JP4565204B2 - Capillary electrophoresis method and capillary and electrophoresis apparatus therefor - Google Patents
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Description
本発明は、キャピラリー電気泳動方法並びにそのためのキャピラリー及び電気泳動装置に関する。 The present invention relates to a capillary electrophoresis method, and a capillary and an electrophoresis apparatus therefor.
キャピラリー電気泳動法は、通常、直径又は幅が100μｍ以下の狭い管又は流路内で電気泳動を行なう方法であり、分離能が高く、微量の試料を分析でき、ジュール熱の発生が少ない等の利点を有し、特にイオン性の化合物の分離に広く用いられている。 Capillary electrophoresis is generally a method in which electrophoresis is performed in a narrow tube or channel having a diameter or width of 100 μm or less, which has a high resolution, can analyze a small amount of sample, and generates less Joule heat. It has advantages and is widely used especially for the separation of ionic compounds.
本出願人は、先に、内壁をプラズマ重合法により形成した高分子膜で被覆したキャピラリー電気泳動用のキャピラリーを発明し、特許出願した（特許文献１）。特許文献１には、中性付近のpHにおいて、プラス又はマイナスの電荷を帯びる官能基を有する高分子膜でキャピラリー内壁を被覆し、分離しようとする物質と、これらの官能基を静電的に相互作用させながら電気泳動を行なうことも記載されている。しかしながら、それによる利点は具体的に記載されておらず、それを用いて等電点と分子量が同一である複数の化合物を分離する方法も記載も示唆もされていない。 The applicant of the present invention invented a capillary for capillary electrophoresis in which an inner wall was covered with a polymer film formed by a plasma polymerization method, and applied for a patent (Patent Document 1). In Patent Document 1, the inner wall of the capillary is coated with a polymer film having a functional group having a positive or negative charge at a pH near neutral, and the substance to be separated is electrostatically bonded to these functional groups. It also describes performing electrophoresis while interacting. However, the advantages thereof are not specifically described, and neither a method nor a description or suggestion of using them to separate a plurality of compounds having the same isoelectric point and molecular weight is provided.
本発明の目的は、等電点と分子量が同一又は近い２以上の物質を分離することが可能な電気泳動法並びにそのためのキャピラリー及び電気泳動装置を提供することである。 An object of the present invention is to provide an electrophoresis method capable of separating two or more substances having the same or close molecular weight as the isoelectric point and a capillary and an electrophoresis apparatus therefor.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、内壁に電荷を付与したキャピラリーを用い、分離すべき対象物質の総電荷を顕在化させるpH、すなわち、対象物質が有するイオン化可能な官能基の全てを陽イオン又は陰イオンにすることができるpH、又は２以上の対象物質の総電荷に、電気泳動により分別可能な差が出るpHを有する緩衝液を媒体としてキャピラリー電気泳動を行なうことにより、キャピラリー内壁と対象物質とが静電的な相互作用を行い、総電荷の多い物質の方が総電荷の少ない物質よりも移動度が小さくなるため、等電点及び分子量が同じでも総電荷が異なれば電気泳動により分離が可能であることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have used a capillary with a charge applied to the inner wall to clarify the pH at which the total charge of the target substance to be separated, that is, all of the ionizable functional groups of the target substance, is positive. By conducting capillary electrophoresis using a buffer solution having a pH that can be changed to an ion or an anion, or a pH at which the total charge of two or more target substances can be distinguished by electrophoresis, as a medium, Electrophoretic interaction with the target substance, and a substance with a high total charge has a lower mobility than a substance with a low total charge. Therefore, even if the total charge is different even at the same isoelectric point and molecular weight, electrophoresis As a result, the present invention was completed.
すなわち、本発明は、互いに分離しようとする２以上の対象物質を含む被検試料を、内壁に電荷が付加されたキャピラリー内で電気泳動するキャピラリー電気泳動方法であって、前記互いに分離しようとする２以上の対象物質が、それぞれイオン化可能な１以上の官能基を有し、該官能基の全てを陽イオン化又は陰イオン化するpH又は２以上の対象物質の総電荷に、電気泳動により分別可能な差が出るpHにおいて電気泳動を行なう、キャピラリー電気泳動方法を提供する。
That is, the present invention is a capillary electrophoresis method in which a test sample containing two or more target substances to be separated from each other is electrophoresed in a capillary having an inner wall charged with electric charge, and is intended to be separated from each other. Two or more target substances each have one or more functional groups that can be ionized, and can be separated by electrophoresis into a pH at which all of the functional groups are cationized or anionized or a total charge of the two or more target substances. Provided is a capillary electrophoresis method in which electrophoresis is performed at a pH at which a difference occurs.
本発明により、これまでの二次元電気泳動（等電点電気泳動とSDS-PAGE)では分離ができなかった、等電点と分子量が同一又は近い２以上の物質を分離することが可能な電気泳動法並びにそのためのキャピラリー及び電気泳動装置が初めて提供された。本発明の方法によれば、分離すべき対象物質の総電荷を顕在化させる又は少なくとも総電荷に差が出るpHの緩衝液中でキャピラリー電気泳動を行なうので、等電点及び分子量が同じでも総電荷が異なれば電気泳動により分離が可能となる。従って、本発明により、従来の二次元電気泳動では分離することができなかった物質同士を分離することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to separate two or more substances having the same or close molecular weight as the isoelectric point, which could not be separated by conventional two-dimensional electrophoresis (isoelectric focusing and SDS-PAGE). For the first time, electrophoresis methods and capillaries and electrophoresis devices therefor have been provided. According to the method of the present invention, capillary electrophoresis is carried out in a buffer solution having a pH at which the total charge of the target substance to be separated is manifested or at least the total charge is different, so even if the isoelectric point and molecular weight are the same, If the charges are different, separation is possible by electrophoresis. Therefore, the present invention makes it possible to separate substances that could not be separated by conventional two-dimensional electrophoresis.
上記の通り、本発明のキャピラリー電気泳動方法では、内壁に電荷を付加したキャピラリーを用いる。キャピラリー内壁への電荷の付加は、好ましくはキャピラリー内壁をプラズマ処理することにより行うことができる。用いるプラズマとしては、負の電荷を付加する場合には、特に限定されないが、好ましくはSO2、CO2、CO等のプラズマを用いることができ、正の電荷を付加する場合には、特に限定されないが、好ましくはN2、NH4等を用いることができる。なお、特許文献１に記載されているように内壁に、プラズマ重合等により高分子膜を被着した後、該高分子被膜にプラズマ処理を行なって電荷を付加してもよい。なお、内壁にプラズマ処理を行なって電荷を付加したキャピラリー電気泳動用のキャピラリーはこれまでに知られていない。従って、本発明は、内壁にプラズマ処理を行なって電荷を付加したキャピラリー電気泳動用のキャピラリーをも新規に提供するものである。 As described above, in the capillary electrophoresis method of the present invention, a capillary with an electric charge added to the inner wall is used. The addition of electric charge to the inner wall of the capillary can be preferably performed by plasma treatment of the inner wall of the capillary. The plasma to be used is not particularly limited when a negative charge is added, but a plasma such as SO 2 , CO 2 , and CO can be preferably used, and when a positive charge is added, the plasma is particularly limited. However, preferably N 2 , NH 4 or the like can be used. In addition, as described in Patent Document 1, after a polymer film is deposited on the inner wall by plasma polymerization or the like, a charge may be applied by performing plasma treatment on the polymer film. Heretofore, a capillary for capillary electrophoresis in which an inner wall is subjected to plasma treatment to add electric charge has not been known. Therefore, the present invention also newly provides a capillary for capillary electrophoresis in which an inner wall is subjected to plasma treatment to add a charge.
付加する電荷の量は、分離すべき対象物質との静電的な相互作用が十分に行なわれるように、多い方が好ましく、pH5又はpH9におけるゼータ電位の絶対値が70mV以上が好ましく、さらに好ましくは80mV以上である。ゼータ電位の絶対値の上限は特にないが、プラズマ処理により付加できる電荷の量は、通常、pH5又はpH9におけるゼータ電位の絶対値で約１００mV以下である。なお、pH5又はpH9におけるゼータ電位の絶対値が70mV以上である内壁を有するキャピラリー電気泳動用のキャピラリーはこれまでに知られていない。従って、本発明は、pH5又はpH9におけるゼータ電位の絶対値が70mV以上である内壁を有するキャピラリー電気泳動用のキャピラリーをも新規に提供するものである。 The amount of electric charge to be added is preferably large so that electrostatic interaction with the target substance to be separated is sufficiently performed, and the absolute value of the zeta potential at pH 5 or pH 9 is preferably 70 mV or more, more preferably. Is 80 mV or more. Although there is no particular upper limit on the absolute value of the zeta potential, the amount of charge that can be added by plasma treatment is usually about 100 mV or less in terms of the absolute value of the zeta potential at pH 5 or pH 9. A capillary for capillary electrophoresis having an inner wall whose absolute value of zeta potential at pH 5 or pH 9 is 70 mV or more has not been known so far. Therefore, the present invention also newly provides a capillary for capillary electrophoresis having an inner wall whose absolute value of zeta potential at pH 5 or pH 9 is 70 mV or more.
上記のように、本発明の電気泳動方法において用いる好ましいキャピラリーは、内壁がプラズマ処理され、pH5又はpH9におけるゼータ電位の絶対値が70mV以上のものであり、このようなキャピラリーは、好ましくはSO2プラズマ、CO2プラズマ、COプラズマ等を用い、放電電力５０W〜８００W、さらに好ましくは１００W〜２００W、放電時間３０秒〜５分、さらに好ましくは１分〜２分、流速５ml/分〜４０ml/分、さらに好ましくは１５ml/分〜２５ml/分、圧力５Pa〜２５Pa、さらに好ましくは１０Pa〜２０Paの条件を採用することにより作製することができる。 As described above, the preferred capillary used in the electrophoresis method of the present invention has a plasma-treated inner wall and has an absolute value of zeta potential of 70 mV or more at pH 5 or pH 9, and such capillary is preferably SO 2. Using plasma, CO 2 plasma, CO plasma, etc., discharge power 50 W to 800 W, more preferably 100 W to 200 W, discharge time 30 seconds to 5 minutes, more preferably 1 minute to 2 minutes, flow rate 5 ml / min to 40 ml / min More preferably, it can be produced by employing conditions of 15 ml / min to 25 ml / min, pressure 5 Pa to 25 Pa, more preferably 10 Pa to 20 Pa.
本発明のキャピラリー電気泳動方法に用いるキャピラリーは、電荷を付加した点を除けば従来の周知のキャピラリーと同様でよい。すなわち、材質としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリプロプレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリアミド、ABS樹脂、アクリル樹脂、フェノール樹脂のようなプラスチックやガラスを挙げることができる。また、形状としては、基板上に設けた流路（溝）状であってもよいし、管状であってもよい。また、流路の幅若しくは深さ又は管の内径は、通常10μm〜100μｍ程度である。なお、溝状のものの場合、幅及び深さの少なくともいずれか一方が約１００μｍ以下のものは本発明で言う「キャピラリー」に包含される。また、キャピラリーの長さは、特に限定されないが、通常、5cm〜100cm程度である。 The capillary used in the capillary electrophoresis method of the present invention may be the same as a conventional well-known capillary except that a charge is added. That is, examples of the material include plastics and glasses such as polymethyl methacrylate (PMMA), polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polyacetal, polycarbonate, polyamide, ABS resin, acrylic resin, and phenol resin. Further, the shape may be a flow path (groove) provided on the substrate, or may be tubular. The width or depth of the flow path or the inner diameter of the tube is usually about 10 μm to 100 μm. In the case of a groove-like one, one having a width and / or depth of about 100 μm or less is included in the “capillary” referred to in the present invention. The length of the capillary is not particularly limited, but is usually about 5 cm to 100 cm.
本発明の電気泳動方法では、互いに分離しようとする２以上の対象物質が、それぞれイオン化可能な１以上の官能基を有し、該官能基の全てを陽イオン化又は陰イオン化するpH又は２以上の対象物質の総電荷に、電気泳動により分別可能な差が出るpHにおいて電気泳動を行なう。このようなpHは、多くの場合、酸性又は塩基性、すなわち、pHが6.0以下又は8.0以上であるが、等電点が酸性又は塩基性域にあるタンパク質等の場合には、中性のpHが採用される場合もある。なお、官能基の全てを陽イオン化又は陰イオン化した結果、電荷数が大きくなりすぎて対象物質がキャピラリー内壁に静電的に結合してしまう場合には、総電荷数がより小さくなるpHを有する緩衝液を用いることにより該対象物質を分離することができる。一方、分離対象である２種以上の物質の構造が類似している等のために総電荷数が近く、pH6.0やpH8.0では明瞭に分離できない場合には、pHをさらに酸性又は塩基性にして、例えばpH5.0以下やpH9.0以上、さらにはpH4.0以下やpH10.0以上の緩衝液を用いて電気泳動することにより分離可能となる場合が多い。 In the electrophoresis method of the present invention, two or more target substances to be separated from each other have one or more functional groups that can be ionized, and each of the functional groups is cationized or anionized at a pH or two or more. Electrophoresis is performed at a pH at which there is a difference that can be separated by electrophoresis in the total charge of the target substance. Such a pH is often acidic or basic, i.e., a pH of 6.0 or less or 8.0 or more, but in the case of a protein having an isoelectric point in the acidic or basic region, a neutral pH is used. May be adopted. In addition, as a result of cationization or anionization of all of the functional groups, if the target substance is electrostatically bound to the inner wall of the capillary due to excessive charge, the total charge number has a lower pH. The target substance can be separated by using a buffer solution. On the other hand, if the total number of charges is close because the structures of two or more substances to be separated are similar and cannot be separated clearly at pH 6.0 or pH 8.0, the pH is further increased to acidic or basic. In many cases, for example, separation is possible by electrophoresis using a buffer solution having a pH of 5.0 or lower, pH 9.0 or higher, and further pH 4.0 or lower or pH 10.0 or higher.
分離対象となる物質の構造が未知で、総電荷数が不明な場合でも、電気泳動による分離する対象は、通常、タンパク質、ペプチド、核酸等の生体由来物質であり、イオン化する官能基はカルボキシル基やアミノ基（第一級ないし第四級アミノ基）等がほとんどであるから、多くの場合、pH6.0以下又はpH8.0以上、さらにはpH5.0以下やpH9.0以上、さらにはpH4.0以下やpH10.0以上の緩衝液を用いれば分離できる（もっとも内壁に結合されてしまう場合には上記の通りより中性に近いpHを採用する）。なお、内壁に電荷を付与したキャピラリーを用い、酸性又は塩基性の緩衝液を媒体として用いるキャピラリー電気泳動方法は本発明が初めて提供したものである。未知の試料については、例えば、公知の電気泳動方法で分離して分離できない場合、pH6.0又はpH8.0程度の緩衝液を用いて本発明の方法に従って電気泳動を行い、それでも明瞭に分離できない場合には、さらにpHを酸性又は塩基性にして、例えばpH5.0以下やpH9.0以上、さらにはpH4.0以下やpH10.0以上にして分離を行なうということも可能である。 Even if the structure of the substance to be separated is unknown and the total number of charges is unknown, the substance to be separated by electrophoresis is usually a biological substance such as protein, peptide, nucleic acid, etc., and the functional group to be ionized is a carboxyl group And amino groups (primary to quaternary amino groups) are mostly included, and in many cases, pH 6.0 or lower or pH 8.0 or higher, pH 5.0 or lower, pH 9.0 or higher, and further pH 4 Separation can be achieved by using a buffer solution of 0.0 or less or pH 10.0 or more (when it is bound to the inner wall, a pH closer to neutrality is adopted as described above). The present invention is the first to provide a capillary electrophoresis method using a capillary having an inner wall charged with an acidic or basic buffer as a medium. For an unknown sample, for example, when it cannot be separated and separated by a known electrophoresis method, electrophoresis is performed according to the method of the present invention using a buffer solution of about pH 6.0 or pH 8.0 and still cannot be separated clearly. In some cases, the separation can be further carried out by making the pH acidic or basic, for example, pH 5.0 or lower or pH 9.0 or higher, further pH 4.0 or lower or pH 10.0 or higher.
本発明の電気泳動方法に用いることができる酸性緩衝液の例としては、リン酸水素二ナトリウムークエン酸緩衝液、酒石酸―酒石酸ナトリウム緩衝液、酢酸―酢酸ナトリウム緩衝液、乳酸―乳酸ナトリウム緩衝液、塩化カリウムー塩酸緩衝液、クエン酸二水素カリウムークエン酸緩衝液、クエン酸二水素カリウムー塩酸緩衝液、クエン酸二水素カリウムー水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸二水素カリウムー四ホウ酸ナトリウム緩衝液、コハク酸―四ホウ酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウムー塩酸緩衝液、蟻酸―水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、本発明の電気泳動方法に用いることができる塩基性緩衝液の例としては、塩化アンモニウムーアンモニア水緩衝液、炭酸ナトリウムー炭酸水素ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウムー水酸化ナトリウム緩衝液、四ホウ酸ナトリウムー塩酸緩衝液、四ホウ酸ナトリウムー水酸化ナトリウム緩衝液、四ホウ酸ナトリウムー炭酸ナトリウム緩衝液、塩酸―炭酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウムー水酸化ナトリウム緩衝液、ジエチルバルビツル酸ナトリウムー塩酸緩衝液、ジメチルグリシンナトリウムー塩酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンー塩酸緩衝液、２-アミノメチル-１，３-プロパンジオールー塩酸緩衝液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 Examples of acidic buffers that can be used in the electrophoresis method of the present invention include disodium hydrogen phosphate-citrate buffer, tartaric acid-sodium tartrate buffer, acetic acid-sodium acetate buffer, lactic acid-sodium lactate buffer. , Potassium chloride-hydrochloric acid buffer, potassium dihydrogen citrate-citrate buffer, potassium dihydrogen citrate-hydrochloric acid buffer, potassium dihydrogen citrate-sodium hydroxide buffer, potassium dihydrogen citrate-sodium tetraborate buffer, Examples thereof include, but are not limited to, succinic acid-sodium tetraborate buffer, sodium acetate-hydrochloric acid buffer, formic acid-sodium hydroxide buffer. Examples of basic buffers that can be used in the electrophoresis method of the present invention include ammonium chloride-ammonia water buffer, sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer, disodium hydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer, four Sodium borate-hydrochloric acid buffer, sodium tetraborate-sodium hydroxide buffer, sodium tetraborate-sodium carbonate buffer, hydrochloric acid-sodium carbonate buffer, disodium hydrogenphosphate-sodium hydroxide buffer, sodium diethylbarbiturate-hydrochloric acid Examples include buffer, dimethylglycine sodium-hydrochloric acid buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer, 2-aminomethyl-1,3-propanediol-hydrochloric acid buffer, and the like. Absent.
内壁に電荷を付加したキャピラリーを用いる点、及び電気泳動を酸性又は塩基性緩衝液中で行なう点を除き、電気泳動自体は周知の方法により行うことができる。電気泳動の電圧は、特に限定されないが、通常、0.5 kV〜30 kV程度であり、泳動時間も特に限定されないが、通常、1分間〜30分間程度である。 The electrophoresis itself can be performed by a well-known method except that a capillary with a charge added to the inner wall is used and the electrophoresis is performed in an acidic or basic buffer. The electrophoresis voltage is not particularly limited, but is usually about 0.5 kV to 30 kV, and the electrophoresis time is not particularly limited, but is usually about 1 to 30 minutes.
本発明はまた、上記した本発明のキャピラリー電気泳動用のキャピラリーを含む、キャピラリー電気泳動装置をも提供する。本発明のキャピラリー電気泳動装置は、上記した本発明のキャピラリーを含むこと以外は従来の周知のキャピラリー電気泳動装置と同様な構成を有するものであってよい。例えば、分離路と誘導路が交差する十字流路チップ（図１参照）を含むものであってよい。また、従来の電気泳動装置と同様、キャピラリーに電圧をかけるための電圧電源、電極、泳動後の対象物質を検出する検出器、緩衝液や被検試料を添加するリザーバー等を具備する。 The present invention also provides a capillary electrophoresis apparatus including the capillary for capillary electrophoresis of the present invention described above. The capillary electrophoresis apparatus of the present invention may have the same configuration as a conventional well-known capillary electrophoresis apparatus except that it includes the above-described capillary of the present invention. For example, it may include a cross passage chip (see FIG. 1) where the separation path and the guidance path intersect. Further, similarly to the conventional electrophoresis apparatus, a voltage power source for applying a voltage to the capillary, an electrode, a detector for detecting a target substance after electrophoresis, a reservoir for adding a buffer solution or a test sample, and the like are provided.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
本実施例で行った電気泳動実験は、一般的に使われている十字流路チップを用いて検討された（図１）。本実施例で使用した十字流路チップは、何も処理しなかったチップ、流路の内壁をＯ２プラズマで処理したチップ、ＳＯ２プラズマで処理したチップを用いた。使用した十字流路チップの作製法は以下に記す。射出成型によって作製された十字路基板（材質：ＰＭＭＡ）を使用し、十字路チップの蓋としてＰＭＭＡ板（厚さ８ ｍｍ）を用いた。２枚のガラス板（厚さ：約５ｍｍ）＋シリコンゴムシート（厚さ：１．５ｍｍ）でＰＭＭＡ板と十字路基板とを挟み、クリップで留めて、オーブン中150℃で１０分間加温してＰＭＭＡ板と十字路基板とを接着した。流路のゼータ（ζ）電位の状態を変化させた十字路チップを作製する場合、十字路基板およびＰＭＭＡ板表面のプラズマ処理を行った。十字路基板およびＰＭＭＡ板をプラズマ重合装置のベルジャー内に設置し、ベルジャー内の内圧を１×１０−３ Pa以下まで下げた後、Ｏ２プラズマまたはＳＯ２プラズマで基板表面を修飾した。プラズマ処理条件は、ＲＦパワー：１５０Ｗ、マスフロー：２０ ml／min、処理時間：６０秒間でそれぞれ行った。流路の内壁はＯ２プラズマで処理することによって負の荷電基が導入され、ＳＯ２プラズマで処理した場合にはより大きな負の荷電基が導入される。これはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板をそれぞれ処理したものの表面のζ電位を測定することによって確認された（表１）。表１はｐＨ５及びｐＨ６におけるそれぞれの表面のζ電位を測定した結果をまとめたものである。表１に示されている通り、ＰＭＭＡを酸素プラズマで処理することによって、その表面のζ電位はＰＭＭＡよりも大きな負の値をとり、ＳＯ２プラズマで処理することでより大きな負の値をとっている。このことより、流路の内壁には、酸素プラズマで処理することで負の荷電基が導入され、ＳＯ２プラズマで処理することによってより大きな負の荷電基が導入されていることが期待される。なお、ゼータ電位は、具体的には次のようにして測定した。ＰＭＭＡ板（2.5 cm×7 cm）の表面をＯ２プラズマまたは、ＳＯ２プラズマで処理し、その表面のｐＨ５、及びｐＨ６におけるゼータ電位を、ζ電位測定装置ELS-8000（大塚電子社製）で平板セルを用いて測定した。 The electrophoresis experiment performed in this example was examined using a commonly used cross-channel chip (FIG. 1). The cross-flow channel chip used in this example was a chip that was not processed at all, a chip whose inner wall was processed with O 2 plasma, or a chip processed with SO 2 plasma. The method for producing the used cross-channel chip is described below. A cross board (material: PMMA) produced by injection molding was used, and a PMMA plate (thickness 8 mm) was used as a lid for the cross chip. The PMMA plate and the cross road substrate are sandwiched between two glass plates (thickness: about 5 mm) + silicon rubber sheet (thickness: 1.5 mm), fastened with clips, and heated in an oven at 150 ° C. for 10 minutes. The PMMA board and the cross board were bonded. In the case of producing a crossroad chip in which the zeta (ζ) potential state of the flow path was changed, plasma processing was performed on the crossroad substrate and the surface of the PMMA plate. The crossroad substrate and the PMMA plate were placed in a bell jar of a plasma polymerization apparatus, the internal pressure in the bell jar was lowered to 1 × 10 −3 Pa or less, and then the substrate surface was modified with O 2 plasma or SO 2 plasma. The plasma treatment conditions were RF power: 150 W, mass flow: 20 ml / min, treatment time: 60 seconds. When the inner wall of the flow path is treated with O 2 plasma, negatively charged groups are introduced, and when treated with SO 2 plasma, larger negatively charged groups are introduced. This was confirmed by measuring the ζ potential on the surface of each treated polymethylmethacrylate (PMMA) plate (Table 1). Table 1 summarizes the results of measuring the zeta potential of each surface at pH 5 and pH 6. As shown in Table 1, by treating PMMA with oxygen plasma, the ζ potential on the surface takes a negative value larger than that of PMMA, and when treated with SO 2 plasma, it takes a larger negative value. ing. From this, it is expected that negatively charged groups are introduced into the inner wall of the flow path by processing with oxygen plasma, and larger negatively charged groups are introduced by processing with SO 2 plasma. . The zeta potential was specifically measured as follows. The surface of a PMMA plate (2.5 cm × 7 cm) is treated with O 2 plasma or SO 2 plasma, and the zeta potential at pH 5 and pH 6 of the surface is measured with a ζ potential measuring device ELS-8000 (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.). It measured using the flat plate cell.
本実施例では、サンプルとして、分子量と等電点が等しい二種類の異なる、下記の構造を有するペプチドを用いて電気泳動実験をおこなって上記の効果を検討した。ペプチドの電気泳動は以下の手順で行われた。十字流路内およびリザーバー内を泳動液としてｐＨ５、またはｐＨ６のリン酸水素二ナトリウム−クエン酸バッファー（20mM）で満たし、サンプルはリザーバーＢに１．５ μl添加後、導入電圧をかけて導入路に誘導した。サンプルの十字路交差点通過を確認後、分離電圧をかけて導入路に誘導したペプチド試料の一部を分離路へと流し込み、リザーバーC方向へと泳動させた。サンプル導入の印加電圧はリザーバーA: ０V、リザーバーB: ＋１５０V、リザーバーC: ０V、リザーバーD: −１５０Vのパターンで印加し、分離路への導入後は、リザーバーA: ＋２００V、リザーバーB: ＋５０V、リザーバーC: −５００V、リザーバーD: ＋５０Vのパターンで印加した。サンプルの検出は蛍光顕微鏡システムを用いて、リザーバーCの手前にて検出した。 In this example, the above effects were examined by conducting electrophoresis experiments using two different types of peptides having the following structures, which have the same molecular weight and isoelectric point. Peptide electrophoresis was performed according to the following procedure. Fill the cross flow channel and reservoir with electrophoresis solution as pH 5 or pH 6 disodium hydrogen phosphate-citrate buffer (20 mM). Induced to. After confirming that the sample passed through the crossroads, a part of the peptide sample guided to the introduction path by applying a separation voltage was poured into the separation path and migrated in the reservoir C direction. The applied voltages for sample introduction are reservoir A: 0V, reservoir B: + 150V, reservoir C: 0V, reservoir D: -150V, and after introduction into the separation path, reservoir A: + 200V, reservoir B: + 50V, Reservoir C: −500V, reservoir D: + 50V was applied in a pattern. The sample was detected in front of reservoir C using a fluorescence microscope system.
各ペプチドの構造及び性質
ペプチドＡ
シーケンス：NH2-CCy5NDLHKKQDKKDKDRQDKLDQDQKDA-OH（26残基）
特殊処理：マレイミド誘導体によるN末端Cys側鎖Cy5標識
ペプチド分子量：3934.32
等電点：7.15
総電荷：約＋2（pH 5付近）；約＋0.5（pH 6付近）
ペプチドＢ
シーケンス：NH2-CCy5HGHHHHHHVDHGERGHHNHYHKENA-OH（26残基）
特殊処理：マレイミド誘導体によるN末端Cys側鎖Cy5標識
ペプチド分子量：3935.14
等電点：7.02
総電荷：約＋11（pH 5付近）；約＋5（pH 6付近）
Structure and properties of each peptide Peptide A
Sequence: NH 2 -C Cy5 NDLHKKQDKKDKDRQDKLDQDQKDA-OH (26 residues)
Special treatment: N-terminal Cys side chain Cy5 labeled peptide with maleimide derivative Molecular weight: 3934.32
Isoelectric point: 7.15
Total charge: about +2 (around pH 5); about +0.5 (around pH 6)
Peptide B
Sequence: NH 2 -C Cy5 HGHHHHHHVDHGERGHHNHYHKENA-OH (26 residues)
Special treatment: N-terminal Cys side chain Cy5 labeled peptide with maleimide derivative Molecular weight: 3951.14
Isoelectric point: 7.02
Total charge: about +11 (around pH 5); about +5 (around pH 6)
ｐＨ５における、それぞれの十字路チップによるペプチドＡとペプチドＢの検出時間を表２(a)に、ｐＨ６におけるペプチドＡとペプチドＢの検出時間を表２(b)にそれぞれまとめた。表２(a)、(b)に示されている様に、未処理のＰＭＭＡチップを用いた場合、両ペプチドともの検出時間に差がなく、また、両ｐＨの間においても検出時間の差はほとんどみられなかった。このことより、未処理のＰＭＭＡチップの壁面とペプチドとの間にはほとんど相互作用はなく、未処理のＰＭＭＡチップでは分子量と等電点が等しい二種類の異なるペプチドを分離することは出来ないと推測される。 The detection times of peptide A and peptide B with each cross chip at pH 5 are summarized in Table 2 (a), and the detection times of peptide A and peptide B at pH 6 are summarized in Table 2 (b). As shown in Tables 2 (a) and 2 (b), when an untreated PMMA chip was used, there was no difference in detection time between both peptides, and there was a difference in detection time between both pHs. Was hardly seen. Therefore, there is almost no interaction between the wall of the untreated PMMA chip and the peptide, and the untreated PMMA chip cannot separate two different peptides with the same molecular weight and isoelectric point. Guessed.
Ｏ２プラズマ処理ＰＭＭＡチップを用いた場合、両ペプチドとも未処理ＰＭＭＡチップを用いた場合よりも検出時間は短縮された。これは、ＰＭＭＡチップの表面をＯ２プラズマで処理することによって、表面のζ電位の値がより大きなマイナスの値をとる様になり、そのためキャピラリー中で生じている電気浸透流が大きくなり、結果としてペプチドは速く検出される様になったと推測される。また、ｐＨ５およびｐＨ６において、両ペプチドの検出時間に大きな差がなく、その上、ペプチドＡよりも総電荷の大きいペプチドＢの検出時間が早くなっていることより、Ｏ２プラズマで処理された壁面とペプチドとでは強い静電相互作用が生じていないとおもわれる。したがって、本実施例で用いたペプチドと壁面との強い静電相互作用を得るには、上記条件下でのＯ２プラズマ処理では不十分であると推測される。 When an O 2 plasma treated PMMA chip was used, the detection time for both peptides was shorter than when an untreated PMMA chip was used. This is because when the surface of the PMMA chip is treated with O 2 plasma, the value of the ζ potential on the surface takes a larger negative value, and therefore, the electroosmotic flow generated in the capillary is increased. It is speculated that the peptide was detected quickly. Further, at pH 5 and pH 6, there is no significant difference in the detection time of both peptides, and in addition, the detection time of peptide B having a larger total charge than peptide A is earlier, so that the wall treated with O 2 plasma It seems that strong electrostatic interaction does not occur between the peptide and the peptide. Therefore, it is estimated that the O 2 plasma treatment under the above conditions is insufficient to obtain a strong electrostatic interaction between the peptide used in this example and the wall surface.
一方、ＳＯ２プラズマ処理ＰＭＭＡチップを用いた場合、ｐＨ５において、ペプチドＡは８４０ｓで検出されたが、ペプチドＢは検出されなかった。ｐＨ５において、ペプチドそれぞれの総電荷は、ペプチドＡが約＋２であり、ペプチドＢは約＋１１であるため、電気泳動の原理に基づけばペプチドＢの方が速く泳動するはずである。しかしながら、実際の実験結果はペプチドＡの方が速く泳動して先に検出され、ペプチドＢは検出すらされなかった。これは、ペプチドＢの総電荷がペプチドＡより大きいため、マイナスの荷電基が導入されているキャピラリーの内壁と強く静電相互作用し、結果、内壁にペプチドＢが吸着してしまったためと考えられる。バッファーのｐＨを６にして、両ペプチドの総電荷を小さくすることによって（ペプチドＡ：＋０．５； ペプチドＢ：＋５）、ペプチドＢは１１００ｓ後に検出できた。ペプチドＡは１７０ｓで検出できているため、ｐＨ６において、ＳＯ２プラズマ処理ＰＭＭＡチップは両ペプチドに対して高い分離能で分離することができると推測される。 On the other hand, when the SO 2 plasma-treated PMMA chip was used, at pH 5, peptide A was detected at 840 s, but peptide B was not detected. At pH 5, the total charge of each peptide is about +2 for peptide A and about +11 for peptide B, so peptide B should migrate faster based on the principle of electrophoresis. However, the actual experimental result was that peptide A migrated faster and was detected earlier, and peptide B was not even detected. This is thought to be because the total charge of peptide B is larger than that of peptide A, so that it strongly electrostatically interacts with the inner wall of the capillary into which the negatively charged group is introduced, and as a result, peptide B is adsorbed on the inner wall. . By setting the pH of the buffer to 6 and reducing the total charge of both peptides (peptide A: +0.5; peptide B: +5), peptide B could be detected after 1100 s. Since peptide A can be detected at 170 s, it is presumed that at pH 6, the SO 2 plasma-treated PMMA chip can be separated with high resolution against both peptides.
図２（a）はペプチドＡをｐＨ６において、未処理ＰＭＭＡ十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＡは分離路に導入後、約４５０秒後に蛍光ピークが検出されている。図２（b）はペプチドＢをｐＨ６において、未処理ＰＭＭＡ十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＢは分離路に導入後、約４５０秒後に蛍光ピークが検出されている。 FIG. 2 (a) shows the result of electrophoresis of peptide A at pH 6 using an untreated PMMA cross-channel chip. Peptide A has a fluorescence peak detected about 450 seconds after being introduced into the separation path. FIG. 2 (b) shows the result of electrophoresis of peptide B at pH 6 using an untreated PMMA cross-channel chip. Peptide B has a fluorescence peak detected about 450 seconds after being introduced into the separation path.
図３（a）はペプチドＡをｐＨ６において、Ｏ２プラズマ処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＡは分離路に導入後、約３８０秒後に蛍光ピークが検出されている。図３（b）はペプチドＢをｐＨ６において、Ｏ２プラズマ処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＢは分離路に導入後、約２９０秒後に蛍光ピークが検出されている。 FIG. 3 (a) shows the result of electrophoresis of peptide A at pH 6 using a cross-flow channel chip treated with O 2 plasma. Peptide A has a fluorescence peak detected about 380 seconds after being introduced into the separation path. FIG. 3 (b) shows the result of electrophoresis of peptide B at pH 6 using a cross-flow channel chip treated with O 2 plasma. Peptide B has a fluorescence peak detected about 290 seconds after introduction into the separation path.
図４（a）はペプチドＡをｐＨ５においてＳＯ２プラズマで処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＡは分離路に導入後、約８４０秒後に蛍光ピークが検出されている。図４（b）はペプチドＢをｐＨ５においてＳＯ２プラズマで処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。図３（b）に示されている様にペプチドＢは分離路に導入後、１３００秒経過しても検出されなかった。 FIG. 4 (a) shows the result of electrophoresis of peptide A using a cross-channel chip treated with SO 2 plasma at pH 5. Peptide A has a fluorescence peak detected about 840 seconds after being introduced into the separation path. FIG. 4 (b) shows the result of electrophoresis of peptide B using a cross-channel chip treated with SO 2 plasma at pH 5. As shown in FIG. 3B, peptide B was not detected even after 1300 seconds had passed after introduction into the separation path.
図５（a）はペプチドＡをｐＨ６においてＳＯ２プラズマで処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＡは分離路に導入後、約１７０秒後に蛍光ピークが検出されている。図５（b）はペプチドＢをｐＨ６においてＳＯ２プラズマで処理した十字流路チップを用いて電気泳動させた結果である。ペプチドＢは分離路に導入後、約１１００秒後に蛍光ピークが検出されている。 FIG. 5 (a) shows the result of electrophoresis of peptide A using a cross-channel chip treated with SO 2 plasma at pH 6. Peptide A has a fluorescence peak detected about 170 seconds after being introduced into the separation path. FIG. 5 (b) shows the result of electrophoresis of peptide B using a cross-channel chip treated with SO 2 plasma at pH 6. Peptide B has a fluorescence peak detected about 1100 seconds after being introduced into the separation path.
以上から明らかなように、図５に示す条件、すなわち、pH６において、ＳＯ２プラズマで処理した十字流路チップを用いて電気泳動することにより、等電点と分子量がほぼ同じ２つのペプチドを明瞭に分離することができる。 As is apparent from the above, two peptides having substantially the same isoelectric point and molecular weight can be clearly identified by electrophoresis using the cross-channel chip treated with SO 2 plasma under the conditions shown in FIG. Can be separated.
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