JP4546929B2

JP4546929B2 - Antibodies to modified valosin-containing proteins

Info

Publication number: JP4546929B2
Application number: JP2005516396A
Authority: JP
Inventors: 彰垣塚; 宏大泉; 清次堀; 良太前田; 昌克野口; 雅昭小池
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2024-12-20
Also published as: WO2005058964A1; JPWO2005058964A1

Description

この出願の発明は、修飾化バロシン含有タンパク質を認識する抗体に関するものである。 The invention of this application relates to an antibody that recognizes a modified valosin-containing protein.

バロシン含有タンパク質（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｏｉｎ：以下「ＶＣＰ」と記載することがある。）はＡＴＰ結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、小胞の輸送や融合、２６Ｓプロテアソーム機能、ペリオキシゾームの集合化等に関している（非特許文献１）。またこのＶＣＰは、神経変性疾患患者の神経系組織、あるいは癌患者の腫瘍組織においての発現亢進が報告され（例えば非特許文献２−４）、その発現レベルの検出は神経変性疾患における変性の程度、または腫瘍の悪性度を判定するための有効な手段となりうると考えられている。
しかしながら、大腸菌等で発現させた組換えＶＣＰはほとんどＡＴＰａｓｅ活性を持たないことから、ＶＣＰがその機能を発揮するためには、何からの修飾が必要と考えられている。ＶＣＰの修飾については、はじめにチロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されていることが報告され（非特許文献５）、その後、そのリン酸化Ｔｙｒの部位が同定されている（非特許文献６）。
［非特許文献］
１：Ｐｌｅａｓｕｒｅ，Ｉ．Ｔ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３６５（６４４５），４５９−４６２（１９９３）
２：Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１（３），４４７−４５２（２００３）
３：Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４９），４７３５８−４７３６５（２００２）
４：Ａｓａｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ．Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．９３（３），２９６−３０４（２００２）
５：ＥｇｅｒｔｏｎＭ．ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１１（１０），３５３３−４０（１９９２）
６：ＥｇｅｒｔｏｎＭ．ａｎｄＳａｍｅｌｓｏｎＬ．Ｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６９（１５），１１４３５−４１，（１９９４）Valosin-containing protein (hereinafter sometimes referred to as “VCP”) is a member of the ATP-binding protein family, and is related to vesicular transport and fusion, 26S proteasome function, peroxisome assembly, etc. (Non-Patent Document 1). Further, this VCP has been reported to be highly expressed in the nervous system tissues of patients with neurodegenerative diseases or tumor tissues of cancer patients (for example, Non-Patent Documents 2-4), and the expression level is detected by the degree of degeneration in neurodegenerative diseases. It is considered that it can be an effective means for determining the malignancy of a tumor.
However, since recombinant VCP expressed in Escherichia coli has almost no ATPase activity, it is considered that some modification is necessary for VCP to exert its function. Regarding the modification of VCP, it is first reported that tyrosine (Tyr) is phosphorylated (Non-Patent Document 5), and then the site of the phosphorylated Tyr has been identified (Non-Patent Document 6).
[Non-patent literature]
1: Pleasure, I.D. T. T. et al. Nature 365 (6445), 459-462 (1993)
2: Yamamoto, S .; , Et al. J. et al. Clin. Oncol. 21 (3), 447-452 (2003)
3: Kobayashi, T .; , Et al. J. et al. Biol. Chem. 277 (49), 47358-47365 (2002)
4: Asai, T .; , Et al. Jpn. J. et al. Cancer Res. 93 (3), 296-304 (2002)
5: Egerton M.M. et al. EMBO J.M. 11 (10), 3533-40 (1992)
6: Egerton M.M. and Samelson L. E. J Biol Chem. 269 (15), 11435-41, (1994)

前記のとおり、ＶＣＰはそのアミノ酸修飾によって機能を発揮すると考えられているが、ＶＣＰ機能の多様性を考慮すると、報告されているようなＴｙｒ残基のリン酸化修飾といった単独の修飾化が全ての機能に対応するとは考えられない。
これに対してこの出願の発明者らは、ＶＣＰがそのセリン（Ｓｅｒ）残基および／またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基の１以上がリン酸化修飾を受け、またリジン（Ｌｙｓ）残基の１以上がアセチル化修飾を受けることによってＶＣＰが様々な機能を発揮することを見出した。さらには、従来はそのリン酸化修飾が報告されていない１個のチロシン（Ｔｙｒ）残基の修飾もその機能にとって重要であることを見出した。
この出願の発明は、以上のとおりのＶＣＰ修飾に関する新規な知見を基礎とするものであって、修飾化ＶＣＰの発現レベルの測定等に有用な抗体を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（５）の発明を提供する。
（１）配列番号１のアミノ酸配列において：
（ａ）３位、７位、１３位、３７位、４０位、４２位、７３位、７８位、１０１位、１９７位、２７６位、２８２位、２８４位、３２６位、３５２位、４４４位、４５７位、４５９位、５１１位、５４１位、５５５位、５８１位、６１２位、６５２位、６６４位、６８３位、７０２位、７０５位、７１８位、７４６位、７４８位、７６５位および７７０位のＳｅｒ残基から選択される１以上のＳｅｒ残基のリン酸化；
（ｂ）１４位、５６位、７６位、１６８位、２４９位、２６２位、３１６位、３３０位、３４７位、３８５位、４３６位、４４８位、４６７位、４７５位、５０９位、５２５位、５４９位、６０６位、６１３位、６７９位、６８８位、７１５位および７６１位のＴｈｒ残基から選択される１以上のＴｈｒ残基のリン酸化；
（ｃ）８位、１８位、２０位、４５位、６０位、６２位、６３位、１０９位、１１２位、１４８位、１６４位、１９０位、２１１位、２１７位、２３１位、２３６位、２５１位、２７７位、２８８位、２９５位、３１２位、３１５位、３３６位、３８６位、３８９位、４２５位、４２６位、４８６位、５０２位、５０５位、５１２位、５２４位、５２９位、５４３位、５６５位、５８４位、６１４位、６５８位、６６３位、６６８位、６７７位、６９６位および７５４位のＬｙｓ残基から選択される１以上のＬｙｓ残基のアセチル化；
（ｄ）４９５位のＴｙｒ残基のリン酸化、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸修飾を有する修飾化ペプチドを抗原として調製された抗体であって、リン酸化Ｓｅｒ残基、リン酸化Ｔｈｒ残基、アセチル化Ｌｙｓ残基および／またはリン酸化Ｔｙｒ残基を有する修飾化バロシン含有タンパク質を認識する抗体。
（２）配列番号１の一部連続配列からなる修飾化ペプチドを抗原として調製された前記発明（１）の抗体。
（３）前記発明（２）の抗体とは異なる修飾化アミノ酸残基を認識する抗体。
（４）それぞれに異なるリン酸化Ｓｅｒ残基、リン酸化Ｔｈｒ残基、アセチル化Ｌｙｓ残基および／またはリン酸化Ｔｙｒ残基を有する修飾化バロシン含有タンパク質を個別に認識する抗体のセット。
（５）識化した前記発明（１）から（３）の抗体、または標識化した前記発明（４）の抗体セットを含むキット。
なお、この発明において「抗体」とは、広義の意味で使用されるものであってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメントおよび誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’およびＦａｂといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ）、トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体を包含する。
この発明における用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。As described above, VCP is considered to exert its function by its amino acid modification. However, considering the diversity of VCP function, single modification such as phosphorylation modification of Tyr residue as reported has been reported in all cases. It is not considered to correspond to the function.
In contrast, the inventors of this application have found that VCP is phosphorylated at one or more of its serine (Ser) and / or threonine (Thr) residues and is one or more of lysine (Lys) residues. It has been found that VCP exerts various functions by undergoing acetylation modification. Furthermore, it has been found that modification of a single tyrosine (Tyr) residue, whose phosphorylation modification has not been reported so far, is also important for its function.
The invention of this application is based on the above-described novel knowledge about VCP modification, and an object thereof is to provide an antibody useful for measuring the expression level of modified VCP.
This application provides the following inventions (1) to (5) to solve the above problems.
(1) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1:
(A) 3rd, 7th, 13th, 37th, 40th, 42nd, 73rd, 78th, 101st, 197th, 276th, 282th, 284th, 326th, 326th, 352nd, 444th 457, 459, 511, 541, 555, 581, 612, 652, 664, 683, 702, 705, 718, 746, 748, 765 and 770 Phosphorylation of one or more Ser residues selected from the Ser residues at the position;
(B) 14th, 56th, 76th, 168th, 249th, 262th, 316th, 330th, 347th, 385th, 436th, 448th, 467th, 475th, 509th, 525th Phosphorylation of one or more Thr residues selected from Thr residues at positions 549, 606, 613, 679, 688, 715 and 761;
(C) 8th, 18th, 20th, 45th, 60th, 62nd, 63rd, 109th, 112th, 148th, 164th, 190th, 211th, 217th, 231st, 231st, 236th 251st, 277th, 288th, 295th, 312th, 315th, 336th, 386th, 389th, 425th, 426th, 486th, 502th, 505th, 512th, 512th, 524th, 529 Acetylation of one or more Lys residues selected from the Lys residues at positions 543, 565, 584, 614, 658, 663, 668, 677, 696 and 754;
(D) phosphorylation of the Tyr residue at position 495;
An antibody prepared by using a modified peptide having one or more amino acid modifications selected from the group consisting of phosphorylated Ser residue, phosphorylated Thr residue, acetylated Lys residue and / or phosphorylated An antibody that recognizes a modified valosin-containing protein having a Tyr residue.
(2) The antibody of the invention (1) prepared by using a modified peptide consisting of a partially continuous sequence of SEQ ID NO: 1 as an antigen.
(3) An antibody that recognizes a modified amino acid residue different from the antibody of the invention (2).
(4) A set of antibodies that individually recognize modified valosine-containing proteins each having a different phosphorylated Ser residue, phosphorylated Thr residue, acetylated Lys residue and / or phosphorylated Tyr residue.
(5) A kit comprising the identified antibody of the invention (1) to (3) or the labeled antibody set of the invention (4).
In the present invention, the “antibody” may be used in a broad sense, and includes a monovalent antibody or a multivalent antibody, a polyclonal antibody, and a monoclonal antibody, and further includes a natural type (intact). Molecules as well as fragments and derivatives thereof, including fragments such as F (ab ′) ₂ , Fab ′ and Fab, and further chimeric or hybrid antibodies having at least two antigens or epitope binding sites; Or, for example, bispecific recombinant antibodies such as quadromes and triomes, interspecific hybrid antibodies, anti-idiotype antibodies, and also known cell fusion or hybridoma techniques and antibody engineering may be applied or synthesized. Or obtained using semi-synthetic techniques Antibodies.
Terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description of the embodiments of the invention and the examples. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for a technique that clearly indicates the source. For example, genetic engineering and molecular biology techniques are described by Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F .; M.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N .; Y, 1995, and the like. The terminology is basically based on the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, or based on the meaning of terms commonly used in this field.

図１は、実施例５のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。縦軸は吸光度、横軸は抗体希釈倍率である。黒丸は修飾化ペプチド（Ｉ）、白四角は非修飾化ペプチド、黒三角はコントロール修飾化ペプチド（Ｖ）のそれぞれに対するマウス抗血清（Ｉ）の抗体力価を示す。
図２は、実施例６のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。縦軸は吸光度、横軸は抗体希釈倍率である。黒四角は修飾化ペプチド（ＩＩ）、白四角は非修飾化ペプチドに対するウサギ抗血清（ＩＩ）の抗体力価を示す。
図３は、実施例７のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。縦軸は吸光度、横軸は抗体希釈倍率である。黒丸は修飾化ペプチド（ＩＩＩ）、白丸は非修飾化ペプチドに対するウサギ抗血清（ＩＩＩ）の抗体力価を示す。
図４は、実施例８のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。縦軸は吸光度、横軸は抗体希釈倍率である。黒丸は修飾化ペプチド（ＩＶ）、白丸は非修飾化ペプチドに対するウサギ抗血清（ＩＶ）の抗体力価を示す。
図５は、実施例９のウェスタン・ブロット分析の結果である。
図６は、実施例１０のウェスタン・ブロット分析の結果である。
図７は、実施例１１のウェスタン・ブロット分析の結果である。1 is a graph showing the results of ELISA analysis of Example 5. FIG. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents antibody dilution rate. The black circle indicates the antibody titer of mouse antiserum (I) against the modified peptide (I), the white square indicates the unmodified peptide, and the black triangle indicates the control modified peptide (V).
FIG. 2 is a graph showing the results of the ELISA analysis of Example 6. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents antibody dilution rate. The black square represents the antibody titer of the rabbit antiserum (II) against the modified peptide (II), and the white square represents the unmodified peptide.
FIG. 3 is a graph showing the results of ELISA analysis of Example 7. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents antibody dilution rate. The black circle shows the antibody titer of the rabbit antiserum (III) against the modified peptide (III) and the white circle shows the unmodified peptide.
FIG. 4 is a graph showing the results of ELISA analysis of Example 8. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents antibody dilution rate. The black circle indicates the antibody titer of the rabbit antiserum (IV) against the modified peptide (IV), and the white circle indicates the unmodified peptide.
FIG. 5 shows the results of Western blot analysis of Example 9.
FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of Example 10.
FIG. 7 shows the results of Western blot analysis of Example 11.

発明（１）の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列（ヒトＶＣＰのアミノ酸配列）において：
（ａ）３位、７位、１３位、３７位、４０位、４２位、７３位、７８位、１０１位、１９７位、２７６位、２８２位、２８４位、３２６位、３５２位、４４４位、４５７位、４５９位、５１１位、５４１位、５５５位、５８１位、６１２位、６５２位、６６４位、６８３位、７０２位、７０５位、７１８位、７４６位、７４８位、７６５位および７７０位のＳｅｒ残基から選択される１以上のＳｅｒ残基のリン酸化；
（ｂ）１４位、５６位、７６位、１６８位、２４９位、２６２位、３１６位、３３０位、３４７位、３８５位、４３６位、４４８位、４６７位、４７５位、５０９位、５２５位、５４９位、６０６位、６１３位、６７９位、６８８位、７１５位および７６１位のＴｈｒ残基から選択される１以上のＴｈｒ残基のリン酸化；
（ｃ）８位、１８位、２０位、４５位、６０位、６２位、６３位、１０９位、１１２位、１４８位、１６４位、１９０位、２１１位、２１７位、２３１位、２３６位、２５１位、２７７位、２８８位、２９５位、３１２位、３１５位、３３６位、３８６位、３８９位、４２５位、４２６位、４８６位、５０２位、５０５位、５１２位、５２４位、５２９位、５４３位、５６５位、５８４位、６１４位、６５８位、６６３位、６６８位、６７７位、６９６位および７５４位のＬｙｓ残基から選択される１以上のＬｙｓ残基のアセチル化；
（ｄ）４９５位のＴｙｒ残基のリン酸化、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸修飾を有する修飾化ペプチドを抗原として調製された抗体である。
従って、この抗体は、抗原として使用した修飾化ペプチドの修飾アミノ酸残基に応じて、それらと同一の修飾Ｓｅｒ残基、Ｔｈｒ残基および／またはＬｙｓ残基を有するＶＣＰを認識する。なお、ＶＣＰはヒト、マウス、ラットで全く同一のアミノ酸配列（配列番号１）を有しているため、この発明の抗体は、ヒト、マウスおよびラットの修飾化ＶＣＰを等しく認識することができる。
この発明の抗体作成に用いるペプチド抗原は、修飾化アミノ酸残基を含み、かつ全長ＶＣＰと同一サイズのペプチドであってもよく、あるいは修飾化アミノ酸残基を含む部分ペプチドであってもよい。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列における１以上のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基および／またはＬｙｓ残基がそれぞれ修飾された７〜１５、１５〜３０、３１〜５０、５１〜８０、８１〜１５０連続アミノ酸配列からなる修飾化ペプチドである。なお、短鎖ペプチドを抗原とする抗体については、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９０，Ｖｏｌ．２６６，ｐ．４９７−５０４（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎからなるペプチドを抗原して作成した抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍＰ−４５０ＩＡ２抗体）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９２，Ｖｏｌ．２８８，ｐ．１９５−２０５（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒを抗原として作成した抗インスリンβ−サブユニットモノクローナル抗体）等が知られている（その他にも、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｖｏｌ．８，ｐ．２１５９−２１６３、Ｃｅｌｌ，１９８９，Ｖｏｌ．５８，ｐ．９４５−９５３）。従って、配列番号１における前記範囲の連続配列を選択し、修飾化されたアミノ酸残基を含む部分ペプチドを抗原とすることによって、対応する修飾化アミノ酸残基を有するＶＣＰを認識する抗体が、当業者であれば格段の困難性なく作成される。
また、この修飾化ペプチドは、アミド結合（ペプチド結合）によって直線的配列で互いに結合した７個以上のアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味し、天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−に対する−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ_２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ_２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ_４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，ＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ２６７−３５７，“ＰｅｐｔｉｄｅＢａｃｋｂｏｎｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＭａｒｃｅｌｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹを参照）。
この発明の抗体作成に使用する修飾化ペプチドは、例えばペプチド合成機を使用して、例えばＦｍｏｃ−ｂｏｐ法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ．ＳｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓＩ．Ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３；ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄＷｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）等によって合成することができる。また、ペプチド合成の材料として使用するリン酸化Ｓｅｒ残基、リン酸化Ｔｈｒ残基、アセチル化Ｌｙｓ残基およびリン酸化Ｔｙｒ残基は、それぞれ市販品を使用することもでき、あるいは公知の方法によって各アミノ酸残基を所望の形態に修飾化することによって作成することもできる。すなわち、リン酸化Ｓｅｒ残基およびＴｈｒ残基は、ＳｅｒおよびＴｈｒにセリン／スレオニンキナーゼを作用させ、またリン酸化Ｔｙｒ残基はＴｙｒにチロシンキナーゼを作用させ、それらのヒドロキシ基にリン酸基を付加することによって作成することができる。またアセチル化Ｌｙｓ残基は、Ｌｙｓにアセチラーゼを作用させてそのアミノ基にアセチル基を付加することによって作成することができる。
また修飾化ペプチドのＮ末端にはシステインを導入してもよい。合成したペプチドはμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）などを用いた高速液体クロマトグラフィーなどにより精製して免疫抗原として使用する。また、修飾化ペプチドの修飾部位や修飾の種類等は、ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ解析によって正確に判定することもできる。
この発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、修飾化ペプチドを免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ニワトリなどが用いられる
抗原ペプチドによる動物の免疫は公知の方法（例えば、村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載された方法）に準じて行うことができる。例えば、一般的方法としては、抗原ペプチドを哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより免疫化を行うことができる。抗原ペプチドはウシアルブミン、ニワトリオボアルブリン、軟体動物由来ヘモシアニンなどの適当なキャリヤータンパク質に、マレイミド、カルボジイミドなどを用いて化学的に結合させた後に免疫しても良い。また、抗原ペプチドをアジュバントと共に投与してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全（または不完全）アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、その動物から採血した血液から調製することができる。
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ”ＪａｍｅｓＷ．Ｇｏｄｉｎｇ，ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９６；ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７など）に従い作製することができる。
具体的には、修飾化ペプチドを用いて哺乳動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。次いでこの動物から抗体産生細胞（リンパ細胞または脾臓細胞）を摘出し、これとミエローマ（骨髄腫）細胞株との融合細胞を得る。そして、これらの融合細胞株から、目的とするモノクローナル抗体を産生する細胞を選択し、培養することによって、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そして、このハイブリドーマ細胞の培養物から、あるいはハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水から採取するなどしてモノクローナル抗体を得ることができる。
このモノクローナル抗体の作成において使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点からは、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴｌ、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は５〜１２週齢が好ましい。
免疫原の投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数１〜６回、複数回の場合は投与間隔１〜２週間が好ましい。また免疫原である修飾化ペプチドの投与は、初回免疫としては１００〜２００μｇ程度、２次免疫以降は５０〜１００μｇを動物の皮内または腹腔内に投与することによって行うことができる。
上記の投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、８１４９／５ＸＸＯ，ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光抗体法等により行うことができる。またスクリーニング後のハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。そして、培養したハイブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞を腹腔内注射して動物の腹水から、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。
この発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、必要に応じてそれをより精製された形態のものとして使用される。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などを採用することができる。好ましくは、抗血清、モノクローナル抗体を含有する腹水などは、硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲルおよびプロテインＡカラムのようなアフィニティーカラムなどで処理し精製分離することができる。特に好ましくは抗原ペプチドを固定化したアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが挙げられる。
この発明の抗体は、前記の方法により得られた抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２といった抗体フラグメントであってもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接および間接サンドイッチ検定、あるいは免疫沈降検定等に使用することができる（例えば、Ｚｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７等を参照）。
この発明の抗体には、標識物質によって標識化されたものも含まれる。標識としては、酵素、酵素基質、酵素阻害物質、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子（例えば金コロイドなど）、非金属元素粒子（例えばセレンコロイドなど）、放射性物質などを挙げることができる。特に、酵素、放射性同位体または蛍光色素をふくむ化学物質が好ましい。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素を使用できる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いること（例えば、酵素的サイクリングの利用）もできる。酵素標識などは、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。また標識は、複数の異なった種類の標識物質を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にする。
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどを例示することができる。
また酵素標識した場合の基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができ、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体などが挙げられ、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。また標識シグナルの形成に４−ヒドロキシフェニル酢酸、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチル酸、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、チラミン、ルミノール、ルシゲニンルシフェリンおよびその誘導体、Ｐｈｏｌａｄｌｕｃｉｆｅｒｉｎなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、ルミジェンＰＰＤ、（４−メチル）ウンベリフェリル−リン酸、ｐ−ニトロフェノール−リン酸、フェノール−リン酸、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ＡＭＰＡＫ^ＴＭ（ＤＡＫＯ）、ＡｍｐｌｉＱ^ＴＭ（ＤＡＫＯ）などとアルカリフォスファターゼ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドといったウンベリフェリルガラクトシド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトシドといったニトロフェニルガラクトシドなどとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼ、ＡＢＴＳなどとグルコースオキシダーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
放射性同位体としては、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマーＲ（ＴＲＩＴＣ）などのローダミン誘導体、７−アミノ−４−クマリン−３−酢酸、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。蛍光色素としては、通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。発色、螢光などを含めた生成するシグナルを検知するには、視覚によることもできるが、公知の装置を使用することもでき、例えば螢光光度計、プレートリーダーなども使用できる。また、放射性同位体（アイソトープ）などの出すシグナルを検知するには、公知の装置（例えばガンマーカウンター、シンチレーションなど）を使用することができる。
抗体を標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができる。また縮合剤（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなど）を用いることもできる。
さらにまた、この出願は、それぞれに異なるリン酸化Ｓｅｒ残基、リン酸化Ｔｈｒ残基、アセチル化Ｌｙｓ残基および／またはリン酸化Ｔｙｒ残基を有する修飾化ＶＣＰを個別に認識する抗体のセット（発明（４））を提供する。すなわちこの発明（４）の抗体セットは、それぞれ異なる修飾化アミノ酸残基を有する修飾化ＶＣＰを個別に認識する少なくとも２種類の抗体からなるセットである。
またこの出願は、発明（５）として、前記発明（１）から（３）のいずれか、および／または発明（４）の抗体セットを含むキットを提供する。この発明（５）のキットは、抗体または抗体セットのそれぞれの抗体が液相系にキット化されたものであってもよく、あるいは抗体が固相単体に結合されたものであってもよい。また、標識物質が酵素の場合には、その基質を含んでもよい。さらに、固相単体に抗体が結合したものの場合には、非結合抗体を洗浄するための溶液を含むようにしてもよい。またさらに、１次抗体と２次抗体を含むキット（例えばＥＬＩＳＡキット）であってもよい。
なお、固相担体としては、例えばガラス、例えばアミノアルキルシリルガラスなどの活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、シリコンガムなど、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
これら担体への抗体との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
この発明によって提供される抗体や抗体セット、あるいは抗体キットは、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法（例えばｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法など）によって修飾化ＶＣＰを同定するために使用することができる。これらの一般的な技術手段の詳細については、例えば、入江寛編、「続ラジオイムノアッセイ」、講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」（第３版）、医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＡ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＢ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＣ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｍｉｃｒｙ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−ＢｉｏｔｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．（ｅｄ．），”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｇｎａｎｄＭｏｄｅｌｉｎｇ：ＣｏｎｃｅｐｔｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＰａｒｔＢ：ＡｎｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＡｎｔｉｇｅｎｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄＤｒｕｇｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）等の記載、あるいはそこで引用された文献中にある記載を参考に行うことができる。The antibody of the invention (1) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of human VCP):
(A) 3rd, 7th, 13th, 37th, 40th, 42nd, 73rd, 78th, 101st, 197th, 276th, 282th, 284th, 326th, 326th, 352nd, 444th 457, 459, 511, 541, 555, 581, 612, 652, 664, 683, 702, 705, 718, 746, 748, 765 and 770 Phosphorylation of one or more Ser residues selected from the Ser residues at the position;
(B) 14th, 56th, 76th, 168th, 249th, 262th, 316th, 330th, 347th, 385th, 436th, 448th, 467th, 475th, 509th, 525th Phosphorylation of one or more Thr residues selected from Thr residues at positions 549, 606, 613, 679, 688, 715 and 761;
(C) 8th, 18th, 20th, 45th, 60th, 62nd, 63rd, 109th, 112th, 148th, 164th, 190th, 211th, 217th, 231st, 231st, 236th 251st, 277th, 288th, 295th, 312th, 315th, 336th, 386th, 389th, 425th, 426th, 486th, 502th, 505th, 512th, 512th, 524th, 529 Acetylation of one or more Lys residues selected from the Lys residues at positions 543, 565, 584, 614, 658, 663, 668, 677, 696 and 754;
(D) phosphorylation of the Tyr residue at position 495;
An antibody prepared by using a modified peptide having one or more amino acid modifications selected from the group consisting of
Thus, this antibody recognizes VCPs having the same modified Ser, Thr and / or Lys residues depending on the modified amino acid residues of the modified peptide used as the antigen. Since VCP has the same amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) in human, mouse and rat, the antibody of the present invention can equally recognize human, mouse and rat modified VCP.
The peptide antigen used for preparing the antibody of the present invention may be a peptide containing a modified amino acid residue and the same size as the full-length VCP, or a partial peptide containing a modified amino acid residue. That is, 7-15, 15-30, 31-50, 51-80, 81-150 consecutive in which one or more Ser residues, Thr residues and / or Lys residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are respectively modified. It is a modified peptide consisting of an amino acid sequence. For antibodies using a short peptide as an antigen, see, for example, Biochem. J. et al. , 1990, Vol. 266, p. 497-504 (anti-cytochrome P-450IA2 antibody prepared by antigenizing a peptide consisting of Ser-Glu-Asn-Tyr-Lys-Asp-Asn), Biochem. J. et al. , 1992, Vol. 288, p. 195-205 (an anti-insulin β-subunit monoclonal antibody prepared using Lys-Lys-Asn-Gly-Arg-Ile-Leu-Thr-Leu-Pro-Arg-Ser-Asn-Pro-Ser as an antigen), etc. (Molecular and Cellular Biology, 1988, Vol. 8, p. 2159-2163, Cell, 1989, Vol. 58, p. 945-953). Therefore, an antibody that recognizes a VCP having a corresponding modified amino acid residue can be obtained by selecting a continuous sequence in the above-mentioned range in SEQ ID NO: 1 and using a partial peptide containing the modified amino acid residue as an antigen. If it is a trader, it is created without any particular difficulty.
In addition, this modified peptide means a molecule composed of a linear sequence of 7 or more amino acid residues linked to each other in a linear sequence by an amide bond (peptide bond), and residues other than natural amide bonds It may consist of concatenation. Residue linkages other than natural amide bonds may be chemistry such as glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, bifunctional maleimide, N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC). A coupling or coupling means can be illustrated. A linking group that can substitute for a peptide bond is, for example, ketomethylene (eg, —C (═O) —CH ₂ —C (═O) —NH—), aminomethylene (CH ₂ -NH), ethylene, olefin (CH = CH), ether (CH2-O), thioether (CH ₂ -S), tetrazole (CN ₄ -), Thiazoles, retroamides, thioamides, or esters (eg, Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Beck Mock”. See NY).
The modified peptide used for the preparation of the antibody of the present invention can be obtained by using, for example, a peptide synthesizer, for example, Fmoc-bop method (Merrifield, RBJ Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W. C. and White, P. D., Oxford University 2000, etc.). . In addition, as the phosphorylated Ser residue, phosphorylated Thr residue, acetylated Lys residue and phosphorylated Tyr residue used as peptide synthesis materials, commercially available products can be used, or each can be obtained by a known method. It can also be created by modifying amino acid residues into the desired form. That is, phosphorylated Ser and Thr residues act on Ser and Thr with serine / threonine kinases, and phosphorylated Tyr residues act on Tyr with tyrosine kinases and add phosphate groups to their hydroxy groups. Can be created by doing. Further, the acetylated Lys residue can be prepared by allowing acetylase to act on Lys and adding an acetyl group to the amino group.
Cysteine may be introduced at the N-terminus of the modified peptide. The synthesized peptide is purified by high-performance liquid chromatography using μBondasphere, C18 column (Waters) or the like and used as an immunizing antigen. Moreover, the modification site | part of a modified peptide, the kind of modification, etc. can also be determined correctly by Mass Spectrometry analysis.
In the case of a polyclonal antibody, for example, the antibody of the present invention can be obtained from serum after immunizing an animal using the modified peptide as an immunogen. As animals, mice, rats, hamsters, rabbits, goats, sheep, cows, horses, pigs, dogs, cats, monkeys, chickens, etc. are used.
Immunization of animals with antigenic peptides is a known method (for example, Shigeru Muramatsu, et al., Laboratory Biology Course 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japanese Biochemical Society, Secondary Biochemistry Laboratory Course 5, Immunization Biochemical Research Method, Tokyo Chemical Doujin, 1986, edited by the Japanese Biochemical Society, New Chemistry Experiment Laboratory 12, Molecular Immunology III, Antigen / Antibody / Complement, Tokyo Chemical Dojin, 1992, etc.) Can be done. For example, as a general method, immunization can be performed by injecting an antigen peptide intraperitoneally or subcutaneously into a mammal. The antigenic peptide may be immunized after chemically binding to an appropriate carrier protein such as bovine albumin, chicken ovoalburin, mollusc-derived hemocyanin using maleimide, carbodiimide or the like. In addition, the antigenic peptide may be administered together with an adjuvant. Examples of the adjuvant include Freund's complete (or incomplete) adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, lipid A, liposome, aluminum hydroxide, silica and the like.
The antiserum containing the polyclonal antibody can be prepared from blood collected from an immunized animal after breeding for a predetermined period.
Monoclonal antibodies are known monoclonal antibody production methods (“monoclonal antibodies”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody”, James W. Godding, third edition, Academic Press, 1996; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, etc.).
Specifically, the modified peptide is used to immunize a mammal, and if necessary, additional immunization is performed to sufficiently sensitize the animal. Subsequently, antibody-producing cells (lymph cells or spleen cells) are removed from the animal, and fused cells of this and myeloma (myeloma) cell line are obtained. From these fused cell lines, hybridoma cells can be obtained by selecting and culturing cells that produce the desired monoclonal antibody. A monoclonal antibody can be obtained from the culture of the hybridoma cells or from the ascites of the animal injected with the hybridoma cells.
As the immunized animal used in the production of this monoclonal antibody, mammals used in known hybridoma production methods can be used. Specific examples include mice, rats, goats, sheep, cows and horses. However, from the viewpoint of easy availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, it is preferable to use mice or rats as immunized animals. Further, the mouse and rat strains actually used are not particularly limited. In the case of mice, for example, each strain A, AKR, BALB / c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR, WB, 129, etc., and in the case of rats, for example, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, etc. Can be used. Among these, considering fusion compatibility with the myeloma cells described later, the BALB / c strain is particularly preferable for mice and the low strain for rats is particularly preferable. In addition, the age at the time of immunization of these mice or rats is preferably 5 to 12 weeks old.
The immunogen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, and the like, but generally, the number of antigen administrations is 1 to 6 times, and in the case of multiple administrations, the administration interval is preferably 1 to 2 weeks. The modified peptide as an immunogen can be administered by administering about 100 to 200 μg as the first immunization and 50 to 100 μg after the second immunization intradermally or intraperitoneally.
Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 5 days after the last immunization day of the above administration schedule. Separation of antibody-producing cells from these spleen cells or lymphocytes can be performed according to a known method.
Next, antibody-producing cells and myeloma cells are fused. The myeloma cells are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines. However, in consideration of convenience when selecting hybridomas from the fused cells, it is preferable to use HGPRT (Hpoxanthine-guanine phosphoryltransferase) -deficient strains for which selection procedures have been established. That is, X63-Ag8 (X63), NS1-Ag4 / 1 (NS-1), P3X63-Ag8. U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, 8149 / 5XXO, BU. 1st, etc. 210 derived from rat. RSY3. Ag. 1.2.3 (Y3), etc., human-derived U266AR (SKO-007), GM1500 / GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR / NIP4-1 (NP41) Etc.
Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately performed according to a known method under conditions that do not extremely reduce the cell viability. As such a method, for example, a chemical method of mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, a physical method using electrical stimulation, or the like can be used.
The selection of fused cells and non-fused cells is preferably performed by, for example, a known HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method. This method is effective when obtaining fused cells using HGPRT-deficient myeloma cells that cannot survive in the presence of aminopterin. That is, by culturing unfused cells and fused cells in a HAT medium, only fused cells having resistance to aminopterin can selectively remain and proliferate.
Screening of hybridoma cells producing the target monoclonal antibody can be performed by a known enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, or the like. Further, the hybridoma cells after screening are cloned by a known method such as methylcellulose method, soft agarose method, limiting dilution method, and used for antibody production.
The hybridoma cells obtained by the method as described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at -80 ° C or lower. The target monoclonal antibody can be obtained from the ascites of the animal by intraperitoneal injection of the cultured hybridoma cells or hybridoma cells.
The polyclonal antibody or monoclonal antibody of the present invention is used in a form in which it is further purified as necessary. Methods for purifying and isolating antibodies include conventionally known methods such as salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, An affinity chromatography method, a high performance liquid chromatography method, etc. are employable. Preferably, antiserum, ascites containing monoclonal antibodies, etc. can be purified and separated by treatment with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein A column after ammonium sulfate fractionation. . Particularly preferred are affinity chromatography in which an antigen peptide is immobilized, affinity chromatography in which protein A is immobilized, hydroxyapatite chromatography, and the like.
The antibody of the present invention is Fab, Fab ′, F (ab ′) obtained by treating the antibody obtained by the above-described method with an enzyme such as trypsin, papain, or pepsin and optionally reducing it. ₂ Such an antibody fragment may be used. The antibodies can be used in any known assay, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, or immunoprecipitation assays (eg, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, pp. 147-). 158, CRC Press, Inc., 1987).
The antibody of the present invention includes those labeled with a labeling substance. Examples of labels include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prosthetic molecules, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent materials, dye materials, chemiluminescent compounds, luminescent materials, coloring materials, magnetic materials, metal particles (for example, Gold colloid etc.), nonmetallic element particles (eg selenium colloid etc.), radioactive substances and the like can be mentioned. In particular, chemical substances including enzymes, radioisotopes or fluorescent dyes are preferred. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large number of turnover, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate, and is used for normal EIA. Enzymes can be used. Examples of enzymes include oxidoreductases such as dehydrogenase, reductase, and oxidase, such as transferases that catalyze the transfer of amino groups, carboxyl groups, methyl groups, acyl groups, phosphate groups, and the like, such as ester bonds, Examples include hydrolase, lyase, isomerase, ligase and the like that hydrolyze glycoside bonds, ether bonds, peptide bonds, and the like. As the enzyme, a plurality of enzymes can be used in combination (for example, use of enzymatic cycling). The enzyme label and the like can be replaced with a biotin label and an enzyme-labeled avidin (streptavidin). A plurality of different types of labeling substances can also be used for the labeling. In such a case, it is possible to perform multiple measurements continuously or discontinuously and simultaneously or separately.
Representative enzyme labels include peroxidase such as horseradish peroxidase, galactosidase such as E. coli β-D-galactosidase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose oxidase, glucoamylase, acetylcholinesterase, Examples thereof include alkaline phosphatase such as catalase, bovine small intestine alkaline phosphatase, and Escherichia coli alkaline phosphatase.
Moreover, as a substrate in the case of enzyme labeling, a known substance can be used according to the type of enzyme used, phosphorylation such as umbelliferone derivatives such as 4-methylumbelliferyl phosphate, nitrophenyl phosphate, and the like. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine is used. When alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like is used. Can be used. Further, 4-hydroxyphenylacetic acid, o-phenylenediamine (OPD), tetramethylbenzidine (TMB), 5-aminosalicylic acid, 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 3-amino-9- Ethylcarbazole (AEC), tyramine, luminol, lucigenin luciferin and derivatives thereof, peroxidase such as Phorad luciferin and horseradish peroxidase, Lumigen PPD, (4-methyl) umbelliferyl-phosphate, p-nitrophenol-phosphorus Acid, phenol-phosphate, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), AMPAK ^TM (DAKO), AmpliQ ^TM (DAKO) and the like, alkaline phosphatase, umbelliferyl galactoside such as 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside, nitrophenyl galactoside such as o-nitrophenol-β-D-galactoside and β-D-galactosidase, glucose- Combinations of 6-phosphate / dehydrogenase, ABTS, etc. and enzyme reagents such as glucose oxidase can also be used, quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone, hydroxyanthraquinone, thiol compounds such as lipoic acid, glutathione, phenol derivatives, ferrocene derivatives, etc. Can be formed by the action of an enzyme or the like.
As a radioisotope, ³² P, ¹²⁵ I, ¹⁴ C, ³⁵ S, ³ What is used by normal RIA, such as H, can be used. Examples of fluorescent substances or chemiluminescent compounds include fluorescein isothiocyanate (FITC), such as rhodamine derivatives such as rhodamine B isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate isomer R (TRITC), 7-amino- Examples include 4-coumarin-3-acetic acid, dansyl chloride, dansyl fluoride, fluorescamine, phycobiliprotein, acridinium salt, lumiferin, luciferase, equolin, and other luminols, imidazoles, oxalate esters, rare earth chelate compounds, and coumarin derivatives. It is done. As the fluorescent dye, those used in the usual fluorescent antibody method can be used. To detect the generated signal including color development and fluorescence, a visual signal can be used, but a known apparatus can also be used. For example, a fluorometer, a plate reader, or the like can be used. Moreover, in order to detect a signal emitted from a radioisotope (isotope) or the like, a known device (for example, a gamma counter, a scintillation, etc.) can be used.
The antibody can be labeled using a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, or the like. Also, condensing agents (for example, formaldehyde, glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, N, N′-polymethylenebisiodoacetamide, N, N′-ethylenebismaleimide, ethylene glycol bissuccinimidyl succinate Bisdiazobenzidine, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy Rate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate, N- Cuccinimidyl 4- (1-maleimidophenyl) butyrate, N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), iminothiolane, S-acetylmercaptosuccinic anhydride, methyl-3- (4′-dithiopyridyl) Propionimidate, methyl-4-mercaptobutyrylimidate, methyl-3-mercaptopropionimidate, N-succinimidyl-S-acetylmercaptoacetate, etc.) can also be used.
Furthermore, this application describes a set of antibodies that individually recognize modified VCPs having different phosphorylated Ser residues, phosphorylated Thr residues, acetylated Lys residues and / or phosphorylated Tyr residues (invention). (4)) is provided. That is, the antibody set of this invention (4) is a set comprising at least two types of antibodies that individually recognize modified VCPs having different modified amino acid residues.
This application also provides, as invention (5), a kit comprising any of the inventions (1) to (3) and / or the antibody set of invention (4). The kit of the present invention (5) may be a kit in which each antibody of an antibody or an antibody set is made into a kit in a liquid phase system, or may be one in which an antibody is bound to a single solid phase. Further, when the labeling substance is an enzyme, the substrate may be included. Further, in the case where the antibody is bound to the solid phase alone, a solution for washing the unbound antibody may be included. Furthermore, a kit (for example, ELISA kit) containing a primary antibody and a secondary antibody may be used.
Examples of the solid phase carrier include glass, activated glass such as aminoalkylsilyl glass, porous glass, silica gel, silica-alumina, alumina, magnetized iron, magnetized alloy and other inorganic materials, polyethylene, polypropylene, polychlorinated Vinyl, polyvinylidene fluoride, polyvinyl, polyvinyl acetate, polycarbonate, polymethacrylate, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, polyacrylamide, crosslinked polyacrylamide, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate Such as copolymers, cross-linked albumin, collagen, gelatin, dextran, agarose, cross-linked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, Natural or modified cellulose such as loose acetate, cross-linked dextran, polyamide such as nylon, polyurethane, polyepoxy resin and other organic polymer materials, and those obtained by emulsion polymerization of these, silicone gum, cells, red blood cells, etc. If necessary, those having a functional group introduced with a silane coupling agent or the like can be mentioned.
The antibody can be bound to these carriers using a physical method such as adsorption, a chemical method using a condensing agent or an activated material, and a chemical binding reaction between them. This can be done by a technique using
The antibody, antibody set, or antibody kit provided by the present invention is a technique known in the art for detecting and measuring a specific amount of protein (for example, in situ hybridization, Western blotting, various immunohistological methods). Etc.) can be used to identify modified VCPs. For details of these general technical means, see, for example, Hiroshi Irie, “Continuing Radioimmunoassay”, Kodansha, published in 1979; Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition), Medical School. Issued in 1987; V. Vunakis et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 70 (Immunochemical Technologies, Part A), Academic Press, New York (1980); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 73 (Immunochemical Technologies, Part B), Academic Press, New York (1981); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 74 (Immunochemical Technologies, Part C), Academic Press, New York (1981); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 84 (Immunochemical Technologies, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 92 (Immunochemical Technologies, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 121 (Immunochemical Technologies, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); Wilchek et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990); J. et al. Langone et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Animateds and Antigens, Nucleic Acids, Polyaccharides, and Drugs in 19). Can be done for reference.

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
［実施例１］
修飾化ペプチドの合成
修飾化ペプチド（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を、文献（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ．ＳｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓＩ．Ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３；ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄＷｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）に記載の方法に従い、ＲａｉｎｉｎＳｙｍｐｈｏｎｙ１２−ｃｈａｎｎｅｌ合成機を用いて合成した。
修飾化ペプチド（Ｉ）は、配列番号２（配列番号１の６９１−７０４アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その６番目（配列番号１の６９６番目）Ｌｙｓ残基がアセチル化している（Ｈ−ＣＱＲＡＣＫ（Ａｃ）ＬＡＩＲＥＳＩＥ−ＮＨ２）。修飾化ペプチド（ＩＩ）は配列番号３（Ｎ末端のＣｙｓ残基以降が、配列番号１の４８７−５０２アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その１０番目（配列番号１の４９５番目）Ｔｙｒ残基がリン酸化している（Ｈ−ＣＲＥＬＱＥＬＶＱＹ（ＰＯ３Ｈ２）ＰＶＥＨＰＤＫ−ＮＨ２）。修飾化ペプチド（ＩＩＩ）は、配列番号４（Ｎ末端のＣｙｓ残基以降が、配列番号１の７５６−７７０アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その７番目（配列番号１の７６１番目）Ｔｈｒ残基がリン酸化している（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴ（ＰＯ３Ｈ２）ＬＱＱＳＲＧＦＧＳ−ＮＨ_２）。修飾化ペプチド（ＩＶ）は、配列番号４（Ｎ末端のＣｙｓ残基以降が、配列番号１の７５６−７７０アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その１１番目（配列番号１の７６５番目）Ｓｅｒ残基がリン酸化している（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴＬＱＱＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＲＧＦＧＳ−ＮＨ２）。
また、コントロールとして、配列番号５（Ｎ末端のＣｙｓ残基以降が、配列番号１の６６２−６７３アミノ酸配列に相当）の８番目（配列番号１の６６８番目）Ｌｙｓ残基がアセチル化している修飾化ペプチド（Ｖ）（Ｈ−ＣＲＫＳＰＶＡＫ（Ａｃ）ＤＶＤＬＥ−ＮＨ２）を合成した。
１：材料と合成
修飾化ペプチド（Ｉ）（Ｖ）は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−樹脂上で、また修飾化ペプチド（ＩＩ）（ＩＩＩ）（ＩＶ）はＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ樹脂上でそれぞれ合成した。保護されたアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌである。またリン酸化ＳｅｒはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ［Ｐ（Ｏｂｚｌ）Ｏ２Ｈ］、リン酸化ＴｙｒはＦｍｏｃ−Ｔｙｒ［Ｐ（Ｏｂｚｌ）Ｏ２Ｈ］、リン酸化ＴｈｒはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ［Ｐ（Ｏｂｚｌ）Ｏ２Ｈ］、アセチル化ＬｙｓはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）として合成に用いた（なお、「Ｆｍｏｃ」は９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、「Ｐｂｆ」は２，２，４，６，７−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−５−ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ、「ｔＢｕ」はｔｅｒｔｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒｏｒｅｔｈｅｒ、「Ｔｒｔ」はＴｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ、「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ−ｂｕｔｈｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｎｙｌ、「Ａｃ」はＡｃｅｔｈｙｌ、「Ｂｚｌ」はＢｅｎｚｙｌをそれぞれ示す）。
２：側鎖の脱保護と分離
合成および最終Ｆｍｏｃ除去の後、ペプチドの側鎖脱保護を行い、さらに８７．５％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）／５％フェノール／５％水／２．５％トリイソプロピル生理食塩水（ＴＩＳ）中、室温で樹脂から分離した。２．５〜３時間振盪することによって反応を促進させた。ペプチド樹脂を含むＴＦＡを濾過し、ペプチド樹脂を純ＴＦＡで洗浄した。濾液に冷エーテル（−２０〜２０℃）を加え、４℃で１時間静置した。このペプチド懸濁液を１０分間遠心し、その上清を分取し、得られたペレットをエーテルで３回洗い、そして真空乾燥下のデシケーター内に静置した。次いで、乾燥ペレットをアセトニトリル／水／氷酢酸中に溶解し、凍結乾燥した。この得られた粗ペプチドを計量し、窒素下で保存した。
３：精製
粗ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。固定相としてＣ１８由来のシリカを用いた。
すなわち、２０３ｍｇの粗乾燥ペレットを０．１％ＴＦＡ／水＋ＤＴＥに溶解し、以下の条件でカラムに通液し、精製した。
装置：ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰｒｅｐＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＨＰＬＣＳｙｓｔｅｍ
溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水
溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ
勾配と流量：
修飾化ペプチド（Ｉ）
・０−１５％溶媒Ｂで５分間、流量４５ｍｌ／分
・１５−２５％溶媒Ｂで６０分間、流量４５ｍｌ／分
修飾化ペプチド（ＩＩ）−（ＩＶ）
・１−１０％溶媒Ｂで５分間、流量３５ｍｌ／分
・１０−２０％溶媒Ｂで６０分間、流量３５ｍｌ／分
検出：２１５ｎｍ
純ペプチドを含む画分を凍結乾燥し、保存した。
４：分析
得られた精製ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析機を用いて分析し、目的のアミノ酸残基が目的の修飾を受けている修飾化ペプチドを単離した。
（１）ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
精製乾燥ペプチドを水に溶解し、分析用カラムに通液し、以下の条件で分析した。
装置：ＢｅｃｋｍａｎＧｏｌｄ，ＮｏｕｖｅａｕＳｙｓｔｅｍ
溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水
溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ
勾配と流量：５−５５％溶媒Ｂで２５分間、流量１．０ｍｌ／分
検出：２１５ｎｍ
（２）質量分析法
精製ペプチドを水に溶解し、ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅＨＰＬＣシステムを連結したＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴ−ＬＣＱｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて分析した。
以上のＲＰ−ＨＰＬＣ分析および質量分析法によって、所定のアミノ酸が修飾された目的の修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）を得た。
［実施例２］
ウサギ抗血清の作成
免疫動物は、１抗原当たり２匹のウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ）を用いた。初回免疫は、１匹当たり８００μｇの各修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）をキャリヤータンパク質（ＫｅｙｈｏｌｅＬｙｍｐｈｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨやオボアルブミンなど）と結合させた後、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と等量混合し、背部皮下２０箇所に投与した。追加免疫は、１匹当たり４００μｇの各修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）を前記キャリヤータンパク質と結合させ、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）に混合し、２、４、６週目に皮下投与した。７週目に測定採血を行い、８週目に全採血を行った。測定採血は耳静脈から２ｍｌを、全採血は頸動脈から可能な限りの血液を採取した。測定採血から得られた血清の抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。得られた血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分間）して血清を得、ＮａＮ_３を０．０５％添加し、４℃で保存した。以上の手続により、修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）のそれぞれを抗原とするウサギ抗血清（Ｉ）−（ＩＶ）を作成した。
［実施例３］
マウス抗血清の作成
免疫動物は、１抗原当たり４匹の雌性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を用いた。初回免疫は、１匹当たり１００−２００μｇの各修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）を前記キャリヤータンパク質と結合させ、ＦＣＡと等量混合し、背部および腹部皮下、足裏１０箇所に投与した。追加免疫は、１匹当たり５０−１００μｇの各修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）を前記キャリヤータンパク質と結合させてＦＩＡに混合し、２、４、６週目に投与した。７週目に測定採血を行い、８週目に全採血を行った。測定採血は眼窩静脈叢から０．５ｍｌを、全採血は腋下静脈または心室から可能な限りの血液を採取した。測定採血から得られた血清の抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。得られた血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分間）して血清を得、ＮａＮ_３を０．０５％添加し、４℃で保存した。以上の手続により、修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）のそれぞれを抗原とするマウス抗血清（Ｉ）−（ＩＶ）を作成した。
［実施例４］
マウス・モノクローナル抗体の作成
実施例３と同様のマウスおよび抗原溶液を用いて免疫を行った。２週間に１回免疫を行い、十分な力価の上昇が見られたら、ＫＬＨに化学的に結合させた抗原ペプチドをＰＢＳまたは生理食塩水に溶解し、腹腔内または静脈に注射して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に全採血および脾臓抽出を行った。脾臓から脾細胞を調製し、ポリエチレングリコール処理によってマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合させた。ＨＡＴ選択培地を使用して増殖能を有する抗体産生細胞を選択した。抗体産生はＥＬＩＳＡにより確認した。以上の手続により、修飾化ペプチド（Ｉ）−（ＩＶ）のそれぞれを抗原とするマウス・モノクローナル抗体（Ｉ）−（ＩＶ）を作成した。
［実施例５］
ＥＬＩＳＡ法
修飾化ペプチド（Ｉ）（Ｈ−ＣＱＲＡＣＫ（Ａｃ）ＬＡＩＲＥＳＩＥ−ＯＨ）、その非修飾化ペプチド（Ｈ−ＣＱＲＡＣＫＬＡＩＲＥＳＩＥ−ＮＨ２）、およびコントロール修飾化ペプチド（Ｖ）（Ｈ−ＣＲＫＳＰＶＡＫ（Ａｃ）ＤＶＤＬＥ−ＮＨ２）、の溶液を９６穴プレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間、または４℃で１０時間放置することによって、抗原を固定した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。０．２％ゼラチン／ＰＢＳを各ウエルに３００μｌ加え、３７℃で１時間、または４℃で１０時間以上放置してブロッキングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、実施例２、３で作成した抗血清（ポリクローナル抗体）、または実施例４で作成したモノクローナル抗体の溶液５０μｌを各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、酵素標識した抗免疫グロブリン抗体（抗ＩｇＧ抗体）の溶液１００μｌを各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、基質溶液１００μｌを各ウエルに添加し、３７℃で７分間反応させて発色させた後、１．５％シュウ酸溶液１００μｌを各ウエルに添加して発色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート分光光度計を用いて４１５ｎｍおよび４８６ｎｍ（コントロール）の吸光度を測定した。
図１は、実施例３で作成したマウス抗血清（Ｉ）を用いたＥＬＩＳＡ分析の結果である。コントロールの非修飾化ペプチドおよび修飾化ペプチド（Ｖ）に比べ、修飾化ペプチド（Ｉ）に対して、マウス抗血清（Ｉ）は高い抗体力価を示すことが確認された。
［実施例６］
ＥＬＩＳＡ法
修飾化ペプチド（ＩＩ）（Ｈ−ＣＲＥＬＱＥＬＶＱＹ（ＰＯ３Ｈ２）ＰＶＥＨＰＤＫ−ＮＨ２）およびその非修飾化ペプチド（Ｈ−ＣＲＥＬＱＥＬＶＱＹＰＶＥＨＰＤＫ−ＮＨ２）を用いて、実施例５と同様ＥＬＩＳＡ法により、実施例２で作成したウサギ抗血清（ＩＩ）の特異性を確認した。
結果は図２に示したとおりである。ウサギ抗血清（ＩＩ）は、非修飾化ペプチドに比べ、修飾化ペプチド（ＩＩ）に対して高い抗体力価を示すことが確認された。
［実施例７］
ＥＬＩＳＡ法
修飾化ペプチド（ＩＩＩ）（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴ（ＰＯ３Ｈ２）ＬＱＱＳＲＧＦＧＳ−ＮＨ２）およびその非修飾化ペプチド（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴＬＱＱＳＲＧＦＧＳ−ＮＨ２）を用いて、実施例５と同様ＥＬＩＳＡ法により、実施例２で作成したウサギ抗血清（ＩＩＩ）の特異性を確認した。
結果は図３に示したとおりである。ウサギ抗血清（ＩＩＩ）は、非修飾化ペプチドに比べ、修飾化ペプチド（ＩＩＩ）に対して高い抗体力価を示すことが確認された。
［実施例８］
ＥＬＩＳＡ法
修飾化ペプチド（ＩＶ）（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴＬＱＱＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＲＧＦＧＳ−ＮＨ２）およびその非修飾化ペプチド（Ｈ−ＣＥＭＦＡＱＴＬＱＱＳＲＧＦＧＳ−ＮＨ２）を用いて、実施例５と同様ＥＬＩＳＡ法により、実施例２で作成したウサギ抗血清（ＩＶ）の特異性を確認した。
結果は図４に示したとおりである。ウサギ抗血清（ＩＶ）は、非修飾化ペプチドに比べ、修飾化ペプチド（ＩＶ）に対して高い抗体力価を示すことが確認された。
［実施例９］
ウェスタン・ブロット法
実施例６で抗原特異性を確認した抗体（ウサギ抗血清（ＩＩ））が実際にヒト子宮頸部癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞）でリン酸化されているＶＣＰを認識しているかどうかを、ウェスタンブロット法により確認した。
定法により培養したＨｅＬａ細胞を界面活性剤を含む緩衝液で溶解し、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に従って分子量ごとに分離した。その後、電気的にｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜に移行させた。タンパク質を吸着したＰＶＤＦ膜は、定法により５％スキムミルクを含む緩衝液で非特異的結合を抑制した後に、目的とする抗体を希釈した液を加え室温で１時間または４℃で１４時間インキュベートした。結合しなかった抗体を洗浄後、定法に従いパーオキシデース標識した抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベートし、再び洗浄した後に、化学発光法により抗体が特異的に結合するタンパク質をＸ線フィルムで検出した。
結果は図５に示したとおりである。培養細胞でチロシンリン酸化されているタンパク質はチロシンフォスファターゼで除去されるが、この脱リン酸化酵素の阻害剤である１ｍＭＨ２Ｏ２＋１ｍＭＶａｎａｄａｔｅで処理すると、ＶＣＰの特異的なチロシンリン酸化が検出された。
［実施例１０］
ウェスタン・ブロット法
実施例９と同様にウェスタン・ブロット法で、実施例６および９で用いた抗体（ウサギ抗血清（ＩＩ））が、ラット副腎髄質褐色腫由来細胞（ＰＣ１２細胞）でのＶＣＰを認識するかを確認した。この細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で神経細胞様に分化することが知られている。
結果は図６に示したとおりである。この培養細胞では定常状態でもある程度のＶＣＰが４９５番目のアミノ酸残基でチロシンリン酸化されていることが分かるが、ＮＧＦ処理でわずかに分子量の大きいリン酸化ＶＣＰのシグナルが現れた。こうした分子量のわずかな変化はリン酸化の昂進に伴ってしばしば観察される現象である。こうした神経細胞への分化に伴うリン酸化の変化が、神経細胞の健全性と関連していることが確立すれば、この抗体は診断薬として有用である。
［実施例１１］
ウェスタン・ブロット法
実施例９と同様にウェスタン・ブロット法で、実施例７および８で用いた抗体（それぞれウサギ抗血清（ＩＩＩ）および（ＩＶ））が、ヒト子宮頸部癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞）でのＶＣＰを認識するかを確認した。
結果は図７に示したとおりである。この培養細胞では定常状態でも７６１番目のスレオニン（Ｔｈｒ）はわずかに、７６５番目のセリン（Ｓｅｒ）は著しくリン酸化を受けていることが分かる。こうした定常状態で見られるリン酸化の変化が癌細胞の悪性度と関連していることが確立すれば、この抗体は診断薬として有用である。Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited by the following examples.
[Example 1]
Synthesis of Modified Peptides Modified peptides (I), (II), (III) and (IV) were obtained from the literature (Merrifield, RBJ Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; according to Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, WC and White, P. D., Oxford University Presity 2000). The synthesis was performed using a 12-channel synthesizer.
The modified peptide (I) consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (corresponding to the 691-704 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), and its sixth (696th position of SEQ ID NO: 1) Lys residue is acetylated ( H-CQRACK (Ac) LAIRESIE-NH2). The modified peptide (II) is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (the N-terminal Cys residue and subsequent portions correspond to the 487-502 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), and its 10th (495th position of SEQ ID NO: 1) Tyr The residue is phosphorylated (H-CRELQELVQY (PO3H2) PVEHPDK-NH2). The modified peptide (III) consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (the N-terminal Cys residue and thereafter correspond to the 756-770 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), the seventh (761 of SEQ ID NO: 1) Thr residue is phosphorylated (H-CEMFAQT (PO3H2) LQQSRGFGS -NH 2). The modified peptide (IV) is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (the N-terminal Cys residue and thereafter correspond to the 756-770 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), and the 11th (765th position of SEQ ID NO: 1). The Ser residue is phosphorylated (H-CEMFAQTLQQS (PO3H2) RGFGS-NH2).
As a control, a modification in which the Lys residue at the 8th position (668th position in SEQ ID NO: 1) is acetylated is SEQ ID NO: 5 (the N-terminal Cys residue and thereafter are equivalent to the 662-673 amino acid sequence in SEQ ID NO: 1) Peptide (V) (H-CRKSPVAK (Ac) DVDLE-NH2) was synthesized.
1: Materials and Synthesis Modified peptide (I) (V) is on Fmoc-Glu (OtBu) -O-resin, and modified peptide (II) (III) (IV) is on Fmoc-Amide resin. Synthesized. The protected amino acids are Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Ile, Fmoc -Leu, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val. Phosphorylated Ser is Fmoc-Ser [P (Obzl) O2H], phosphorylated Tyr is Fmoc-Tyr [P (Obzl) O2H], phosphorylated Thr is Fmoc-Thr [P (Obzl) O2H], and acetylated Lys is Fmoc-Lys (Ac) was used for the synthesis (where “Fmoc” was 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, “Pbf” was 2,2,4,6,7-pentamethyldibenzofuran-5-sulphonyl, “tButer” was tbu ether, “Trt” represents Triphenylmethyl, “Boc” represents tert-butyloxycarbonyl, “Ac” represents Acetyl, and “Bzl” represents Benzyl).
2: Side chain deprotection and separation After synthesis and final Fmoc removal, side chain deprotection of the peptide was performed, and 87.5% TFA (trifluoroacetic acid) / 5% phenol / 5% water / 2.5% tri Separated from the resin in isopropyl saline (TIS) at room temperature. The reaction was accelerated by shaking for 2.5-3 hours. TFA containing the peptide resin was filtered, and the peptide resin was washed with pure TFA. Cold ether (-20-20 degreeC) was added to the filtrate, and it left still at 4 degreeC for 1 hour. The peptide suspension was centrifuged for 10 minutes, the supernatant was separated, and the resulting pellet was washed three times with ether and placed in a desiccator under vacuum drying. The dried pellet was then dissolved in acetonitrile / water / glacial acetic acid and lyophilized. The resulting crude peptide was weighed and stored under nitrogen.
3: Purification The crude peptide was purified using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Silica derived from C18 was used as the stationary phase.
That is, 203 mg of coarsely dried pellets were dissolved in 0.1% TFA / water + DTE, passed through the column under the following conditions, and purified.
Apparatus: Waters Delta Prep Preparative HPLC System
Solvent A: 0.1% TFA / water
Solvent B: 0.1% TFA / ACN
Slope and flow:
Modified peptide (I)
-0-15% solvent B for 5 minutes, flow rate 45 ml / min
-15-25% solvent B for 60 minutes, flow rate 45 ml / min
Modified peptide (II)-(IV)
-1-10% solvent B for 5 minutes, flow rate 35 ml / min
-60 minutes with 10-20% solvent B, flow rate 35 ml / min
Detection: 215nm
Fractions containing pure peptide were lyophilized and stored.
4: Analysis The obtained purified peptide was analyzed using RP-HPLC and a mass spectrometer, and the modified peptide in which the target amino acid residue was subjected to the target modification was isolated.
(1) RP-HPLC analysis The purified dry peptide was dissolved in water, passed through an analytical column, and analyzed under the following conditions.
Equipment: Beckman Gold, Neuveau System
Solvent A: 0.1% TFA / water
Solvent B: 0.1% TFA / ACN
Gradient and flow rate: 25 minutes with 5-55% solvent B, flow rate 1.0 ml / min
Detection: 215nm
(2) Mass spectrometry The purified peptide was dissolved in water and analyzed using a Finnigan MAT-LCQ mass spectrometer connected with a Waters Alliance HPLC system.
By the above RP-HPLC analysis and mass spectrometry, the target modified peptide (I)-(IV) in which a predetermined amino acid was modified was obtained.
[Example 2]
Preparation of Rabbit Antiserum Two rabbits (Kbl: JW) were used for each immunized animal. In the first immunization, 800 μg of each modified peptide (I)-(IV) per mouse is combined with a carrier protein (Keyhole Lymphet Hemocyanin: KLH, ovalbumin, etc.) and then mixed in an equal volume with Freund's complete adjuvant (FCA). Then, it was administered to 20 sites subcutaneously on the back. For booster immunization, 400 μg of each modified peptide (I)-(IV) was combined with the carrier protein, mixed with Freund's incomplete adjuvant (FIA), and administered subcutaneously at 2, 4, and 6 weeks. . Measurement blood was collected at 7 weeks, and whole blood was collected at 8 weeks. For measurement blood collection, 2 ml was collected from the ear vein, and for whole blood collection, as much blood as possible was collected from the carotid artery. The antibody titer of the serum obtained from the measured blood sample was measured by ELISA. The obtained blood was centrifuged (3000 rpm, 20 minutes) to obtain serum, and 0.05% NaN ₃ was added and stored at 4 ° C. By the above procedure, rabbit antiserum (I)-(IV) was prepared using each of the modified peptides (I)-(IV) as antigens.
[Example 3]
Preparation of mouse antiserum Four female mice (Balb / c) per antigen were used as immunized animals. In the first immunization, 100-200 μg of each modified peptide (I)-(IV) per mouse was combined with the carrier protein, mixed with FCA in an equal amount, and administered to the back and abdomen subcutaneously and at 10 sites on the sole of the foot. For booster immunization, 50-100 μg of each modified peptide (I)-(IV) per mouse was combined with the carrier protein, mixed with FIA, and administered at 2, 4, 6 weeks. Measurement blood was collected at 7 weeks, and whole blood was collected at 8 weeks. For measurement blood collection, 0.5 ml was collected from the orbital venous plexus. The antibody titer of the serum obtained from the measured blood sample was measured by ELISA. The obtained blood was centrifuged (3000 rpm, 20 minutes) to obtain serum, and 0.05% NaN ₃ was added and stored at 4 ° C. By the above procedure, mouse antiserum (I)-(IV) using each of the modified peptides (I)-(IV) as antigens was prepared.
[Example 4]
Preparation of mouse monoclonal antibody Immunization was carried out using the same mouse and antigen solution as in Example 3. Immunization once every two weeks and when sufficient titer is observed, antigen peptide chemically conjugated to KLH is dissolved in PBS or physiological saline and injected intraperitoneally or intravenously for final immunization Went. Three days after the final immunization, whole blood collection and spleen extraction were performed. Spleen cells were prepared from the spleen and fused with mouse myeloma cells (P3U1 X63Ag8.653) by polyethylene glycol treatment. Antibody-producing cells having proliferative ability were selected using a HAT selection medium. Antibody production was confirmed by ELISA. By the above procedure, mouse monoclonal antibodies (I)-(IV) were prepared using the modified peptides (I)-(IV) as antigens.
[Example 5]
ELISA method Modified peptide (I) (H-CQRACK (Ac) LAIRESIE-OH), its unmodified peptide (H-CQRACKLAIRESIIE-NH2), and control modified peptide (V) (H-CRKSPVAK (Ac) DVDLE- NH2) was dispensed 100 μl into each well of a 96-well plate and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours or at 4 ° C. for 10 hours, and then fixed with 0.05% Tween 20 / PBS. Washed 3 times. 300 μl of 0.2% gelatin / PBS was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour or at 4 ° C. for 10 hours or more to perform blocking, and then washed three times with 0.05% Tween 20 / PBS. Next, 50 μl of the antiserum (polyclonal antibody) prepared in Examples 2 and 3 or the monoclonal antibody solution prepared in Example 4 was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 0.05% Washed 3 times with Tween 20 / PBS. Further, 100 μl of an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody (anti-IgG antibody) solution was added to each well, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then washed 3 times with 0.05% Tween 20 / PBS. Finally, 100 μl of the substrate solution was added to each well and reacted at 37 ° C. for 7 minutes for color development. Then, 100 μl of 1.5% oxalic acid solution was added to each well to stop the color reaction, and ELISA Absorbance at 415 nm and 486 nm (control) was measured using a plate spectrophotometer.
FIG. 1 shows the results of ELISA analysis using mouse antiserum (I) prepared in Example 3. It was confirmed that the mouse antiserum (I) showed a higher antibody titer against the modified peptide (I) than the unmodified peptide and the modified peptide (V) as controls.
[Example 6]
ELISA method Using modified peptide (II) (H-CRELQELVQY (PO3H2) PVEHPDK-NH2) and its unmodified peptide (H-CRELQELVQPYPVEHPDK-NH2), prepared in Example 2 by ELISA method as in Example 5. The specificity of the rabbit antiserum (II) was confirmed.
The results are as shown in FIG. Rabbit antiserum (II) was confirmed to show a higher antibody titer against the modified peptide (II) than the unmodified peptide.
[Example 7]
ELISA method Using modified peptide (III) (H-CEMFAQT (PO3H2) LQQSRGFGS-NH2) and its unmodified peptide (H-CEMFAQTLQQSRGFGS-NH2), prepared in Example 2 by ELISA method as in Example 5. The specificity of the rabbit antiserum (III) was confirmed.
The results are as shown in FIG. Rabbit antiserum (III) was confirmed to show a higher antibody titer against the modified peptide (III) than the unmodified peptide.
[Example 8]
ELISA method Using modified peptide (IV) (H-CEMFAQTLQQS (PO3H2) RGFGS-NH2) and its unmodified peptide (H-CEMFAQTLQQSRGFGS-NH2), prepared in Example 2 by ELISA method as in Example 5. The specificity of the rabbit antiserum (IV) was confirmed.
The results are as shown in FIG. Rabbit antiserum (IV) was confirmed to show a higher antibody titer against the modified peptide (IV) than the unmodified peptide.
[Example 9]
Western blotting Whether the antibody (rabbit antiserum (II)) whose antigen specificity was confirmed in Example 6 actually recognizes VCP phosphorylated in human cervical cancer-derived cells (HeLa cells) Was confirmed by Western blotting.
HeLa cells cultured by a conventional method were lysed with a buffer containing a surfactant, and separated according to molecular weight according to Laemmli SDS-polyacrylamide electrophoresis. Thereafter, it was electrically transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The PVDF membrane adsorbed with protein was inhibited from non-specific binding with a buffer containing 5% skim milk by a conventional method, and then a solution in which the target antibody was diluted was added and incubated at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. for 14 hours. After washing the unbound antibody, incubate with peroxidase-labeled anti-rabbit antibody at room temperature for 1 hour according to a conventional method, and after washing again, detect the protein to which the antibody specifically binds by X-ray film by chemiluminescence method did.
The results are as shown in FIG. Proteins that were tyrosine phosphorylated in cultured cells were removed by tyrosine phosphatase, but specific tyrosine phosphorylation of VCP was detected when treated with 1 mM H2O2 + 1 mM Vanadate, an inhibitor of this phosphatase.
[Example 10]
Western blotting In the same manner as in Example 9, the antibody used in Examples 6 and 9 (rabbit antiserum (II)) was subjected to VCP in rat adrenal medulla melanoma-derived cells (PC12 cells). Confirmed whether to recognize. This cell is known to differentiate like a nerve cell in the presence of nerve growth factor (NGF).
The results are as shown in FIG. In this cultured cell, it can be seen that a certain amount of VCP is tyrosine phosphorylated at the 495th amino acid residue even in a steady state, but a signal of phosphorylated VCP having a slightly large molecular weight appeared by NGF treatment. This slight change in molecular weight is a phenomenon that is often observed as phosphorylation proceeds. If it is established that the change in phosphorylation accompanying differentiation into nerve cells is associated with the health of nerve cells, this antibody is useful as a diagnostic agent.
[Example 11]
Western blotting In the same manner as in Example 9, the antibodies used in Examples 7 and 8 (respectively rabbit antisera (III) and (IV)) were isolated from human cervical cancer-derived cells (HeLa cells). ) Was confirmed to recognize VCP.
The results are as shown in FIG. In this cultured cell, it can be seen that even at steady state, the threonine (Thr) at the 761th is slightly, and the serine (Ser) at the 765th is significantly phosphorylated. If it is established that the change in phosphorylation seen in the steady state is associated with the malignancy of cancer cells, this antibody is useful as a diagnostic agent.

以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、様々なアミノ酸残基が修飾されたＶＣＰを、その修飾化アミノ酸の違いに応じて認識することのできる抗体が提供される。この抗体の使用によって、ＶＣＰ発現レベルが関与する神経変性疾患や悪性腫瘍の診断、予後判定等が可能となる。 As described in detail above, the invention of this application provides an antibody capable of recognizing VCP modified with various amino acid residues according to the difference in the modified amino acid. Use of this antibody enables diagnosis, prognosis determination, and the like of neurodegenerative diseases and malignant tumors involving the VCP expression level.

Claims

Amino acid sequence smell of SEQ ID NO: 1 Te, 8, 18, 20, 45, 60-position, 62-position, 63-position, 109-position, 112-position, 148-position, 164-position, 190-position, 211-position, 217-position 231st, 236th, 251st, 277th, 288th, 295th, 312th, 315th, 336th, 336th, 386th, 389th, 425th, 426th, 486th, 502th, 502th, 505th, 512 Position, 524, 529, 543, 565, 584, 614, 658, 663, 668, 677, 696 and 754 at least one Lys residue selected from Lys residues recognize modifications of valosin containing protein group was acetylated antibodies.

The antibody of claim 1, which is prepared using a modified peptide consisting of a partially continuous sequence of SEQ ID NO: 1 as an antigen.

In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, position 8, position 18, position 45, position 60, position 62, position 63, position 109, position 112, position 148, position 164, position 190, position 211, position 217, 231st, 236th, 251st, 277th, 288th, 295th, 312th, 315th, 336th, 336th, 386th, 389th, 425th, 426th, 486th, 502th, 502th, 505th, 512th , 524, 529, 543, 565, 584, 614, 658, 663, 668, 677, 696 and 754, each Lys residue is individually acetylated A set of antibodies that individually recognize valosin-containing proteins.

A kit comprising a labeled antibody that recognizes a modified valosin-containing protein in which the Tyr residue at position 495 of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated, and a labeled antibody in which each antibody constituting the antibody set according to claim 3 is labeled.