のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
〔４〕ビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩が式（２）
【００１２】
【化７】
、式（３）
【００１４】
【化８】
、式（４）
【００１６】
【化９】
、または式（５）
【００１８】
【化１０】
である〔１〕記載のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
【００２０】
〔５〕医薬製剤中におけるビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法である〔１〕記載のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
〔６〕医薬製剤が錠剤である〔５〕記載のビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩の検出または定量方法；
等に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明におけるビスフォスフォネート化合物としては、
【００２２】
【化１１】
（式中、Ｒ1は、水素原子、水酸基またはハロゲン原子を表し、およびＲ2は、ハロゲン原子、アミノ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素数３〜７のシクロアルキルアミノ基、またはアミノ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基および炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換された炭素数１〜６のアルキル基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
【００２４】
なかでも、紫外線（特に波長２２０ｎｍ〜３００ｎｍのもの）をほとんど吸収しない化合物が好ましい。
【００２５】
Ｒ1およびＲ2における「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、好ましくは塩素原子が挙げられる。
【００２６】
Ｒ2における「炭素数１〜６のアルキル基」とは、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、好ましくはメチルおよびプロピルが挙げられる。
【００２７】
Ｒ2における「炭素数１〜６のアルキルアミノ基」とは、１つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。ここでいう炭素数１〜６のアルキル基は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」と同義である。「炭素数１〜６のアルキルアミノ基」の具体例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ等が挙げられる。
【００２８】
Ｒ2における「炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基」とは、２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。ここでいう炭素数１〜６のアルキル基は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」と同義である。「炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基」の具体例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジプロピルアミノ、メチルプロピルアミノ、ジブチルアミノ等が挙げられる。
【００２９】
Ｒ2における「炭素数３〜７のシクロアルキルアミノ基」とは、１つの炭素数３〜７のシクロアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。具体的には、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、シクロへプチルアミノ等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ2における「アミノ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基および炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換された炭素数１〜６のアルキル基」（以下、置換アルキルと略す。）のアルキル部分は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」と同義である。
【００３１】
上記置換アルキルの置換基における炭素数１〜６のアルキルアミノ基は、上記「炭素数１〜６のアルキルアミノ基」と同義である。
【００３２】
上記置換アルキルの置換基における炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基は、上記「炭素数２〜１２のジアルキルアミノ基」と同義である。
【００３３】
上記置換アルキルの具体例としては、３−アミノプロピル等が挙げられる。
【００３４】
上記式（１）で表されるビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩における好ましい具体例としては、
式（２）：（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート
【００３５】
【化１２】
、式（３）：（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩
【００３７】
【化１３】
、式（４）：（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−フォスフォネート
【００３９】
【化１４】
、式（５）：（ジクロロメチレン）ビス−フォスフォネート
【００４１】
【化１５】
等が挙げられる。
【００４３】
なかでも、式（２）：（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート
【００４４】
【化１６】
またはその薬学上許容される塩が特に好ましい。
【００４６】
本発明における紫外線とは、波長が２００ｎｍ〜４００ｎｍの電磁波をいう。好ましくは後記複合体の極大吸収波長が存在する２００ｎｍ〜２６０ｎｍの範囲が挙げられ、特に好ましくは２２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲が挙げられる。
【００４７】
本発明における遷移金属とは、遷移金属の原子またはイオンを意味し、ビスフォスフォネート化合物と共に紫外線を吸収する複合体を形成するものであれば特に限定されない。好ましくは後記複合体の紫外線の吸収を測定する波長付近に遷移金属自身が強い吸収を持たないものが好ましい。このような遷移金属の具体例としては、銅、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛等が挙げられ、好ましくは銅、鉄、コバルト、ニッケルが挙げられる。なかでも銅が好ましく、特に２価の銅が好ましい。
【００４８】
本発明におけるビスフォスフォネート化合物と遷移金属とから形成される複合体は、錯体、錯イオン、塩等のビスフォスフォネート化合物と遷移金属とから形成される化合物であって、紫外線を吸収するものであれば特に限定されないが、感度の点から、紫外線吸収スペクトルを測定した場合の極大吸収波長に対する分子吸光係数が１００以上であるものが好ましい。また、該複合体は、紫外線を吸収する性質を有している限り、ビスフォスフォネート化合物および遷移金属以外の原子またはイオン、溶媒分子等を含んでいてもよい。
【００４９】
上記複合体は、溶液中で形成させることが好ましい。該溶液としては中性、酸性の水溶液等が挙げられ、好ましくは酸性の水溶液が挙げられる。
【００５０】
上記複合体を溶液中で形成させる場合、通常、上記遷移金属は塩の形態で供給される。このような遷移金属塩としては、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩等が挙げられ、好ましくは硫酸塩が挙げられる。具体的な遷移金属塩としては、硫酸銅(II)等が挙げられ、好ましくは無水硫酸銅(II)が挙げられる。また、これらの塩は、水和物等の溶媒和物であってもよい。
【００５１】
上記複合体を形成させる際のビスフォスフォネート化合物に対する遷移金属の量は、ビスフォスフォネート化合物に対して大過剰であればよいが、好ましくはビスフォスフォネート化合物に対し５倍モル以上であり、より好ましくは１０倍モル以上である。
【００５２】
上記複合体による紫外線の吸収は、通常溶液中で測定を行う。測定用溶液としては、上記複合体を形成させた溶液をそのまま使用することができるが、該複合体を形成した後に分離し、測定用の別の溶液を調製してもよい。また、紫外線の吸収は、ｐＨ、温度、溶液組成（溶媒および含有されるイオンの種類および濃度）、調製方法（試薬混合順序、ｐＨ調整の時機等）、溶液調製から測定までの時間等の条件によって測定値が変動するため、測定用溶液を測定前に所定の条件になるよう調整することが好ましい。
【００５３】
また、測定用溶液は、ｐＨの変動を少なくするために、各種の緩衝液であることが好ましい。緩衝液は目的のｐＨに応じて選択することができる。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、塩酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度としては、０．０１〜１モルの範囲であることが好ましい。
【００５４】
上記複合体による紫外線の吸収を測定する際のｐＨは、酸性であることが好ましい。好ましい範囲としては、ｐＨ１．２〜４．５の範囲が挙げられ、さらに好ましくはｐＨ４前後が挙げられる。ｐＨの調整は、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液等の酸および塩基を用いて行えばよい。
【００５５】
上記複合体による紫外線の吸収を測定する際の波長は、２００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲から選択されるが、感度の点から、好ましくは複合体の極大吸収波長が存在する２００ｎｍ〜２６０ｎｍの範囲（特に２２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲）から選択される。具体的には、所定の測定条件において複合体の紫外線吸収スペクトルを測定し、その際に極大吸収を示す波長とすることが好ましい。また、極大吸収ピークが単一ピークでない場合には、それ以外の単一ピークを示す波長を測定波長として選択してもよい。例えば、遷移金属として２価の銅を使用する場合、複合体の極大吸収は２２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲に存在するので、測定波長は２２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲から選択することが好ましい。具体的には、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートと２価の銅とから形成される複合体の場合、極大吸収波長は２２５ｎｍ〜２３５ｎｍの範囲に存在するので、測定波長は２２５ｎｍ〜２３５ｎｍの範囲から選択することが好ましい。この場合の分子吸光係数は、測定用溶液に含有されるイオン、ｐＨ等によって異なるが、例えば、ｐＨが４前後であれば、１．３×１０3〜２．７×１０3の範囲、ｐＨ１．２前後であれば１．９×１０2〜２．１×１０2の範囲となる。
【００５６】
紫外線の吸収を測定する際の温度は、特に限定されないが、通常室温付近で行う。また、測定用装置も特に限定されず、一般に市販されている紫外線分光器を使用することができる。
【００５７】
本発明の方法は、測定用溶液（サンプル）が、ビスフォスフォネート化合物を１０-4〜１０-3ｍｏｌ／Ｌの濃度の範囲内で含有するものである場合、測定精度の点で有利である。測定溶液中の該化合物の濃度が上記範囲内にないと想定される場合、上記範囲内になるように、測定前に予め測定用溶液を公知の方法により希釈または濃縮して該化合物濃度を調整してもよい。
【００５８】
次に一般的な検量線の作成の仕方と測定方法および条件を示す。
【００５９】
まず、ビスフォスフォネート化合物の標準品を乾燥し、正確に秤量する。このビスフォスフォネート化合物をメスフラスコ等のなかで試験液に溶解し、標準原液とする。この標準原液を一定量採取して、遷移金属または遷移金属の溶液を加え、数種類の濃度のビスフォスフォネート化合物・遷移金属複合体溶液を作成する。当該複合体溶液は、緩衝液であることが好ましく、さらに、サンプルのｐＨが測定に好ましくない場合等においてはｐＨ調整を行ってもよい。
【００６０】
次に、上記複合体溶液について紫外線分光光度計を用いて紫外線吸収スペクトルを測定し、その結果から測定波長を決定する。好ましくは極大吸収波長を測定波長とする。次いで決定した測定波長において、上記各濃度の複合体溶液の紫外線の吸収（吸光度）を紫外線分光光度計を用いて測定する。なお、紫外線の吸収を測定する際は、リファレンスとして、同濃度の遷移金属塩溶液を使用する。また、測定温度は、例えば、室温付近とする。
【００６１】
得られた吸光度と、ビスフォスフォネート化合物の濃度から検量線を作成し、次いで分子吸光係数を計算する。分子吸光係数（ε）は以下の式（ｉ）で求めることができる。
【００６２】
【数１】
（式中、Ａは吸光度、ｃはモル濃度、ｌは光路の厚さ（ｃｍ）、Ｍは当該化合物の分子量、ｃ'は１Ｌあたりの当該化合物のグラム数を表す。）
【００６４】
次いで、サンプルについて、検量線を作成する場合と同様に、測定用溶液を調製し、所定の波長における吸光度を測定する。なお、測定時のｐＨ、温度、溶液組成（溶媒および含有されるイオンの種類および濃度）、調製方法（試薬混合順序等）、溶液調製から測定までの時間等の条件によって、得られる測定値が変動するので、検量線を作成する場合と同様にすることが好ましい。サンプルについて得られた吸光度と上記分子吸光係数からサンプル中のビスフォスフォネート化合物の濃度を算出することができる。
【００６５】
【実施例】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００６６】
なお、実施例および比較例において、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩を「化合物Ａ」と、（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−フォスフォネートを「化合物Ｂ」と称する。また、実施例および比較例において使用される各試験液を以下に示す。
【００６７】
試験液▲１▼（ｐＨ１．２）：日本薬局方（第１３改正）崩壊試験の第１液の調製法に従い、塩化ナトリウム２．０ｇに３６%塩酸７．０ｍＬおよび水を加えて１０００ｍＬにしたもの。
【００６８】
試験液▲２▼（ｐＨ４．５）：日本薬局方（第１３改正）試薬・溶液のリン酸緩衝液の調製法に従い、リン酸２水素カリウム１．７０ｇおよび無水リン酸水素２ナトリウム１．７７５ｇを水に溶かし５００ｍＬとした液に、更に水を加え、１０００ｍＬにした液を３ｍｏｌ/Ｌの塩酸でｐＨを４．５に調整したもの。
【００６９】
試験液▲３▼（ｐＨ４．０）：酢酸３．０ｇに水を加えて１０００ｍＬとした液に、酢酸ナトリウム３水和物１．７０ｇを水２５０ｍＬに溶解した液を加え、ｐＨ４．０に調整したもの。
【００７０】
試験液▲４▼（ｐＨ６．８）：日本薬局方（第１３改正）試薬・溶液のリン酸緩衝液の調製法に従い、リン酸２水素カリウム１．７０ｇおよび無水リン酸水素２ナトリウム１．７７５ｇを水に溶かし５００ｍＬとした液に、更に水を加え、１０００ｍｌにしたもの。
【００７１】
試験液▲５▼（ｐＨ４．０）：試験液▲１▼に０．１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム試液を加えてｐＨ４．０に調整したもの。
【００７２】
試験液▲６▼（ｐＨ４．０）：試験液▲４▼に０．１ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液を加えてｐＨ４．０に調整したもの。
【００７３】
試験液▲７▼：無水硫酸銅(II)０．０７ｇを水に溶かし、１００ｍＬとしたもの。
【００７４】
実施例１ 化合物Ａと銅(II)から形成された複合体の分子吸光係数
（１）測定用溶液がｐＨ１．２の場合
化合物Ａの濃度が０．１１ｍｇ/ｍＬとなるように試験液▲１▼で調整した溶液４ｍＬに、試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲１▼で正確に１０ｍＬとした。この溶液の紫外線吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長を求め、その結果から測定波長を２２８ｎｍに定めた。該紫外線吸収スペクトルの結果を図１に示す。なお、リファレンスとして、化合物Ａを加えないで上記方法で調整した溶液を用いた。次いで測定波長２２８ｎｍおける吸光度を測定し、得られた吸光度から分子吸光係数を上記式（ｉ）により算出した。その結果を表１に示す。
【００７５】
（２）測定用溶液がｐＨ４．５の場合
化合物Ａの濃度が０．１１ｍｇ/ｍＬとなるように試験液▲２▼で調整した溶液４ｍＬに、試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲２▼を加えて正確に１０ｍＬとした。この溶液の紫外線吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長を求め、その結果から測定波長を２３２ｎｍに定めた。該紫外線吸収スペクトルの結果を図２に示す。なお、リファレンスとして、化合物Ａを加えないで上記方法で調製した溶液を用いた。次いで測定波長２３２ｎｍおける吸光度を測定し、得られた吸光度から分子吸光係数を上記式（ｉ）により算出した。その結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
実施例２ 錠剤中の化合物Ａの溶出試験
１．溶出試験
日本薬局方（第１３改正）一般試験法の溶出試験法の項に記載の第２法（パドル法）に従って、化合物Ａを含有する錠剤１個（化合物Ａ含有量２００ｍｇ）をとり、溶出試験液として水、試験液▲１▼、▲３▼および▲４▼をそれぞれ９００ｍＬ使用し、毎分５０回転で撹拌しながら溶出試験を行った。溶出試験開始後５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分の各時点で定量ポンプを用いて、溶出試験液５ｍＬを孔径２０μｍのポリエステル繊維を積層したフィルターでろ過してろ液を採取した。採取後、直ちに３７±０．５℃に加温した試験液５ｍＬ（採取により減じた分）を注意して補った。
【００７８】
２．試料溶液の調製
上記ろ液２ｍＬを正確に量り、以下のように各試料溶液を調製した。
（１）溶出試験液が水の場合
ろ液２ｍＬに試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、水を加えて正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。
（２）溶出試験液がｐＨ１．２（試験液▲１▼）の場合
ろ液２ｍＬに０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム試液、０．０１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム試液または試験液▲１▼を加えてｐＨ３．９〜４．１に調整した。この液に試験液▲７▼２ｍＬを正確に加え、試験液▲５▼を加えて正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。
（３）溶出試験液がｐＨ４．０（試験液▲３▼）の場合
ろ液２ｍＬに試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲３▼を加えて正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。
（４）溶出試験液がｐＨ６．８（試験液▲４▼）の場合
ろ液２ｍＬに０．０５ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液、０．０１ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液または試験液▲４▼を加えてｐＨ３．９〜４．１に調整した。この液に試験液▲７▼２ｍＬを正確に加え、さらに試験液▲６▼を加えて正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。
【００７９】
３．標準溶液の調製
以下の化合物Ａ標準品を２１０℃で２時間乾燥し、その約０．０２２ｇを精密に量り、各試験液に溶かし、正確に２００ｍＬとし、標準原液とした。この標準原液を用いて以下のように標準溶液(a)、(b)および(c)を調製した。なお、以下における対表示量とは、上記本錠剤１錠中の化合物Ａ量（２００ｍｇ）に対応する量である。
【００８０】
［化合物Ａ標準品］
Ｃ2Ｈ6Ｎａ2Ｏ7Ｐ2：２４９．９９
下記の規格に適合するもの。
性状：本品は白色の粉末である。
確認試験：本品を乾燥し、赤外吸収スペクトル測定法の臭化カリウム錠剤法により測定するとき、波数１１６７ｃｍ-1、１０５８ｃｍ-1、９１９ｃｍ-1および８１４ｃｍ-1付近に吸収を認める。
純度試験：亜リン酸塩 本品約３．５ｇを精密に量り、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液（リン酸二水素ナトリウム二水和物７．８０ｇを水４５０ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウム試液を加えてｐＨ８．０に調整した後、水を加えて５００ｍＬとしたもの。）１００ｍＬに溶かした後、０．０５ｍｏｌ/Ｌヨウ素液２０ｍＬを正確に加え、直ちに密栓する。この液を暗所で３０分間放置した後、酢酸１ｍＬを加え、過量のヨウ素を０．１ｍｏｌ/Ｌチオ硫酸ナトリウム液で滴定する（指示薬：デンプン試液１ｍＬ）。同様の方法で空試験を行い、亜リン酸塩（ＮａＨ2ＰＯ3）の量を求めるとき、１．０％以下である。０．０５ｍｏｌ/Ｌヨウ素液１ｍＬ＝５．１９９ｍｇＮａＨ2ＰＯ3。
乾燥減量：５．０％以下（０．５ｇ、２１０℃、２時間）。
含量：９９．０％以上。
定量法：本品を乾燥し、その約０．５ｇを精密に量り、水に溶かし、正確に５０ｍＬとする。この液１５ｍＬを正確に量り、あらかじめカラムクロマトグラフ用強酸性イオン交換樹脂（Ｈ型）５ｍＬを用いて調製した直径１０ｍｍのクロマトグラフ柱に入れ、１分間に約１．５ｍＬの流速で流出させる。次に水２５ｍＬずつを用いてクロマトグラフ柱を２回洗う。洗液は先の流出液に合わせ、０．１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液で滴定する（電位差滴定法）。０．１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液１ｍＬ＝１２．５００ｍｇＣ2Ｈ6Ｎａ2Ｏ7Ｐ2。
【００８１】
（１）溶出試験液が水の場合
・標準溶液(a)（化合物Ａ濃度；対表示量の５０％）：標準原液２ｍＬを正確に量り、試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、水を加えて正確に１０ｍＬとした。
・標準溶液(b)（化合物Ａ濃度；対表示量の１００％）：標準原液４ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
・標準溶液(c)（化合物Ａ濃度；対表示量の１１２．５％）：標準原液４．５ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
（２）溶出試験液がｐＨ１．２（試験液▲１▼）の場合
・標準溶液(a)（化合物Ａ濃度；対表示量の５０％）：標準原液２ｍＬを正確に量り、０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム試液、０．０１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム試液または試験液▲１▼を加えてｐＨ３．９〜４．１に調整した。この液に試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲５▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
・標準溶液(b)（化合物Ａ濃度；対表示量の１００％）：標準原液４ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
・標準溶液(c)（化合物Ａ濃度；対表示量の１１２．５％）：標準原液４．５ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
（３）溶出試験液がｐＨ４．０（試験液▲３▼）の場合
・標準溶液(a)（化合物Ａ濃度；対表示量の５０％）：標準原液２ｍＬを正確に量り、試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲３▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
・標準溶液(b)（化合物Ａ濃度；対表示量の１００％）：標準原液４ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
・標準溶液(c)（化合物Ａ濃度；対表示量の１１２．５％）：標準原液４．５ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
（４）溶出試験液がｐＨ６．８（試験液▲４▼）の場合
・標準溶液(a)（化合物Ａ濃度；対表示量の５０％）：標準原液２ｍＬを正確に量り、０．０５ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液、０．０１ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液または試験液▲４▼を加えてｐＨ３．９〜４．１に調整した。この液に試験液▲７▼２ｍＬを正確に加えた後、試験液▲６▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
・標準溶液(b)（化合物Ａ濃度；対表示量の１００％）：標準原液４ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
・標準溶液(c)（化合物Ａ濃度；対表示量の１１２．５％）：標準原液４．５ｍＬを正確に量り、標準溶液(a)と同様に調製した。
【００８２】
４．対照液の調製
（１）溶出試験液が水の場合
試験液▲７▼２ｍＬを正確に量り、水を加えて正確に１０ｍＬとした。
（２）溶出試験液がｐＨ１．２（試験液▲１▼）の場合
試験液▲７▼２ｍＬを正確に量り、試験液▲５▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
（３）溶出試験液がｐＨ４．０（試験液▲３▼）の場合
試験液▲７▼２ｍＬを正確に量り、試験液▲３▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
（４）溶出試験液がｐＨ６．８（試験液▲４▼）の場合
試験液▲７▼２ｍＬを正確に量り、試験液▲６▼を加えて正確に１０ｍＬとした。
【００８３】
５．測定
上記（１）〜（４）における各標準溶液(a)について紫外線吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長を求め、各測定波長を以下のように決定した。なお、リファレンスとして、（１）〜（４）における各対照液を用いた。また、各紫外線吸収スペクトルの結果をそれぞれ図３〜６に示す。
（１）溶出試験液が水の場合 ：２３３ｎｍ
（２）溶出試験液がｐＨ１．２（試験液▲１▼）の場合：２３１ｎｍ
（３）溶出試験液がｐＨ４．０（試験液▲３▼）の場合：２２８ｎｍ
（４）溶出試験液がｐＨ６．８（試験液▲４▼）の場合：２３２ｎｍ
【００８４】
各試料溶液ならびに各標準溶液(a)、(b)および(c)につき、上記波長における吸光度ＡT（試料溶液）ならびに吸光度ＡS(a)（標準溶液(a)）、ＡS(b)（標準溶液(b)）およびＡS(c)（標準溶液(c)）を測定した。その結果から、縦軸に吸光度ＡS(a)、ＡS(b)およびＡS(c)を、横軸にそれぞれの標準溶液に対応する溶出試験液中の化合物Ａの濃度をとり、検量線を作成し、分子吸光係数を求めた。その結果を表２に示す。
【００８５】
【表２】
得られた分子吸光係数から各採取時間における溶出試験液中の化合物Ａの濃度を求めた。
【００８７】
実施例３ 錠剤中の化合物Ａの溶出試験
実施例２と同様にして、化合物Ａを含有する錠剤１個（化合物Ａ含有量２００ｍｇ）をとり、水、試験液▲１▼、▲３▼および▲４▼をそれぞれ９００ｍＬ使用した溶出試験を行い、その結果から下記式（ii）より各採取時間における化合物Ａの溶出率を算出した。その結果を表３に示す。
【００８８】
【数２】
（式中、Ｔは１錠中の化合物Ａの表示量（ｍｇ）、ｎは採取回数、Ｃｔnは試料溶液の吸光度ＡTおよび検量線から求めた各採取時間における溶出試験液中の化合物Ａの濃度（ｍｇ／ｍｌ）（ただし、Ｃｔ0＝０とする。）を表す。）
【００９０】
【表３】
実施例４ 錠剤中の化合物Ａの溶出試験
１．試験方法
日本薬局方（第１３改正）一般試験法の溶出試験法の項に記載の第２法（パドル法）に従って、化合物Ａを含有する各錠剤（ロットＮｏ．１〜３）１個（化合物Ａ含有量２００ｍｇ）をとり、水９００ｍＬ使用し、毎分５０回転で撹拌しながら溶出試験を行った（各ロットについて６つのベッセルを用いた。）。溶出試験開始６０分後、溶出試験液２０ｍｌをとり、孔径０．４５μmのメンブランフィルターでろ過した。初めのろ液１０ｍｌを除き、次のろ液２ｍｌを正確に量り、試験液▲７▼２ｍｌを正確に加えた後、水を加えて正確に１０ｍｌとし、試料溶液とした。
【００９２】
別に上記化合物Ａ標準品を２１０℃で２時間乾燥し、その約０．０２２gを精密に量り、水に溶かし、正確に２００ｍｌとし、標準原液とした。この液２ｍｌ、４ｍｌおよび４．５ｍｌを正確に量り、それぞれに試験液▲７▼２ｍｌを正確に加えた後、水を加えて正確に１０ｍｌとし、それぞれ５０％標準溶液、１００％標準溶液および１１２．５％標準溶液とした。
【００９３】
各試料溶液および各標準溶液につき、試験液▲７▼２ｍｌを正確に量り、水を加えて正確に１０ｍｌとした液を対照とし、吸光度測定法により試験を行い、波長２３３ｎｍにおける吸光度ＡT（試料溶液）、ＡS1（５０％標準溶液）、ＡS2（１００％標準溶液）およびＡS3（１１２．５％標準溶液）を測定した。縦軸に吸光度ＡS1、ＡS2およびＡS3を、横軸にそれぞれの標準溶液に対応する溶出試験液中の化合物Ａの濃度をとり、検量線を作成した。この検量線を用いて溶出試験液中の化合物Ａの濃度を求めた。その結果から下記式(iii)より各ベッセルの溶出率（％）および６つのベッセルの平均溶出率（％）を算出した。その結果を表４に示す。
【００９４】
【数３】
（式中、Ｔは１錠中の化合物Ａの表示量（ｍｇ）、Ｃは試料溶液の吸光度ＡTおよび検量線から求めた溶出試験液中の化合物Ａの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を表す。）
【００９６】
【表４】
実施例５ 化合物Ｂと銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトルの測定
１．試験方法
化合物Ｂ約０．０２２gを精密に量り、水に溶かし、正確に２００ｍｌとし、標準原液とした。この液４ｍｌを正確に量り、試験液▲７▼４ｍｌを正確に加えた後、水を加えて正確に１０ｍｌとし、標準溶液とした。試験液▲７▼４ｍｌを正確に量り、水を加えて正確に１０ｍｌとした液を対照とし、波長２００ｎｍから４００ｎｍにおける標準溶液の紫外線吸収スペクトルを測定した。その結果を図７に示す。また、その極大波長および極大波長における吸光度を表５に示す。
【００９８】
【表５】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の方法と同程度の測定精度で、簡便かつ短時間でビスフォスフォネート化合物またはその薬学上許容される塩を検出または定量することができる。従って、本発明の方法は、医薬品の品質検査等の非常に多くのサンプルを分析する場合において、特に優れた方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨ１．２の測定用溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図２】ｐＨ４．５の測定用溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図３】溶出試験液として水を使用し、銅(II)を添加した溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図４】ｐＨ１．２の溶出試験液を使用し、ｐＨ４．０に調整後、銅(II)を添加した溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図５】ｐＨ４．０の溶出試験液を使用し、銅(II)を添加した溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図６】ｐＨ６．８の溶出試験液を使用し、ｐＨ４．０に調整後、銅(II)を添加した溶液中の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩と銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。
【図７】水中の（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−フォスフォネートと銅(II)から形成された複合体の紫外線吸収スペクトル図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0002]
[Prior art]
Bisphosphonate compounds are compounds characterized by having two CP bonds, and are known as a group of compounds that strongly suppress bone resorption. For example, bisphosphonate compounds are known to inhibit bone resorption caused by various means in cell culture and organ culture in vitro. In the former, the formation of pits on the calcified tissue by osteoclasts is suppressed. The latter also reduces bone resorption in fetal long bone and neonatal calvaria. Moreover, it is known that the action of bone resorption stimulating substances such as parathyroid hormone, calcitriol, prostaglandin, and tumor cells is suppressed by bisphosphonate compounds.
[0003]
Bisphosphonate compounds are also known to inhibit primary and secondary trabecular resorption and stop metaphyseal modeling and remodeling in growing animals. Alternatively, the pharmaceutically acceptable salt thereof is applied as a pharmaceutical to patients with Paget's disease, paraneoplastic bone disease, and osteoporosis with enhanced bone resorption.
[0004]
The bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is usually used as a pharmaceutical in the form of a tablet. For quality inspection, the bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in a pharmaceutical preparation (especially a tablet) is used. The salt to be detected needs to be detected or quantified for a very large number of samples.
[0005]
Conventionally, as a method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound, a differential refraction method or a method combining a liquid chromatograph and a mass spectrum has been used. However, these methods require expensive equipment and require a long time for analysis. Further, the bisphosphonate compound itself has almost no absorption in the ultraviolet range (wavelength 220 nm to 300 nm) usually used for ultraviolet absorption spectrum analysis.
[0006]
On the other hand, bisphosphonate compounds are known to have a strong affinity for metal ions and form soluble or insoluble complexes. In addition, it is known that a divalent copper salt of a bisphosphonate compound is useful as an algicidal agent (Japanese Patent Laid-Open No. 48-98017). Furthermore, it is known that a divalent copper salt of a bisphosphonate compound is used as a copper recovery method in the copper plating process (Japanese Patent Laid-Open No. 6-272096). However, none of the reports describes the ultraviolet absorption spectrum of the bisphosphonate compound.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As noted above, bisphosphonate compounds have little absorption in the ultraviolet range typically used for analysis, and expensive equipment is required to detect or quantify bisphosphonate compounds, There was a problem that analysis took a long time. Further, the bisphosphonate compound is a compound used as a pharmaceutical, and it is necessary to analyze (detect or quantify) a very large number of samples in quality inspection or the like. Accordingly, it has been desired to develop a method capable of detecting or quantifying a bisphosphonate compound easily and in a short time.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have formed a complex from a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a transition metal, and the ultraviolet rays produced by the complex have been formed. By measuring absorption, it was found that a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be detected or quantified, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention
[1] The following formula (1)
[0010]
[Chemical 6]
(Wherein R 1 Represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a halogen atom, and R 2 Is a halogen atom, an amino group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, a dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms, a cycloalkylamino group having 3 to 7 carbon atoms, or amino Represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a group, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms and a dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms. A bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a transition metal, and measuring the absorption of ultraviolet rays by the complex. Or a method for detecting or quantifying a pharmaceutically acceptable salt thereof;
[2] A method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [1], wherein the transition metal is copper, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel or zinc;
[3] A method for detecting or quantifying the bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [1], wherein the wavelength of ultraviolet rays is 220 nm to 250 nm;
[4] A bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is represented by the formula (2)
[0012]
[Chemical 7]
, Formula (3)
[0014]
[Chemical 8]
, Formula (4)
[0016]
[Chemical 9]
Or formula (5)
[0018]
[Chemical Formula 10]
[1] A method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [1];
[0020]
[5] A method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [1], which is a method for detecting or quantifying a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in a pharmaceutical preparation. ;
[6] The method for detecting or quantifying the bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [5], wherein the pharmaceutical preparation is a tablet;
Etc.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As the bisphosphonate compound in the present invention,
[0022]
Embedded image
(Wherein R 1 Represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a halogen atom, and R 2 Is a halogen atom, an amino group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, a dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms, a cycloalkylamino group having 3 to 7 carbon atoms, or amino Represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a group, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms and a dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms. ).
[0024]
Among these, compounds that hardly absorb ultraviolet rays (especially those having a wavelength of 220 nm to 300 nm) are preferable.
[0025]
R 1 And R 2 Examples of the “halogen atom” include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, preferably a chlorine atom.
[0026]
R 2 The “alkyl group having 1 to 6 carbon atoms” in the formula means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl Hexyl and the like, preferably methyl and propyl.
[0027]
R 2 The “alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms” means an amino group substituted with one alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. The C1-C6 alkyl group here is synonymous with the said "C1-C6 alkyl group." Specific examples of the “C 1-6 alkylamino group” include methylamino, ethylamino, propylamino, isopropylamino, butylamino, isobutylamino, pentylamino, hexylamino and the like.
[0028]
R 2 The “dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms” in the group means an amino group substituted by two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms. The C1-C6 alkyl group here is synonymous with the said "C1-C6 alkyl group." Specific examples of the “dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms” include dimethylamino, diethylamino, ethylmethylamino, dipropylamino, methylpropylamino, dibutylamino and the like.
[0029]
R 2 The “cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms” in the group means an amino group substituted with one cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms. Specific examples include cyclopropylamino, cyclobutylamino, cyclopentylamino, cyclohexylamino, cycloheptylamino and the like.
[0030]
R 2 “An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with at least one substituent selected from the group consisting of an amino group, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, and a dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms” ( In the following, the alkyl moiety in (hereinafter abbreviated as substituted alkyl) has the same meaning as the above-mentioned “alkyl group having 1 to 6 carbon atoms”.
[0031]
The C1-C6 alkylamino group in the substituent of the said substituted alkyl is synonymous with the said "C1-C6 alkylamino group."
[0032]
The dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms in the substituent of the substituted alkyl has the same meaning as the “dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms”.
[0033]
Specific examples of the substituted alkyl include 3-aminopropyl.
[0034]
As a preferable specific example in the bisphosphonate compound represented by the above formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
Formula (2): (1-Hydroxyethylidene) bisphosphonate
[0035]
Embedded image
Formula (3): (1-hydroxyethylidene) bisphosphonate disodium salt
[0037]
Embedded image
Formula (4): (4-Amino-1-hydroxybutylidene) bisphosphonate
[0039]
Embedded image
Formula (5): (Dichloromethylene) bis-phosphonate
[0041]
Embedded image
Etc.
[0043]
Among them, the formula (2): (1-hydroxyethylidene) bisphosphonate
[0044]
Embedded image
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof is particularly preferred.
[0046]
The ultraviolet ray in the present invention refers to an electromagnetic wave having a wavelength of 200 nm to 400 nm. Preferably, the range of 200 nm to 260 nm in which the maximum absorption wavelength of the composite described later exists, and particularly preferably the range of 220 nm to 250 nm.
[0047]
The transition metal in the present invention means an atom or ion of a transition metal, and is not particularly limited as long as it forms a complex that absorbs ultraviolet rays together with a bisphosphonate compound. Preferably, the transition metal itself does not have strong absorption in the vicinity of the wavelength for measuring the ultraviolet absorption of the composite described later. Specific examples of such a transition metal include copper, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, and zinc, and preferably copper, iron, cobalt, and nickel. Of these, copper is preferable, and divalent copper is particularly preferable.
[0048]
The complex formed from a bisphosphonate compound and a transition metal in the present invention is a compound formed from a bisphosphonate compound such as a complex, complex ion, or salt and a transition metal, and absorbs ultraviolet rays. Although it will not specifically limit if it is a thing, From the point of a sensitivity, the thing whose molecular extinction coefficient with respect to the maximum absorption wavelength at the time of measuring an ultraviolet absorption spectrum is 100 or more is preferable. In addition, the complex may contain atoms or ions other than the bisphosphonate compound and the transition metal, solvent molecules, etc. as long as it has the property of absorbing ultraviolet rays.
[0049]
The complex is preferably formed in a solution. Examples of the solution include neutral and acidic aqueous solutions, and an acidic aqueous solution is preferable.
[0050]
When the complex is formed in solution, the transition metal is usually supplied in the form of a salt. Such transition metal salts include sulfates, hydrochlorides, nitrates, and the like, and preferably sulfates. Specific examples of the transition metal salt include copper (II) sulfate, preferably anhydrous copper sulfate (II). These salts may be solvates such as hydrates.
[0051]
The amount of the transition metal with respect to the bisphosphonate compound when forming the above complex may be large excess with respect to the bisphosphonate compound, but is preferably 5 times mol or more with respect to the bisphosphonate compound. Yes, more preferably 10 times the mole or more.
[0052]
Absorption of ultraviolet rays by the complex is usually measured in a solution. As the measurement solution, the solution in which the above complex is formed can be used as it is, but another solution for measurement may be prepared by separating the complex after forming the complex. In addition, UV absorption is based on conditions such as pH, temperature, solution composition (type and concentration of solvent and contained ions), preparation method (reagent mixing order, pH adjustment timing, etc.), time from solution preparation to measurement, etc. Therefore, it is preferable to adjust the measurement solution so as to satisfy predetermined conditions before measurement.
[0053]
Further, the measurement solution is preferably various buffer solutions in order to reduce pH fluctuation. The buffer can be selected according to the target pH. Examples of such a buffer include phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, borate buffer, and hydrochloric acid buffer. The concentration of the buffer is preferably in the range of 0.01 to 1 mol.
[0054]
The pH when measuring the absorption of ultraviolet rays by the complex is preferably acidic. As a preferable range, the range of pH 1.2-4.5 is mentioned, More preferably, about pH 4 is mentioned. The pH may be adjusted using acids and bases such as hydrochloric acid and sodium hydroxide aqueous solution.
[0055]
The wavelength for measuring the absorption of ultraviolet rays by the complex is selected from the range of 200 nm to 400 nm. From the viewpoint of sensitivity, the range of 200 nm to 260 nm (particularly 220 nm) in which the maximum absorption wavelength of the complex exists is preferable. ˜250 nm range). Specifically, it is preferable to measure the ultraviolet absorption spectrum of the composite under predetermined measurement conditions and set the wavelength to the maximum absorption at that time. In addition, when the maximum absorption peak is not a single peak, a wavelength indicating another single peak may be selected as the measurement wavelength. For example, when divalent copper is used as the transition metal, the maximum absorption of the composite exists in the range of 220 nm to 250 nm, so the measurement wavelength is preferably selected from the range of 220 nm to 250 nm. Specifically, in the case of a complex formed of (1-hydroxyethylidene) bis-phosphonate and divalent copper, the maximum absorption wavelength exists in the range of 225 nm to 235 nm, so the measurement wavelength is from 225 nm to It is preferable to select from a range of 235 nm. The molecular extinction coefficient in this case varies depending on ions, pH, and the like contained in the measurement solution. For example, if the pH is around 4, 1.3 × 10 Three ~ 2.7 × 10 Three If the pH is around 1.2, 1.9 × 10 2 ~ 2.1 × 10 2 It becomes the range.
[0056]
The temperature at the time of measuring the absorption of ultraviolet rays is not particularly limited, but is usually around room temperature. Further, the measuring device is not particularly limited, and a commercially available ultraviolet spectrometer can be used.
[0057]
In the method of the present invention, the measurement solution (sample) contains 10 bisphosphonate compounds. -Four -10 -3 When it is contained within the concentration range of mol / L, it is advantageous in terms of measurement accuracy. If it is assumed that the concentration of the compound in the measurement solution is not within the above range, the concentration of the compound is adjusted by diluting or concentrating the measurement solution in advance by a known method so that the concentration is within the above range. May be.
[0058]
Next, how to create a general calibration curve, measurement method and conditions will be shown.
[0059]
First, a standard bisphosphonate compound is dried and accurately weighed. This bisphosphonate compound is dissolved in a test solution in a measuring flask or the like to obtain a standard stock solution. A certain amount of the standard stock solution is collected, and a transition metal or transition metal solution is added to prepare a bisphosphonate compound / transition metal complex solution having several concentrations. The complex solution is preferably a buffer solution, and pH adjustment may be performed when the pH of the sample is not preferable for measurement.
[0060]
Next, an ultraviolet absorption spectrum is measured for the complex solution using an ultraviolet spectrophotometer, and a measurement wavelength is determined from the result. Preferably, the maximum absorption wavelength is the measurement wavelength. Next, at the determined measurement wavelength, the absorption (absorbance) of ultraviolet rays of the complex solution at each concentration is measured using an ultraviolet spectrophotometer. When measuring the absorption of ultraviolet rays, a transition metal salt solution having the same concentration is used as a reference. The measurement temperature is, for example, around room temperature.
[0061]
A calibration curve is prepared from the obtained absorbance and the concentration of the bisphosphonate compound, and then the molecular extinction coefficient is calculated. The molecular extinction coefficient (ε) can be obtained by the following equation (i).
[0062]
[Expression 1]
(Wherein, A is absorbance, c is molar concentration, l is optical path thickness (cm), M is molecular weight of the compound, and c ′ represents grams of the compound per liter.)
[0064]
Next, as in the case of preparing a calibration curve for the sample, a measurement solution is prepared and the absorbance at a predetermined wavelength is measured. Note that the measured value obtained depends on the conditions such as pH, temperature, solution composition (type and concentration of the solvent and contained ions), preparation method (reagent mixing order, etc.), time from solution preparation to measurement, etc. Since it fluctuates, it is preferable that the calibration curve be created in the same manner. The concentration of the bisphosphonate compound in the sample can be calculated from the absorbance obtained for the sample and the molecular extinction coefficient.
[0065]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example are given and this invention is demonstrated in detail, the scope of the present invention is not limited to these.
[0066]
In Examples and Comparative Examples, (1-hydroxyethylidene) bis-phosphonate disodium salt is referred to as “Compound A” and (4-amino-1-hydroxybutylidene) bis-phosphonate is referred to as “Compound. B ". Moreover, each test liquid used in an Example and a comparative example is shown below.
[0067]
Test solution (1) (pH 1.2): According to the preparation method of the first solution of the Japanese Pharmacopoeia (13th revision) disintegration test, 7.0 mL of 36% hydrochloric acid and water were added to 2.0 g of sodium chloride to make 1000 mL. thing.
[0068]
Test solution (2) (pH 4.5): 1.70 g of potassium dihydrogen phosphate and 1.775 g of anhydrous sodium hydrogen phosphate according to the preparation method of phosphate buffer solution of Japanese Pharmacopoeia (13th revision) reagent / solution Water was added to a solution made up to 500 mL by dissolving the solution in water, and the solution made up to 1000 mL was adjusted to pH 4.5 with 3 mol / L hydrochloric acid.
[0069]
Test solution (3) (pH 4.0): To a solution made by adding water to 3.0 g of acetic acid to make 1000 mL, a solution in which 1.70 g of sodium acetate trihydrate was dissolved in 250 mL of water was added to adjust to pH 4.0. What you did.
[0070]
Test solution {circle around (4)} (pH 6.8): 1.70 g of potassium dihydrogen phosphate and 1.775 g of anhydrous sodium hydrogen phosphate according to the preparation method of phosphate buffer of Japanese Pharmacopoeia (13th revision) reagent / solution Water was added to a solution made up to 500 mL by dissolving in water to make 1000 mL.
[0071]
Test solution (5) (pH 4.0): A solution adjusted to pH 4.0 by adding 0.1 mol / L sodium hydroxide test solution to test solution (1).
[0072]
Test solution (6) (pH 4.0): 0.1 mol / L hydrochloric acid test solution was added to test solution (4) to adjust to pH 4.0.
[0073]
Test solution (7): A solution prepared by dissolving 0.07 g of anhydrous copper (II) sulfate in water to make 100 mL.
[0074]
Example 1 Molecular Absorption Coefficient of Complex Formed from Compound A and Copper (II)
(1) When the solution for measurement is pH 1.2
After accurately adding 2 mL of the test solution (7) to 4 mL of the solution adjusted with the test solution (1) so that the concentration of Compound A is 0.11 mg / mL, the test solution is adjusted to 10 mL with the test solution (1). . The ultraviolet absorption spectrum of this solution was measured to determine the maximum absorption wavelength, and the measurement wavelength was set to 228 nm from the result. The results of the ultraviolet absorption spectrum are shown in FIG. As a reference, a solution prepared by the above method without adding Compound A was used. Next, the absorbance at a measurement wavelength of 228 nm was measured, and the molecular extinction coefficient was calculated from the obtained absorbance by the above formula (i). The results are shown in Table 1.
[0075]
(2) When the measurement solution is pH 4.5
After accurately adding 2 mL of test solution (7) to 4 mL of the solution prepared in test solution (2) so that the concentration of Compound A is 0.11 mg / mL, add 10 mL of test solution (2). It was. The ultraviolet absorption spectrum of this solution was measured to determine the maximum absorption wavelength, and the measurement wavelength was determined to 232 nm from the result. The results of the ultraviolet absorption spectrum are shown in FIG. As a reference, a solution prepared by the above method without adding Compound A was used. Next, the absorbance at a measurement wavelength of 232 nm was measured, and the molecular extinction coefficient was calculated from the obtained absorbance by the above formula (i). The results are shown in Table 1.
[0076]
[Table 1]
Example 2 Dissolution test of compound A in tablets
1. Dissolution test
In accordance with the second method (paddle method) described in the Dissolution Test Method section of the Japanese Pharmacopoeia (13th revision) General Test Method, take one tablet containing Compound A (
[0078]
2. Sample solution preparation
2 mL of the filtrate was accurately weighed and each sample solution was prepared as follows.
(1) When the dissolution test solution is water
After 2 mL of the test solution {7} was accurately added to 2 mL of the filtrate, water was added to make exactly 10 mL to obtain a sample solution.
(2) When the dissolution test solution is pH 1.2 (test solution (1))
0.05 mol / L sodium hydroxide test solution, 0.01 mol / L sodium hydroxide test solution or test solution (1) was added to 2 mL of the filtrate to adjust the pH to 3.9 to 4.1. To this solution, 2 mL of the test solution (7) was accurately added, and the test solution (5) was added to make exactly 10 mL to obtain a sample solution.
(3) When the dissolution test solution is pH 4.0 (test solution (3))
After accurately adding 2 mL of the test solution (7) to 2 mL of the filtrate, the test solution (3) was added to make exactly 10 mL to obtain a sample solution.
(4) When the dissolution test solution is pH 6.8 (test solution (4))
0.05 mol / L hydrochloric acid test solution, 0.01 mol / L hydrochloric acid test solution or test solution (4) was added to 2 mL of the filtrate to adjust the pH to 3.9 to 4.1. To this solution, 2 mL of the test solution (7) was accurately added, and further, the test solution (6) was added to make exactly 10 mL to obtain a sample solution.
[0079]
3. Preparation of standard solution
The following compound A standard product was dried at 210 ° C. for 2 hours, about 0.022 g thereof was accurately weighed and dissolved in each test solution to make exactly 200 mL, and used as a standard stock solution. Using this standard stock solution, standard solutions (a), (b) and (c) were prepared as follows. In the following, the indicated amount is an amount corresponding to the amount of Compound A (200 mg) in one tablet.
[0080]
[Compound A standard product]
C 2 H 6 Na 2 O 7 P 2 : 249.99
Conforms to the following standards.
Properties: This product is a white powder.
Confirmation test: When this product is dried and measured by the potassium bromide tablet method of infrared absorption spectrum measurement, the wave number is 1167 cm. -1 1058cm -1 , 919cm -1 And 814cm -1 Absorption is observed in the vicinity.
Purity test: Phosphite About 3.5 g of this product is weighed accurately, phosphate buffer solution of pH 8.0 (7.80 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate is dissolved in 450 mL of water, and sodium hydroxide test solution is used. In addition, after adjusting to pH 8.0, water was added to make 500 mL.) After dissolving in 100 mL, accurately add 20 mL of 0.05 mol / L iodine solution and immediately plug tightly. This solution is allowed to stand in the dark for 30 minutes, and then 1 mL of acetic acid is added, and an excess amount of iodine is titrated with a 0.1 mol / L sodium thiosulfate solution (indicator: starch sample solution 1 mL). A blank test was performed in the same manner, and phosphite (NaH 2 PO Three ) Is 1.0% or less. 0.05 mol / L iodine solution 1 mL = 5.199 mg NaH 2 PO Three .
Loss on drying: 5.0% or less (0.5 g, 210 ° C., 2 hours).
Content: 99.0% or more.
Quantitative method: Dry this product, weigh accurately about 0.5 g, dissolve in water, and make exactly 50 mL. 15 mL of this liquid is accurately weighed and placed in a chromatographic column having a diameter of 10 mm prepared in advance using 5 mL of a strongly acidic ion exchange resin for column chromatography (H type), and allowed to flow out at a flow rate of about 1.5 mL per minute. Next, the chromatographic column is washed twice with 25 mL each of water. The washing solution is titrated with a 0.1 mol / L sodium hydroxide solution in accordance with the previous effluent (potentiometric titration method). 0.1 mol / L sodium hydroxide solution 1 mL = 12.500 mgC 2 H 6 Na 2 O 7 P 2 .
[0081]
(1) When the dissolution test solution is water
Standard solution (a) (compound A concentration; 50% of the indicated amount): 2 mL of the standard stock solution was accurately weighed, 2 mL of the test solution {7} was accurately added, and water was added to make exactly 10 mL.
Standard solution (b) (compound A concentration; 100% of the indicated amount): 4 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
Standard solution (c) (compound A concentration; 112.5% of the indicated amount): 4.5 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
(2) When the dissolution test solution is pH 1.2 (test solution (1))
Standard solution (a) (compound A concentration; 50% of the indicated amount): Accurately measure 2 mL of standard stock solution, 0.05 mol / L sodium hydroxide test solution, 0.01 mol / L sodium hydroxide test solution or test solution ▲ 1 ▼ was added to adjust the pH to 3.9 to 4.1. After accurately adding 2 mL of the test solution 7 to this solution, the test solution 5 was added to make exactly 10 mL.
Standard solution (b) (compound A concentration; 100% of the indicated amount): 4 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
Standard solution (c) (compound A concentration; 112.5% of the indicated amount): 4.5 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
(3) When the dissolution test solution is pH 4.0 (test solution (3))
Standard solution (a) (compound A concentration; 50% of the indicated amount): Weigh accurately 2 mL of the standard stock solution, add 2 mL of test solution (7) correctly, and then add test solution (3). 10 mL.
Standard solution (b) (compound A concentration; 100% of the indicated amount): 4 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
Standard solution (c) (compound A concentration; 112.5% of the indicated amount): 4.5 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
(4) When the dissolution test solution is pH 6.8 (test solution (4))
Standard solution (a) (compound A concentration; 50% of the indicated amount): Accurately measure 2 mL of standard stock solution and add 0.05 mol / L hydrochloric acid test solution, 0.01 mol / L hydrochloric acid test solution or test solution (4) The pH was adjusted to 3.9 to 4.1. After accurately adding 2 mL of the test solution (7) to this solution, the test solution (6) was added to make exactly 10 mL.
Standard solution (b) (compound A concentration; 100% of the indicated amount): 4 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
Standard solution (c) (compound A concentration; 112.5% of the indicated amount): 4.5 mL of standard stock solution was accurately weighed and prepared in the same manner as standard solution (a).
[0082]
4). Control solution preparation
(1) When the dissolution test solution is water
Test solution (7) 2 mL was accurately weighed and water was added to make exactly 10 mL.
(2) When the dissolution test solution is pH 1.2 (test solution (1))
Test solution (7) 2 mL was accurately weighed and test solution (5) was added to make exactly 10 mL.
(3) When the dissolution test solution is pH 4.0 (test solution (3))
Test solution (7) 2 mL was accurately weighed and test solution (3) was added to make exactly 10 mL.
(4) When the dissolution test solution is pH 6.8 (test solution (4))
Test solution (7) 2 mL was accurately weighed, and test solution (6) was added to make exactly 10 mL.
[0083]
5). Measurement
The ultraviolet absorption spectrum was measured for each standard solution (a) in the above (1) to (4), the maximum absorption wavelength was determined, and each measurement wavelength was determined as follows. In addition, each control solution in (1) to (4) was used as a reference. Moreover, the result of each ultraviolet absorption spectrum is shown in FIGS.
(1) When the dissolution test solution is water: 233 nm
(2) When the dissolution test solution is pH 1.2 (test solution (1)): 231 nm
(3) When the dissolution test solution is pH 4.0 (test solution (3)): 228 nm
(4) When the dissolution test solution is pH 6.8 (test solution (4)): 232 nm
[0084]
Absorbance A at the above wavelength for each sample solution and each standard solution (a), (b) and (c) T (Sample solution) and absorbance A S (a) (Standard solution (a)), A S (b) (Standard solution (b)) and A S (c) (Standard solution (c)) was measured. From the result, the vertical axis indicates the absorbance A. S (a) , A S (b) And A S (c) The horizontal axis represents the concentration of Compound A in the dissolution test solution corresponding to each standard solution, a calibration curve was prepared, and the molecular extinction coefficient was determined. The results are shown in Table 2.
[0085]
[Table 2]
From the obtained molecular extinction coefficient, the concentration of Compound A in the dissolution test solution at each sampling time was determined.
[0087]
Example 3 Dissolution test of compound A in tablets
In the same manner as in Example 2, one tablet containing Compound A (
[0088]
[Expression 2]
(Wherein, T is the indicated amount (mg) of compound A in 1 tablet, n is the number of times of collection, Ct n Is the absorbance A of the sample solution T And the concentration (mg / ml) of Compound A in the dissolution test solution at each sampling time determined from the calibration curve (where Ct 0 = 0. ). )
[0090]
[Table 3]
Example 4 Dissolution test of compound A in tablets
1. Test method
According to the second method (paddle method) described in the dissolution test method section of the Japanese Pharmacopoeia (13th revision) general test method, one tablet (lot No. 1-3) containing compound A (containing compound A) An elution test was conducted using 900 mL of water and stirring at 50 revolutions per minute (six lots were used for each lot). 60 minutes after the start of the dissolution test, 20 ml of the dissolution test solution was taken and filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm. Except for 10 ml of the first filtrate, 2 ml of the next filtrate was accurately weighed, and 2 ml of the test solution {7} was accurately added, and then water was added to make exactly 10 ml to obtain a sample solution.
[0092]
Separately, the above-mentioned compound A standard product was dried at 210 ° C. for 2 hours, and about 0.022 g thereof was accurately weighed and dissolved in water to make exactly 200 ml to obtain a standard stock solution. Accurately measure 2 ml, 4 ml and 4.5 ml of this solution, add exactly 2 ml of test solution {7} to each, then add water to make exactly 10 ml, 50% standard solution, 100% standard solution and 112% respectively. A 5% standard solution was used.
[0093]
For each sample solution and each standard solution, accurately measure 2 ml of the test solution 7 and add water to make exactly 10 ml. The test is performed by the absorbance measurement method, and the absorbance A at a wavelength of 233 nm is measured. T (Sample solution), A S1 (50% standard solution), A S2 (100% standard solution) and A S3 (112.5% standard solution) was measured. Absorbance A on the vertical axis S1 , A S2 And A S3 A calibration curve was prepared by taking the concentration of Compound A in the dissolution test solution corresponding to each standard solution on the horizontal axis. Using this calibration curve, the concentration of Compound A in the dissolution test solution was determined. From the results, the dissolution rate (%) of each vessel and the average dissolution rate (%) of 6 vessels were calculated from the following formula (iii). The results are shown in Table 4.
[0094]
[Equation 3]
(Wherein, T is the indicated amount (mg) of compound A in one tablet, and C is the absorbance A of the sample solution. T And the concentration (mg / ml) of Compound A in the dissolution test solution obtained from the calibration curve. )
[0096]
[Table 4]
Example 5 Measurement of UV absorption spectrum of complex formed from compound B and copper (II)
1. Test method
About 0.022 g of Compound B was accurately weighed and dissolved in water to make exactly 200 ml, which was used as a standard stock solution. 4 ml of this solution was accurately weighed and 4 ml of the test solution (7) was accurately added, and then water was added to make exactly 10 ml to obtain a standard solution. Test solution {circle around (7)} 4 ml was accurately weighed and water was added to make exactly 10 ml, and the ultraviolet absorption spectrum of the standard solution at wavelengths from 200 nm to 400 nm was measured. The result is shown in FIG. Table 5 shows the maximum wavelength and the absorbance at the maximum wavelength.
[0098]
[Table 5]
【The invention's effect】
According to the present invention, a bisphosphonate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be detected or quantified easily and in a short time with a measurement accuracy comparable to that of a conventional method. Therefore, the method of the present invention is a particularly excellent method when analyzing a very large number of samples such as pharmaceutical quality inspection.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an ultraviolet absorption spectrum diagram of a complex formed from (1-hydroxyethylidene) bis-phosphonate disodium salt and copper (II) in a pH 1.2 measuring solution.
FIG. 2 is an ultraviolet absorption spectrum diagram of a complex formed from (1-hydroxyethylidene) bis-phosphonate disodium salt and copper (II) in a measurement solution having a pH of 4.5.
FIG. 3 shows a complex formed from (1-hydroxyethylidene) bisphosphonate disodium salt and copper (II) in a solution to which copper (II) was added using water as a dissolution test solution. It is an ultraviolet absorption spectrum figure.
FIG. 4 Using a dissolution test solution having a pH of 1.2, adjusting to pH 4.0, and then adding (1-hydroxyethylidene) bis-phosphonate disodium salt and copper ( It is an ultraviolet absorption spectrum figure of the composite_body | complex formed from II).
FIG. 5 shows a composite formed from (1-hydroxyethylidene) bisphosphonate disodium salt and copper (II) in a solution to which copper (II) was added using a dissolution test solution of pH 4.0. It is an ultraviolet absorption spectrum figure of a body.
FIG. 6 shows a dissolution test solution having a pH of 6.8, adjusted to pH 4.0, and (1-hydroxyethylidene) bisphosphonate disodium salt and copper (II) in a solution to which copper (II) is added. It is an ultraviolet absorption spectrum figure of the composite_body | complex formed from II).
FIG. 7 is an ultraviolet absorption spectrum diagram of a complex formed from (4-amino-1-hydroxybutylidene) bis-phosphonate and copper (II) in water.
Claims (10)
（１）前記錠剤を水に添加し、パドル法により溶出試験を行う工程、(1) A step of adding the tablet to water and performing a dissolution test by a paddle method,
（２）溶出試験液をろ過し、ろ液に無水硫酸銅（ＩＩ）水溶液を添加して、試料溶液を調製する工程、および(2) filtering the dissolution test solution, adding anhydrous copper (II) sulfate aqueous solution to the filtrate to prepare a sample solution, and
（３）前記試料液の２２５ｎｍ〜２３５ｎｍにおける紫外線の吸光度を測定する工程、(3) a step of measuring the absorbance of ultraviolet rays at 225 nm to 235 nm of the sample liquid,
を含むことを特徴とする、溶出試験法。A dissolution test method comprising:
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